A metilação do DNA em mamíferos é uma importante modificação epigenética, sendo essencial no silenciamento de DNAs repetitivos, de regiões que sofrem imprinting genômico e no estabelecimento do cromossomo X inativo em fêmeas. Existem 5 tipos de DNA Metiltransferases, tendo a DNMT3B um importante papel na metilação de novo. A MeCP2, por sua vez, é uma proteína capaz de reconhecer sítios de DNA metilados e recrutar proteínas responsáveis pela desacetilação das histonas. Isto provoca alterações na conformação da cromatina, impedindo a transcrição gênica. Alterações nos padrões de expressão de DNMT3B e na metilação do DNA encontradas em diferentes tipos de tumores, e a temporalidade de expressão de Dnmt3b e de Mecp2 durante ondas de desmetilação e de metilação que ocorrem no início do desenvolvimento embrionário, podem auxiliar na identificação de fatores envolvidos no estabelecimento e manutenção do padrão de metilação do DNA, os quais ainda são pouco conhecidos. Por sua vez, uma nova classe de pequenos RNAs, os microRNAs, envolvidos com a regulação da expressão gênica pós-transcricional, têm grande importância na manutenção do estado diferenciado de diferentes tipos celulares. Trabalhos recentes demonstram também que há alterações nos padrões de expressão de microRNAs entre tecidos normais e tumorais. Assim, é objetivo deste trabalho a identificação de possíveis miRNAs envolvidos na modulação da expressão dos genes DNMT3B/Dnmt3b e MeCP2/Mecp2 em diferentes linhagens de células normais e tumorais, bem como, em células tronco embrionárias humanas e murinas submetidas à diferenciação. / DNA methylation in mammals is an important epigenetic modification, playing an essential role in the silencing of repetitive DNA, in genomic imprinting and, in females, the establishment of X chromosome inactivation. There are 5 DNA metyhltransferases, and one of them, DNMT3B has an important role in de novo methylation. MeCP2, by its turn, is a protein capable of recognizing methylated DNA sites and of recruiting proteins responsible for histones deacetylation. This causes alterations in chromatin conformation, therefore inhibiting gene transcription. Changes in the expression patterns of DNMT3B and in DNA methylation are found in several types of tumors, and temporal expression of Dnmt3b and Mecp2 during global demetyhlation and de novo methylation waves, which occur in early embryonic development, could give a better understanding of the factors involved in the establishment and maintenance of DNA methylation patterns, which are still largely unkown. Additionally, a new class of small RNAs, the microRNAs, involved in the post-transcriptional gene silencing, has great importance in maintaining the differentiated state of several cell types. Recent studies have demonstrated alterations in miRNAs expression patterns between normal and tumor tissues. Thus, the aim of this work was to identify possible miRNAs involved in the modulation of Dnmt3b and Mecp2 RNAs in different normal and tumoral cell lines, as well as in human and murine embryonic stem cells and their respectively differentiated embryoid bodies.

O gene supressor tumoral RASSF1A tem sido associado com redução da proliferação celular em diversos tumores. Sua expressão é regulada por eventos epigenéticos que envolvem o complexo repressivo polycomb (PRC2), no entanto os mecanismos moleculares da modulação do recrutamento deste modificador epigenético para este locus ainda são desconhecidos. Neste trabalho identificamos e caracterizamos ANRASSF1, um RNA não codificador longo (lncRNA) intrônico unspliced, que é transcrito na fita oposta do gene RASSF1A, em várias linhagem celulares e tecidos, e se liga a PRC2. ANRASSF1 é transcrito pela RNAPII, possui cap-5´ e cauda poli-A, além de localizar-se no núcleo e possuir uma meia-vida em média quatro vezes menor comparada com outros lncRNAs ligados à PRC2. A super-expressão ectópica de ANRASSF1 reduziu os níveis de RASSF1A e aumentou a taxa de proliferação em células HeLa, enquanto seu silenciamento provocou efeito oposto. Essas mudanças nos níveis de ANRASSF1 não afetaram a abundância da isoforma RASSF1C em nenhuma das condições. A super-expressão de ANRASSF1 provocou um grande aumento tanto da ocupação de PRC2 como da marca de histona repressiva H3K27me3 especificamente na região promotora RASSF1A. Nenhum efeito da super-expressão de ANRASSF1 foi detectado na ocupação de PRC2 e na histona H3K27me3 nas regiões promotoras de RASSF1C e de outros quatro genes vizinhos, incluindo dois genes supressores tumorais bem caracterizados. Além disso, foi demonstrado que ANRASSF1 forma um híbrido de RNA/DNA e recruta SUZ12, um componente do PRC2, para o promotor de RASSF1A. Notavelmente, foi detectado pelo ensaio de RNase-ChIP que a degradação de ANRASSF1 diminui a ocupação de PRC2 neste promotor. Esses resultados demonstram um novo mecanismo de repressão epigenética do supressor tumoral RASSF1A, envolvendo um lncRNA unspliced antissenso, onde ANRASSF1 reprime seletivamente a expressão da isoforma de RASSF1 que sobrepõe o transcrito antissenso de modo local e específico. Considerando uma perspectiva mais ampla, nossos resultados sugerem que outros lncRNAs intrônicos unspliced não caracterizados no genoma humano podem contribuir para uma modulação epigenética local e específica de cada região em que os lncRNAs são transcritos. / Tumor-suppressor RASSF1A gene down-regulation has been implicated in increasing cell proliferation in several tumors. Its expression is regulated by epigenetic events involving polycomb repressive complex 2 (PRC2), however the molecular mechanisms modulating recruitment of this epigenetic modifier to the locus remain largely unknown. Here, we identify and characterize ANRASSF1, an endogenous unspliced long noncoding RNA (lncRNA) that is transcribed from the opposite strand of RASSF1 gene in several cell lines and tissues, and binds to PRC2. ANRASSF1 is transcribed by RNA Polymerase II, 5\'-capped, polyadenylated, displays nuclear localization, and has on average a four-fold shorter half-life compared to other lncRNAs that bind PRC2. ANRASSF1 ectopic overexpression decreases RASSF1A abundance and increases the proliferation rate of HeLa cells, whereas its silencing causes opposite effects. These changes in NRASSF1 levels do not affect RASSF1C isoform abundance. ANRASSF1 overexpression causes a marked increase both in PRC2 occupancy and in histone H3K27me3 repressive mark specifically at the RASSF1A promoter region. No effect of ANRASSF1 overexpression is detected on PRC2 occupancy and on histone H3K27me3 at the promoter regions of RASSF1C and of four other neighbor genes, including two well-characterized tumor suppressor genes. Additionally, we demonstrate that ANRASSF1 forms an RNA/DNA hybrid, and recruits SUZ12, a PRC2 component, to the RASSF1A promoter. Notably, depletion of ANRASSF1 disrupts SUZ12 occupancy on RASSF1A promoter as measured by RNAse-ChIP assay. Together, these results show a new mechanism of epigenetic repression of RASSF1A tumor suppressor gene involving an antisense unspliced lncRNA, in which ANRASSF1 selectively represses expression of the RASSF1 isoform overlapping the antisense transcript in a location-specific manner. In a broader perspective, our findings suggest that other non-characterized unspliced intronic lncRNAs transcribed in the human genome may contribute to a location-specific epigenetic modulation of genes.

Tesis por compendio / [ES] Los viroides son los patógenos con replicación autónoma más simples y sólo se han encontrado de forma natural infectando plantas superiores. Desde que se descubrieron en los años setenta, se ha adquirido un conocimiento considerable sobre su naturaleza y mecanismos de replicación en las plantas huésped. Sin embargo, aún quedan por descubrir muchos aspectos de la biología de los viroides. Por lo tanto, un conocimiento más profundo de la naturaleza y el modo de acción de los viroides han sido los objetivos principales que engloban esta tesis. Para ello, es esencial contar con procedimientos sencillos y eficientes para la obtención de clones de ADNc infecciosos. Se desarrolló un nuevo método eficiente para construir clones de viroides infecciosos y se probó con un viroide de cada familia: El viroide latente de la berenjena (ELVd, Avsunviroidae) y el viroide del lúpulo (HSVd, Pospiviroidae). Esta aproximación se basó en enzimas de restricción de tipo IIS que cortan fuera del sitio de reconocimiento y supone un procedimiento universal para obtener clones infecciosos de un viroide independientemente de su secuencia, con una alta eficiencia. A pesar de que los viroides han sido considerados como ARN no codificantes desde su descubrimiento, nuestro análisis computacional predijo pequeños marcos de lectura abiertos en cada uno de los genomas de HSVd y ELVd. No se encontraron similitudes significativas con las proteínas de la base de datos de plantas superiores, pero algunos de estos péptidos predichos estaban altamente conservados entre todas las variantes de HSVd y ELVd. Curiosamente, la fusión de estas secuencias conservadas con una proteína fluorescente reveló una localización subcelular específica en el correspondiente orgánulo donde tiene lugar la replicación/acumulación para cada viroide: nucleolo y cloroplasto para HSVd y ELVd, respectivamente. Las mutaciones que truncan el dominio nucleolar de HSVd fueron perjudiciales para el viroide, mientras que el truncamiento de cualquiera de los dos ORF de ELVd que contiene una señal de localización al cloroplasto también disminuyó (pero en menor medida) la eficiencia biológica del viroide, tal vez debido a la redundancia funcional. Se encontraron formas circulares de los ARN de HSVd y ELVd en fracciones polisómicas, lo que revela su interacción física con la maquinaria de traducción de la célula vegetal. En conjunto, estas observaciones experimentales indican que no se puede descartar la capacidad de codificación de los viroides, aunque la prueba definitiva (la detección de los péptidos codificados por los circRNAs) es un reto tecnológico que deberá abordarse en futuras líneas de investigación. Finalmente, para estudiar qué cambios se producen en el huésped durante la infección con un viroide sintomático, se realizó un análisis integrador de las alteraciones genómicas de plantas de pepino infectadas con HSVd. Se integraron los transcriptomas, el sRNAnomas y el metilomas para determinar la respuesta temporal a la infección por el viroide. Nuestros resultados apoyan que el HSVd promueve el rediseño de las vías reguladoras del pepino afectando predominantemente a capas reguladoras específicas en diferentes fases de la infección. La respuesta inicial se caracterizó por una reconfiguración del transcriptoma del hospedador mediante el uso diferencial de exones, seguido de una predominante regulación a la baja de la actividad transcripcional modulada por los cambios epigenéticos del hospedador asociados a la infección y caracterizada por un aumento de la hipermetilación. Las alteraciones en el metabolismo de los ARN pequeños y microARNs del huésped fueron marginales y se produjeron principalmente en la fase tardía. En general, estos datos constituyen el primer mapa exhaustivo de las respuestas de la planta a la infección de un viroide. / [CA] Els viroids són els patògenes més simples amb replicació autònoma i només s'han identificat de forma natural infectant a plantes superiors. Des que es descobriren als anys setanta, s'ha adquirit un coneixement considerable sobre la seua natura i els mecanismes de replicació en plantes hoste. No obstant, encara queden per descobrir molts aspectes de la biologia dels viroids. Per tant, un coneixement més profund de la natura i el mode d'acció dels viroids han sigut els objectius principals que engloben aquesta tesi. Per a això, és essencial la disponibilitat de procediments senzills i eficients per a l'obtenció de clones infecciosos. Es va desenvolupar un nou mètode eficient per a construir clones infecciosos y es fa provar amb un viroid de cada família: el viroide latent de la albergínia (ELVd, Avsunviroidae) y el viroid del llúpol (HSVd, Pospiviroidae). Aquesta aproximació es basà en enzims de restricció de tipus IIS que tallen fora del lloc de reconeixement i suposa un procediment universal per obtenir clones infecciosos de un viroid independentment de la seua seqüencia amb una elevada eficiència. Tot i que els viroids s'han considerat com ARNs no codificants des del seu descobriment, el nostre anàlisi computacional va predir xicotets ORF als genomes de HSVd y ELVd. No es trobaren similituds significatives amb proteïnes depositades a les bases de dades, però alguns d'aquest pèptids estaven altament conservats a les variants de HSVd y ELVd. Curiosament, la fusió d'aquestes seqüencies conservades amb una proteïna fluorescent revelà una localització subcel·lular especifica al orgànul on te lloc la replicació/acumulació de cada viroid: nuclèol i cloroplast per a HSVd i ELVd, respectivament. Les mutacions que trunquen el domini nucleolar de HSVd foren perjudicials per al viroid, mentre que el truncament de qualsevol de les dos ORF de ELVd que contenen una senyal de localització al cloroplast també va disminuir (però en menor mesura) l'eficiència biològica del viroid, el que pot ser degut a una redundància funcional. Es detectaren formes d'ARN circular de HSVd i ELVd a les fraccions polisòmiques, el que revela la seua interacció física amb la maquinaria de traducció cel·lular. En conjunt, aquestes observacions experimentals indiquen que no es pot descartar la capacitat codificants dels viroids, encara que la evidencia definitiva (la detecció del pèptids codificats per ARN circulars) es un repte tecnològic que s'haurà d'adreçar en línies d'investigació futures. Finalment, per tal d'estudiar que canvis es produeixen a l'hoste durant la infecció amb un viroid simptomàtic, es va realitzar un anàlisi integrador de les alteracions genòmiques de les plantes de cogombre infectades amb HSVd. S'integraren els transcriptomes, sARNomes i metilomes per determinar la resposta temporal a la infecció per viroid. Els resultats obtinguts suporten que HSVd promou un redisseny de les vies reguladores de cogombre afectant predominantment a nivells reguladors específics a les diferents etapes de la infecció. La resposta inicial es caracteritzà per una reconfiguració del transcriptoma de l'hoste mitjançant l'ús diferencial d'exons, seguit d'una repressió transcripticional modulada per canvis epigenètics de l'hoste caracteritzats per una major hipermetilació. Les alteracions al metabolisme de ARN xicotets i microARNs de l'hoste van ser marginals i es produïren principalment al final de la infecció. En general, aquestes dades constitueixen el primer mapa exhaustiu de les respostes de la planta a la infecció per un viroid. / [EN] Viroids are the simplest pathogens with autonomous replication and have only been found naturally infecting higher plants. Since viroids were discovered in the seventies, we have gained considerable knowledge about their nature and replication mechanisms in host plants. However, many aspects of viroid biology are yet to be discovered. Therefore, a deeper understanding of the nature and mode of action of viroids have been the encompassing main goals of this thesis. For this purpose, simple and efficient procedures for obtaining infectious cDNA clones are essential. A new efficient method for constructing infectious viroid clones was developed and tested with one viroid of each family: eggplant latent viroid (ELVd, Avsunviroidae) and hop stunt viroid (HSVd, Pospiviroidae). This procedure was based on type IIS restrictions enzymes that cut outside of the recognition site and supposes a universal procedure for obtaining infectious clones of a viroid independently of its sequence, with a high efficiency. Despite viroids have been considered as plant-pathogenic non-coding RNAs since their discovery, our computational analysis predicted small open reading frames in each of the HSVd and ELVd genomes. No significant similarities with proteins in the database of higher plants were found, but some of these predicted peptides were highly conserved among all HSVd and ELVd variants. Interestingly, the fusion of these conserved sequences to a fluorescent protein revealed a specific subcellular localization in the corresponding organelle where replication/accumulation takes place for each viroid: nucleolus and chloroplast for HSVd and ELVd, respectively. Mutations that truncate the nucleolar domain of HSVd were detrimental for the viroid while truncating any of the two ELVd ORF that contains a chloroplast transit signal also diminished (but to a lesser extent) viroid biological efficiency, maybe because of functional redundancy. Circular forms of both, HSVd and ELVd RNAs were found in polysome fractions, revealing their physical interaction with the translational machinery of the plant cell. Altogether, these experimental observations indicate that the coding capacity of viroids cannot be ruled out, although the definitive evidence (detection of the circRNA-encoded peptides) is a technological challenge to be addressed in future research lines. Finally, to study the host changes that are produced during a symptomatic viroid infection, an integrative analysis of the timing and intensity of the genome-wide alterations in cucumber plants infected with HSVd was performed. Differential host transcriptome, sRNAnome and methylome were integrated to determine the temporal response to viroid-infection. Our results support that HSVd promotes the redesign of the cucumber regulatory-pathways predominantly affecting specific regulatory layers at different infection-phases. The initial response was characterized by a reconfiguration of the host-transcriptome by differential exon usage, followed by a predominant down-regulation of the transcriptional activity modulated by the host epigenetic changes associated to infection and characterized by increased hypermethylation. The alterations in host sRNA and microRNA metabolism were marginal and mainly occurred at the late stage. Overall, these data constitute the first comprehensive map of the plant responses to a viroid infection. / La Conselleria d’Educació, Investigació, Cultura i Esports (Generalitat Valenciana) y el Fondo Social Europeo (FSECV 2014-2020) han cofinanciado la contratación del doctorando como personal investigador de carácter predoctoral (ACIF/2017/114) y unas estancias predoctorales fuera de la Comunitat Valenciana (BEFPI/2020). La realización de esta tesis doctoral también se ha realizado en el marco de dos proyectos de investigación del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, con cofinanciación de fondos FEDER [BIO2017-88321-R y AGL2016-79825-R] . / Márquez Molins, J. (2022). Novel Insights of Viroid Biology and Host Responses to Their Infection [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183479 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales / Compendio

Tesis por compendio / [ES] La acuicultura se proyecta como un medio vital para alimentar de manera sostenible a la creciente población mundial. Sin embargo, para lograrlo, la producción de peces debe abordarse con sostenibilidad y adaptabilidad en mente, especialmente frente a desafíos como el cambio climático y la disminución de recursos. Esto requiere innovaciones en genética y nutrición para garantizar la resiliencia de las poblaciones de peces cultivados. Comprender las interacciones entre organismos, microbiota y el medio ambiente es crucial, y las tecnologías ómicas ofrecen una manera de profundizar en estas dinámicas. Se ha secuenciado el genoma del dorado, una especie significativa de acuicultura europea, lo que ha llevado a conocer la expansión génica y la plasticidad fenotípica. Esta tesis tuvo como objetivo aprovechar este conocimiento integrando diversas aproximaciones ómicas para anotar el genoma y la microbiota intestinal de esta importante especie mediterránea. El enfoque se centró en acciones para hacer más sostenibles las prácticas futuras de acuicultura. Un aspecto crítico abordado fue la gestión de los niveles de oxígeno, dada su disminución debido al cambio climático. Comprender las respuestas de los peces al oxígeno reducido es vital para la acuicultura sostenible. La investigación sobre el dorado reveló adaptaciones a la hipoxia leve, incluida una disminución general de la respuesta metabólica y variaciones a nivel de expresión génica. La selección genética y los avances en piensos acuícolas también son esenciales para la acuicultura sostenible. La tesis monitoreó la evolución de los peces y la dieta junto con un programa de cría para el crecimiento, revelando respuestas diferenciales en peces alimentados con recursos marinos reducidos. La selección genética por un crecimiento rápido es capaz de influir en la composición y la actividad de la microbiota intestinal. La caracterización de esta comunidad también reveló su importancia en la salud y el crecimiento de los peces. Los factores genéticos parecían jugar un papel más importante que la dieta en la formación de la composición de la microbiota intestinal, pero las interacciones entre genética y dieta influenciaron tanto las respuestas del huésped como las microbianas. En resumen, la tesis presenta resultados prometedores para mejorar el crecimiento, la salud y la adaptación ambiental en especies de acuicultura, contribuyendo también a la sostenibilidad del sector acuícola. / [CA] L'aqüicultura es projecta com un mitjà vital per a alimentar de manera sostenible la creixent població mundial. No obstant això, per a aconseguir-ho, la producció de peixos ha d'abordar-se amb sostenibilitat i adaptabilitat en ment, especialment front a desafiaments com el canvi climàtic i la disminució de recursos. Això requereix innovacions en genètica i nutrició per a garantir la resiliència de les poblacions de peixos cultivats. Comprendre les interaccions entre organismes, microbiota i el medi ambient és crucial, i les tecnologies òmiques oferixen una manera de profunditzar en aquestes dinàmiques. S'ha sequenciat el genoma de l'orada, una espècie significativa d'aqüicultura europea, la qual cosa ha portat a conèixer l'expansió gènica i la plasticitat fenotípica de l'espècie. Aquesta tesi té com a objectiu aprofitar aquest coneixement integrant diverses aproximacions òmiques per a anotar el genoma i la microbiota intestinal d'aquesta important espècie mediterrània. L'enfocament es va centrar en accions per a fer més sostenibles les pràctiques futures d'aqüicultura. Un aspecte crític abordat va ser la gestió dels nivells d'oxigen, donada la seua disminució a causa del canvi climàtic. Comprendre les respostes dels peixos a l'oxigen reduït és vital per a l'aqüicultura sostenible. La investigació va revelar adaptacions a la hipòxia lleu, inclosa una disminució general de la resposta metabòlica i variacions a nivell d'expressió gènica. La selecció genètica i els avanços en pinso per a l'aqüicultura també són essencials per a la sostenibilitat del sector. La tesi va monitorar l'evolució dels peixos i la dieta juntament amb un programa de sel·lecció genètica per creixement, revelant respostes diferencials en peixos alimentats amb recursos marins reduïts. La selecció genètica per a un creixement ràpid és capaç d'influir en la composició i l'activitat de la microbiota intestinal. La caracterització d'aquesta comunitat també va revelar la seua importància en la salut i el creixement dels peixos. Els factors genètics semblaven jugar un paper més important que la dieta en la formació de la composició de la microbiota intestinal, però les interaccions entre genètica i dieta van influir tant en les respostes de l'organisme com en les microbianes. En resum, la tesi presenta resultats prometedors per a millorar el creixement, la salut i l'adaptació ambiental en espècies d'aqüicultura, contribuint també a la sostenibilitat del sector aqüícola. / [EN] Aquaculture is projected as a vital means to feed the growing global population sustainably. However, to achieve this, fish production must be approached with sustainability and adaptability in mind, especially in the face of challenges like climate change and resource depletion. This requires innovations in genetics and nutrition to ensure the resilience of farmed fish populations. Understanding the interactions between organisms, microbiota, and the environment is crucial, and omics technologies offer a way to delve deeper into these dynamics. The genome of the gilthead sea bream, a significant European aquaculture species, has been sequenced, leading to insights into gene expansion and phenotypic plasticity. This thesis aimed to leverage this knowledge by integrating various omics approaches to annotate the genome and gut microbiome of this important Mediterranean species. The focus was on actions to conserve and "green" future aquaculture practices. One critical aspect addressed was the management of oxygen levels, given their declining availability due to climate change. Understanding fish responses to reduced oxygen is vital for sustainable aquaculture. Research on gilthead sea bream revealed adaptations to mild hypoxia, including a hypo-metabolic general response and changes in metabolic processes and gene expression profiling. Selective breeding and advancements in aquafeeds are also essential for sustainable aquaculture. The thesis monitored fish and diet evolution alongside a breeding program for growth, revealing differential responses in fish fed with reduced marine resources. Genetic selection for fast growth influenced the gut microbiota, highlighting the interconnectedness of genetics, diet, and microbial communities. Characterization of the gut microbiota revealed its importance in fish health and growth. Genetic factors appeared to play a more significant role than diet in shaping the gut microbiota composition, but interactions between genetics and diet influenced both host and microbial responses. Overall, the thesis presents promising outcomes for enhancing growth, health, and environmental adaptation in aquaculture species. By understanding the interconnectedness of genetics, nutrition, and microbiota, it aims to contribute to the sustainability of the aquaculture sector. / This PhD thesis has been elaborated by the PhD candidate thanks to two research contracts appointed to the framework of two H2020 European projects: AQUAEXCEL2020 “AQUAculture infrastructures for EXCELlence in European fish research towards 2020” (2015-2020; grant agreement nº 652831), and AquaIMPACT “Genomic and nutritional innovations for genetically superior farmed fish to improve efficiency in European aquaculture” (2019-2023; grant agreement nº 818367). During the thesis, the candidate completed a 3-months (91 days) stay in the Centre for Integrative Genetics (CIGENE), belonging to the Norwegian University of Life Sciences (NMBU) in Ås, Norway. This stay was financed by an EMBO Scientific Exchange Grant (grant agreement nº 10168). A grant from the iMOVE program from CSIC (grant agreement nº IMOVE23080) was also awarded, but not financially executed. Core publications of this thesis were funded by: AQUAEXCEL2020 H2020 EU Project (652831); PerformFISH H2020 EU Project (H2020-SFS-2016-2017; 727610); AquaIMPACT H2020 EU Project (818367); ThinkInAzul (THINKINAZUL/2021/024, PRTR-C17.I1); Bream-AquaINTECH (RTI2018–094128-B-I00); The rest of publications in which the candidate was involved received extra funding from: GAIN H2020 EU Project (773330) y AQUAEXCEL3.0 H2020 EU Project (871108) / Naya Català, F. (2024). The Two Genomes of Gilthead Sea Bream (Sparus aurata): a Multi-Omics and Holobiont Approach [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/205692 / Compendio

Recentes estudos genômicos têm mostrado que vários fungos e bactérias possuem um potencial biossintético superior à quantidade de me tabólitos secundários já isolados desses micro-organismos. A descoberta de produtos naturais inéditos e bioativos é limitada pela impossibilidade dos micro-organismos expressarem to das as suas rotas biossintéticas em laboratório. Assim, estratégias alternativas para i nduzir a produção de produtos naturais microbianos são necessárias. A utilização de cultur as mistas de micro-organismos é uma estratégia que vem sendo recentemente utilizada, na tentativa de mimetizar condições mais naturais de crescimento. Além disso, a adição de mo duladores químicos e epigenéticos às culturas microbianas também pode potencialmente est imular a produção de compostos de interesse, seja por ativar mecanismos celulares em resposta à condição de estresse, ou por alterar a taxa de transcrição de certos genes, em f unção de mudanças no grau de enovelamento da cromatina. Alternativamente, a indu ção de certos genes, e até mesmo a diversificação do metabolismo secundário, podem ser conseguidos através de engenharia genética, pela manipulação direta de genes de inter esse. A linhagem endofítica Alternaria tenuissima SS77, selecionada para os experimentos de modulaçã o química e epigenética, teve seu metabolismo secundário alterado após o tra tamento com diferentes moduladores. Provavelmente, o efeito observado ocorreu em função de uma eliciação inespecífica dos diferentes moduladores. Além disso, o cultivo misto desse fungo com o fungo endofítico Nigrospora sphaerica SS67 , isolada da mesma planta hospedeira ( Smallanthus sonchifolius ), levou ao isolamento de dois novos policetídeos, da classe das perilenequinonas, juntamente com um já relatado na literatura científica. Para r ealizar os cultivos microbianos mistos, envolvendo uma linhagem bacteriana e uma fúngica, t rês linhagens de actinobactérias e cinco de fungos, todos endofíticos da planta Lychnophora ericoides , foram selecionadas. Alterações no perfil metabólico da cultura mista de Phomopsis sp FLe6 com Streptomyces albospinus RLe7 foram as mais evidentes e por isso a maioria das investigações foram focadas nessa cultura mista. Várias condições de cu ltivo foram testadas e diferentes resultados foram obtidos. Em alguns casos, o desenv olvimento da linhagem fúngica foi inibido pela bacteriana, e em outros, foi observado o inverso. Da mesma forma, houve acentuada inibição da produção de alguns metabólito s secundários na presença da linhagem desafiadora, mas também foi verificada a eliciação de outros. Os extratos das culturas simples desses micro-organismos também apresentaram relativas alterações nos perfis metabólicos em função das condições de cultivo. Os metabólitos produzidos pelo fungo Phomopsis sp FLe6 e pela actinobactéria Streptomyces albospinus RLe7 foram isolados e caracterizados. Os resultados mostram que as intera ções entre os micro-organismos endofíticos são bastante complexas, estando sujeita s a ação de diversos fatores externos que muitas vezes não podem ser pré-determinados. Po r isso, estabelecer um cultivo misto adequado, do ponto de vista da eliciação da produçã o de metabólitos secundários, pode requerer uma série de tentativas. Ainda assim, os r esultados almejados podem ser conseguidos utilizando essa estratégia. Diferenteme nte das linhagens endofíticas, manipuladas quimicamente através de diferentes estr atégias, a linhagem sequenciada de Fusarium heterosporum ATCC 74349, foi manipulada geneticamente para a co nstrução de um gene biossintético híbrido pks-nrps , contendo a porção nrps do gene híbrido da equisetina e um pks críptico de Aspergillus fumigatus . Era esperado que a linhagem hibridizada fosse capaz de produzir o metabólito se cundário geneticamente planejado, entretanto, após seu cultivo, esse produto não foi detectado nos extratos, e as possíveis razões são discutidas. Ainda que os resultados espe rados não tenham sido obtidos, estudos que contribuam para a ampliação do entendimento das megassintases fúngicas são de extrema valia. / Recently, genetic studies have shown that several b acteria and fungi hold a greater biosynthetic potential than the amount of secondary metabolites isolated from these microorganisms. The discovery of novel bioactive na tural products is limited by the inability of microorganisms to express all their biosynthetic pa thways in laboratory conditions. Therefore, alternative strategies to induce the production of microbial natural products are required. Mixed cultures of microorganisms are a strategy tha t has been used to mimic more natural conditions of growth. Furthermore, the addition of chemical and epigenetic modulators to the microbial cultures can also stimulate the productio n of compounds by activating cellular mechanisms in response to stress conditions or by c hanging the transcription rate of certain genes, due to changes in the chromatin folding. Alt ernatively, the induction of some genes, and even the diversification of secondary metabolis m, can be achieved by genetic engineering, by manipulating genes of interest. The endophytic strain Alternaria tenuissima SS77, which was selected for the experiments of che mical and epigenetic modulation, had changed its secondary metabolism after treatment wi th different modulators. Probably, the observed effect was due to a nonspecific elicitatio n of those modulators. Moreover, the mixed cultures of this fungus with the endophytic fungus Nigrospora sphaerica SS67, isolated from the same host plant ( Smallanthus sonchifolius ), led to the isolation of two new polyketides, belonging to perylene quinone class, along with ano ther one already reported in the scientific literature. Three strains of actinobacteria and fiv e fungi, all endophytes of Lychnophora ericoides , were selected to grow in microbial mixed cultures comprising one bacteria and one fungus. Changes in the metabolic profile of the mix ed culture of Phomopsis sp. FLe6 with Streptomyces albospinus RLe7 were the most obvious, and then further studi es were focused on this mixed culture. Many culture conditions were analyzed and different results were obtained. In some cases, the development of the fun gal strain was inhibited by bacteria, and in other cases was observed the opposite. Similarly , there was a remarkable inhibition of the production of certain secondary metabolites in the presence of the challenging strain, but the eliciting of others was also observed. The extracts of the single cultures of these microorganisms also showed changes in metabolic pro files due to culture conditions. The metabolites produced by the fungus Phomopsis sp. FLe6 and the actinobacteria S. albospinus RLe7 were isolated and characterized. The results show that interactions between endophytic microorganisms are quite complex and are influenced by various external factors that often can not be previously determined. Theref ore, establishing a suitable mixed culture to elicit the production of secondary metabolites m ay require some attempts. Still, the expected results can be achieved using this strateg y. Unlike the endophytic strains, that was chemically manipulated by different strategies, the sequenced strain Fusarium heterosporum ATCC 74349 was genetically manipulated to construct a hybrid PKS-NRPS biosynthetic gene containing the NRPS portion of the hybrid gene of e quisetin and a cryptic PKS gene of Aspergillus fumigatus . It was expected that hybridized strain could be a ble to produce the secondary metabolite genetically planned, however, after its cultivation, this product was not detected in any extracts, and some possible reasons are discussed. Although the expected results have not been obtained, studies that contri bute to increasing the understanding of fungal megasynthases are extremely valuable

A identidade na segmentação do corpo de diversos organismos, durante o desenvolvimento, é devida, em grande parte, à ação das proteínas homeóticas. Em especial, dois grupos de proteínas, Trithorax (trxG) e Polycomb (PcG) têm um papel fundamental na manutenção, respectivamente, da ativação e da repressão da transcrição gênica, associando-se à cromatina. A importância das PcG nos estimulou a buscar a caracterização das proteínas humanas ortólogas ao \"Enhancer of Polycomb\" (Epc) de Drosophila, até então não descritas no genoma humano. Para tanto, buscamos: - obter a sequência completa e mapear o cDNA do novo gene humano homólogo ao \"Enhancer of Polycomb\" de Drosophila; - analisar sua expressão em tecidos fetais, adultos e tumorais e fazer estudos buscando sua caracterização funcional. Encontramos, mapeamos e obtivemos a seqüência completa de dois genes humanos, ortólogos de Epc1 (10p11-22) e de Epc2 (2q21-23) de camundongo, publicando estes dados em 2001 (Camargo et al., 2001). Ambos os genes são bastante conservados entre várias espécies, sendo que o cDNA de hEPC2 humano, por exemplo, é 94% idêntico ao Epc2 de camundongo e possui 96% de identidade ao nível de proteína, sugerindo que a função do gene deve ter sido mantida durante a evolução. No entanto, as seqüências protéicas de hEPC1 e hEPC2 humanos possuem apenas 68% de identidade entre si. Portanto, é provável que após a duplicação dos parálogos, estes tenham divergido funcionalmente. A expressão de ambos os genes foi avaliada utilizando \"dot-blots\" contendo 76 mRNAs de amostras de tecidos fetais, adultos e tumorais, mostrando-se fraca e ubíqua. Análises in silico sugeriram a existência de 4 isoformas de splicing para hEPC2, as quais foram validadas por RT-PCR ou \"Northern blots\". Uma das isoformas (de 2.7 Kpb) se mostrou mais abundante em todas as linhagens tumorais estudadas através de análises de \"Northern blot\", principalmente nas linhagens de linfoma de Burkitt\'s Raji e na linhagem de leucemia pró-mielocítica HL-60. Esta isoforma é gerada através de um sítio alternativo de poli-adenilação, que reduz sua porção 3\'UTR, retirando 4 dos 5 \"elementos ricos em adenilatos e uridilatos\" (AREs), envolvidos com a degradação de mRNAs lábeis que codificam proteínas regulatórias. Estes resultados se encontram em um manuscrito recentemente submetido à publicação (anexo à tese). Interação entre hEPC2 e SMADs e sua modulação por TGF-β. Durante a montagem da seqüência completa de hEPC2, verificamos que duas ESTs patenteadas mostravam alta identidade com o gene. Estas seqüências foram descritas como sendo parte de uma nova proteína de interação com as proteínas da família SMAD, envolvidas com transdução de sinais desencadeados por TGF-β. Esta citocina por sua vez, regula a proliferação, diferenciação e morte celular. Partimos para a avaliação da possível interação entre hEPC2 e as SMADs, em colaboração com o grupo do Dr. Aristidis Moustakas, do Ludwig Institute for Cancer Research de Uppsala, Suécia. Os resultados de co-imunoprecipitação sugeriram que as SMADs 2, 3, 4, 7 e 8 interagem com hEPC2, sendo que a interação entre as SMAD2, SMAD3, SMAD4 e hEPC2 nas células tratadas com TGF-β1, mostraram uma redução na co-imunoprecipitação. Este resultado sugere que TGF-β1 modula negativamente a interação entre essas proteínas. Da mesma maneira, foi observada uma redução na interação de hEPC2 com SMAD8 após o tratamento com BMP-7. Esse resultado é ainda mais destacado para as SMADs 2 e 3. Estes dados foram observados para ambas as construções de hEPC2, o que sugere fortemente a veracidade da interação entre estas proteínas. A localização celular de hEPC2, e também sua co-localização com SMAD2 foram investigadas através de imunofluorescência indireta e confirmaram a predição do programa PSORTII, de que hEPC2 se localiza no núcleo. No entanto, não foi possível observar a co-localização entre hEPC2 e SMAD2. É possível que hEPC2 não se ligue diretamente ao DNA, necessitando se associar como parceiro de um fator de transcrição. Esta foi uma das hipóteses para a atuação de hEPC2, como um co-fator que se associe com uma das SMADs e se ligue a um elemento específico de ligação a SMAD (SBE). Para investigar essa hipótese um ensaio de gene repórter foi feito utilizando uma construção de um repórter contendo 12 repetições da seqüência CAGA (seqüência específica de ligação das SMADs 2,3 e 4) fusionado com o gene da luciferase. No entanto, este ensaio não demonstrou que a transcrição de SMAD2 é dependente de hEPC2 e o experimento deverá ser repetido. Para confirmar a interação entre hEPC2 e as SMADs, será feito um experimento de \"pull-down\". Para tal o cDNA de hEPC2 foi clonado no vetor pET-32A de expressão indutível em bactérias. A proteína recombinante já foi produzida, tendo sido induzida e posteriormente purificada em condições desnaturantes. Apesar de dezenas de genes PcG terem sido caracterizados em Drosophila, poucos destes genes foram estudados em mamíferos. Portanto, a descrição do gene hEPC2 e seus transcritos alternativos, contribui para o conhecimento de PcG humanos, indicando a associação de maior expressão de uma de suas isoformas em linhagens celulares tumorais. Em relação à interação de hEPC2 com as SMADs, é interessante observar que nenhuma outra proteína foi descrita por possuir a particularidade de interagir com as SMADs de diferentes categorias. Talvez este seja um dado importante, que indique o papel singular de hEPC2 na sinalização de TGF-β1. / The identity of body segmentation in several organisms during development is, to a large extent, due to the action of the homeotic proteins. In particular, two groups of proteins, the Trithorax (trxG) and Polycomb (PcG), have a major role in maintenance of respectively, transcription activation and repression, when associated to the chromatin. The importance of PcGs has motivated us to pursue the isolation and characterization of two new human proteins that are orthologs of the \"Enhancer of Polycomb\" (Epc) of Drosophila. To achieve this goal we undertook the task of the cloning and mapping of complete cDNA sequence of the novel genes hEPC1 and hEPC2, analyzing its expression in fetal, adult and tumoral tissues and functionally characterizing the hEPC2 protein. In 2001, we published the mapping and cloning of the complete cDNA sequences of both genes, as being orthologs of the mouse Epc1 (10p11-22) and Epc2 (2q21-23), together with the strategy used to obtain the full-length cDNAs (Camargo et al., 2001). Both genes are shown to be highly conserved among several species. Thus, the human hEPC2 cDNA is 94% identical to the mouse Epc2 and displays 96% identity at the protein level, suggesting maintenance of its function during the evolution. However, the protein sequences of the human hEPC1 and hEPC2 display only 68% identity. Therefore, it is likely that they have undergone a functional divergence after their duplication. The expression of both genes was evaluated using \"dot-blots\" containing 76 mRNAs samples from fetal, adult and tumoral tissues and is shown to be weak and ubiquitous. \"In silico\" analysis suggested the existence of 4 hEPC2 splicing isoforms that were validated by RT-PCR and/or Northern-blots. One of the isoforms (of 2.7 Kbp) is shown to be more abundant in all of the tumoral cell lines evaluated using Northern-blot analysis, mainly in the Burkit\'s Raji lymphoma and in the promyelocytic leukemia HL-60. This isoform results from the use of an alternative polyadenylation site that reduces the 3\'UTR, abolishing 4 of 5 \"adenylates and urilates rich elements\" (AREs), involved in the degradation of labile mRNAs that codify to regulatory proteins. These results have been recently submitted to publication (manuscript attached to this thesis). Interaction between the hEPC2/SMADs and its modulation by TGF-β. During the assembly of the hEPC2 full-length cDNA sequence, we found two patented ESTs that tagged a portion of the gene. These sequences were described as partial sequences of a \"new SMAD interacting protein\", involved in signal transduction of TGF-β, a cytokine that regulates cell proliferation, differentiation and death. To evaluate this putative interaction between hEPC2 and the SMADs proteins, we begun a collaboration with the TGF-β signalling group of the Dr. Aristidis Moustakas, from the Uppsala Ludwig Institute for Cancer Research, Sweden. The results of co-imunoprecipitation assays suggested that SMADs 2, 3, 4, 7 e 8 interact with hEPC2. Moreover, the interaction among SMAD2, SMAD3, SMAD4 and hEPC2 in cells treated with TGF-β1 showed decreased co-imunoprecipitation. This result suggests that TGF-β1 negatively modulates the interaction of these proteins. Likewise, we observed a reduction in hEPC2 interaction with SMAD8 upon BMP-7 treatment. This effect was even more dramatic for SMADs 2 and 3. These data were observed for both hEPC2 plasmid constructs, which strongly suggest the veracity of these proteins interaction. The cell localization of the hEPC2 protein, as well as its co-localization with the SMAD2, were investigated through indirect immunofluorescence assay, confirming the predicted localization of hEPC2 in the cell nucleus using the PSORTII program. However, we were not able to confirm the co-localization of hEPC2 and SMAD2. It is possible that hEPC2 does not bind directly to the DNA, requiring an association with a partner such as a transcription factor. This raises the hypothesis of hEPC2 having a role as a co-factor associated to one of the SMADs and binding to a \"SMAD binding element\" (SBE). To investigate this hypothesis, gene reporter assays were undertaken using a reporter construct containing 12 CAGA sequence repetitions (specific binding sequence of the SMADs 2, 3 and 4) fused to the luciferase gene. However, this assay could not demonstrate that the transcription of the SMAD is dependent on hEPC2. This experiment must be repeated. To confirm the interaction of hEPC2 and SMADs, a pull-down assay will be performed. To this end, the coding region of hEPC2 was cloned into the pET-32A bacterial inducible expression vector. The recombinant protein was already produced, having been induced and purified under denaturing conditions. Despite the dozens of PcG genes that were described in Drosophila, only a few of these genes have been characterized in mammals. Therefore, the description of the hEPC2 and its alternative transcripts is a contribution to better knowledge of the human PcGs. Regarding the hEPC2 and SMADs interaction, it\'s it is noteworthy that this is the first protein described to interact with SMADs of distinct categories. This may be an important indication of a unique role for hEPC2 in the TGF-β1 signaling pathway.

O aneurisma de aorta abdominal (AAA) é uma doença assintomática na maioria dos casos, podendo acometer 5% das pessoas do gênero masculino com idade superior a 65 anos, predispondo ao risco de ruptura com mortalidade em torno de 80%. O presente estudo teve como objetivo avaliar os perfis de expressão gênica e de metilação do DNA no tecido, como também os microRNAs no plasma e no tecido de indivíduos com e sem AAA na tentativa de identificar marcadores biológicos e alvos terapêuticos para o diagnóstico, monitoramento e tratamento precoce do AAA. Os perfis de expressão gênica, miRNA e metilação de DNA dos tecidos da aorta abdominal (n=6) obtidos durante a cirurgia aberta para correção de AAA foram comparados com tecidos da aorta abdominal de doadores de órgãos sem AAA (n=6). Também foram comparados os perfis de miRNAs circulantes no plasma do grupo AAA (n=6) com o grupo-controle de voluntários com as características semelhantes, porém sem AAA (n=6). Para a análise da expressão gênica, utilizou-se a qPCR Array, analisando-se genes relacionados ao endotélio vascular humano (PAHS-015Z, QIAGEN®). A análise do perfil de miRNA foi realizada utilizando-se Human miFinder 384HC miScript miRNA PCR Array (MIHS-3001Z, QIAGEN®) e, para análise de metilação do DNA, utilizou-se a qPCR array com 22 genes das vias de estresse e toxicidade EpiTect Methyl II (EAHS-581Z, QIAGEN®). O software Ingenuity Pathway analysis (IPA®) foi utilizado para identificação das prováveis relações entre os microRNAs e a expressão gênica realizada nesta pesquisa. No estudo da expressão gênica, quatro genes (SPHK-1, TYMP, ALOX5 e HIF1A) foram identificados como mais expressos e outros 6 genes (PTGIS, CX3CL1, ITGB1, COL18A-1, FN1 e AGTR1) apresentaram expressão reduzida nos tecidos de AAA. Na análise do perfil de miRNAs, 24 miRNAs foram significantemente mais expressos e 35 miRNAs menos expressos no tecido. No plasma de indivíduos com AAA, 8 miRNAs apresentaram-se mais expressos e 9 miRNAs menos expressos. Dois miRNAs, miR-328-3p e let-7c-5p demonstraram expressões comuns entre tecido e plasma. Quanto ao padrão de metilação de DNA, somente o gene GDF15 teve grau de metilação maior nos tecidos de AAA quando comparado ao grupo-controle. A análise funcional revelou que o gene PTGIS (prostaciclina sintetase), um potente vasodilatador e inibidor da atividade plaquetária, foi reprimido pelo miR-150-5p, que se mostrou 7,5 vezes mais expresso no tecido de AAA, e teve uma possível interação com o miR-328-3p, cuja expressão foi 3,7 vezes mais baixa no tecido. Os genes com expressão reduzida nos tecidos do AAA foram alvos de miRNAs com expressão aumentada, evidenciando a importância e influência dos fatores epigenéticos tanto para o desenvolvimento quanto para a gravidade do AAA. / Abdominal aortic aneurism (AAA) is an asymptomatic disease in the majority of cases that may occur in 5% of males over age 65, predisposing to the risk of rupture leading to a mortality rate of 80%. The aim of this study was to evaluate the DNA metilation and gene expression profile in tissue, and microRNA expression pattern in both plasma and tissue samples from individuals with and without AAA to identify biological markers and therapeutic targets for an early diagnosis and treatment of AAA, respectively. Genes and miRNA expression and DNA metilation profiles in AAA tissues (n= 6) were compared to abdominal aortic tissues obtained from organ donators without AAA (n = 6). We also compared circulating miRNAs profiles in plasma samples, between AAA (n = 6) and the control group without AAA (n = 6). For the gene expression analysis we used a qPCR Array (PAHS-015Z, QIAGEN®) to analyze genes related to human vascular endothelium. For the miRNA expression pattern and for DNA methylation analysis we used the Human miFinder 384HC miScript miRNA PCR Array (MIHS-3001Z, QIAGEN®) and EpiTect Methyl II (EAHS-581Z, QIAGEN®), respectively. The Ingenuity software was used to identify the interactions between the miRNAs and genes evaluated in this study. Four genes (SPHK-1, TYMP, ALOX5 and HIF1A) were upregulated and six other genes (PTGIS, CX3CL1, ITGB1, COL18A-1, FN1 e AGTR1) were downregulated in AAA tissues. In addition, the miRNAs analysis showed 24 miRNAs more expressed and 35 miRNAs less expressed in AAA tissue than controls. Although in plasma samples, AAA group presented 8 miRNAs more expressed and 8 miRNAs less expressed than controls. Only, miR-328-3p and let-7c-5p were differently expressed between AAA and controls in both tissue and plasma samples. DNA methylation analysis showed that the gene GDF15 was hypermethylated in AAA tissues when compared to the control group. Functional analysis revealed that PTGIS, a potent vasodilator and platelet activity inhibitor was supressed by miR-150-5p, which had a seven-fold increase in AAA tissues. Moreover, a possible interaction between PTGIS and miR-328-3p, about 4-fold decreased in AAA tissues, was showed. Thus, the downregulated genes in AAA tissues are targets of miRNAs with increased expression in the same biological sample. These results highlight the importance and influence of epigenetic factors for both development and severity of AAA.

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) DISSERTAÇÃO LORENA FINAL.pdf: 1421059 bytes, checksum: 1a05f733f0860794f3f2113b146dc128 (MD5) Previous issue date: 2018-03-09 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O carcinoma broncopulmonar é o mais frequente em todo o mundo, sendo uma das neoplasias mais agressivas, possuindo uma razão mortalidade/incidência em torno de 90%, com sobrevida global em cinco anos baixa, cerca de 10 a 15%, na maioria das populações do mundo. Na Região Norte do Brasil, esta patologia é a terceira mais frequente entre os homens e a quarta entre as mulheres. Do ponto de vista anatomopatológico, o câncer de pulmão é classificado em dois tipos principais: pequenas células e não-pequenas células, sendo este último o mais incidente, respondendo por 75% dos casos. Atualmente, a distinção entre os subtipos se baseia em diferenças histológicas, imunohistoquímicas e moleculares. Nesse contexto, é importante ressaltar que as informações moleculares influenciam não só no diagnóstico, prognóstico, mas também na conduta terapêutica. Diversas alterações genéticas e epigenéticas do genoma nuclear estão relacionadas a patogênese deste tumor. Entretanto, alterações na fosforilação oxidativa resultantes da disfunção mitocondrial tem sido há muito tempo sugeridas como envolvidas no processo de tumorigênese. Dessa forma, o presente estudo analisou dois genes do DNA mitocondrial (ND1 e ND3) integrantes do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial em 66 amostras de tecido pulmonar de pacientes com e sem câncer de pulmão não pequenas células na população do estado do Pará. Após a análise pelo sequenciamento, foram identificadas quatro alterações no gene ND1: C3553T, T3552A, C3595ins e G3666A e apenas duas alterações no gene ND3: A10398G e C10400T. Dentre as alterações encontradas no gene ND1, não foram observadas significância estatística em relação ao desenvolvimento do câncer de pulmão. Entretanto, foi descoberto uma alteração estrutural no gene ND1 na presença de C3595ins, ainda não descrita na literatura. Ao passo que, a presença do alelo A, observada em T3552A no gene ND1, foi associada de forma significativa ao um efeito protetor ao desenvolvimento de câncer de pulmão. Já alterações no gene ND3 (G10398A e T10400C) foram significantemente associadas com o câncer de pulmão, sendo estas alterações em ND3 potenciais para utilização como marcadores em pacientes com câncer de pulmão não pequenas células. / Bronchopulmonary carcinoma is the most frequent in the world, being one of the most aggressive neoplasms, with a mortality / incidence ratio of around 90%, with overall survival in five years low, about 10 to 15%, in most populations of the world. In the Northern Region of Brazil, this pathology is the third most frequent among men and the fourth among women. From the anatomopathological point of view, lung cancer is classified into two main types: small cells and non-small cells, the latter being the most incident, accounting for 75% of cases. Currently, the distinction between subtypes is based on histological, immunohistochemical, and molecular differences. In this context, it is important to emphasize that molecular information influences not only diagnosis, prognosis, but also therapeutic behavior. Several genetic and epigenetic alterations of the nuclear genome are related to the pathogenesis of this tumor. However, changes in oxidative phosphorylation resulting from mitochondrial dysfunction have long been suggested as involved in the process of tumorigenesis. Thus, the present study analyzed two mitochondrial DNA (ND1 and ND3) genes belonging to the I complex of the mitochondrial respiratory chain in 66 lung tissue samples from patients with and without non-small cell lung cancer in the population of the state of Pará. the sequencing analysis identified four alterations in the ND1 gene: C3553T, T3552A, C3595ins and G3666A and only two changes in the ND3 gene: A10398G and C10400T. Among the alterations found in the ND1 gene, no statistical significance was observed in relation to the development of lung cancer. However, a structural alteration in the ND1 gene was found in the presence of C3595ins, not yet described in the literature. Whereas, the presence of the A allele, observed in T3552A in the ND1 gene, was significantly associated with a protective effect on the development of lung cancer. Already changes in the ND3 gene (G10398A and T10400C) were significantly associated with lung cancer, these changes in ND3 being potential for use as markers in patients with non-small cell lung cancer

Embora a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) seja uma ferramenta promissora, seu amplo uso é impedido devido às altas taxas de mortalidade durante o desenvolvimento dos animais clonados. Acredita-se que a reprogramação epigenética anormal seja a principal causa desta baixa eficiência. Nós hipotetizamos que agentes modificadores de cromatina (AMCs) atingindo a acetilação das histonas e a metilação do DNA poderiam alterar a configuração da cromatina e torná-la mais facilmente reprogramável. Deste modo, fibroblastos bovinos foram tratados com 5-aza-2\'-deoxicitidina (AZA) mais tricostatina A (TSA) ou hidralazina (HH) mais ácido valpróico (VPA) enquanto, em outro experimento, zigotos bovinos clonados foram tratados com TSA. O tratamento dos fibroblastos com AZA+TSA ou HH+VPA aumentou a acetilação das histonas, mas não afetou o nível de metilação do DNA. Entretanto, o tratamento com HH+VPA diminuiu a viabilidade/proliferação celular. O uso destas células como doadoras de núcleo não mostrou efeitos positivos sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação. Em relação ao tratamento dos zigotos clonados com TSA, o tratamento destes mostrou um aumento nos padrões de acetilação das histonas, mas não reduziu o nível de metilação do DNA. Além disso, este tratamento não resultou em efeito positivo sobre o desenvolvimento pré- e pósimplantação. Este trabalho fornece evidências de que o tratamento de células doadoras de núcleo ou zigotos clonados com AMCs não tem efeito positive sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação de bovinos clonados. / Although somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a promising tool, its potential use is hampered by the high mortality rates during the development to term of cloned offspring. Abnormal epigenetic reprogramming of donor nuclei after SCNT is thought to be the main cause of this low efficiency. We hypothesized that chromatinmodifying agents (CMAs) targeting chromatin acetylation and DNA methylation could alter the chromatin configuration and turn them more amenable to reprogramming. Thus, bovine fibroblasts were treated with 5-aza-2\'-deoxycytidine (AZA) plus trichostatin (TSA) or hydralazine (HH) plus valproic acid (VPA) whereas, in another trial, cloned bovine zygotes were treated with TSA. The treatment of fibroblasts with either AZA+TSA or HH+VPA increased histone acetylation, but did not affect the level of DNA methylation. However, treatment with HH+VPA decreased cellular viability and proliferation. The use of these cells as nuclear donors showed no positive effect on pre- and post-implantation development. Regarding the treatment of cloned zygotes with TSA, treated one-cell embryos showed an increase in the acetylation patterns, but not in the level of DNA methylation. Moreover, this treatment revealed no positive effect on pre- and post-implantation development. This work provides evidence the treatment of either nuclear donor cells or cloned zygotes with CMAs has no positive effect on pre- and post-implantation development of cloned cattle.

Recentes estudos genômicos têm mostrado que vários fungos e bactérias possuem um potencial biossintético superior à quantidade de me tabólitos secundários já isolados desses micro-organismos. A descoberta de produtos naturais inéditos e bioativos é limitada pela impossibilidade dos micro-organismos expressarem to das as suas rotas biossintéticas em laboratório. Assim, estratégias alternativas para i nduzir a produção de produtos naturais microbianos são necessárias. A utilização de cultur as mistas de micro-organismos é uma estratégia que vem sendo recentemente utilizada, na tentativa de mimetizar condições mais naturais de crescimento. Além disso, a adição de mo duladores químicos e epigenéticos às culturas microbianas também pode potencialmente est imular a produção de compostos de interesse, seja por ativar mecanismos celulares em resposta à condição de estresse, ou por alterar a taxa de transcrição de certos genes, em f unção de mudanças no grau de enovelamento da cromatina. Alternativamente, a indu ção de certos genes, e até mesmo a diversificação do metabolismo secundário, podem ser conseguidos através de engenharia genética, pela manipulação direta de genes de inter esse. A linhagem endofítica Alternaria tenuissima SS77, selecionada para os experimentos de modulaçã o química e epigenética, teve seu metabolismo secundário alterado após o tra tamento com diferentes moduladores. Provavelmente, o efeito observado ocorreu em função de uma eliciação inespecífica dos diferentes moduladores. Além disso, o cultivo misto desse fungo com o fungo endofítico Nigrospora sphaerica SS67 , isolada da mesma planta hospedeira ( Smallanthus sonchifolius ), levou ao isolamento de dois novos policetídeos, da classe das perilenequinonas, juntamente com um já relatado na literatura científica. Para r ealizar os cultivos microbianos mistos, envolvendo uma linhagem bacteriana e uma fúngica, t rês linhagens de actinobactérias e cinco de fungos, todos endofíticos da planta Lychnophora ericoides , foram selecionadas. Alterações no perfil metabólico da cultura mista de Phomopsis sp FLe6 com Streptomyces albospinus RLe7 foram as mais evidentes e por isso a maioria das investigações foram focadas nessa cultura mista. Várias condições de cu ltivo foram testadas e diferentes resultados foram obtidos. Em alguns casos, o desenv olvimento da linhagem fúngica foi inibido pela bacteriana, e em outros, foi observado o inverso. Da mesma forma, houve acentuada inibição da produção de alguns metabólito s secundários na presença da linhagem desafiadora, mas também foi verificada a eliciação de outros. Os extratos das culturas simples desses micro-organismos também apresentaram relativas alterações nos perfis metabólicos em função das condições de cultivo. Os metabólitos produzidos pelo fungo Phomopsis sp FLe6 e pela actinobactéria Streptomyces albospinus RLe7 foram isolados e caracterizados. Os resultados mostram que as intera ções entre os micro-organismos endofíticos são bastante complexas, estando sujeita s a ação de diversos fatores externos que muitas vezes não podem ser pré-determinados. Po r isso, estabelecer um cultivo misto adequado, do ponto de vista da eliciação da produçã o de metabólitos secundários, pode requerer uma série de tentativas. Ainda assim, os r esultados almejados podem ser conseguidos utilizando essa estratégia. Diferenteme nte das linhagens endofíticas, manipuladas quimicamente através de diferentes estr atégias, a linhagem sequenciada de Fusarium heterosporum ATCC 74349, foi manipulada geneticamente para a co nstrução de um gene biossintético híbrido pks-nrps , contendo a porção nrps do gene híbrido da equisetina e um pks críptico de Aspergillus fumigatus . Era esperado que a linhagem hibridizada fosse capaz de produzir o metabólito se cundário geneticamente planejado, entretanto, após seu cultivo, esse produto não foi detectado nos extratos, e as possíveis razões são discutidas. Ainda que os resultados espe rados não tenham sido obtidos, estudos que contribuam para a ampliação do entendimento das megassintases fúngicas são de extrema valia. / Recently, genetic studies have shown that several b acteria and fungi hold a greater biosynthetic potential than the amount of secondary metabolites isolated from these microorganisms. The discovery of novel bioactive na tural products is limited by the inability of microorganisms to express all their biosynthetic pa thways in laboratory conditions. Therefore, alternative strategies to induce the production of microbial natural products are required. Mixed cultures of microorganisms are a strategy tha t has been used to mimic more natural conditions of growth. Furthermore, the addition of chemical and epigenetic modulators to the microbial cultures can also stimulate the productio n of compounds by activating cellular mechanisms in response to stress conditions or by c hanging the transcription rate of certain genes, due to changes in the chromatin folding. Alt ernatively, the induction of some genes, and even the diversification of secondary metabolis m, can be achieved by genetic engineering, by manipulating genes of interest. The endophytic strain Alternaria tenuissima SS77, which was selected for the experiments of che mical and epigenetic modulation, had changed its secondary metabolism after treatment wi th different modulators. Probably, the observed effect was due to a nonspecific elicitatio n of those modulators. Moreover, the mixed cultures of this fungus with the endophytic fungus Nigrospora sphaerica SS67, isolated from the same host plant ( Smallanthus sonchifolius ), led to the isolation of two new polyketides, belonging to perylene quinone class, along with ano ther one already reported in the scientific literature. Three strains of actinobacteria and fiv e fungi, all endophytes of Lychnophora ericoides , were selected to grow in microbial mixed cultures comprising one bacteria and one fungus. Changes in the metabolic profile of the mix ed culture of Phomopsis sp. FLe6 with Streptomyces albospinus RLe7 were the most obvious, and then further studi es were focused on this mixed culture. Many culture conditions were analyzed and different results were obtained. In some cases, the development of the fun gal strain was inhibited by bacteria, and in other cases was observed the opposite. Similarly , there was a remarkable inhibition of the production of certain secondary metabolites in the presence of the challenging strain, but the eliciting of others was also observed. The extracts of the single cultures of these microorganisms also showed changes in metabolic pro files due to culture conditions. The metabolites produced by the fungus Phomopsis sp. FLe6 and the actinobacteria S. albospinus RLe7 were isolated and characterized. The results show that interactions between endophytic microorganisms are quite complex and are influenced by various external factors that often can not be previously determined. Theref ore, establishing a suitable mixed culture to elicit the production of secondary metabolites m ay require some attempts. Still, the expected results can be achieved using this strateg y. Unlike the endophytic strains, that was chemically manipulated by different strategies, the sequenced strain Fusarium heterosporum ATCC 74349 was genetically manipulated to construct a hybrid PKS-NRPS biosynthetic gene containing the NRPS portion of the hybrid gene of e quisetin and a cryptic PKS gene of Aspergillus fumigatus . It was expected that hybridized strain could be a ble to produce the secondary metabolite genetically planned, however, after its cultivation, this product was not detected in any extracts, and some possible reasons are discussed. Although the expected results have not been obtained, studies that contri bute to increasing the understanding of fungal megasynthases are extremely valuable