Submitted by Vasti Diniz (vastijpa@hotmail.com) on 2017-09-08T11:33:23Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1921817 bytes, checksum: 7ba035d7ef40f1aafd9f93476aabedd6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-08T11:33:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1921817 bytes, checksum: 7ba035d7ef40f1aafd9f93476aabedd6 (MD5) Previous issue date: 2016-03-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Epigenetics is the study heritable changes of in gene expression without modifications in the primary sequence of DNA. In our study we investigated the influence of sun exposure on global DNA methylation and hydroxymethylation status and at specific sites of the miR-9-1, miR9-3 and MTHFR genes in skin samples of subjects with no history of skin diseases. Skin biopsies were obtained by punch on sun-exposed and sun-protected arm areas from 24 corpses aged 16-89 years old from the Brazilian Service of Death Investigation. Genomic DNA was extracted from skin samples that were ranked according to Fitzpatrick’s criteria as light, moderate and dark brown. Global DNA methylation and hydroxymethylation and DNA methylation at specific sites analyses were performed using an ELISA and MSP, respectively. No significant differences in global DNA methylation and hydroxymethylation levels were found between the skin areas, skin type or age. However, gender-related differences were detected, where women showed higher methylation levels in comparison to those in men. Global DNA methylation levels were higher than hydroxymethylation levels, and the levels of these DNA modifications correlated in skin tissue. For specific sites, it was detected no differences among areas. Additional analyses showed no differences in the methylation status when age, gender and skin type were considered. We conclude that sun exposure does not induce changes in the global DNA methylation and hydroxymethylation status or at specific sites in the miR-9-1, miR-9-3 and MTHFR genes for skin types studied. / A epigenética é o estudo das alterações hereditárias na expressão gênica sem mudanças na sequência primária do DNA. No nosso estudo investigamos a influência da exposição solar sobre o perfil de metilação e hidroximetilação global de DNA e em sítios específicos nos genes miR-9-1, miR-9-3 e MTHFR em amostras de pele humana. Para isso, biópsias foram obtidas por punch circular de área exposta e não exposta ao sol do braço de 24 cadáveres de ambos os sexos, com idade entre 16-89 anos sem histórico de doenças de pele oriundos do Serviço de Verificação de Óbitos da Paraíba (SVO). O DNA foi extraído e a análise de metilação e hidroximetilação global do DNA foi realizada através de Elisa indireto. A análise de metilação nos sítios específicos dos genes miR-9-1, miR-9-3 e MTHFR foi realizada por meio de PCR específica para metilação (MSP) seguida de eletroforese. As análises estatísticas foram realizadas pelo software BioEstat 5.0 ao nível de significância de 5%. Não encontramos diferenças significativas nos níveis de metilação e hidroximetilação global de DNA entre as áreas exposta e não exposta da pele, tipo de pele ou idade. No entanto, foram detectadas diferenças em relação ao gênero, onde as mulheres apresentaram nível de metilação global mais alto em comparação aos homens. O nível de metilação global de DNA foi maior do que o nível de hidroximetilação, sendo estes, correlacionados no tecido da pele. Para sítios específicos, não foi detectada nenhuma diferença entre as áreas. Análises adicionais mostraram não haver diferenças significativas no perfil de metilação quando consideradas a idade, gênero e o tipo de pele. Conclui-se que a exposição ao sol não induz mudanças no perfil de metilação e hidroximetilação global do DNA ou em sítios específicos dos genes miR-9-1, miR-9-3 e MTHFR para os tipos de pele estudado.

O Distrito Grafitífero Aracoiába-Baturité apresenta depósitos do tipo gnaisse grafitoso (minério disseminado) e veio (minério maciço) com diferentes origens genéticas e com características físicas e ambientes geológicos de formação próprios. O minério tipo gnaisse grafitoso é de origem sedimentar, singenético, com teores de 1,5 a 8% de C, que se distribuem ao longo de duas extensas faixas paralelas, hospedadas na Subunidade Baturité, que constitui um importante metalotecto regional. A associação de grafita metamórfica disseminada em metassedimentos da Sequência Acarápe constitui um geoindicador de antiga bacia sedimentar neoproterozóica e, também, pode ser considerado como zona de geosutura resultante do subsequente fechamento de um oceano primitivo. As rochas desta subunidade correspondem na paleogeografia da Sequência Acarápe aos fácies de sopé de talude e de planície abissal. O minério tipo veio (fluido depositado) é epigenético e, com teores entre 20% e 70% de C, forma corpos tabulares e bolsões, controlados em escala local por estruturas de alívio (falhas, fraturas, zonas de contato, eixos de dobras etc.) que permitiram a percolação de soluções penumatolíticas relacionadas ao corpo plutônico de Pedra Aguda. As variações dos valores das relações entre isótopos estáveis de carbono (δ13C) na grafita do minério disseminado são de -26,72 a -23,52 e do minério maciço de -27,03 a -20,83, revelando sinal de atividades biológicas (bioassinaturas) e permitem afirmar que a grafita das amostras acima são derivadas de matéria orgânica. Foram apresentados os principais guias de prospecção para grafita e testados os seguintes métodos geofísicos: Eletro-Resistividade; GPR - Ground Penetrating Radar; Magnetometria; VLF (Very Low Frequency); e Polarização Induzida Espectral (IPS) / Resistividade (ER). A conjugação dos métodos de Polarização Induzida Espectral (IPS) e Eletro Resistividade (ER) foi o que demonstrou a melhor eficiência. Com relação à determinação do teor de carbono por termogravimetria (ATG), que é o método mais utilizado para este elemento. Verificou-se, que as faixas de queima atribuídas ao carbono no minério do Distrito de Aracoiába-Baturité (340 a 570C e de 570 a 1050C) eram diferentes das faixas do minério de Minas Gerais (350C a 650C e 650C a 1.050C). Esta constatação indica a necessidade de se determinar previamente as faixas de temperatura para cada região pesquisada. / The Aracoiába-Baturité Graphite-bearing District has graphitic gneiss deposits (disseminated ore) and vein (solid ore) with different genetic origins and their own physical characteristics and geological environments. The graphite gneiss ore is of sedimentary, syngenetic origin, with 1.5% to 8% C content, which is distributed along two long parallel belts, hosted in the Baturité Sub-unit, which consists of a major regional metallotect. The association of metamorphic graphite disseminated in metasediments of the Acarápe Sequence consists of a geoindicator of an old Neo-Proterozoic sedimentary basin and also can be considered a geosuture zone, the result of the subsequent closing of a primitive ocean. The rocks of this subunit correspond in the paleogeography of the Acarápe Sequence to the facies of the bottom of a slope and of an abyssal plain. The vein ore (deposited fluid) is epigenetic and, with C contents of between 20% and 70%, forms tabular bodies and pockets, controlled on a local scale by relief structures (faults, fractures, contact zones, fold axes, etc.), which allowed seepage of pneumatolithic solutions relating to the plutonic body of Pedra Aguda. The variations in the values of the ratios between stable carbon isotopes (δ13C) in the graphite of the disseminated ore are -26.72 to -23.52 and of the solid ore -27.03 to -20.83, showing a sign of biological activities (biosignatures), and it can be said that the graphite of the above samples is derived from organic matter. The main prospecting guides for graphite were presented and the following geophysical methods tested: Electro-resistivity (ER); Ground Penetrating Radar (GPR); Magnetometry; Very Low Frequency (VLF); and Spectral Induced Polarization (SIP) / Electro-resistivity (ER). It was found that the combination of the Spectral Induced Polarization (SIP) and Electro-resistivity (ER) methods proved the most efficient. In relation to determining the carbon content using thermogravimetry (TG), which is the most commonly used method for this element, it was found that the bands of burning attributed to the carbon in the ore in the Aracoiába-Baturité District (340 to 570C and from 570oC to 1050C) were different from the bands of the ore in Minas Gerais (350C to 650C and 650C to 1050C). This finding suggests the need to determine beforehand the temperature ranges for each region studied.

During the process of cloning using nuclear transfer, epigenetic marks in cells must go through a reprogramming process, so that embryonic development can occur appropriately. However, during TN this reprogramming process is not completely efficient. Analysis of cell viability and expression of genes related to pluripotency and epigenetic changes, allowed us to evaluate the action of demethylation drugs such as Procaine and SAH in somatic cell cultures. These substances are potencial inducers of epigenetic reprogramming and they could be used to improve the process of cloning by TN. The bovine fibroblasts treated with 1 mM Procaine had lower cell viability compared to the control group (non trated), while the group treated with 2 mM of SAH did not differ from the controls. OCT4 and NANOG genes were detected in control group as well as in the group treated with 1mM Procaine, while HDAC2 and DNMT1 genes were expressed in cells treated with 1 mM of Procaine as in those treated with 2 mM of SAH, showing no significant difference between the experimental groups. In this study we concluded that the OCT4 and NANOG genes are not molecular markers for cellular pluripotency in bovines and we can modify the epigenetic patterns of DNA of the nucleus donor cells for cloning by TN process, contributing to the improving of the results of this technique. / Durante o processo de clonagem por transferência nuclear, as marcas epigenéticas existentes nas células devem sofrer um processo de reprogramação, para que o desenvolvimento embrionário ocorra de forma correta, porém, essa reprogramação não é completamente eficaz. Assim, a utilização de substâncias desmetilantes, como a Procaína e SAH, podem ser de grande valia para facilitar essa reprogramação. Ao avaliar a viabilidade celular e a expressão de genes relacionados à pluripotência e alterações epigenéticas, nos permitiu verificar a atuação de drogas desmetilantes como a Procaína e a SAH em cultivo de células somáticas. Essas drogas podem auxiliar a desprogramação epigenética e serem úteis para uma melhoria do processo de clonagem por TN. Os fibroblastos bovinos tratados com 1mM de Procaína apresentaram menor viabilidade celular em relação ao grupo não tratado (controle), enquanto que as células tratadas com 2mM de SAH não apresentaram diferença em sua viabilidade entre os grupos experimentais. Os genes OCT4 e NANOG foram detectados tanto nas células controle como nas tratadas com 1mM de Procaína. Os genes HDAC2 e DNMT1 foram detectados nos mesmos níveis, tanto nas células tratadas com 1mM de Procaína quanto nas tratadas com 2mM de SAH. Com os resultados obtidos nesse estudo, concluímos que os genes OCT4 e NANOG não são marcadores moleculares para pluripotência celular em bovinos e que com possíveis modificações no cultivo celular, podemos alterar os padrões epigenéticos do DNA das células doadoras de núcleo para a clonagem por TN, contribuindo para o incremento dos resultados da técnica. / Mestre em Ciências Veterinárias

As sirtuínas 1-7 (SIRT) constituem uma família altamente conservada de desacetilases de histonas que, de modo geral, participam da regulação da longevidade em diversos organismos, modulando a resposta celular frente ao stress oxidativo e promovendo mecanismo de reparo de DNA, parada do ciclo celular, estabilidade telomérica, senescência e apoptose celulares. O envolvimento das SIRTs no processo tumorigênico tem sido bastante investigado, contudo ainda não existe descrição do estudo desses genes nos adenomas hipofisários. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão gênica das SIRT1-7 nos somatotropinomas e adenomas hipofisários clinicamente não funcionantes (ACNF) e sua relação com o tamanho e a invasividade do tumor. A expressão das sirtuínas foi ainda correlacionada à expressão dos marcadores de senescência CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) e do proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Foram selecionados 68 pacientes, 37 somatotropinomas e 31 portadores de ACNF. Desses casos, 33 apresentavam tumores invasivos e 35 eram não invasivos. A quantificação do RNAm das SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A e PTTG foi realizada nas amostras tumorais pela técnica de PCR em tempo real utilizando o método de quantificação relativa 2-??Ct. A hiperexpressão da SIRT1 foi observada em 86,5% dos somatotropinomas versus 41,9% dos ACNF (P < 0.01), não sendo observada perda de expressão desse gene. A SIRT3 foi mais hipoexpressa nos ACNF em relação aos somatotropinomas (77,4% e 40,5%, respectivamente; P < 0.01). A SIRT4 foi hipo e hiperexpressa, respectivamente, em 45,2% e 12,9% dos ACNF e 16,2% e 24,3% dos somatotropinomas (P=0.03). A hipoexpressão da SIRT7 também foi maior nos ACNF (67,7%) versus somatotropinomas (32,4%; P=0.01) e, para ambos os subtipos, o percentual de casos apresentando hiperexpressão desse RNAm foi baixo. O padrão de expressão das SIRT2 e 5 não diferiu entre os subtipos tumorais e não se mostrou alterado em relação ao pool de hipófises normais. Não foi observada diferença estatisticamente significante na expressão dos genes das sirtuínas entre os grupos de tumores invasivos e não invasivos. Contudo, a expressão das SIRT1 e 3 foi relacionada ao tamanho tumoral; nos casos com hiperexpressão da SIRT1 a média do maior diâmetro tumoral foi 2.4 ± 1.1 enquanto nos pacientes com expressão normal foi de 3.3 ± 1.3 (P < 0.01). Já os casos com perda de expressão da SIRT3 apresentaram tumores maiores (3.1 ± 1.2) em relação aos casos com expressão normal (2.2 ± 1.1; P < 0.01). A expressão de todas as SIRTs apresentou correlação positiva moderada (SIRT1-5,7) ou forte (SIRT6) com a expressão do CDKN1A. Uma correlação positiva foi observada também em relação a expressão do CDKN2A. Contudo, essa foi fraca e presente apenas para as SIRTs 3-5. Em relação ao PTTG, foi observado apenas uma fraca correlação com a expressão da SIRT1 e SIRT3. Em conclusão, esses resultados sugerem que a hiperexpressão de SIRT1 e a hipoexpressão das SIRTs 3, 4 e 7 podem estar relacionadas ao processo tumorigênico nos somatotropinomas e ACNFs, respectivamente e, em especial as SIRT1 e 3, ao controle da proliferação celular nesses adenomas / Sirtuins 1-7 (SIRT) are a highly conserved family of histone deacetylases. In general, these proteins are involved in the regulation of longevity in several organisms, modulating the cellular response to oxidative stress. SIRTs can also regulate DNA repair, telomeric stability, cell senescence and apoptosis. Due to their functions, there is a growing interest in the role of sirtuins in tumorigenesis. However, these genes were not investigated in pituitary tumors so far. In this study, SIRT1-7 gene expression was evaluated in somatotropinomas and nonfunctioning pituitary adenomas (NFPA) and related to tumor size and invasiveness. SIRT1-7 expression was also correlated with cellular senescence markers CDKN1A (p21) e CDKN2A (p16) and with the proto-oncogene PTTG (pituitary tumor transforming gene). Sixty-eight patients were selected, 37 with somatotropinomas and 31 with NFPA. Tumor invasion was observed in 33 patients. SIRT1-7, CDKN1A, CDKN2A and PTTG mRNA levels was evaluated from pituitary tumor samples by the real-time PCR using 2-??Ct relative quantification. Pronounced differences in SIRT1, 3, 4 and 7 expressions were identified between somatotropinomas and NFPA. Overexpression of SIRT1 was observed in 86.5% of somatotropinomas versus 41.9% of NFPA (P < 0.01) whereas underexpression was not detected. SIRT3 was more underexpressed in NFPA than somatotropinomas (77.4% and 40.5%, respectively, P < 0.01). SIRT4 was under and overexpressed, respectively, in 45.2% and 12.9% of NFPA and 16.2% and 24.3% of somatotropinomas (P=0.03). SIRT7 underexpression was also higher in NFPAs (67.7%) versus somatotropinomas (32.4%; P=0.01) with few cases showing overexpression. SIRT2 and 5 expressions did not differ between tumors subtypes and was not altered in relation to the normal pituitary gland pool. No statistically significant difference was observed in the expression of these genes between invasive and non-invasive tumor groups. However, SIRT1 and 3 expressions were related to tumor size. Mean of the largest tumor diameter was 2.4 ± 1.1 and 3.3 ± 1.3 (P < 0.01) in adenomas with SIRT1 over- and normal expression, respectively. On the other hand, cases with SIRT3 underepression exhibited larger tumors (3.1 ± 1.2) compared to cases with SIRT3 normal expression (2.2 ± 1.1, P < 0.01). Moderated (SIRT1-5.7) or strong (SIRT6) positive correlation was observed between sirtuins and CDKN1A expression. A weak correlation was observed with respect to CDKN2A expression and SIRTs 3-5. Regarding PTTG mRNA, only a weak correlation with SIRT1 and SIRT3 expression was observed. In conclusion, these results suggest that overexpression of SIRT1 and underexpression of SIRTs 3, 4 and 7 could be related to the tumorigenic process in somatotropinomas and NFPAs, respectively. SIRT1 and 3 could also play a role in control of pituitary adenomas cell proliferation

A idade normal para início da puberdade em meninas varia bastante, de 8 a 13 anos, e os genes envolvidos nesse controle são parcialmente conhecidos. Fatores ambientais, como alimentação e exposição a disruptores endócrinos, contribuem para essa variabilidade, de modo que genes modulados epigeneticamente podem justificar parte da complexidade desse processo. O termo epigenética se refere às modificações na expressão gênica que não são causadas por alterações na sequência do DNA. A metilação do DNA é o mecanismo epigenético mais bem estudado. Na última década surgiram evidências demonstrando a relação entre metilação do DNA e desenvolvimento puberal. Em fêmeas de roedores, a hipermetilação do DNA levou à puberdade precoce. Em humanos, a puberdade precoce central (PPC) familial causada por mutações nos genes MKRN3 e DLK1 é considerada um defeito do imprinting, fenômeno epigenético no qual apenas um dos alelos parentais é expresso, estando o outro metilado e inativo. Além disso, um conceito atual propõe que o início da puberdade requer a repressão epigenética de fatores inibidores do eixo gonadotrófico. Recentemente, genes zinc finger (ZNF) foram relacionados ao processo puberal, e muitos deles codificam repressores transcricionais. Neste trabalho, estudamos a metilação do DNA do sangue periférico de 10 pacientes do sexo feminino com PPC familial (casos índices) e 33 meninas com desenvolvimento puberal normal (15 pré-púberes e 18 púberes), usando a plataforma Human Methylation 450 BeadChip. Duas pacientes tinham PPC de causa genética (uma com mutação no MKRN3 e outra com deleção no DLK1) e oito tinham PPC idiopática, sem mutações identificadas pelo sequenciamento exômico global. Cento e vinte regiões diferencialmente metiladas foram identificadas entre as meninas saudáveis pré-púberes e púberes, estando 74% delas no cromossomo X. Apenas uma região mostrou-se hipometilada no grupo púbere e, de maneira importante, contém a região promotora do ZFP57, fator necessário para manutenção do imprinting. Uma vez que a hipermetilação nas regiões promotoras dos genes é relacionada à inibição transcricional, o achado de hipermetilação global do DNA na puberdade sugere que haja inibição de fatores inibidores do eixo gonadotrófico, o que resultaria no início do processo puberal. O receptor estrogênico destacou-se como um fator transcricional que se liga a sete genes diferencialmente metilados entre os controles pré-púberes e púberes. As pacientes com PPC apresentaram mais sítios CpG hipermetilados tanto na comparação com as meninas pré-púberes (81%) quanto púberes (89%). Há doze genes ZNF contendo sítios CpG hipermetilados na PPC. Não foram encontradas anormalidades de metilação nos genes MKRN3 e DLK1 nem em suas regiões regulatórias. Em conclusão, este estudo evidenciou hipermetilação global do DNA em meninas com puberdade normal e precoce, sugerindo que esse padrão é uma marca epigenética da puberdade. Pela primeira vez, mudanças no metiloma de pacientes com PPC foram descritas. Modificações na metilação de vários genes ZNF parecem compor a complexa rede de mecanismos que leva ao início da puberdade humana / Normal puberty initiation varies greatly among girls, from 8 to 13 years, and the genetic basis for its control is partially known. Environmental factors, such as nutrition and exposure to endocrine disruptors, contribute to this variance, and epigenetically modulated genes may justify some of the complexity observed in this process. Epigenetics refers to alterations in gene expression that are not caused by changes in DNA sequence itself. DNA methylation is the best studied epigenetic mechanism. In the last decade, evidence has emerged showing the relationship between DNA methylation and pubertal development. In female mice, DNA hypermethylation led to precocious puberty. In humans, familial central precocious puberty (CPP) caused by mutations in the MKRN3 and DLK1 genes is considered a disorder of imprinting, an epigenetic phenomenon in which only one parental allele is expressed, and the other allele is methylated and inactive. In addition, animal studies indicated that pubertal timing requires epigenetic repression of inhibitory factors of the gonadotrophic axis. Recently, zinc finger genes (ZNF) were related to pubertal development, many of which encode transcriptional repressors. In the present study, we analyzed the DNA methylation of peripheral blood samples from 10 female patients with familial CPP (index cases) and 33 girls with normal pubertal development (15 pre-pubertal and 18 pubertal), using the Human Methylation 450 BeadChip assay. Genetic CPP was diagnosed in two patients (one with a MKRN3 mutation and the other with a DLK1 deletion). The remaining eight cases with idiopathic CPP were previously evaluated by whole exome sequencing and no causative mutations were identified so far. We evidenced 120 differentially methylated regions between pre-pubertal and pubertal healthy girls, and 74% of them were located at the X chromosome. Only one genomic region was hypomethylated in the pubertal group. Of note, it contains the promoter region of ZFP57, an important factor for imprinting maintenance. As DNA hypermethylation in gene promoters is related to gene silencing, the finding of global DNA hypermethylation in puberty suggests inhibition of inhibitory factors of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis that results in puberty onset. Importantly, the estrogen receptor was identified as a transcriptional factor that binds to seven differentially methylated genes associated with pubertal process. Patients with CPP exhibited more hypermethylated CpG sites compared to both pre-pubertal (81%) and pubertal (89%) controls. Twelve ZNF genes were recognized as having hypermethylated CpG sites in CPP. The methylation analyses of MKRN3 and DLK1 genes showed no abnormalities. In conclusion, this study revealed a widespread DNA hypermethylation in girls with normal and precocious puberty, suggesting that this pattern can be an epigenetic signature of puberty. For the first time, changes in the methylome of patients with CPP were described. We highlight that alterations in methylation levels of several ZNF genes may impact the onset of human puberty

Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são produzidos pela microbiota intestinal e possuem papéis anti-inflamatórios e ação inibitória sobre histona deacetilases. A lesão renal aguda (LRA) é caracterizada por uma inflamação renal que influencia a função do rim. Este projeto avaliou se o tratamento com os AGCC impactaria nos desfechos inflamatórios da LRA em camundongos. Foi observado que o tratamento com AGCC, protege da LRA. Esta melhora foi associada a uma menor inflamação e menor taxa de apoptose. Além disso, o tratamento com acetato diminuiu a atividade de histona deacetilase. Administrando bactérias produtoras de acetato, também foi possível observar uma proteção da LRA, junto de uma menor inflamação sistêmica. Esta proteção do AGCC na LRA foi também observada em modelo de LRA secundária à sepse In vitro, o tratamento com AGCC modularam tanto células imunes como células renais sob estímulos inflamatórios e de hipóxia. AGCC modulam processos inflamatórios no rim via ações epigenéticas ou não, podendo ser uma promissora ferramenta na proteção da LRA. / Short-Chain Fatty Acids (SCFA) are produced by the intestinal microbiota and have anti-inflammatory and histone deacetylases inhibitors properties. Acute kidney injury (AKI) is characterized by renal inflammation that may impair kidney function. This project evaluated whether treatment with SCFA inflammatory impacts the outcomes of AKI in mice. It was observed that treatment with SCFA protected the AKI. This improvement was associated with less inflammation and lower apoptosis rate. In addition, treatment with acetate decreased the activity of histone deacetylase. Giving bacteria producing acetate, was also observed protection from AKI, along with a lower systemic inflammation. This protection of the AGCC in AKI was also observed in sepsis model. In vitro, SCFA treatment modulated both immune cells and renal cells under hypoxia and inflammatory stimuli. SCFA modulate inflammatory processes in the kidney via epigenetic actions or not, may be a promising tool in the protection of the AKI.

A tolerância operacional (TO) é um estado de estabilidade funcional do órgão transplantado, após a parada de drogas imunossupressoras, por um período maior ou igual a um ano. Os microRNAs são pequenas moléculas de RNA não codificantes que regulam, negativamente, a expressão gênica de seus alvos, incluindo de moléculas relacionadas ao sistema imune, desempenhando um papel crítico na manutenção da homeostase. Nosso objetivo foi determinar se há um perfil diferencial de microRNAs na TO no transplante renal humano, indicando sua potencial participação nos mecanismos de tolerância. Analisamos o perfil sérico dos níveis de microRNAs na tolerância operacional (TO) (n= 8), comparando com rejeição crônica (RC) (n= 5), estáveis em uso de imunossupressão convencional (EST) (n= 5) e indivíduos saudáveis (SAU) (n= 5), utilizando, inicialmente, um painel de primers para 768 miRNAs, pela tecnologia TLDA (TaqMan Low Density Array). Detectamos um perfil diferencial nos níveis de microRNAs entre TO e o seu desfecho clínico oposto - RC- sugerindo que microRNAs podem integrar a rede de mecanismos envolvidos na tolerância ao transplante. Nesse perfil diferencial, alguns tiveram níveis maiores na TO: miR-885-5p (p=0,031), miR-331 (p=0,009), miR-27a (p=0,033), em comparação com RC, enquanto outros, o miR-1233-3p (p=0,029), miR-572 (p=0,028), miR-1260a (p=0.017) e o miR-638 (p=0,047) apresentaram menores níveis na TO. Na comparação de TO com o estado fisiológico (SAU), 2 dos microRNAs do perfil diferencial TO x RC apresentaram níveis diminuídos na TO: miR-27a-5p, (p=0,033) miR-1260a (p=0,017) e, para os demais, não encontramos diferenças de níveis, indicando predomínio de preservação do perfil na TO, em relação ao estado fisiológico. Por bioinformática, foram preditas vias de sinalização e observamos que os genes alvos desses microRNAs tiveram, predominantemente, relação com morte celular, integrando as vias de granzima e receptor de morte. Considerando os diversos alvos dos microRNAs do perfil diferencial e seus potenciais efeitos de favorecer vida e morte, nessas duas vias, encontramos uma razão de vida/morte de 1,95 na TO e de 0,39 na RC, indicando o maior potencial de promoção de morte na RC e, de vida, na TO, pela ação desses microRNAs. Esses dados indicam que a regulação de vias relacionadas à morte celular pode integrar os mecanismos de tolerância imunológica no transplante renal humano. Selecionamos o miR-885-5p para validar os achados, em um número maior de amostras, e confirmamos maiores níveis na TO (n=8), em relação à RC (n=12; p=0,0063) e também em relação ao SAU (n=12; p=0,0035). Considerando que CASP3 é um dos alvos do miR-885, interpretamos que a sua ação, na TO, pode promover a menor expressão de CASP3 e, consequentemente, favorecer a sobrevivência celular. Concluímos que mecanismos epigenéticos podem integrar a rede de mecanismos da tolerância ao transplante, como por meio da ação de microRNAs regulando a expressão de genes envolvidos com sobrevida/morte celular / Operational tolerance (OT) is a state of functional stability of the transplanted organ, after stopping immunosuppressive drugs for a period of at least one year. MicroRNAs are small non-coding RNA that downregulate gene expression of their targets, including genes related to the immune system, playing a critical role in keeping homeostasis. Our objective was to determine whether there is a differential profile of microRNAs in OT in human renal transplantation, indicating their potential participation in the mechanisms of tolerance. We analyzed the serum profile of microRNAs levels in operational tolerance (OT) (n = 8), compared with chronic rejection (CR) (n=5), stable subjects using conventional immunosuppression (STA) (n = 5) and healthy individuals (HI) (n = 5), initially using a panel of primers for 768 miRNAs, by TaqMan Low Density Array (TLDA) technology. We detected a differential profile in the levels of microRNAs between OT and its opposing clinical outcome - CR - suggesting that the microRNAs can integrate the network of mechanisms involved in human transplantation tolerance. Within this differential profile, some microRNAs showed higher levels in OT: miR-885-5p (p = 0.031), miR-331 (p = 0.009), miR-27a (p = 0.033) compared to CR, while others, miR-1233-3p (p = 0.029), miR-572 (p = 0.028), miR-1260a (p=0.017) and miR-638 (p = 0.047) had lower levels in OT. Comparing OT with the physiological state (HI), 2 microRNAs of the differential profile presented decreased levels in OT: miR-27a-5p, (p = 0.033) miR-1260a (p = 0.017) but no differences for the others, indicating the predominance of preservation of the profile in OT, in relation to the physiological state. Using bioinformatics, we predicted signaling pathways and we found that the target genes of these microRNAs were, predominantly, related to cell death, integrating the granzyme and death receptor pathways. Considering the various targets of the microRNAs comprised in the differential profile and their potential life-and-death effects, in these two pathways, we found a life-to-death ratio of 1.95 in OT and 0.39 in CR, indicating the greater potential to promote death in CR, and life in OT, by the action of these microRNAs. These data indicate that the regulation of pathways related to cell death may integrate the mechanisms of immune tolerance in human renal transplantation. We selected miR-885-5p to validate the findings in a larger number of subjects, and confirmed higher levels in OT (n = 8), in relation to CR (n = 12, p = 0.0063) and in relation to HI (n = 12, p = 0.0035). Considering that CASP3 is a relevant target of miR-885, we interpret that its action in OT can promote a decrease in CASP3 expression and, consequently, favor the preservation of cell survival. We conclude that epigenetic mechanisms can integrate the network of mechanisms of transplantation tolerance, such as by the action of microRNAs, regulating the expression of genes involved in cell survival and death

A compensação da dosagem gênica entre fêmeas XX e machos XY em mamíferos é adquirida através de um complexo mecanismo epigenético que resulta na inativação de grande parte de um dos cromossomos X nas células femininas. O processo de inativação do cromossomo X (XCI) se inicia cedo durante a embriogênese, concomitantemente à diferenciação celular, e envolve a aquisição de modificações epigenéticas características do cromossomo X inativo (Xi). Uma estabelecido, o padrão de inativação é estavelmente mantido através de todas as mitoses celulares subsequentes e por toda a vida do organismo (exceto para células germinativas que sofrem reativação do Xi). Os mecanismos envolvidos na iniciação e estabelecimento da XCI foram extensivamente estudados, especialmente em camundongos. Embora algumas características epigenéticas associadas à manutenção da XCI tenham sido descritas, a identidade e modo específico de ação de fatores envolvidos durante essa fase da XCI são aspectos ainda não bem compreendidos. Além disso, o processo de XCI apresenta diferenças importantes entre humanos e camundongos e estudos direcionados para a identificação de novos componentes envolvidos na manutenção da XCI em humanos tornam-se de fundamental importância. Triagens funcionais genômicas por bibliotecas de shRNAs constituem uma ferramenta poderosa para a identificação de genes envolvidos em diferentes mecanismos celulares e vias bioquímicas. Sendo assim, utilizamos essa ferramenta para triar genes envolvidos na manutenção da XCI em humanos. Células somáticas femininas primárias HPRT+/-/HPRT- foram transduzidas com uma biblioteca lentiviral de shRNAs e posteriormente tratadas em meio de cultura contendo a droga HAT para seleção de células HPRT+ nas quais esperava-se que o cromossomo Xi presente tivesse sofrido reativação em decorrência do knockdown de genes envolvidos na manutenção da XCI. Essa estratégia nos permitiu identificar 20 novos genes candidatos a estarem envolvidos na manutenção da XCI. Esses candidatos deverão ser avaliados individualmente para confirmar seu papel no processo de controle epigenético do cromossomo X / Transcriptional dosage compensation between mammalian XX females and XY males is acquired through a complex epigenetic mechanism that leads to the inactivation of most part of one of the X chromosomes in the female cells. The X chromosome inactivation (XCI) process takes place early during embryogenesis and involves the acquisition of epigenetic modifications that are characteristic of the inactive X chromosome (Xi). Once silencing is established, the inactivation pattern is maintained in through all the subsequent mitosis and the same X chromosome remains stably silenced in all the descendant cells and throughout the life of the organism (except for the germ line cells that undergo X chromosome reactivation). The initiation of XCI has been studied extensively, especially in mice. Although some epigenetic features associated with the maintenance of XCI have already been described, the identity and specific mode of action of the factors involved in this phase of XCI are largely unknown. Moreover, the XCI process presents important differences between mice and humans, and studies directed to the identification of new players involved in the maintenance of human XCI are fundamentally important. Functional genome-wide screens using multiplex shRNA libraries are a powerful tool for the identification of genes involved in different cellular mechanisms and biochemical pathways. In order to screen for genes involved in the maintenance of XCI in humans, a population of HPRT+/-/HPRT- primary somatic female cells were transduced with a multiplex lentiviral shRNA library and subsequently treated in HAT medium to select for HPRT+ cells in which we expected that the Xi would undergo reactivation as a result of the knockdown of genes involved in the maintenance of XCI. As a result, we identified 20 new candidate genes that could potentially be involved in the maintenance of XCI. These candidates should be individually evaluated in order to confirm their role in the epigenetic control of the X chromosome

Os genes homeobox atuam como reguladores da morfogênese e diferenciação celular embrionária, portanto, é evidente a possibilidade de sua expressão anormal estar presente na progressão de tumores. Estudos preliminares em nosso laboratório verificaram a participação de alguns genes homeobox em carcinoma epidermóide de boca (CEB). Este trabalho teve como objetivo avaliar a amplificação, expressão e o perfil de metilação dos genes HOXA5, HOXA7, HOXA9, HOXB5, HOXB13, HOXC12 em linhagem celular derivadas de CEB e tecidos frescos tumoral e não-tumoral. Além disso, verificar o efeito da desmetilação na expressão gênica de linhagens celulares que apresentaram genes 100% metilados e a participação das enzimas responsáveis pela metilação do DNA, bem como a expressão das DNAmetiltransferases (DNMT) nos tumores. A análise de amplificação do DNA e expressão de mRNA foi realizada por qRT-PCR. O perfil de metilação foi avaliada pelo sistema PCR Array e a análise proteica das DNMT1, DNMT3a, DNMT3b e HOXA9 foi verificada por meio de reações imunohistoquímicas. As linhagens celulares SCC4 e SCC9 foram utilizadas para análise de desmetilação com 5-aza-2\'-deoxicitidina e a linhagem SCC4 para avaliar os efeitos do aumento de expressão do HOXA9, na proliferação celular por imunocitoquimica para Ki67, migração celular por transwell e apoptose pela avaliação de células positivas no ensaio de TUNEL. Na comparação entre os grupos, o gene HOXA5 apresentou-se amplificado na margem em relação ao tumor; o HOXA9 apresentou nível de metilação aumentada no tumor; o HOXB5 com amplificação maior na margem, com nível de expressão do mRNA aumentada nos tumores, e nível de metilação do tumor maior em relação a margem, sendo correlacionada com menor sobrevida; HOXB13 se apresentou amplificado no tumor em relação a margem, e com nível de metilação maior nos tumores e, HOXC12 com níveis de metilação maior nos tumores em relação a margem. É interessante, que os mesmos genes que tiveram níveis de metilação aumentados nos tumores em relação a margem, também estavam 100% metilados nas linhagens celulares SCC4 e SCC9 e tiveram sua expressão restaurada após o tratamento com 5-aza-2´-deoxicitina. Na avaliação do nível de expressão das DNMTs nos tumores, a DNMT3b apresentou-se com níveis aumentados em relação a DNMT1 e DNMT3a, e quando avaliado em nível proteico, a DNMT3a pode ser correlacionada com melhor sobrevida. O aumento da expressão do gene HOXA9 mostrou diminuição da migração celular, porém não alterou a proliferação e apoptose celular. A expressão proteica não apresentou correlação com parâmetros clínicos. Em conclusão, os resultados mostram que os genes homeobox estudados estão pouco metilados nas linhagens celulares e em tecidos de CEB. A amplificação desses genes não é um evento frequente. O gene HOXA9 é pouco expresso no tumor, e o aumento da sua expressão em linhagens celulares diminui a migração celular. / Homeobox genes are important as morphogenetic and embrionary cellular differentiation regulators, therefore there is basis for their abnormal expression in tumor progression. Preliminary studies in our laboratory have shown that homeobox genes are dysregulated in oral squamous cell carcinoma (OSCC). This study evaluates the genomic amplification, mRNA expression and methylation status of HOXA5, HOXA7, HOXA9, HOXB5, HOXB13, HOXC12 in squamous cell carcinoma derived cell lines, and fresh tumor tissue. Also, analyzes the demethylation effect in gene expression of cell lines with genes showing 100% methylation, and the participation of enzymes responsible for DNA methylation, DNAmetiltransferases (DNMT), in gene and protein expression in tumors. DNA amplification and mRNA expression was analyzed by qRT-PCR. The methylation profile was evaluated by PCR Array System and DNMT1, DNMT3a, DNMT3b and HOXA9 protein expression was verified by immunohistochemistry. SCC4 and SCC9 cell lines were submitted to 5-aza-2\'-deoxycytidine for demethylation analysis. SCC4 cell lineage was analyzed by immunocytochemistry for Ki67, cell migration by transwell and apoptosis by TUNEL test after increased expression of HOXA9. HOXA5 gene was amplified in the adjacent margin when compared with the tumor; HOXA9 showed increased level of methylation in tumor; HOXB5 showed amplification in the margin, increased mRNA expression in tumors, increased methylation level and was correlated with decreased survival; HOXB13 was amplified in tumor samples when compared to the margins and also higher methylation level in tumors; and HOXC12 also showed increased methylation levels in tumors when compared to margin. Interestingly, the same genes with increased methylation levels in tumors, were also 100% methylated in cell lines SCC4 and SCC9. The expression of these gens was restored after treatment with 5-aza-2\'-deoxycytidine. DNMT3b presented higher levels of protein expression relative to DNMT1 and DNMT3a. DNMT3a protein expression was correlated with improved survival. SCC4 cells overexpressing HOXA9 gene showed decreased cell migration, with no effect on cell proliferation and apoptosis. HOXA9 protein expression was not correlated with clinical parameters. In conclusion, the results shows that homeobox genes are methylated in some OSCC cell lines and tissues. Amplification of these genes is not a frequent event. HOXA9 gene has low expression in OSCC, and when overexpressed in cell lines decreases cell migration.

A reprogramação nuclear de uma célula somática a um estado embrionário tem diversas aplicações, como pesquisas básicas na biologia do desenvolvimento, terapia celular, melhoramento genético em animais de produção e conservação de espécies. As principais técnicas utilizadas para a reprogramação nuclear são a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) e a geração de células tronco pluripotente induzidas (iPS). Muitos trabalhos têm mostrado uma baixa eficiência no processo de reprogramação nuclear nas duas técnicas, além disso, modificações epigenéticas tem sido apontada como a principal barreira para uma reprogramação nuclear eficiente. Por esse motivo, medidas como a utilização de células menos diferenciadas e/ou alteração do perfil epigenético das células somáticas podem aumentar a eficiência destas técnicas. Por isso, o objetivo deste trabalho foi investigar a influência de marcas epigenéticas em células bovinas utilizadas na reprogramação nuclear mediada por TNCS ou superexpressão de genes relacionados a pluripotêcia (iPS). Para isso, utilizamos 3 abordagens. Primeiro, analisamos marcações epigenéticas relacionadas ao desenvolvimento embrionário e pluripotência (H3K9me2, H3K9me3, H3K9ac, 5mC e 5hmC) em diferentes tipos celulares, analisamos a expressão gênica de genes responsáveis por essas marcações em células de diferentes tecidos (ex. células tronco mesenquimais (MSC) e fibroblastos) e as utilizamos como doadoras de núcleo na TNCS. Na segunda e a terceira abordagem, utilizamos células com menores níveis de H3K9me2 para a geração de iPS e na TNCS, respectivamente. Além disso, por se mostrar eficiente na TNCS, analisamos o efeito da sincronização do ciclo celular por privação de soro fetal bovino (SFB) na geração de células iPS. Com o intuito de diminuir os níveis de H3K9me2, as células foram tratadas com UNC0638, um inibidor especifico das metiltransferases de histona G9a/GLP. Nossos resultados do primeiro experimento mostraram que as MSC podem ser utilizadas como doadoras de núcleo na TNCS, no entanto, mesmo com algumas diferenças na expressão gênica em relação aos fibroblastos, a produção de blastocistos não foi diferente entre as duas células. No segundo experimento, as células privadas de SFB geraram mais colônias que as células controle, enquanto que as células tratadas não apresentaram diferença. Por último, as células tratadas com o UNC0638 apresentaram um menor nível de metilação no DNA em zigotos em relação às células controle. Os resultados encontrados neste trabalho podem contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos epigenéticos envolvidos na reprogramação nuclear de bovinos / Nuclear reprogramming of somatic cells to embryonic state has several aplications, such as basic research on developmental biology, cell therapy, genetic improvement in livestock animals and preservation of endangered species. The principal techniques utilized to achieve nuclear reprogramming are Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) and induced pluripotency. Several works has reported low efficiency rates of nuclear reprogramming when these techniques are used to reprogram somatic cells. Moreover, epigenetic modifications acquired during development act as epigenetic barrier to the complete reprogramming process. For this reason, strategies such as use of less differentiated cells and/or modification of epigenetic profile of somatic cells might increase the efficiency these techniques. The objective of this work was investigate the influence of epigenetic marks in bovine cells utilized on nuclear reprogramming experiments mediated by SCNT or induced pluripotency. To investigate it, we used three approaches. First, we analyzed the epigenetic marks related to the embryonic development and pluripotency (e.g H3K9me2, H3K9me3, H3K9ac, 5mC and 5hmC), gene expression of genes involved in these epigenetic marks in different tissues (i.e. mesenchymal stem cells (MSC) and fibroblasts) and their use as nuclear donor cells on SCNT procedure. Regarding the second and the third approach, we utilized cells with reduced levels of H3K9me2 to generate iPS cells and cloned embryos, respectively. Furthermore, since serum starvation has been demonstrated increase SCNT developmental rates, we assessed the effect of cell cycle synchronization mediated by serum starvation on nuclear reprogramming using iPS cells. Aiming decrease the levels of H3K9me2, cells were treated with UNC0638, a chemical probe that works as a specific inhibitor of the histone methyltransferases G9a and its counterpartner GLP. Our results showed that MSC are suitable to be used as nuclear donors on SCNT procedures, however, in spite of differences on gene expression comparing with fibroblasts, the embryonic developmental rates were not improved. On the second experiment, cells privated of fetal calf serum produced more iPS cells colonies than control cells, whereas cells treated with UNC did not show differences when compared with untreated cells. Lastly, UNC treated donor cells treated produced cloned zygotes with lower levels of DNA methylation compared to zygotes derivated from untreated cells. The results presented here will contribute to the better understanding of the epigenetic mechanisms involved on bovine nuclear reprogramming