Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Visceral leishmaniasis is a neglected disease caused by Leishmania infantum in Brazil. The Ecto-NTPDase activities, described in various parasites including Leishmania, is involved in adhesion, infection and virulence of these parasites, functioning as a molecular mechanism able to modulate the host immune response and promoting the disease progression. E-NTPDases are enzymes that hydrolyze nucleotides tri and/or di-phosphate into monophosphate products. The extracellular metabolism of these nucleotides has an important role in infection by L. infantum and other intracellular pathogens. These nucleotides are powerful extracellular signals involved in various cellular processes, which are part of the purinergic signalling that modulates the immune response. The objective of this study was to evaluate the role of ecto-NTPDase activities in adherence and infection of L. infantum in human macrophages. The ecto-NTPDase activities of parasites were evaluated in four different media or conditions: (1) purine-depleted, (2) adenosine-enriched, (3) with inhibitor of ecto-NTPDase activities, and (4) with anti-E antibody NTPDase 1. The effects of these treatments on the adhesion and infection of these parasites in human macrophages were investigated. Immunolocalization of the E-NTPDase in the membrane of L. infantum was also evaluated. The ecto-nucleotidase activity is modulated according to the availability of adenosine in the medium. Parasites cultivated in a purine-depleted medium showed increased hydrolytic capacity of nucleotides and higher infectivity. Parasites grown in adenosine-enriched medium had lower ecto-nucleotidase activity and infectivity. Growing parasites with an inhibitor of Ecto-NTPDase activities led to an increase in the adherence of Leishmania to non-phagocytic cells. E-NTPDase enzymes responsible for the hydrolysis of nucleotides are present in the membrane of L. infantum. The higher hydrolysis capacity is associated with increased adhesion capacity and infection of these parasites in human macrophages. / A Leishmaniose visceral é uma doença negligenciada causada, no Brasil, pelo protozoário Leishmania infantum. A atividade ecto-nucleotidásica descrita em vários parasitos incluindo Leishmania sp está associada à nutrição, adesão, infecção e virulência destes, funcionando como um mecanismo molecular capaz de modular a resposta imune do hospedeiro, favorecendo a progressão da doença. As ecto-nucleotidases da família E-NTPDases são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos tri e/ou di-fosfatados em seus produtos monofosfatados. O metabolismo extracelular destes nucleotídeos tem um papel importante na infecção por L. infantum e outros patógenos intracelulares. Estes nucleotídeos extracelulares são potentes sinalizadores envolvidos em vários processos celulares, incluindo a sinalização purinérgica que está relacionada à modulação da resposta imune. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da atividade ecto-nucleotidásica em L. infantum na adesão e infecção de macrófagos humanos. Avaliação da atividade ecto-nucleotidásica de parasitos crescidos em meio depletado de purina, meio enriquecido com adenosina, incubados previamente com inibidor da atividade NTPDásica, ou na presença do anticorpo Anti E-NTPDase 1 e investigar os efeitos desses tratamentos na adesão e infecção desses parasitos em macrófagos humanos. A atividade ecto-nucleotidásica dos parasitas foram avaliadas em quatro condições diferentes: (1) na meio depletado de purina, (2) meio enriquecido com adenosina, (3) com o inibidor da atividade ecto-nucleotidásica, e (4) incubada com anticorpo anti-E NTPDase 1. foram investigados os efeitos desses tratamentos sobre a adesão e infecção destes parasitas em macrófagos humanos. Imunodetectamos a presença de E-NTPDases presentes na membrana de L. infantum, e comparamos a atividade ecto-nucleotidásica de diferentes cepas de L. infantum. A atividade ecto-nucleotidásica, é modulada de acordo com a disponibilidade de adenosina do meio, parasitos cultivados em meio depletado de purina apresentaram o aumento da capacidade hidrolítica de nucleotídeos, e maior capacidade infectiva, os parasitos cultivados em meio suplementado com adenosina apresentaram uma menor atividade ecto-nucleotidásica e uma redução de 30% na capacidade infectiva. O aumento da atividade ecto-nucleotidásica levou a um aumento na adesão em células não fagocíticas. As enzimas E-NTPDases estão presentes na membrana de L. infantum. Concluímos que atividade ecto-nucleotidásica está associada a maior capacidade de adesão e infecção destes parasitos in vitro.

Sodium and water intake are important regulatory components of the hidromineral balance. In this context, human body regulates hidromineral imbalance through the neuro-immune-endocrine and behavioral response. Gonadal hormones are important players for the modulation of ingestive behaviors. The present study aimed to investigate the influence of male and female gonadal hormones in cerebral ECA2/ANG-(1-7)/Mas axis over the control of water sodium intake in rats. In this experiment, ovariectomized female rats were treated with estradiol benzoate (20μg/animal/day, sc; OVXE) or vehicle (sunflower oil; OVXV). Male rats underwent bilateral orchiectomy (ORQX) or sham surgery (SHAM). Guide cannulae were implanted into the right lateral ventricle for intracerebroventricular administration (icv) of drugs. We used angiotensin-converting enzyme type 2 (ACE2) activator, DIZE (diminazene of aceturate, 40 nmol / 2μl , icv ) or the antagonist of Ang-(1-7) Mas recetor, D-Ala7-ANG-(1-7) (A779, 10 nmol / 2μl, icv). The vehicle for both drugs was artificial cerebrospinal fluid (aCFS) administered in the same volume. For induction of thirst and sodium appetite, animals were subjected to hydrossaline depletion by administration of furosemide (20 mg / kg, sc) and access to distilled water and low sodium diet (corn ) for 24 hours. After microinjection of drugs, water and 0.3 M NaCl were reoffered and the ingested volume were recorded at the following 15, 30 , 60, 90 , 120, 180, 240 min and 24 h. Two-way analysis of variance was performed, followed by Bonferroni posthoc test when appropriate. The level of significance was p < 0.05. In females treated with vehicle or DIZE, sodium and water intake, as well as sodium preference index (SPI) did not differ between groups. However, OVXV ingested less water than OVXE when both were treated with A779 (p < 0.05). Twenty-four hours after reintroduction of fluids intake sodium ingestions was higher in OVXV than in OVXE when both received A779 (p<0.05). Similarly, OVXV rats showed greater preference for sodium when compared to OVXE, if both received icv injection of A779. Males ORQX microinjected with aCFS ingested more water than SHAM+aCSF. However, at 30 min, SHAM+DIZE male rats presented higher water intake when compared to their respective control. Up to 15 min after reintroduction of fluids, ORQX rats ingested less sodium than SHAM rats, regardless DIZE administration (p < 0.05). Water intake as well as SPI did not differ between groups in males undergoing A779 administrarion. However sodium intake was lower in ORQX+A779 than in ORQX+aCFS (p < 0.05) at 30, 60 , 90, 120 , 180 and 240 min after fluid presentation. Thus, we conclude that estrogen seems to exert inhibitory influences on sodium intake independent ECA2/ANG (1-7)/Mas activity. On the other hand, the male gonadal hormones act by raising intake for the regulation of salt intake shaft in the proposed protocol. / Os comportamentos de ingestão de sódio e água constituem importantes componentes regulatórios do equilíbrio hidroeletrolítico. Neste contexto, o organismo humano regula seu déficit hidromineral através de uma resposta neuroimunoendócrina e comportamental comandada majoritariamente pelo sistema nervoso central (SNC). Reconhecidamente, os hormônios gonadais representam importantes fatores moduladores dos comportamentos ingestivos. O presente estudo objetivou estudar a influência dos hormônios gonadais masculinos e femininos no eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas sobre o controle da ingestão de água e NaCl 0,3 M em ratos e ratas. Neste experimento, fêmeas ovariectomizadas foram tratadas com benzoato de estradiol (20μg/animal/dia, s.c.; OVXE), ou com veículo (óleo de girassol; OVXV). Machos foram submetidos à orquiectomia bilateral (ORQX) ou cirurgia fictícia (SHAM). Por meio de cirurgia estereotáxica, cânulas-guia foram implantadas no ventrículo lateral direito para administração intracerebroventricular (icv) das drogas utilizadas. Foram utilizados o ativador da enzima conversora de angiotensina tipo 2 (ECA2), DIZE (Aceturato de Diminazeno, 40 nmol / 2 μL, i.c.v.) ou o antagonista do receptor Mas de ANG (1-7), o D-Ala7-ANG(1-7) (A779, 10 nmol / 2 μL, i.c.v.). O veículo para ambas as drogas foi líquido cerebro-espinhal artificial (LCEa), administrado nos animais controle em igual volume. Para indução da sede e apetite por sódio, os animais foram submetidos a depleção hidrossalina por administração de um diurético de alça (furosemida, 20 mg / kg, s.c.) e acesso à água destilada e dieta pobre em sódio (fubá de milho) por 24 horas. Após a microinjeção das drogas, água e de NaCl 0,3 M foram reapresentados e registrados os volumes ingeridos nos tempos 15, 30, 60, 90, 120, 180, 240 min e 24 h. Foram realizadas análises de variância de duas vias seguidas do pós-teste de Bonferroni, quando necessário. O nível de significância foi de p < 0,05. Os dados demonstraram que, em fêmeas tratadas com DIZE ou veículo, a ingestão de água, NaCl 0,3 M e o índice de preferência ao sódio (IPS) não diferiram entre os grupos. Porém, fêmeas OVXV ingeriram menos água quando comparadas às femeas OVXE, quando ambas foram tratadas com A779 (p < 0,05). Vinte e quatro horas após a reapresentação de fluidos, a ingestão de NaCl 0,3 M foi maior em ratas OVXV que nas OVXE, quando ambas receberam A779 (p < 0,05). No mesmo sentido, ratas OVXV apresentaram maior preferência por sódio que as OVXE, ambas tratadas com A779. Machos ORQX microinjetados com LCEa ingeriram mais água quando comparados aos animais do grupo SHAM+LCEa. Todavia, aos 30 min, os machos SHAM+DIZE apresentaram maior ingestão de água quando comparado ao seu respectivo controle. Até 15 min após a reapresentação de fluidos, a ingestão de NaCl 0,3 M em ratos ORQX foi menor em comparação aos ratos SHAM independente do tratamento com DIZE (p<0,05), o IPS não diferiu entre os grupos. Os dados referentes a ingestão de água e ao IPS em machos submetidos ao tratamento icv com A779, revelam não haver diferença entre os grupos estudados, porém para ingestão de NaCl 0,3 M, os ratos ORQX+A779 demonstraram menor ingestão quando comparados aos animais ORQX+LCEa (p<0,05) nos tempos 30, 60, 90, 120, 180 e 240 min. Assim, podemos concluir que o estrógeno parece exercer influencia inibitória na ingestão de sódio independente da atividade do eixo ECA2/ANG(1-7)/Mas. Por outro lado, os hormônios gonadais masculinos atuam elevando a ingestão hidrossalina para a regulação do eixo no protocolo proposto.

Este trabalho teve por objetivo a preparação e caracterização de membranas de polissulfona (PSU) e a imobilização da enzima lipase nestes filmes, para a produção de membranas enantiosseletivas, visando utilização futura em separação de misturas quirais. Membranas de PSU foram preparadas pelo processo de inversão de fase, utilizando clorofórmio como solvente e água como agente coagulante para a inversão. Foram preparadas membranas com diferentes espessuras e os seguintes parâmetros para a inversão de fase foram definidos: concentração das soluções, tempo de evaporação do solvente, secagem e tratamento térmico. As membranas foram caracterizadas, visando a utilização em processo de eletrodiálise (ED) e imobilização da enzima lipase PS. Para a imobilização foi utilizado o glutaraldeído como agente bifuncional para ligação da enzima ao polímero. Na imobilização foram determinados os parâmetros cinéticos velocidade máxima (Vmáx) e constante de Michaelis-Menten (Km), a quantidade de enzima imobilizada nas membranas pelo método de Bradford e a atividade da enzima livre e imobilizada através da hidrólise do acetato de p-nitrofenila (PNPA). As membranas de PSU preparadas por inversão são hidrofóbicas, e apresentaram características de permesseletividade e capacidade de troca iônica inferiores às apresentadas pelas membranas comerciais Selemion®; CMT e CMV e resistência elétrica superior à destas membranas. O diâmetro dos poros nas membranas é menor que 100 nm. . A quantidade máxima de enzima imobilizada foi de 2,35 mg .g-1 de polímero em 18 horas de imobilização com um rendimento de 61,2%. A atividade da enzima decai após a imobilização, de 14780 U.g-1 (enzima livre) para 1184 U.g-1 (enzima imobilizada). / Preparation and characterization of polysulfone (PSU) membranes and the immobilization of lipase enzyme in these membranes to produce enantioselective membranes, in order to separate chiral compounds, is the subject of the present work. PSU membranes were prepared by phase inversion, using chloroform as solvent and water as nonsolvent. Membranes with different thickness were prepared and phase inversion parameters such as (solution concentrations, solvent evaporation time, drying and thermal treatment) were investigated. Membranes were characterized, in order to use them in electrodialysis process (ED) and in the lipase PS enzyme immobilization. For immobilization, bifunctional agent glutaraldehyde was used to link the enzyme to the polymer. On immobilization, the kinetic constants (Km e Vmax), the amount of immobilized enzyme with Bradford method and the activity of free and immobilized enzyme with p-nitrophenyl acetate (PNPA) hydrolysis, were determined. PSU membranes prepared by phase inversion are hydrophobic and, when compared with Selemion®; CMT and CMV commercial membranes, present lower permeselectivity, lower ion exchange capability and higher resistance. Membranes pore diameter is lower than 100 nm. The maximum amount of immobilized enzyme in the membranes reached 2.35 mg per gram of polymer after 18 hours of immobilization with a 61,2% yield . Enzyme activity decays after immobilization , from 14780 U.g-1 (free enzyme) to 1184 U.g-1 (immobilized enzyme).

The post-exercise hypotension (HPE) is considered a non-pharmacological strategy adopted for the reduction of blood pressure (BP). However, some factors may influence the HPE, among them stand out the genetic mutations that are responsible for 30% of the predisposition to cardiovascular disease. In this regard, recent studies have directed attention to better understand how the presence of genetic polymorphisms, such as I / D angiotensin-converting enzyme (ACE) gene may influence the pressure response after performing the exercise. The objective of this study was to analyze the influence of the ACE ID polymorphism on PEH in different intensities as well as the possible attenuation of the reactivity of BP after a cardiovascular stress test in normotensive, young and physically active men. Voluntarily participated in the study 26 young normotensive adults, male and were grouped into two genotype groups (DD = 11, ID / II = 15). All underwent a maximal exercise session of 1.600 meters, on the athletics track, in order to estimate the anaerobic threshold and the indirect VO2max. Subsequently, randomly assigned to three experimental sessions of 20 minutes was carried out: # 1. Moderate Test at 6% below the anaerobic threshold; # 2. Intense Test at 6% above the anaerobic threshold; # 3. Control session without exercise. All sessions were composed of five times, being: 1. Previous PA measurement (rest) for 20 min; 2. Realization of the sessions; 3. Record of post-exercise BP during 60 minutes; 4. Realization of cardiovascular stressor test (CPT); 5. Measurement of PA for over 30min. The main result was that moderate exercise resulted HPE, independent of genotypic group, especially for systolic BP at 45 and 60 min (p . 0.05). This reduction persisted after CPT only for allele carrier group |I| (p . 0.05). Thus, it was concluded that moderate intensity was more effective to cause HPE and the carrier group allele |I| showed effective attenuation of pressor reactivity. / A hipotensao pos-exercicio (HPE) e considerada uma estrategia nao farmacologica adotada para a reducao da pressao arterial (PA). Contudo, alguns fatores podem influenciar a HPE, entre eles destacam-se as mutacoes genicas, que sao responsaveis por 30% da predisposicao as doencas cardiovasculares. Neste sentido, estudos recentes direcionaram as atencoes para melhor compreender o quanto a presenca de polimorfismos geneticos, como o I/D do gene da enzima conversora da angiotensina (ECA), podem influenciar na resposta pressorica apos a realizacao do exercicio fisico. Assim, o objetivo do presente estudo foi analisar a influencia do polimorfismo ID da ECA sobre a HPE em diferentes intensidades, bem como a possivel atenuacao da reatividade da PA apos a realizacao de um teste de estresse cardiovascular em jovens normotensos e fisicamente ativos. Participaram voluntariamente do estudo 26 adultos jovens, normotensos, do sexo masculino, sendo agrupados em dois grupos genotipicos (DD=11, ID / II=15). Todos foram submetidos a um sessao de exercicio maxima de 1.600 metros, na pista de atletismo, com o intuito de estimar o limiar anaerobio e o VO2max indireto. Posteriormente, de forma randomizada, foram realizadas tres sessoes experimentais de 20 minutos, sendo: #1. Teste moderado a 6% abaixo do limiar anaerobio; #2. Teste intenso a 6% acima do limiar anaerobio; #3. Sessao controle sem exercicio fisico. Todas as sessoes foram compostas por cinco momentos, sendo: 1. Afericao previa da PA (repouso) durante 20min; 2. Realizacao das sessoes; 3. Afericao pos-exercicio da PA durante 60min; 4. Realizacao do teste estressor cardiovascular (CPT); 5. Afericao da PA por mais 30min. O principal resultado foi que o exercicio moderado ocasionou HPE independente do grupo genotipico, principalmente para a PA sistolica aos 45 e 60min (p.0,05). Tal reducao perdurou apos o CPT apenas no grupo carreador do alelo gI h (p.0,05). Desse modo, conclui-se que a intensidade moderada foi mais efetiva para ocasionar HPE e que o grupo carreador do alelo gI h apresentou efetiva atenuacao da reatividade pressorica.

Individual genetic susceptibility, inadequate nutrition and sedentary lifestyle figure among the most relevant risk factors for the emergence of cardiovascular and metabolic diseases. In this context, the two axes of the renin-angiotensin system (RAS), Angiotensin Converting Enzyme–Angiotensin II–AT1 receptor and Angiotensin Converting Enzyme 2–Angiotensin-(1-7)–Mas receptor, participate in central homeostatic regulatory mechanisms. Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2) acts in an attempt to counteract the actions mediated, mainly, by Angiotensin II. In this scenario, the relevant action of ACE2 in the cardiovascular regulation has already been suggested, but the participation of such enzyme in glucose and lipid homeostasis still remains controversial. Thus, the aim of this work was to characterize the lipid and glucose metabolic alterations resulting from the gene deletion of ACE2 in C57BL/6 and apolipoprotein E knockout (ApoE-/-) mice, as well as the main mechanisms involved. C57Bl/6 and ACE2-/y mice were assessed at 3, 6 and 12 months of age after consumption of standard diet (Kcal, 10% lipids) and at 6 and 12 months of age after consumption of high fat diet (Kcal, 45% lipids). ApoE/ACE2-/y mice at 6 months of age were also used in the study. The gene deletion of ACE2 caused a paradoxical metabolic effect: at all ages assessed, ACE2 knockout animals presented a marked reduction in body weight, white adipose tissue deposition and systemic lipid profile. This event is associated with a lower susceptibility to high fat diet-induced obesity in animals at 6 months of age, but not at 12 months of age. Nevertheless, such gene deletion induced both steatosis and impairment in insulin signaling in the liver. The probable mechanism involves the increase of CD36 gene expression and the protein decrease of sirtuin 1 and protein kinase A in the liver, coupled with high expression of UCP2, a mitochondrial uncoupling protein which main function is control the production of oxidants. Furthermore, different from the results in the liver, systemically, ACE2-/y animals present greater glucose tolerance and greater insulin sensitivity. These results are due to lower fat deposition in these animals, coupled with increased expression of genes involved in insulin regulation in the white adipose tissue and in the muscle. Similar to the ACE2-/y animals, the double gene deletion (ApoE/ACE2-/y) attenuated the dyslipidemic metabolic profile of ApoE-/- animals, resulting in a systemic phenotype similar to that observed in ACE2-/y, for example: reduction in body weight, triglyceride levels and free fatty acids in plasma, along with the hepatic steatosis caused by mechanisms dependent on the increase in the CD36 pathway and reduction in the hepatic sirtuin 1 pathway. The new findings indicate that ACE2 and/or the “new axis” of the RAS have a central role in the regulation of glucose and lipid metabolism both systemically and in the liver, and probably, by an age-dependent mechanism. ACE2 deletion in mice involves the protection against high fat diet-induced obesity, but not steatosis. In this sense, ACE2-/y is a new animal model of lipodystrophy and represents a tool for investigating new metabolic treatments. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A suscetibilidade genética individual, a alimentação inadequada e o sedentarismo figuram entre os mais relevantes fatores de risco para o surgimento de doenças cardiovasculares e metabólicas. Neste contexto, os dois eixos do sistema renina angiotensina (SRA), Enzima Conversora de Angiotensina–AngiotensinaII–receptor AT1 e Enzima Conversora de Angiotensina 2–Angiotensina-(1–7)–receptor Mas, participam de mecanismos reguladores homeostásicos centrais. A Enzima Conversora de Angiotensina 2 (ECA2) atua na tentativa de contrabalancear as ações mediadas, principalmente, pela Angiotensina II. Neste cenário, a ação relevante da ECA2 na regulação cardiovascular já foi sugerida, mas a participação desta enzima na homeostase glicêmica e lipídica ainda permanece controversa. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi estudar as alterações metabólicas lipídicas e glicêmicas decorrentes da deleção gênica da ECA2 em camundongos C57BL/6 e knockout para a apolipoproteína E (ApoE-/-) bem como os principais mecanismos envolvidos. Camundongos C57Bl/6 e ECA2-/y foram analisados nas idades de 3, 6 e 12 meses após consumo de dieta padrão (Kcal, 10% lipídios) e nas idades de 6 e 12 meses após consumo de dieta hiperlipídica (Kcal, 45% lipídios). Animais ApoE/ECA2-/y com 6 meses de idade também foram utilizados no estudo. A deleção gênica da ECA2 causou um efeito metabólico paradoxal: em todas as idades analisadas os animais ECA2 knockouts apresentaram uma acentuada diminuição do peso corporal, da deposição de tecido adiposo branco e do perfil lipídico sistêmico. Este evento está associado a menor susceptibilidade a obesidade induzida por dieta com alto teor de gordura nos animais com 6 meses, mas não com 12 meses de idade. Entretanto, esta deleção gênica induziu tanto a esteatose como ao prejuízo na sinalização insulínica hepática. O provável mecanismo envolve o aumento da expressão gênica de CD36 e a diminuição proteica da sirtuina 1 e proteína quinase A no fígado, associado a elevada expressão do UCP2, uma proteína desacopladora mitocondrial cuja principal função é o controle da produção de oxidantes. Além disso, diferente dos resultados hepáticos, sistemicamente, os animais ECA2-/y são mais tolerantes à glicose e sensíveis à insulina. Esses resultados são decorrentes da menor deposição de gordura nestes animais, associado ao aumento da expressão de genes envolvidos na regulação insulínica no tecido adiposo branco e no músculo. Semelhante aos ECA2-/y, a dupla deleção gênica (ApoE/ECA2-/y) atenuou o perfil metabólico dislipidêmico dos animais ApoE-/-, resultando-se em um fenótipo sistêmico semelhante aos animais ECA2-/y, a citar: diminuição do peso corporal, dos níveis de triglicerídeos e dos ácidos graxos livres no plasma, somando-se a esteatose hepática causada por mecanismos dependentes de aumento da via CD36 e diminuição da via da sirtuina 1 hepática. Os novos achados indicam que a ECA2 e/ou o “novo eixo” do SRA tem um papel central na regulação do metabolismo glicêmico e lipídico tanto sistêmico quanto hepático e, provavelmente, por um mecanismo dependente de idade. A deleção da ECA2 em camundongos envolve a proteção contra obesidade, mas não esteatose, induzida por dieta hiperlipídica. Neste sentido, ECA2-/y é um novo modelo animal de lipodistrofia e representa uma ferramenta de investigação para novos tratamentos metabólicos.

Orientador: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T15:27:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VilcaQuispe_Augusto_M.pdf: 840674 bytes, checksum: 0ee3f83d8486d73f628e60ca5c8a83fd (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Muitas das toxinas isoladas e estudadas em seus efeitos biológicos precisam ser reavaliadas à luz de metodologias otimizadas em HPLC e confirmadas por espectrometria de massas, devido à possível presença de algum componente não estudado. No caso da serpente Bothrops marajoensis, são valorizados os estudos sobre essa espécie devido aos poucos trabalhos realizados, provavelmente por se tratar de uma espécie restrita e rara encontrada na ilha de Marajó, no Pará, e posteriormente em alguns locais litorâneos do Maranhão, aparentemente endêmica. A reprodutibilidade da atividade biológica, através dos efeitos farmacológicos, só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas que mantenham a integridade da função biológica. No presente trabalho, foi purificada uma nova serinoprotease TLBm, com atividade trombina "like" em um único passo cromatográfico em um sistema de HPLC de fase reversa, com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, sem perda da atividade biológica. A nova serinoprotease foi caracterizada fisico-quimicamente, revelando uma massa molecular de 33332,5 Da por Espectrometria de Massa (MALDI-Tof). Por outro lado, mostrou uma atividade proteolítica perante o substrato cromogênico DL-BA?NA, assim como foi capaz de evidenciar uma atividade fibrinogenolítica frente ao fibrinogênio bovino e hidrolisar a cadeia alfa (a) e beta (ß), comportando-se como uma trombina "like" tipo A e B. Os estudos da atividade cinética mostraram que a serinoprotease com atividade trombina "like" possui um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-BA?NA, registrando as constantes cinéticas de Vmax = 2,3x10-1 nmoles p-NA/Lt/min e o KM = 0,52x10-1M. Os estudos do efeito da temperatura sobre a atividade catalítica revelaram que a serinoprotease TLBm apresenta uma ótima atividade em torno de 38ºC e um pH de 8,0. Para confirmar o caráter trombina "like" da TLBm, esta foi inibida pela ação do fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF) e outros inibidores, através dos quais a atividade foi reduzida em mais de 50% (69,89±1,5 %). A análise de composição de aminoácidos mostrou que a serinoprotease TLBm trata-se de uma proteína de caráter ácido ao apresentar um elevado número de aminoácidos ácidos, assim como uma boa quantidade de aminoácidos hidrofóbicos, o que garante a estabilidade conformacional da proteína. A presença de 12 cisteínas sugere a possível presença de 6 pontes dissulfeto. A seqüência N-terminal da serinoprotease com atividade trombina "like" TLBm mostrou um alto grau de homologia seqüencial (55,9 a 79,4 %). No entanto, existem algumas substituições nos aminoácidos (S)12?(H)12 e (V)15?(L)15, os quais poderiam estar relacionados à diferença na atividade biológica estudada aqui ou em outras atividades, o que faria da TLBm uma serinoprotease particular. Com relação ao estudo das atividades biológicas, a TLBm mostrou-se desprovida de atividade hemorrágica, o que é característico desta família de proteínas e reforça a afirmação de esta ser uma serinoprotease. A TLBm apresentou também baixa capacidade inflamatória (edematogênica) e uma alta concentração na letalidade (DL50) intracerebroventricular (i.c.v), evidenciando que a toxina não contribui significativamente com a letalidade do veneno total. A serinoprotease com atividade trombina "like" TLBm tem a propriedade de induzir a agregação plaquetária em plasma rico em plaquetas (PRP) e esse efeito é inibido na presença do PMSF. / Abstract: Many of the isolated and studied toxins in their biological effects need to be revalued, to the light of methodologies optimized in HPLC and confirmed by Mass Spectrometry, due to the possible presence of some component which has not been studied. In the case of the serpent Bothrops marajoensis, its results are valuable due to the fact that there are few works accomplished probably because the treating of a restricted and rare species found at the island of Marajó, in Pará, and later in some coastal places of Maranhão, which seem endemic. The reproduction of the biological activity, through the pharmacological effects, is only possible with the use of chemically homogeneous fractions so that they maintain the integrity of the biological function. In the present work a new serineprotease was purified with activity thrombin like TLBm in a Chromatography step in a system of HPLC of reverse phase, with a high degree of purity and molecular homogeneity, without loss of the biological activity. A new serineprotease was characterized physical-chemically revealing a molecular mass of 33332,5 Da by a Mass Spectrometry (MALDI-Tof), on the other hand, it did show an proteolitic activity before the substratum chromogenic DL-BA?NA, as well as it was capable to evidence an fibrinogenolitic activity in front of the bovine fibrinogen, and hydrolise the alpha (a) and beta (ß) chain which behaved as a thrombin like A and B types. The studies of the kinetic activity showed that the serineprotease with activity thrombin like, possesses a michaeliano behavior in front of the substratum DL-Ba?NA registering the kinetic constants of Vmax = 2,3x10-1 nmoles ?-NA/Lt/min and the KM = 0,52x10-1M respectively. The studies of the effect of the temperature under the catalytic activity, revealed that the serineprotease TLBm was capable to show a great activity around 38ºC and a pH of 8,0. To confirm the character thrombin like of TLBm, it was inhibited by the action of the fenilmetilsulfonil fluoride (PMSF) and other inhibitors, where the activity was reduced in more of the 50% (69,89 ± 1,5%). The analysis of composition of amino acids showed that the serineprotease TLBm is a character protein acid when presenting a high number of acid amino acids, as well as a good amount of amino acids hydrophobic that guarantees the conformational stability of the protein. The presence of 12 cisteinas suggests the possible presence of 6 dissulfeto bridges. The N-terminal sequence of the serineprotease with activity thrombin like TLBm, showed a high degree of sequential homology (55,9 to 79,4%). However there are some substitutions in the following amino acids: (S)12?(H)12 and (V)15?(L)15 which could be related with the difference in the biological activity studied here or with other activities, which would make TLBm a private serineprotease. The studies of biological activity such an as hemorrhage, reveal that the serineprotease is completely deprived which is known is already of this family of proteins. On the other hand the studies of the inflammatory effect (oedematogenic) reveal that the serineprotease possesses a low inflammatory capacity and finally it displays a high concentration in the lethality (DL50) intracerebroventricular (i.c.v.) showing that the toxin doesn't contribute significantly with the lethality of the total poison. The serineprotease with thrombin like activity has the property of inducing the platelet aggregation in platelets-rich plasma (PRP), and that effect is inhibited in the presences of the PMSF. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Flavia Maria Netto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-09T02:23:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tiengo_Andrea_M.pdf: 1037181 bytes, checksum: fa41390046e1fd743ebaf166db3e45ec (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O amaranto vem se destacando como uma excelente fonte alternativa ou complementar de proteínas alimentares devido à sua composição balanceada em aminoácidos essenciais. A cultura do amaranto (Amaranthus cruentus BR Alegria) vem sendo introduzida no Brasil por sua ótima qualidade nutricional, alto teor de proteínas e melhor valor biológico que a de cereais, e funcional, além de características agronômicas de adaptabilidade. Apesar de o amaranto ter sido bem caracterizado quimicamente e apresentar componentes relacionados a diferentes atividades bioquímicas com potencial fisiológico, pouco se conhece sobre seu potencial funcional. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade inibidora da enzima conversora da angiotensina (ECA) e a capacidade ligante de ácidos biliares (AB) da farinha desengordurada de amaranto e seus produtos. Farinha integral foi obtida pela moagem do grão de Amaranthus cruentus (variedade BR Alegria) e tratada com hexano para obtenção da farinha desengordura (FDA), utilizada para a produção do concentrado protéico de amaranto (CPA). Para obtenção de hidrolisados protéicos, CPA, sem e com tratamento térmico prévio (90°C/ 30 minutos), foi hidrolisado com a enzima Alcalase, até atingir 12% de grau de hidrólise (GH). As farinhas e seus produtos derivados foram caracterizados quanto à composição e perfis eletroforético e cromatográfico de suas proteínas. A digestão in vitro das proteínas também foi avaliada e o material digerido utilizado para avaliação da atividade inibidora da ECA. A farinha integral de amaranto e seus derivados apresentaram composição semelhante à encontrada na literatura. O tratamento térmico prévio do CPA não alterou o padrão de atividade das enzimas utilizadas, pois o perfil eletroforético e cromatográfico (fase reversa e exclusão molecular) mostraram-se semelhantes. Todos os hidrolisados protéicos e digeridos apresentaram capacidade de inibir a ECA in vitro. No entanto, os digeridos do CPA sem e com tratamento térmico prévio (DCPAst e DCPAtt respectivamente) apresentaram menor atividade inibidora da ECA (IC50 de 0,439 mg proteína/mL e 0,475 mg proteína/mL respectivamente) que os hidrolisados com Alcalase tanto antes (HPAst e HPAtt) como após a digestão in vitro (DHPAst e DHPAtt) que apresentaram IC50 0,118 a 0,176 mg de proteína/mL. Estes resultados sugerem que, in vivo, a ingestão da proteína de amaranto intacta pode apresentar menor atividade inibidora da ECA quando comparada à ingestão da proteína previamente hidrolisada com Alcalase. A digestão in vitro não alterou a atividade inibitória da ECA dos hidrolisados, sugerindo que os peptídeos inibidores da ECA liberados pela ação da Alcalase foram resistentes à hidrólise gastrintestinal. A capacidade ligante de ácidos biliares dos produtos de amaranto (FDA, CPA, HPAst e resíduo alcalino ¿ RA - obtido da extração do CPA) e da colestiramina (utilizada como controle positivo), foi diferente em função do ácido biliar estudado (ácidos cólico, taurocólico, glicocólico e deoxicólico). A colestiramina apresentou a maior atividade ligante para todos os AB testados, diferindo-se de todas as amostras (p<0,05). O RA, mais rico em fibras (8,6%), apresentou a menor atividade ligante para os AB testados, com exceção do ácido glicocólico, que os demais produtos. A FDA apresentou atividade ligante intermediária para todos os AB, porém semelhante à do CPA com o ácido deoxicólico e do HPAst com o ácido taurocólico, que apresentaram as maiores atividades. A FDA e CPA apresentaram capacidade ligante de ácidos biliares secundários tóxicos à mucosa intestinal. A partir dos resultados obtidos não foi possível afirmar se foram as proteínas, as fibras ou eventualmente outro componente não avaliado, o principal responsável por esta atividade. Com a comprovação das atividades inibidora da ECA e ligante de ácidos biliares in vitro, sugere-se a realização de estudos in vivo, sendo o experimento in vivo um método mais confiável para avaliar a atividade biológica das proteínas de amaranto e demais componentes / Abstract: Amaranth has been highlighted as an excellent alternative or complementary source of food protein due to its balanced amino acid composition. The culture of amaranth has been introduced into Brazil on account of its optimum nutritional (high protein content and better biological quality than that of cereal protein) and functional quality, apart from its agricultural characteristics and adaptability. Although amaranth has been well characterised chemically and present components related to different biochemical activities with physiological potential, little is known about its functional potential. The objective of the present work was to evaluate the inhibitory activity of the angiotensin converting enzyme (ACE) and the capacity to bind with the bile acids (BA) of defatted amaranth flour and its products. Whole flour was obtained by grinding the Amaranthus cruentus grain (BR Alegria variety), and treating with hexane to obtain the defatted flour (ADF), used to produce the amaranth protein concentrate (APC). To obtain the protein hydrolysates, APC, with and without prior heat treatment (90ºC/ 30 minutes), was hydrolysed using the enzyme Alcalase to a 12% degree of hydrolysis (DH). The flours and their derived products were characterised with respect to the electrophoretic and chromatographic compositions and profiles of their proteins. The in vitro digestibility of the proteins was also evaluated and the digested material used to determine the ACE inhibitory activity. The whole amaranth flour and its derivatives presented a composition similar to that found in the literature, and the prior heat treatment of the APC did not alter the activity pattern of the enzymes used, since the electrophoretic and chromatographic profiles (reverse phase and molecular exclusion) were shown to be similar. All the protein hydrolysates, before and after digestion, showed in vitro ACE inhibitory capacity. However, the digested APC, with or without prior heat treatment (DAPCnt and DAPCht, respectively) presented less ACE inhibitory activity (IC50 of 0,439 mg protein/mL and 0,475 mg protein/mL, respectively) than the Alcalase hydrolysates both before (APHnt and APHtt) and after in vitro digestion (DAPHnt and DAPHtt), which presented IC50 values of from 0,118 to 0,176 mg protein/mL. These results suggest that, in vivo, the ingestion of intact amaranth protein could present less ACE inhibitory activity than when ingesting protein previously hydrolysed with Alcalase. In vitro digestion did not change the ACE inhibitory activity of the hydrolysates, suggesting that the ACE inhibitory peptides liberated by the action of Alcalase were resistant to gastro-intestinal hydrolysis. The bile acid binding capacity of the amaranth products (ADF, APC, APHnt and the alkaline residue ¿ AR ¿ obtained from the extraction of APC) and of cholestyramine (used as the positive control), varied as a function of the bile acid studied (cholic, taurocholic, glycocholic and deoxycholic acids). The cholestyramine showed greater binding activity with all the BAs tested, differing from all the samples (p<0,05). The fibre-rich (8,6%) AR presented the least binding activity with all the BAs tested, as compared to the other products, with the exception of with glycocholic acid. The ADF presented intermediate binding activity with all the BAs, which was nevertheless similar to that of APC with glycocholic acid and of APHnt with taurocholic acid, which presented the highest activities. The ADF and APC presented binding capacity with the secondary bile acids toxic to the intestinal mucous membrane. From the results obtained, it was not possible to affirm if it was the proteins, fibres or even some other non-evaluated component, that was responsible for this activity. Having proven the ACE inhibitory and bile acid binding activities in vitro, it is important to also carry out in vivo studies, since the in vivo experiment is a more reliable method to evaluate the biological activity of the amaranth proteins and their other components / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-09-15T17:16:01Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Deborah Pereira Carvalho - 2016.pdf: 1291033 bytes, checksum: 11909a32b04cb17d98b30025fea8cce2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-09-16T12:17:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Deborah Pereira Carvalho - 2016.pdf: 1291033 bytes, checksum: 11909a32b04cb17d98b30025fea8cce2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T12:17:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Deborah Pereira Carvalho - 2016.pdf: 1291033 bytes, checksum: 11909a32b04cb17d98b30025fea8cce2 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-03-11 / Research with use of exogenous enzymes in feed for broiler, has shown its advantages in improving the digestibility and nutrient availability for birds, resulting in better performance. The objective of this study was to evaluate the effect of adding "on the top" the enzyme protease 0.05% (Cybenza DP 100) in diets for broilers containing animal meal. Two experiments were conducted divided into 4 treatments each experiment. In both experiments were using the same treatments, the treatments offered were: T1 - corn-based feed and soybean meal, T2 - corn-based feed and soybean meal with addition of protease, T3 - based feed corn and soybean meal with addition of meat, feathers and viscera, T4 - corn-based feed and soybean meal with addition of meat, feathers and viscera, with the addition of protease. The "experiment 1" was carried out with 320 chicks Cobb500 strain of 1 to 21 days. The experimental design was completely randomized, divided into batteries, with 4 treatments and 8 repetitions each containing 10 broiler per cage. The variables analyzed were: digestibility and performance variables. The "Experiment 2" was carried out with 720 chicks Cobb500 strain of 1 to 42 days. The experimental design was completely randomized, divided into box with 4 treatments and 6 repetitions each containing 30 broiler per box. The analyzed variables were: performance and Biometry of the gastrointestinal tract organs and the intestines and bowel. In all treatments the data were subjected to analysis of variance, and means were compared by Tukey test at 5% significance. In the " experiment 1 " it was observed that supplementation of the enzyme protease improved the feed conversion only in the pre- initial stage , but proved advantageous to use also in the initial phase , because even with the reduction in nutrient levels the results did not differ . In the " second experiment " it was observed that the use of animal meal for broilers from 1 to 21 days of age proved advantageous , since treatments with animal meal in their composition showed better weight gain and lower feed intake . The protease enzyme supplementation improved viability. / Pesquisas com a utilização de enzimas exógenas na alimentação de frangos de corte, tem evidenciado as suas vantagens em melhorar a digestibilidade e disponibilidade de nutrientes para os frangos, resultando em melhor desempenho. Objetivou-se com o presente trabalho avaliar o efeito da adição “on the top” da enzima protease 0,05% (Cybenza DP 100) em dietas para frangos de corte contendo farinhas de origem animal. Foram conduzidos dois experimentos divididos em 4 tratamentos cada experimento. Em ambos os experimentos foram utilizando os mesmos tratamentos, os tratamentos oferecidos foram: T1 - ração à base de milho e farelo de soja, T2 - ração à base de milho e farelo de soja, com adição de protease, T3 - ração à base de milho e farelo de soja com inclusão de farinha de carne, penas e vísceras, T4 - ração à base de milho e farelo de soja com inclusão de farinha de carne, penas e vísceras, com adição de protease. O “experimento 1” foi realizado com 320 pintos da linhagem Cobb500 de 1 a 21 dias. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, dividido em baterias, com 4 tratamentos e 8 repetições cada, contendo 10 frangos por gaiola. As variáveis analisadas foram: digestibilidade e variáveis de desempenho. O “experimento 2” foi realizado com 720 pintos da linhagem Cobb500 de 1 a 42 dias. O delineamento experimental adotado foi inteiramente casualizado, dividido em box, com 4 tratamentos e 6 repetições cada, contendo 30 frangos por box. As Variáveis analisadas foram: desempenho e Biometria de órgãos do trato gastrointestinal e do intestino e do intestino. Em todos os tratamentos os dados foram submetidos a análise de variância, e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. No “experimento 1” foi observado que a suplementação da enzima protease melhorou a conversão alimentar apenas na fase pré-inicial, porém se mostrou vantajoso a sua utilização também na fase inicial, pois mesmo com a redução dos níveis nutricionais os resultados não diferiram entre si. No “experimento 2” foi observado que a utilização da farinha de origem animal para frangos de corte de 1 a 21 dias de idade se mostrou vantajosa, uma vez que os tratamentos que receberam farinhas de origem animal em sua composição apresentaram um melhor ganho de peso e menor consumo de ração. A suplementação da enzima protease melhorou a viabilidade.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:13:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vanessa Lewandowski.pdf: 762023 bytes, checksum: 7429ef66529d330e89eb20c8a3620f23 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of the study was to evaluate the digestibility of oat, rice grits, and wheat middling nutrients by silver catfish (Rhamdia voulezi), with and without phytase supplementation. We used 288 fish distributed in 24 tanks of 500 L with tapered conical bottom. The experimental design was completely randomized represented by eight treatments and three replications. The treatments consisted of two reference diets (reference with and without phytase) and six test diets (oats with and without phytase, rice grits with and without phytase and wheat middling with and without phytase), factorial design, obtaining four diets without enzyme supplementation and four diets with supplementation. In the supplemented diets we added 1500 FTU kg-1 of phytase. We performed chemical, physical and mineral (phosphorus, calcium, magnesium, iron and cupper) analysis of the ingredients, diets and feces, as well as chromium oxide measurement of the diets and feces. The digestibility coefficients observed were submitted to factorial variance analysis (P>0,05). When a significant effect was observed, the Tukey s test was performed for mean comparisons. Oat presented the lowest digestibility coefficients for dry matter and energy compared to the other feeds supplemented or not with phytase. Phytase supplementation increased the digestibility coefficient of dry matter for rice grits, and of energy both for this feed and for wheat middling. As for the use of minerals we verified that wheat middling presented the highest digestibility coefficients related to feed without phytase as much as for feed supplemented with the enzyme. The supplementation of phytase in quantity of 1500 FTU kg-1 in the diet improves the nutrients digestibility coefficients mainly for oat and rice grits. Taking into account the feeds with or without supplementation of 1500 FTU kg-1 in the diet, rice grits and wheat middling presented the highest values of its nutrients use and can be used more efficiently for silver catfish (R. voulezi) feeding. / O objetivo do estudo foi avaliar a digestibilidade de nutrientes da aveia, quirera de arroz e do triguilho pelo jundiá (Rhamdia voulezi), com e sem suplementação de fitase. Foram utilizados 288 peixes distribuídos em 24 tanques de 500 L com fundo cônico afunilado. O delineamento experimental foi inteiramente casualisado, representado por oito tratamento e três repetições. Os tratamentos consistiram na elaboração de duas dietas referências (referência com e sem fitase), e seis dietas testes (aveia com e sem fitase, quirera de arroz com e sem fitase e triguilho com e sem fitase), em esquema fatorial, obtendo-se quatro dietas sem suplementação da enzima e quatro dietas com suplementação. Nas dietas suplementadas, foi utilizado 1500 FTU Kg-1 de fitase. Foram realizadas análises físico-químicas e de minerais (fósforo, cálcio, magnésio, ferro e cobre) dos ingredientes, dietas e fezes e realizou-se leitura de óxido de crômio das dietas e das fezes. Os coeficientes de digestibilidade observados foram submetidos à análise de variância fatorial (P>0,05). Ao constar efeito significativo foi realizado o teste de Tukey para comparação de médias. A aveia apresentou os menores coeficientes de digestibilidade para a matéria seca e energia em relação aos demais alimentos suplementados ou não com fitase. A suplementação de fitase aumentou o coeficiente de digestibilidade da matéria seca para a quirera de arroz e da energia tanto para esse alimento como para o triguilho. A suplementação enzimática apresentou maior influência na disponibilidade dos minerais para a aveia, entretanto, o triguilho apresentou os maiores coeficientes de digestibilidade dos mesmos, tanto em relação aos alimentos sem fitase como aos alimentos suplementados com a enzima. A quantidade de 1500 FTU Kg-1 na dieta melhora os coeficientes de digestibilidade dos nutrientes principalmente para a aveia e quirera de arroz. Levando em consideração os alimentos suplementados ou não com 1500 FTU Kg-1 na dieta, a quirera de arroz e o triguilho apresentam valores maiores de aproveitamento de seus nutrientes podendo ser utilizados de forma mais eficiente na alimentação do jundiá (R. voulezi).

A imobilização de moléculas de interesse biológico em superfícies sólidas é essencial para uma série de aplicações biotecnológicas. Dentre as técnicas de imobilização, a automontagem camada por camada por adsorção física possui inúmeras vantagens, incluindo condições brandas e fisiológicas de preparação, capacidade de incorporar diferentes biomoléculas, e controle molecular. Nesta tese foram explorados filmes nanoestruturados de materiais de interesse biológico, bem como modelos de membranas, em que foram empregadas a técnica de automontagem e a preparação de lipossomos. Os lipossomos, que serviram como modelos de membrana, foram imobilizados em filmes automontados e sua integridade estrutural foi mantida. Também foram utilizados para incorporar e estabilizar melanina, e então imobilizados em filmes automontados, com preservação da propriedade fluorescente da melanina. A automontagem também foi utilizada para imobilização das enzimas uricase, fitase e colesterol oxidase, alternadas com camadas de polieletrólitos. Estes filmes mostraram bom desempenho como biossensores amperométricos para uricase e fitase, e como biossensores usando espectroscopia de impedância para a fitase e colesterol oxidase. Tais biossensores foram usados para detectar baixas quantidades de ácido úrico, ácido fítico e colesterol, respectivamente. Não houve efeitos de interferentes nos sensores amperométricos devido à utilização de eletrodos previamente modificados com azul da Prússia, que funcionou como mediador redox. A alta sensibilidade e seletividade dos biossensores foram atribuídas à natureza do filme ultrafino e à capacidade de reconhecimento das biomoléculas, respectivamente. Esta abordagem abre caminho para novas tecnologias de dispositivos para diagnósticos clínicos e análises de alimentos, bem como para entender mecanismos de interação da biomolécula com a membrana celular para o desenvolvimento de agentes terapêuticos. / The immobilization of molecules of biological interest on solid surfaces is essential for a number of biotechnological applications. Among the techniques for immobilization the layer-by-layer (LbL) method based on physical adsorption exhibits several advantages, including mild, physiological conditions for film preparation, ability to incorporate different biomolecules and molecular control. In this thesis, nanostructured films made with materials of biological interest were exploited as model membranes, where use was made of the LbL technique and liposomes. The latter, which served as membrane models, were immobilized in LbL films and had their structural integrity preserved. Liposomes were also used to incorporate and stabilize melanin, which were then deposited on LbL films with the fluorescence of melanin being preserved. The LbL method was also used to immobilize the enzymes uricase, phytase and cholesterol oxidase, alternated with layers of polyelectrolytes. These LbL films were employed in amperometric biosensors with uricase and phytase, and in biosensors based on impedance spectroscopy for phytase and cholesterol oxidase. Low amounts of uric acid, phytic acid and cholesterol were detected, respectively. There was no effect from interferents in the amperometric biosensors because the electrodes were previously modified with a layer of Prussian Blue, which acted as a redox mediator. The high sensitivity and selectivity were attributed to the ultrathin nature of the films and the ability of molecular recognition of the biomolecules, respectively. The approaches used here open the way for novel devices for clinical diagnostics and food quality control, in addition to understanding the interaction mechanisms between the biomolecules and the cell membranes, which is important for developing therapeutic agents.