Diese Arbeit untersucht den Zusammenhang zwischen Mechanismen der translationalen Regulation und der Genomorganisation in Bakterien. Der erste Teil der Arbeit analysiert die Beziehung zwischen der Translationseffizienz von Genen und der Häufigkeit bestimmter Codons am Genanfang. Es ist bekannt, dass die Häufigkeitsverteilung der Codons am Anfang der Gene bei einigen Organismen eine andere ist als sonst im Genom. Durch die systematische Analyse von ungefähr 400 bakteriellen Genomen, evolutionären Simulationen und experimentellen Untersuchungen sind wir zu dem Schluss gekommen, dass die beobachtete Abweichung der Codonhäufigkeiten wohl eine Konsequenz der Notwendigkeit ist, RNA Sekundärstruktur in der Nähe des Translationsstarts zu vermeiden und somit eine effiziente Initiation der Translation zu gewährleisten. Im zweiten Teil der Arbeit untersuchen wir den Einfluss der Genreihenfolge innerhalb eines Operons auf die Fitness von E. coli. In bakteriellen Genomen vereint ein Operon funktionell zusammengehörige Gene, die in einer mRNA zusammen transkribiert werden und somit in der Expression stark korreliert sind. Daneben kann die translationale Kopplung, d. h. die Interdependenz der Translationseffizienz zwischen benachbarten Genen innerhalb einer solchen mRNA, eine bestimmte Proteinstöchiometrie weiter stabilisieren. Mithilfe eines Modells für die translationale Kopplung sowie für den Chemotaxis Signalweg konnten wir zeigen, dass die native Genreihenfolge eine der Permutationen ist, die am meisten zur Robustheit der Chemotaxis beitragen. Die translationale Kopplung ist daher ein wichtiger Faktor, der die Anordnung der Gene innerhalb des Chemotaxis Operon bestimmt. Diese Arbeit zeigt, dass die Anforderungen einer effizienten Genexpression sowie die Robustheit wichtiger zellulärer Funktionen einen Einfluss auf die Organisation eines Genoms haben können: einerseits bei der Wahl der Codons am Anfang der Gene, andererseits auf die Ordnung der Gene innerhalb eines Operons. / This work investigates the relationship between mechanisms of translational regulation and genome organization in bacteria. The first part analyzes the connection between translational efficiency and codon usage at the beginning of genes. It is known for some organisms that usage of synonymous codons at the gene start deviates from the codon usage elsewhere in the genome. By analyzing about 400 bacterial genomes, evolutionary simulations and experimental investigations, we conclude that the observed deviation of codon usage at the beginning of genes is most likely a consequence of the need to suppress mRNA structure around the ribosome binding site, thereby allowing efficient initiation of translation. We investigate further driving forces for genome organization by studying the impact of gene order within an operon on the fitness of bacterial cells. Operons group functionally related genes which are transcribed together as single mRNAs in E. coli and other bacteria. Correlation of protein levels is thus to a large extent attributed to this coupling on the transcriptional level. In addition, translational coupling, i.e. the interdependence of translational efficiency between neighboring genes within such a mRNA, can stabilize a desired stoichiometry between proteins. Here, we study the role of translational coupling in robustness of E. coli chemotaxis. By employing a model of translational coupling and simulating the underlying signal transduction network we show that the native gene order ranks among the permutations contributing most to robustness of chemotaxis. We therefore conclude that translational coupling is an important determinant of the gene order within the chemotaxis operon. Both these findings show that requirements for efficient gene expression and robustness of cellular function have a pronounced impact on the genomic organization, influencing the local codon usage at the beginning of genes and the order of genes within operons.

Für die erfolgreiche Lösung eines Optimierungsproblems ist die Wahl der verwendeten Suchstrategie von entscheidender Bedeutung. Die vorliegende Arbeit untersucht die Kriterien dieser Wahl. Dabei stellen sich drei grundlegende Fragen: Welche Strategien der Optimierung eines gegebenen Problems existieren überhaupt, und was für Eigenschaften besitzen sie? Wodurch wird der Charakter eines Optimierungsproblems bestimmt, und gibt es Klassen ähnlicher Probleme? Besteht eine Verbindung zwischen den Eigenschaften der Strategien und den Klassen der Probleme, die es ermöglicht, für jede Problemklasse eine geeignete Optimierungsstrategie anzugeben? Dazu wird zuerst die Klasse der Evolutionären Algorithmen naher betrachtet, deren generelles Verhalten die Boltzmannstrategie, Darwinstrategie oder Boltzmann-Darwin-Strategie beschreiben. Als weiteres Beispiel wird die Multitome Strategie untersucht. In ihr wird das Problem unter verschiedenen Gesichtspunkten betrachtet und in Einzelanforderungen zerlegt, die abwechselnd optimiert werden. Für den speziellen Fall der Dichotomen Strategie wird die allgemeine zeitabhängige Lösung mit Hilfe der Methode der Charakteristiken bestimmt. Zur Beantwortung der zweiten Frage wird die Zustandsdichte als klassifizierende Größe des Optimierungsproblems eingeführt. Sie kann unter Verwendung der Boltzmannstrategie während des Optimierungslaufes durch zwei allgemeine Approximationsmethoden: die Methode der stationären Verteilungen und die Eigenvektormethode bestimmt werden. Aus der Zustandsdichte erhält man den Wirkungsgrad der Zufallssuche. Er charakterisiert den Ordnungsgrad des Problems und stellt damit ein wichtiges Maß der Problemschwierigkeit dar. Die entscheidende dritte Frage wird für Probleme der Optimierung frustrierter Sequenzen, der Netzwerkoptimierung und für das Faltungsproblem der RNA behandelt. Mit der Einführung der Klassen gerichteter und ungerichteter Strategien, die für Optimierungsprobleme mit niedrigem bzw. hohem Wirkungsgrad der Zufallssuche effektiv sind, kann eine Verbindung zwischen dem Strategieverhalten und dem Problemcharakter hergestellt werden, die es ermöglicht, für eine konkrete Optimierungsaufgabe die Klasse der geeigneten Strategien zu wählen. / A crucial point of successful solving an optimization problem is the choice of the used strategy. The present paper investigates the criteria of this choice. Thereby three fundamental questions put themselves: Which strategies of the optimization of a given problem exist altogether, and which properties characterize the strategies? How is the character of an optimization problem determined, and are there classes of similar problems? Does a combination exist between the characteristics of the strategies and the classes of problems, which makes it possible to indicate a suitable strategy for each class? The class of the Evolutionary Algorithms is considered more closely. The general behavior of the algorithms can be described by the Boltzmann strategy, Darwin strategy or Boltzmann-Darwin strategy. As a further example the Multitomic strategy is explored. In this approach the problem is considered under different points of view and decomposes in single demands, which are optimized alternately. For the special case of the Dichotomic strategy the general time dependent solution is determined. To answer the second question the density of states is introduced as classifying measure of optimization problems. The density can be determined during the optimization course by two general approaches: the method of the stationary distribution and the eigenvalue method. From the density of states one receives the efficiency of the random search. It describes the degree of order of the problem and presents an measure of the problem difficulty. The important third question is treated for problems of the optimization of frustrated sequences, the network optimization and RNA folding. The introduction of the classes of directed and non directed strategies, which are effective for problems with low and high efficiency of the random search, establishes a connection between the strategy and the character of the problem, which makes it possible to choose the class of the suitable strategies for a given optimization task.

Das Lektin aus <i>Pisum sativum</i>, der Gartenerbse, ist Teil der Familie der Leguminosenlektine. Diese Proteine haben untereinander eine hohe Sequenzhomologie, und die Struktur ihrer Monomere, ein all-ß-Motiv, ist hoch konserviert. Dagegen gibt es innerhalb der Familie eine große Vielfalt an unterschiedlichen Quartärstrukturen, die Gegenstand kristallographischer und theoretischer Arbeiten waren. Das Erbsenlektin ist ein dimeres Leguminosenlektin mit einer Besonderheit in seiner Struktur: Nach der Faltung in der Zelle wird aus einem Loop eine kurze Aminosäuresequenz herausgeschnitten, so dass sich in jeder Untereinheit zwei unabhängige Polypeptidketten befinden. Beide Ketten sind aber stark miteinander verschränkt und bilden eine gemeinsame strukturelle Domäne. Wie alle Lektine bindet Erbsenlektin komplexe Oligosaccharide, doch sind seine physiologische Rolle und der natürliche Ligand unbekannt. In dieser Arbeit wurden Versuche zur Entwicklung eines Funktionstests für Erbsenlektin durchgeführt und seine Faltung, Stabilität und Monomer-Dimer-Gleichgewicht charakterisiert. Um die spezifische Rolle der Prozessierung für Stabilität und Faltung zu untersuchen, wurde ein unprozessiertes Konstrukt in <i>E. coli</i> exprimiert und mit der prozessierten Form verglichen. <br /> <br /> Beide Proteine zeigen die gleiche kinetische Stabilität gegenüber chemischer Denaturierung. Sie denaturieren extrem langsam, weil nur die isolierten Untereinheiten entfalten können und das Monomer-Dimer-Gleichgewicht bei mittleren Konzentrationen an Denaturierungsmittel auf der Seite der Dimere liegt. Durch die extrem langsame Entfaltung zeigen beide Proteine eine apparente Hysterese im Gleichgewichtsübergang, und es ist nicht möglich, die thermodynamische Stabilität zu bestimmen. Die Stabilität und die Geschwindigkeit der Assoziation und Dissoziation in die prozessierten bzw. nichtprozessierten Untereinheiten sind für beide Proteine gleich. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch unter nicht-denaturierenden Bedingungen die Untereinheiten zwischen den Dimeren ausgetauscht werden.<br /> <br /> Die Renaturierung der unprozessierten Variante ist unter stark nativen Bedingungen zu 100 % möglich. Das prozessierte Protein dagegen renaturiert nur zu etwa 50 %, und durch die Prozessierung ist die Faltung stark verlangsamt, der Faltungsprozess ist erst nach mehreren Tagen abgeschlossen. Im Laufe der Renaturierung wird ein Intermediat populiert, in dem die längere der beiden Polypeptidketten ein Homodimer mit nativähnlicher Untereinheitenkontaktfläche bildet. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Renaturierung ist die Assoziation der entfalteten kürzeren Kette mit diesem Dimer. / The lectin from <i>Pisum sativum</i> (garden pea) is a member of the family of legume lectins. These proteins share a high sequence homology, and the structure of their monomers, an all-ß-motif, is highly conserved. Their quaternary structures, however, show a great diversity which has been subject to cristallographic and theoretical studies. Pea lectin is a dimeric legume lectin with a special structural feature: After folding is completed in the cell, a short amino acid sequence is cut out of a loop, resulting in two independent polypeptide chains in each subunit. Both chains are closely intertwined and form one contiguous structural domain. Like all lectins, pea lectin binds to complex oligosaccharides, but its physiological role and its natural ligand are unknown. In this study, experiments to establish a functional assay for pea lectin have been conducted, and its folding, stability and monomer-dimer-equilibrium have been characterized. To investigate the specific role of the processing for stability and folding, an unprocessed construct was expressed in <i>E. coli</i> and compared to the processed form.<br /> <br /> Both proteins have the same kinetic stability against chemical denaturant. They denature extremely slowly, because only the isolated subunits can unfold, and the monomer-dimer-equilibrium favors the dimer at moderate concentrations of denaturant. Due to the slow unfolding, both proteins exhibit an apparent hysteresis in the denaturation transition. Therefore it has not been possible to determine their thermodynamic stability. For both proteins, the stability and the rates of association and dissociation into processed or unprocessed subunits, respectively, are equal. Furthermore it could be shown that even under non-denaturing conditions the subunits are exchanged between dimers.<br /> <br /> Renaturation of the unprocessed variants is possible under strongly native conditions with 100 % yield. The processed protein, however, can be renatured with yields of about 50 %, and its refolding is strongly decelerated. The folding process is finished only after several days. During renaturation, an intermediate is populated, in which the longer of the two polypeptide chains forms a homodimer with a native-like subunit interface. The rate limiting step of renaturation is the association of the unfolded short chain with this dimer.

Introducing a new method for measureing ultra-short laser pulses, the research group "Solid State Light Sources" of the Max Born Institute for Nonlinear Optics and Short Pulse Spectroscopy, Berlin, encountered a new type of autoconvolution problem. The so called SD-SPIDER method aims for the reconstruction of the real valued phase of a complex valued laser pulse from noisy measurements. The measurements are also complex valued and additionally influenced by a device-related kernel function. Although the autoconvolution equation has been examined intensively in the context of inverse problems, results for complex valued functions occurring as solutions and right-hand sides of the autoconvolution equation and for nontrivial kernels were missing. The thesis is a first step to bridge this gap. In the first chapter, the physical background is explained and especially the autoconvolution effect is pointed out. From this, the mathematical model is derived, leading to the final autoconvolution equation. Analytical results are given in the second chapter. It follows the numerical treatment of the problem in chapter three. A regularization approach is presented and tested with artificial data. In particular, a new parameter choice rule making use of a specific property of the SD-SPIDER method is proposed and numerically verified. / Bei der Entwicklung einer neuen Methode zur Messung ultra-kurzer Laserpulse stieß die Forschungsgruppe "Festkörper-Lichtquellen" des Max-Born-Institutes für Nichtlineare Optik und Kurzzeitspektroskopie, Berlin, auf ein neuartiges Selbstfaltungsproblem. Die so genannte SD-SPIDER-Methode dient der Rekonstruktion der reellen Phase eines komplexwertigen Laserpulses mit Hilfe fehlerbehafteter Messungen. Die Messwerte sind ebenfalls komplexwertig und zusätzlich beeinflusst von einer durch das Messprinzip erzeugten Kernfunktion. Obwohl Selbstfaltungsgleichungen intensiv im Kontext Inverser Probleme untersucht wurden, fehlen Resultate für komplexwertige Lösungen und rechte Seiten ebenso wie für nichttriviale Kernfunktionen. Die Diplomarbeit stellt einen ersten Schritt dar, diese Lücke zu schließen. Im ersten Kapitel wird der physikalische Hintergrund erläutert und insbesondere der Selbstfaltungseffekt erklärt. Davon ausgehend wird das mathematische Modell aufgestellt. Kapitel zwei befasst sich mit der Analysis der Gleichung. Es folgt die numerische Behandlung des Problems in Kapitel drei. Eine Regularisierungsmethode wird vorgestellt und an künstlichen Daten getestet. Insbesondere wird eine neue Regel zur Wahl des Regularisierungsparameters vorgeschlagen und numerisch bestätigt, welche auf einer speziellen Eigenschaft des SD-SPIDER Verfahrens beruht.

Die vorliegende Arbeit untersucht die Struktur der Untereinheit B des natriumabhängigen Kplus-Aufnahmesystems KtrAB aus Vibrio alginolyticus. Sie gehört zu einer Superfamilie von Kaliumtransportproteinen, die auf der im KcsA-Kanal gefundenen MPM-Topologie beruht. Eine MPM-Domäne besteht aus zwei Transmenbranhelices, die durch einen in die Membran zurückgefalteten P-Loop verbunden sind. Im KcsA-Kanal arrangieren sich vier dieser Untereinheiten um eine zentrale Pore. Im Unterschied zum KcsA-Kanal aus S. lividans sind in dieser Superfamilie die MPM-Domänen durch cytoplasmatische Loops miteinander verbunden. Die KtrB-Topologie beruht zur Zeit nur auf Modellen und wird in dieser Arbeit genauer untersucht. Dabei konnte die MPM-Faltung mittels PhoA-Fusionen für die Bereiche B-D von VaKtrB bestätigt, und die sogenannte Turret -Struktur, wie sie im KcsA-Kanal gefunden wurde, nachgewiesen werden. Bei Modellierungstudien der KtrB-Topologie fiel im Besonderen die M2C-Helix auf, woraufhin Durell und Guy drei Unterteilungen für diesen Bereich vorschlugen: M2C1: alpha-Helix; M2C2: flexibler Bereich; M2C3: teilweise amphiphile Helix. Es herrschen zwei Modelle dieser Helix vor, wobei sie sich vor allem in der Lokalisation von M2C2 und M2C3 unterscheiden. Im ersten bildet M2C2 einen gestreckten Übergang von M2C1 zu M2C3, die waagerecht in die Membranoberfläche eingelagert ist. Im 2. Modell liegt M2C2 innerhalb der Kavität als Schleife vor und M2C3 steckt senkrecht in der Membranoberfläche. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten (Cysteinzugänglichkeit für Maleimide, PhoA-Fusionen, ESR-Spektroskopie) erhärten das 1. Modell und unterstützen die These, dass M2C2 einen flexiblen Bereich innerhalb von M2C bildet, der wichtig für den Transport bzw. dessen Regulation ist. Die Faltung der M2C-Helix konnte allerdings nicht abschließend geklärt werden. Desweiteren deuten die Daten dieser Arbeit auf eine wässrige Verbindung bis tief in KtrB vom Periplasma her hin.

Relatively little is known about the folding and stability of membrane proteins. Conventional thermal or chemical unfolding techniques probe the average behavior of large numbers of molecules and thus cannot resolve co-existing minor and major unfolding pathways and intermediates. Here, I applied single-molecule force measurements based on an atomic force microscope (AFM) to characterize the stability of the membrane protein bacteriorhodopsin (BR). In these mechanical unfolding experiments, an external pulling force played the role of the denaturant and lead to unfolding of the three-dimensional structure of individual proteins. It was found that single BRs unfold step-wise in a well-defined sequence of stable intermediates and in different unfolding pathways. Although single [alpha]-helices were sufficiently stable to unfold in individual steps they also exhibited certain probabilities to unfold in pairs. These observations support the &amp;quot;two-stage&amp;quot; and the &amp;quot;helical-hairpin&amp;quot; model of membrane protein folding. Dynamic force measurements showed that [alpha]-helices and helical hairpins are relatively rigid structures, which are stabilized by narrow energy barriers and have stabilities between 100-10?000 seconds. These forced unfolding experiments were complemented with the development of new force measurement techniques. It is demonstrated that hydrodynamic effects need to be considered to obtain more complete kinetic pictures of single molecules. In addition, two force spectroscopy approaches to measure the complex visco-elastic response of single molecules are presented and applied to BR. These experiments revealed that the unfolding patterns of single proteins are dominated by purely elastic polypeptide extension and determined the dissipative interactions associated with the unfolding of single [alpha]-helices. In addition, it was found that kinks result in a reduced unfolding cooperativity of [alpha]-helices.

Die Proteinfaltung ist ein Prozess der molekularen Selbstorganisation, bei dem sich eine lineare Kette von Aminosäuren zu einer definierten, funktionellen dreidimensionalen Struktur zusammensetzt. Der Prozess der Faltung ist ein thermisch getriebener diffusiver Prozess durch eine Gibbs-Energie-Landschaft im Konformationsraum für die Struktur der minimalen Energie. Während dieses Prozesses zeigt die freie Enthalpie des Systems nicht immer eine monotone Abnahme; stattdessen führt eine suboptimale Kompensation der Enthalpie- und der Entropieänderung während jedes Faltungsschrittes zur Bildung von Freien-Enthalpie-Faltungsbarrieren. Diese Barrieren und damit verbundenen hochenergetischen Übergangszustände, die wichtige Informationen über Mechanismen der Proteinfaltung enthalten, sind jedoch kinetisch unzugänglich. Um den Prozess der Barrierebildung und die strukturellen Merkmale von Übergangszuständen aufzudecken, werden Proteine genutzt, die über barrierefreie Pfade falten – so genannte “downhill folder“. Aufgrund der geringen Faltungsbarrieren werden wichtige Interaktionen der Faltung zugänglich und erlauben Einblicke in die ratenbegrenzenden Faltungsvorgänge. In dieser Arbeit vergleichen wir die Faltungsdynamiken von drei verschiedenen Varianten eines Lambda-Repressor-Fragments, bestehend aus den Aminosäuren 6 bis 85: ein Zwei-Zustands-Falter λWT (Y22W) und zwei downhill-folder-artige Varianten, λYA (Y22W/Q33Y/ G46,48A) und λHA (Y22W/Q33H/G46,48A). Um auf die Kinetik und die strukturelle Dynamik zu greifen zu können, werden Einzelmolekülkraftspektroskopische Experimente mit optische Pinzetten mit Submillisekunden- und Nanometer-Auflösung verwendet. Ich fand, dass die niedrige denaturierende Kraft die Mikrosekunden Faltungskinetik von downhill foldern auf eine Millisekunden-Zeitskala verlangsamt, sodass das System für Einzelmolekülstudien gut zugänglich ist. Interessanterweise zeigten sich unter Krafteinwirkung die downhill-folder-artigen Varianten des Lambda-Repressors als kooperative Zwei-Zustands-Falter mit deutlich unterschiedlicher Faltungskinetik und Kraftabhängigkeit. Drei Varianten des Proteins zeigten ein hoch konformes Verhalten unter Last. Die modellfreie Rekonstruktion von Freien-Enthalpie-Landschaften ermöglichte es uns, die feinen Details der Transformation des Zwei-Zustands-Faltungspfad direkt in einen downhill-artigen Pfad aufzulösen. Die Auswirkungen von einzelnen Mutationen auf die Proteinstabilität, Bildung der Übergangszustände und die konformationelle Heterogenität der Faltungs- und Entfaltungszustände konnten beobachtet werden. Interessanterweise zeigen unsere Ergebnisse, dass sich die untersuchten Varianten trotz der ultraschnellen Faltungszeit im Bereich von 2 μs in einem kooperativen Prozess über verbleibende Energiebarrieren falten und entfalten, was darauf hindeutet, dass wesentlich schnellere Faltungsraten notwendig sind um ein downhill Limit vollständig zu erreichen. / Protein folding is a process of molecular self-assembly in which a linear chain of amino acids assembles into a defined, functional three-dimensional structure. The process of folding is a thermally driven diffusive search on a free-energy landscape in the conformational space for the minimal-energy structure. During that process, the free energy of the system does not always show a monotonic decrease; instead, sub-optimal compensation of enthalpy and entropy change during each folding step leads to formation of folding free-energy barriers. However, these barriers, and associated high-energy transition states, that contain key information about mechanisms of protein folding, are kinetically inaccessible. To reveal the barrier-formation process and structural characteristics of transition states, proteins are employed that fold via barrierless paths – so-called downhill folders. Due to the low folding barriers, the key folding interactions become accessible, yielding insights about the rate-limiting folding events. Here, I compared the folding dynamics of three different variants of a lambda repressor fragment, containing amino acids 6 to 85: a two-state folder λWT (Y22W) and two downhill-like folding variants, λYA (Y22W/Q33Y/G46,48A) and λHA (Y22W/Q33H/G46,48A). To access the kinetics and structural dynamics, single-molecule optical tweezers with submillisecond and nanometer resolution are used. I found that force perturbation slowed down the microsecond kinetics of downhill folders to a millisecond time-scale, making it accessible to single-molecule studies. Interestingly, under load, the downhill-like variants of lambda repressor appeared as cooperative two-state folders with significantly different folding kinetics and force dependence. The three protein variants displayed a highly compliant behaviour under load. Model-free reconstruction of free-energy landscapes allowed us to directly resolve the fine details of the transformation of the two-state folding path into a downhill-like path. The effect of single mutations on protein stability, transition state formation and conformational heterogeneity of folding and unfolding states was observed. Noteworthy, our results demonstrate, that despite the ultrafast folding time in a range of 2 µs, the studied variants fold and unfold in a cooperative process via residual barriers, suggesting that much faster folding rate constants are required to reach the full-downhill limit.

Präzise regulierte Genexpression, ist der Schlüssel zu erfolgreicher Embryonal-entwicklung. Die Expression von Zelltyp-spezifischen Transkriptionsfaktoren kann durch räumliche Interaktionen von Promotoren und Enhancern im Nukleus kontrolliert werden, aber auch durch 3D Faltung der DNA in größere organisatorische Einheiten wie “Topologically Associating Domains” (TADs) oder “A/B compartments”. Um die 3D Faltung in den Zelltypen des prä-implantations Embryos zu untersuchen, nutze ich ES und XEN Zellen, die stark dem Epiblast und dem primitiven Endoderm in der inneren Zellmasse des E4.5 Embryos ähneln. Um den Zusammenhang zwischen 3D DNA Faltung und zellulärer Identität zu erforschen, habe ich GAM, ATAC-seq und RNA-seq Daten von ES und XEN Zellen produziert. Um die Genom-Architektur im Embryo zu untersuchen, habe ich außerdem die GAM Methode an den Mausembryo angepasst und kann dadurch erstmals genomweit DNA-Faltung in den spezifischen Zelltypen der inneren Zellmasse des prä-implantations Embryos zeigen. ES und XEN Zellen zeigen viele differentiell exprimierte Gene, sowie starke Veränderungen in der Chromatin-Organisation, beispielweise in der Bildung von reprimierten Chromatinnetzwerken in ESCs, die wichtige XEN Gene wie Gata6 und Lama1 enthalten, während diese nicht aktiv sind. XEN-spezifische Genexpression ist oft mit der Präsenz von XEN-spezifischen “TAD boundaries” gekoppelt. Der Sox2 Locus zeigt eine ESC-spezifische Organisation mit aktiven Genen, und Regionen die von den Transkriptionsfaktoren SOX2, NANOG und OCT4 gebunden sind. Die starke Reorganisation der Genom-Architektur in wichtigen Loci wie Gata6 und Sox2 konnte ich mit in vivo GAM Daten bestätigen und finde ähnliche Unterschiede zwischen den beiden Zelltypen der inneren Zellmasse wie im in vitro Model. Diese Ergebnisse zeigen, wie wichtig es ist, Zelltypen getrennt zu untersuchen und, dass eine Verbindung zwischen zellulärer Identität und der Faltung des Genoms in der Embryonalentwicklung besteht. / Tightly controlled gene regulation is key to functional metazoan embryonic development. The expression of cell-fate determining transcription factors orchestrates the establishment of the various lineages of the embryo. Gene expression is often regulated via specific chromatin organisation. To investigate cell type-specific differences in chromatin folding in early embryonic development, I used in vitro models of the two distinct cell populations in the blastocyst ICM. In mouse ES and XEN cells, I mapped 3D genome conformation using Genome Architecture Mapping (GAM), chromatin accessibility using ATAC-seq, and gene expression using total RNA-seq. To enable the mapping of 3D genome folding directly in the blastocyst ICM, I adapted GAM for cell type-specific selection of nuclei, by integrating immunofluorescence detection of markers, and generated the first genome-wide chromatin contact maps that distinguish ICM cell types. I report that the ES and XEN cell lineages undergo abundant large scale rearrangements of genome architecture and exhibit high numbers of differentially expressed genes. For example, extra-embryonic endoderm genes, such as Lama1 and Gata6, form silent hubs in ESCs, potentially connecting maintenance of pluripotency to 3D structure of the genome. Further, I show that the expression of XEN cell-specific genes relates to the formation of XEN cell-specific TAD boundaries. Chromatin contacts at the Sox2 locus exhibit an ESC-specific organisation around binding of pluripotency transcription factors OCT4, NANOG and SOX2, into hubs of high gene activity. The observations detected in in vitro models, were investigated in smaller GAM datasets produced using the in vivo counterparts in the ICM. Overall, in vivo data confirmed the high degree of chromatin rearrangement among the two cell types, specifically in loci of lineage driving genes. The findings from in vivo data further underscore the connection of genome topology and cellular identity.

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Die Proteinfaltung ist ein Prozess der molekularen Selbstorganisation, bei dem sich eine lineare Kette von Aminosäuren zu einer definierten, funktionellen dreidimensionalen Struktur zusammensetzt. Der Prozess der Faltung ist ein thermisch getriebener diffusiver Prozess durch eine Gibbs-Energie-Landschaft im Konformationsraum für die Struktur der minimalen Energie. Während dieses Prozesses zeigt die freie Enthalpie des Systems nicht immer eine monotone Abnahme; stattdessen führt eine suboptimale Kompensation der Enthalpie- und der Entropieänderung während jedes Faltungsschrittes zur Bildung von Freien-Enthalpie-Faltungsbarrieren. Diese Barrieren und damit verbundenen hochenergetischen Übergangszustände, die wichtige Informationen über Mechanismen der Proteinfaltung enthalten, sind jedoch kinetisch unzugänglich. Um den Prozess der Barrierebildung und die strukturellen Merkmale von Übergangszuständen aufzudecken, werden Proteine genutzt, die über barrierefreie Pfade falten – so genannte “downhill folder“. Aufgrund der geringen Faltungsbarrieren werden wichtige Interaktionen der Faltung zugänglich und erlauben Einblicke in die ratenbegrenzenden Faltungsvorgänge. In dieser Arbeit vergleichen wir die Faltungsdynamiken von drei verschiedenen Varianten eines Lambda-Repressor-Fragments, bestehend aus den Aminosäuren 6 bis 85: ein Zwei-Zustands-Falter λWT (Y22W) und zwei downhill-folder-artige Varianten, λYA (Y22W/Q33Y/ G46,48A) und λHA (Y22W/Q33H/G46,48A). Um auf die Kinetik und die strukturelle Dynamik zu greifen zu können, werden Einzelmolekülkraftspektroskopische Experimente mit optische Pinzetten mit Submillisekunden- und Nanometer-Auflösung verwendet. Ich fand, dass die niedrige denaturierende Kraft die Mikrosekunden Faltungskinetik von downhill foldern auf eine Millisekunden-Zeitskala verlangsamt, sodass das System für Einzelmolekülstudien gut zugänglich ist. Interessanterweise zeigten sich unter Krafteinwirkung die downhill-folder-artigen Varianten des Lambda-Repressors als kooperative Zwei-Zustands-Falter mit deutlich unterschiedlicher Faltungskinetik und Kraftabhängigkeit. Drei Varianten des Proteins zeigten ein hoch konformes Verhalten unter Last. Die modellfreie Rekonstruktion von Freien-Enthalpie-Landschaften ermöglichte es uns, die feinen Details der Transformation des Zwei-Zustands-Faltungspfad direkt in einen downhill-artigen Pfad aufzulösen. Die Auswirkungen von einzelnen Mutationen auf die Proteinstabilität, Bildung der Übergangszustände und die konformationelle Heterogenität der Faltungs- und Entfaltungszustände konnten beobachtet werden. Interessanterweise zeigen unsere Ergebnisse, dass sich die untersuchten Varianten trotz der ultraschnellen Faltungszeit im Bereich von 2 μs in einem kooperativen Prozess über verbleibende Energiebarrieren falten und entfalten, was darauf hindeutet, dass wesentlich schnellere Faltungsraten notwendig sind um ein downhill Limit vollständig zu erreichen.:I Theoretical background 1 1 Introduction 3 2 Protein folding: the downhill scenario 5 2.1 Protein folding as a diffusion on a multidimensional energy landscape 5 2.2 Downhill folding proteins 7 2.2.1 Thermodynamic description of downhill folders 7 2.2.2 Identification criteria for downhill folders 8 2.3 Lambda repressor as a model system for studying downhill folding 9 2.3.1 Wild-type lambda repressor fragment λ{6-85} 10 2.3.2 Acceleration of λ{6-85} folding by specifific point mutations 11 2.3.3 The incipient-downhill λYA and downhill λHA variants 14 2.4 Single-molecule techniques as a promising tool for probing downhill folding dynamics 17 3 Single-molecule protein folding with optical tweezers 19 3.1 Optical tweezers 19 3.1.1 Working principle of optical tweezers 19 3.1.2 The optical tweezers setup 21 3.2 The dumbbell assay 22 3.3 Measurement protocols 23 3.3.1 Constant-velocity experiments 23 3.3.2 Constant-trap-distance experiments (equilibrium experiments) 24 4 Theory and analysis of single-molecule trajectories 27 4.1 Polymer elasticity models 27 4.2 Equilibrium free energies of protein folding in optical tweezers 28 4.3 Signal-pair correlation analysis 29 4.4 Force dependence of transition rate constants 29 4.4.1 Zero-load extrapolation of rates: the Berkemeier-Schlierf model 30 4.4.2 Detailed balance for unfolding and refolding data 31 4.5 Direct measurement of the energy landscape via deconvolution 32 II Results 33 5 Efficient strategy for protein-DNA hybrid formation 35 5.1 Currently available strategies for protein-DNA hybrid formation 35 5.2 Novel assembly of protein-DNA hybrids based on copper-free click chemistry 37 5.3 Click-chemistry based assembly preserves the native protein structure 40 5.4 Summary 42 6 Non-equilibrium mechanical unfolding and refolding of lambda repressor variants 45 6.1 Non-equilibrium unfolding and refolding of lambda repressor λWT 45 6.2 Non-equilibrium unfolding and refolding of incipient-downhill λYA and downhill λHA variants of lambda repressor 48 6.3 Summary 52 7 Equilibrium unfolding and refolding of lambda repressor variants 53 7.1 Importance of the trap stiffness to resolve low-force nanometer transitions 54 7.2 Signal pair-correlation analysis to achieve millisecond transitions 56 7.3 Force-dependent equilibrium kinetics of λWT 59 7.4 Equilibrium folding of incipient-downhill λYA and downhill λHA variants of lambda repressor 61 7.5 Summary 65 8 Model-free energy landscape reconstruction for λWT, incipient-downhill λYA and downhill λHA variants 69 8.1 Direct observation of the effect of a single mutation on the conformational heterogeneity and protein stability 71 8.2 Artifacts of barrier-height determination during deconvolution 75 8.3 Summary 76 9 Conclusions and Outlook 79 / Protein folding is a process of molecular self-assembly in which a linear chain of amino acids assembles into a defined, functional three-dimensional structure. The process of folding is a thermally driven diffusive search on a free-energy landscape in the conformational space for the minimal-energy structure. During that process, the free energy of the system does not always show a monotonic decrease; instead, sub-optimal compensation of enthalpy and entropy change during each folding step leads to formation of folding free-energy barriers. However, these barriers, and associated high-energy transition states, that contain key information about mechanisms of protein folding, are kinetically inaccessible. To reveal the barrier-formation process and structural characteristics of transition states, proteins are employed that fold via barrierless paths – so-called downhill folders. Due to the low folding barriers, the key folding interactions become accessible, yielding insights about the rate-limiting folding events. Here, I compared the folding dynamics of three different variants of a lambda repressor fragment, containing amino acids 6 to 85: a two-state folder λWT (Y22W) and two downhill-like folding variants, λYA (Y22W/Q33Y/G46,48A) and λHA (Y22W/Q33H/G46,48A). To access the kinetics and structural dynamics, single-molecule optical tweezers with submillisecond and nanometer resolution are used. I found that force perturbation slowed down the microsecond kinetics of downhill folders to a millisecond time-scale, making it accessible to single-molecule studies. Interestingly, under load, the downhill-like variants of lambda repressor appeared as cooperative two-state folders with significantly different folding kinetics and force dependence. The three protein variants displayed a highly compliant behaviour under load. Model-free reconstruction of free-energy landscapes allowed us to directly resolve the fine details of the transformation of the two-state folding path into a downhill-like path. The effect of single mutations on protein stability, transition state formation and conformational heterogeneity of folding and unfolding states was observed. Noteworthy, our results demonstrate, that despite the ultrafast folding time in a range of 2 µs, the studied variants fold and unfold in a cooperative process via residual barriers, suggesting that much faster folding rate constants are required to reach the full-downhill limit.:I Theoretical background 1 1 Introduction 3 2 Protein folding: the downhill scenario 5 2.1 Protein folding as a diffusion on a multidimensional energy landscape 5 2.2 Downhill folding proteins 7 2.2.1 Thermodynamic description of downhill folders 7 2.2.2 Identification criteria for downhill folders 8 2.3 Lambda repressor as a model system for studying downhill folding 9 2.3.1 Wild-type lambda repressor fragment λ{6-85} 10 2.3.2 Acceleration of λ{6-85} folding by specifific point mutations 11 2.3.3 The incipient-downhill λYA and downhill λHA variants 14 2.4 Single-molecule techniques as a promising tool for probing downhill folding dynamics 17 3 Single-molecule protein folding with optical tweezers 19 3.1 Optical tweezers 19 3.1.1 Working principle of optical tweezers 19 3.1.2 The optical tweezers setup 21 3.2 The dumbbell assay 22 3.3 Measurement protocols 23 3.3.1 Constant-velocity experiments 23 3.3.2 Constant-trap-distance experiments (equilibrium experiments) 24 4 Theory and analysis of single-molecule trajectories 27 4.1 Polymer elasticity models 27 4.2 Equilibrium free energies of protein folding in optical tweezers 28 4.3 Signal-pair correlation analysis 29 4.4 Force dependence of transition rate constants 29 4.4.1 Zero-load extrapolation of rates: the Berkemeier-Schlierf model 30 4.4.2 Detailed balance for unfolding and refolding data 31 4.5 Direct measurement of the energy landscape via deconvolution 32 II Results 33 5 Efficient strategy for protein-DNA hybrid formation 35 5.1 Currently available strategies for protein-DNA hybrid formation 35 5.2 Novel assembly of protein-DNA hybrids based on copper-free click chemistry 37 5.3 Click-chemistry based assembly preserves the native protein structure 40 5.4 Summary 42 6 Non-equilibrium mechanical unfolding and refolding of lambda repressor variants 45 6.1 Non-equilibrium unfolding and refolding of lambda repressor λWT 45 6.2 Non-equilibrium unfolding and refolding of incipient-downhill λYA and downhill λHA variants of lambda repressor 48 6.3 Summary 52 7 Equilibrium unfolding and refolding of lambda repressor variants 53 7.1 Importance of the trap stiffness to resolve low-force nanometer transitions 54 7.2 Signal pair-correlation analysis to achieve millisecond transitions 56 7.3 Force-dependent equilibrium kinetics of λWT 59 7.4 Equilibrium folding of incipient-downhill λYA and downhill λHA variants of lambda repressor 61 7.5 Summary 65 8 Model-free energy landscape reconstruction for λWT, incipient-downhill λYA and downhill λHA variants 69 8.1 Direct observation of the effect of a single mutation on the conformational heterogeneity and protein stability 71 8.2 Artifacts of barrier-height determination during deconvolution 75 8.3 Summary 76 9 Conclusions and Outlook 79