A antracnose foliar e a podridão do colmo do milho, doenças causadas pelo fungo Colletotrichum graminicola, são consideradas de grande importância em muitas regiões produtoras do Brasil e do mundo, sendo o controle realizado unicamente através da resistência. A eficácia da utilização de genes de resistência no controle de doenças de plantas depende da existência ou não de raças do patógeno capazes de vencê-los. Ensaios para determinar a variabilidade patogênica e genética de Colletotrichum graminicola isolado de milho foram realizados com isolados coletados em regiões produtoras situadas nos Estados de Minas Gerais, Goiás, Mato Grosso do Sul, São Paulo e Maranhão. Os isolados foram comparados geneticamente entre si com auxílio de marcadores moleculares do tipo RAPD, comparando-se os padrões de bandas e realizando-se agrupamento de similaridade entre eles. Após o agrupamento, cinco isolados foram selecionados para realização de estudos de virulência e agressividade frente a linhagens de milho. Experimentos foram conduzidos a campo para avaliação de antracnose no colmo e em casa de vegetação para avaliação de antracnose foliar. Análises dos ensaios de campo mostraram que não houve interação diferencial entre genótipos do patógeno e do hospedeiro quando se avalia resistência à antracnose do colmo e folha, levando a conclusão que para as fontes de resistência e isolados utilizados neste trabalho, não foi possível a identificação de raças de Colletotrichum graminicola. A correlação entre área do colmo lesionada e área foliar afetada foi baixa, evidenciando que os mecanismos que conferem resistência à podridão de colmo e antracnose foliar provavelmente não são os mesmos. / Anthracnose leaf blight and stalk rot of corn are importa nt diseases in maize caused by Colletotrichum graminicola, and are considered to be very important in production corn areas throughout the world and Brazil. The control is based only on genetic resistance. The effectiveness of genetic resistance to control plant diseases depends on the existence of races of pathogens, able overcome them. Trials to study pathogenic and genetic variability of Colletotrichum graminicola from maize were done using isolates from brazilian states Minas Gerais, Goiás, Mato Grosso do Sul, São Paulo and Maranhão. Isolates were geneticaly compared using RAPDs molecular markers. After clustering, five isolates were choosen in order to conduct virulence and agressiveness experiments in maize inbred lines. Trials were conducted in field for evaluation of stalk rot and at green house to evaluate anthracnose leaf blight. Field trials did not show diferential interaction between isolates and host genotypes, neither studing anthracnose leaf blight, nor anthracnose stalk rot, driven to conclusion that, for genotypes and isolates used in this study, we're not able to identificate races of Colletotrichum graminicola. There was no correlation between stalk lesion area and leaf blighted area, showing that genetic resistance pathways were different.

O meloeiro (Cucumis melo L.) é uma frutífera largamente cultivada no Brasil, principalmente no nordeste brasileiro, onde vem alcançando grande importância econômica, visto que grande parte da produção é voltada para a exportação. Plantas da família do meloeiro, como pepino e abóbora, são afetadas pelo oídio (Podosphaera xanthii) que causa uma das doenças foliares mais destrutivas destas espécies. Este fungo apresenta diversas raças fisiológicas e a correta identificação destas é de elevada importância para o manejo da doença, pois o melhoramento de meloeiro com o emprego de genes de resistência é o método mais eficiente para o seu controle. A identificação destas raças por meio da prática tradicional de inoculações em uma série diferenciadora de variedades de meloeiro é um método laborioso e passível de erros. Devido a isso, uma alternativa seria o uso de métodos moleculares para determinar a identidade da raça de forma rápida e econômica. O presente trabalho objetivou verificar a variabilidade de isolados de P. xanthii através da técnica de AFLP e de seqüenciamento da região ITS 5.8S do rDNA. A partir de AFLP obteve-se um dendrograma no qual não houve separação de raças, origem geográfica e nem hospedeiro. Com esta técnica verificou-se alta variabilidade entre isolados, com similaridade genética máxima de 69% e similaridade mínima de 23%. Ao contrário, os mesmos isolados apresentaram seqüências idênticas através do seqüenciamento da região ITS 5.8S do rDNA. As duas técnicas são distintas e o AFLP proporciona a obtenção de maior quantidade de fragmentos e com isso mais chances de polimorfismos. O AFLP indica que os isolados testados têm composição genética heterogênea embora isto não tenha sido evidenciado com o seqüenciamento da região ITS. / Melon (Cucumis melo L.) is a largely cultivated fruit in Brazil, especially in the northeastern region where it is achieving great economic importance since a great part of its production is destined to exportation. Plants of the melon crop family, such as cucumbers and pumpkins, are affected by powdery mildew (Podosphaera xanthii) that causes one of the most destructive foliar diseases of this species. This fungus presents various physiological races and their correct identification is of great importance to determine the control of the disease since breeding with the use of resistant genes is the most effective method for its control. Identification of these races by traditional practice of inoculation in a differential series of melon varieties is a laborious method and misleading. Due to this, an alternative would be the use of molecular methods to quickly and economically determine the race identity. The present research has the objective of verifying the variability of isolated P. xanthii through the AFLP technique and sequencing of the rDNA\'s ITS 5.8S region. From the AFLP a dendrogram was obtained where there was no separation of race, geographic region or host. With this technique, a high variability among isolated samples was verified, with 69% maximum genetic similarity and 23% minimum similarity. On the other hand, the same isolated samples presented identical sequence through the sequencing of the rDNA\'s ITS 5.8S region. The two techniques are distinct and the AFLP helps get highest amount of fragments and with this more incidence of polymorphisms. AFLP indicates that the tested isolated samples have an heterogeneous genetic composition although this was not evidenced with the sequencing of the ITS region.

A mancha preta dos citros (MPC), incitada pelo fungo Guignardia citricarpa, causa lesões em frutos depreciando-os para a comercialização no mercado interno de fruta fresca, restringindo-os para a exportação e pode causar queda prematura. Para auxiliar nos estudos epidemiológicos, foi desenvolvida uma escala diagramática para a severidade da MPC que contempla os dois tipos de sintomas usualmente observados no campo, “mancha dura”, cujos valores variam entre 0,5 e 49,0%, e “falsa melanose”, cujos valores variam entre 1,1 e 68%. O grau de suscetibilidade das variedades cítricas ‘Hamlin’, ‘Pera’ e ‘Valência’ à MPC foi avaliado em pomar comercial, sob infecção natural. O modelo monomolecular ajustou-se às curvas de progresso da incidência e da severidade da doença para as três variedades. Não houve diferença estatística significativa entre as taxas de progresso da MPC, concluindo-se que as três variedades possuem o mesmo grau de suscetibilidade à doença. O agente causal da MPC em sua fase epidêmica forma ascósporos e conídios. Os ascósporos, formados em folhas em decomposição no solo, são disseminados a curtas e longas distâncias pela ação do vento. Os conídios, formados em ramos e frutos fixados à planta, são disseminados a curtas distâncias pela ação da água. O padrão de distribuição espacial de plantas com MPC foi avaliado pelo índice de dispersão e pela função K de Ripley. As plantas doentes mostraram-se agregadas independentemente da incidência da doença, indicando elevada importância da dispersão do inóculo a curtas distâncias. Avaliou-se, também, o padrão de distribuição de frutos sintomáticos dentro da planta, pelo índice de dispersão e pela forma binária da lei de Taylor. Pelo índice de dispersão 84% das plantas avaliadas mostraram agregação de frutos sintomáticos. Pela lei de Taylor concluiu-se que a agregação de frutos sintomáticos independe da incidência da doença na planta, sugerindo a participação dos conídios no incremento da doença em condições de campo. Estudou-se o efeito da supressão de ascósporos, pela retirada periódica de folhas cítricas em decomposição do campo e o de conídios, pela colheita antecipada de frutos de maturação tardia, na intensidade da MPC, por dois anos, em área com alta pressão de inóculo. Esses tratamentos reduziram a severidade da doença, no segundo ano de avaliação, entretanto não foram suficientes para controlá-la adequadamente. Estas medidas de sanitização são importantes no controle da MPC, devendo ser adotadas em conjunto com o controle químico. Danos causados pela redução na produtividade e perdas medidas pelo retorno financeiro foram avaliados em dois experimentos. Tratamentos cujo incremento na produção por hectare que, em comparação com a isenção de tratamento, excederam 100 caixas de 40,8 kg, foram rentáveis. A amostragem de áreas para diagnosticar a presença da MPC depende da finalidade da produção. Em áreas para exportação e mercado interno de fruta fresca deve-se avaliar todas as plant as do talhão, uma vez que esta doença é quarentenária e causa danos qualitativos. Em áreas para a indústria de suco cítrico concentrado, 285 plantas são suficientes para amostrar incidências superiores a 15% de MPC, em pomares médios de 2200 plantas. / The fungus Guignardia citricarpa is the causal agent of citrus black spot (CBS), which is a disease that become the fruits unsightly and unsuitable for the fresh fruit market. Besides, premature fruit drop may occur, reducing the productivity. A diagrammatic scale for the two symptoms of CBS (hard spot and false melanose) was developed to evaluate the severity and help in epidemiological studies of this disease. The susceptibility level of ‘Hamlin’, ‘Pera’ and ‘Valência’ sweet orange to CBS was evaluated in commercial orchard, under natural infection. The monomolecular model was fitted to the incidence and severity progress curves of the disease for the three sweet oranges. According to the progress curves, there was not significant difference among cultivars, showing that ‘Hamlin’, ‘Pera’ and ‘Valência’ sweet orange have similar susceptibility level to CBS. G. citricarpa in the epidemic phase produce ascospores and conidia. The ascospores, produced in leaves on soil, are disseminated by wind, while conidia, produced in plant twigs and fruits, are disseminated by water. The pattern of spatial distribution of CBS plants was evaluated by dispersion index and Ripley K function. The groups of symptomatic plants were distributed independently of disease incidence, suggesting that short distance dispersion of the inocullum could be the most important factor in distribution of the disease. The binary form of Taylor´s power law and dispersion index were used to evaluate the distribution of symptomatic fruits in the plant. According to dispersion index 84% o f the evaluated plants showed aggregation of symptomatic fruits, while by the Taylor´s power law the symptomatic fruits aggregation occurred independently of the incidence of plant disease, suggesting that the increase of disease in field conditions is related to conidia production. The effect of ascospore suppression on intensity of CBS was evaluated by removing citrus leaves from the orchard soil surface, while the conidia suppression was evaluated by early harvesting of late maturation fruits. These treatments, carried out during two years in a high inocullum incidence area, reduced the disease severity in the second year, but the satisfactory control was not observed. However, these treatments could be important in CBS control whether used in association with chemical control. Damages caused by yield reduction and losses of financial return were evaluated in two experiments. In relation to non-treated orchards, those treated orchards where the production/ha increased more than hundred boxes (40.8 kg each box) were considered profitable. The destination of the orange production (juice of fresh fruit market) are important for determine the size of samples to assess the CBS incidence. Since the G. citricarpa fungus is considered a quarentine organism that causes qualitative losses, in areas used for production of fresh fruit market whole orchard has to be evaluated. However, in areas used for production of fruits to concentrated orange juice, 285 plants sampled are enough to determinate the CBS incidence superior to 15%, in average orchards containing 2200 plants.

A antracnose, doença causada por fungos do gênero Colletotrichum, é uma das doenças mais importantes em muitas plantas cultivadas. Nas cucurbitáceas, como pepino, chuchu, melão e melancia, a antracnose é muito freqüente e causa prejuízos bastante elevados. O agente causal é o Colletotrichum lagenarium, que apresenta como sinonímias C. orbiculare e C. gloeosporioides f. sp. cucurbitae. O presente trabalho visa caracterizar cultural, morfológica e patogenicamente, e identificar molecularmente, os isolados de C. lagenarium, obtidos de plantas da família Cucurbitaceae. Os isolados foram obtidos através de isolamento de tecidos de plantas que apresentavam sintomas de antracnose. A caracterização cultural envolveu a avaliação do crescimento micelial, esporulação, coloração da colônia, topografia da colônia, formação de setores, presença e coloração de massa conidial. A caracterização morfológica compreendeu a avaliação das formas e dimensões dos conídios e apressórios. A caracterização patogênica envolveu a avaliação da virulência de todos os isolados em inoculações cruzadas com pepino, melão, melancia, abóbora e chuchu, além da avaliação do período de incubação, do período latente e do índice de crescimento da lesão. A identificação molecular compreendeu a análise de PCR, utilizando “primer” específico para C. lagenarium, para auxílio na identificação da espécie. Quanto à caracterização cultural, os isolados apresentaram uma variabilidade muito grande quanto à cor e topografia da colônia e formação de setores, contudo, quando analisada a coloração de massa micelial, nos isolados em que esta se fez presente, a coloração não apresentou grandes variações. Apesar da grande variação encontrada nos índices de crescimento micelial diário entre os isolados, não existiu grande variação para cada isolado quando se alterou o meio de cultivo. A esporulação não apresentou correlação com o crescimento micelial, e não constituiu um bom parâmetro para caracterização, devido à variação que apresentou tanto entre os isolados, quanto entre os meios de cultivo. Os conídios apresentaram formatos cilíndrico, clavado e levemente curvo, com dimensões variando de 2,25 a 6,38µm de largura e 5,34 a 15,73µm de comprimento. Os apressórios apresentaram os formatos globoso, clavado e lobado, com dimensões variando de 5,54 a 8,68µm de largura e 6,71 a 10,75µm de comprimento. Dos 25 isolados testados nas inoculações cruzadas, apenas 14 se apresentaram virulentos aos hospedeiros testados. Não foi encontrada correspondência entre a virulência do isolado e o hospedeiro, o local de coleta, suas características culturais ou morfológicas. Cada isolado apresentou um comportamento diferente perante os demais, quando se considerou a gama de hospedeiros a ele suscetíveis, e ao seu comportamento quanto aos períodos latente e de incubação, e ao índice de crescimento de lesão. O período de incubação variou de dois a sete dias, e período latente variou de três a nove dias. O índice de crescimento de lesão variou de 0,5 a 4,9mm/dia. Não foi observada correlação entre o período latente, o período de incubação e o índice de crescimento de lesão. Através da identificação molecular, cinco isolados puderam ser identificados pelo “primer” específico utilizado, contudo não foi encontrada correspondência entre a identificação molecular e as caracterizações cultural, morfológica e patogênica. / Anthracnose is one of the most important diseases of cucurbitaceous plants, causing severe damages to cucumber, chayote, melon, watermelon and pumpkin. The causal agent is Colletotrichum lagenarium (syn. C. orbiculare, C. gloeosporioides f. sp. cucurbitae). The objective of this work was to determine cultural, morphological and pathogenic characterization, and molecular identification of C. lagenarium, isolated from plants of the Cucurbitaceae family. The isolates used in this study were obtained through isolation from plants presenting symptoms of Anthracnose. The cultural characterization involved the evaluation of mycelial growth, sporulation, colony colour, colony topography, sectors formation, presence and colour of conidial mass. The shape and size of the conidia and apressoria were assessed to the morphological characterization. The pathogenic characterization involved the evaluation of the virulence of all isolates on cross inoculations with cucumber, melon, watermelon, pumpkin and chayote, evaluation of the incubation period, the latent period and the lesion growth. For the molecular identification PCR analysis was used, with specific “primer” for C. lagenarium, to assist the identification of the species. Colonies of all isolates presented great variability in color, topography, and sectors formation; however the color of the mycelial mass did not present great variations. Despite the great variation found in the daily micelial growth indices among the isolates, great variation for each one did not exist when the culture medium was changed. The sporulation did not present correlation with the micelial growth, showing a high variation among the isolates and the culture media. This later parameter was not useful for characterization. The conidia of the isolates were classified in the shapes cylindrical, clavate and slightly curved, with average dimensions varying from 2.25 to 6.38µm in width, and from 5.34 to 15.73µm in length. The apressoria had the shapes globose, clavate and lobed, with average dimensions varying from 5.54 to 8.68µm in width, and 6.71 to 10,75µm in length. From the 25 isolates tested in the cross inoculations, only 14 were virulent to the tested host plants. Correspondence was not found between the virulence of the isolates and de host plants origin, the local origin, and the cultural and morphological characteristics. Analyzing the variability of susceptible host plants, the inoculation and latent periods, and the lesion growth, each isolate showed a different behavior compared to the others. The incubation period varied from two to seven days, and the latent period varied from three to nine days. The lesion growth varied from 0,5 to 4,9mm/day. It was not observed correlation between the latent and incubation periods, as well as in lesion growth. Five isolates were identified to the pair of primers used, although correspondence was not found among the molecular identification and the cultural, morphological and pathogenic characterization.

A formação de micorrizas arbusculares é um processo regulado geneticamente e envolve alterações da expressão gênica da planta e do fungo. Poucos genes essenciais para o desenvolvimento da simbiose foram identificados até o presente. Para identificar genes possivelmente envolvidos no controle da colonização fúngica intrarradicular, o perfil de seqüências expressas em raízes de cana-de-açúcar colonizadas por Glomus clarum, em condições de baixo e alto fósforo (P), foi avaliado através do seqüenciamento em larga escala de ESTs e hibridização em macroarranjos de cDNAs. Plântulas micropropagadas de cana-de-açúcar foram plantadas em vasos contendo substrato composto por areia:vermiculita (3:1, vol/vol) e adubado com 20 ou 200 mg P kg-1 de substrato e inoculadas com Glomus clarum. A biomassa seca da parte aérea e a taxa de colonização micorrízica das raízes foram avaliadas no momento da colheita que foi feita oito ou doze semanas após o plantio. O RNA poliA foi extraído das raízes e utilizado para a síntese de cDNAs. Neste trabalho, quatro bibliotecas de cDNA e uma biblioteca subtrativa supressiva foram preparadas a partir de cDNAs de raízes de cana-de-açúcar colonizadas por G. clarum. Esta abordagem resultou na identificação de 1,925 ESTs as quais foram agrupadas em 1615 genes supostamente regulados pela micorrização. Estes clones foram analisados por Northern blots eletrônico, e aqueles que foram diferencialmente expressos foram submetidos a hibridização em macroarranjos de cDNAs. Um total de 386 genes foram arranjados em membranas de náilon e sua expressão avaliada por sondas sintetizadas a partir de cDNA extraído de raízes em diferentes condições. Dentre os genes com expressão diferencial significativa estatística em raízes colonizadas por G. clarum, em condições de baixo e alto P, foram detectados genes codificando proteínas putativamente envolvidas na percepção de moléculas sinais (receptor tipo quinase de proteína), transporte de íons (canais de íons), transdução de sinais (quinases de proteína e calmodulina), regulação da transcrição (fatores de transcrição), alterações de parede celular e citoesqueleto (extensina, arabinogalactanas, tubulinas), respostas de defesa e estresse (síntese de fitoalexinas e metalotioneínas), síntese de fitohormônios (nitrilase). Os dados sugerem que a transdução de sinais em MAs se dá através da fosforilação de proteínas e que a indução de respostas anti-oxidantes pode ser importante para o desenvolvimento da simbiose. Da mesma forma, os dados sugerem que a atividade de aspartatoproteases podem ser essenciais para o controle do crescimento fúngico intrarradicular. A caracterização desses genes e seus padrões de expressão em MAs poderá elucidar os mecanismos genéticos envolvidos no controle da simbiose. / The formation of arbuscular mycorrhizae (AM) is a genetically regulated process and involves alteration in both plant and fungus gene expression. Few genes essential for the development of the symbioses have been identified so far. In order to identify genes possible involved in the intraradical fungal colonization control, the profiles of expressed sequences in sugarcane roots colonized roots with Glomus clarum at low or high phosphate (P) conditions were evaluated using large scale EST sequencing and cDNA macroarray hybridization. Sugarcane micropropagated seedlings were planted in pots containing sand:vermiculite (3:1, vol:vol), and fertilized with 20 or 200 mg P kg-1 substrate. Seedlings were inoculated with G. clarum and cultivated under greenhouse conditions for 8 or 12 weeks. After harvesting shoot dry weight and root colonization rates were evaluated. PolyA RNA was extracted from the root tissues and used for cDNA synthesis. In this work, one suppressive subtractive library and four cDNA libraries were synthesized using cDNA from sugarcane roots not-colonized or colonized by G. clarum, at low and high P conditions. This approach resulted in the identification of 1,925 ESTs which were clustered in 1,615 genes. The expression of these genes was evaluated using electronic Northern blots. A total of 386 genes with putative differential expression were spotted into nylon membranes in macroarrays and their expression profiles in roots under different conditions were evaluated using macroarray hybridization. Among the genes with statistically significant differential expression, in roots colonized by G. clarum grown at low or high P conditions, it was detected genes encoding proteins putatively involved in the perception of signal molecules (receptor-like protein kinase), ion transporte (channel-like protein precursor), signal transduction (protein kinases and calmodulin), transcriptional regulation (transcription factor), cell wall and cytoskeleton alterations (extensin, arabinogalactans, and tubulins), defense and stress responses (phythoalexins synthesis and metalothioneins), and phytohormone biosynthesis (nitrilases). Our data suggest that the signal transduction in AM occurs through protein phosphorylation, and that the induction of anti-oxidant responses may be important for the development of the symbioses. Additionally, the data suggest that aspartic-proteases might be essential for the control of intraradical fungal growth. Further characterization of these genes and their expression patterns in AM would contribute to elucidate the genetic mechanisms controlling the symbioses.

A antracnose é uma das doenças mais importantes do pimentão em vários países. Por muitos anos, somente C. gloeosporioides foi relatado como agente causal da antracnose desta cultura no Brasil. Entretanto, recentemente C. acutatum e C. capsici também tem sido associados a esta doença em algumas regiões do país. Neste trabalho, 56 isolados de Colletotrichum obtidos de pimentão e procedentes de diferentes regiões produtoras do país foram caracterizados e identificados por meio de algumas características morfológicas e culturais, e pela análise por PCR utilizando oligonucleotídeos espécie-específicos. Isolados representativos de cada espécie identificada na população amostrada também foram caracterizados quanto à patogenicidade em frutos de pimentão verdes e maduros, feridos e não feridos e quanto a sensibilidade aos fungicidas azoxistrobina, carbendazim, tiabendazol, tebuconazol, captana, clorotalonil e cloreto de benzalcônio. Os resultados demonstram que C. acutatum é a espécie predominante nas principais regiões produtoras de pimentão do país, representando cerca de 72% da população amostrada. C. capsici foi encontrada com freqüência aproximada de 14%, nos estados de São Paulo e Minas Gerais. C. gloeosporioides representou apenas 5% da população amostrada e teve distribuição restrita ao estado de São Paulo e ao Distrito Federal. Um único isolado de C. coccodes foi encontrado no Rio Grande do Sul. Além dessas espécies, isolados identificados como C. boninense foram encontrados em São Paulo e no Rio Grande do Sul, com freqüência de 7% na população amostrada. Este parece ser o primeiro relato de C. boninense infectando pimentão no Brasil e em outras partes do mundo. A caracterização patogênica mostrou que isolados representativos de todas as espécies foram patogênicos aos frutos maduros feridos e não feridos. Nos frutos verdes feridos, apenas os isolados de C. acutatum e de C. capsici promoveram sintomas. Não foram observados sintomas nos frutos verdes sem ferimentos durante o período de avaliação do experimento (12 dias) para nenhum dos isolados. C. acutatum demonstrou ser a espécie mais agressiva, apresentando os menores períodos de latência e a maior esporulação tanto em frutos verdes (feridos) como nos maduros (feridos e não feridos). Os isolados pertencentes a diferentes espécies de Colletotrichum apresentaram sensibilidade diferenciada para todos os fungicidas sistêmicos avaliados. Os isolados de C. acutatum foram mais sensíveis a azoxistrobina, enquanto os isolados de C. gloeosporioides demonstraram a menor sensibilidade para este fungicida. Os isolados de C. gloeosporioides e C. boninense foram os mais sensíveis aos benzimidazóis (carbendazim e tiabendazol), enquanto o isolado de C. coccodes teve a menor sensibilidade para estes fungicidas. O fungicida tebuconazol promoveu o maior controle sobre o crescimento micelial dos isolados. Para este fungicida, C. capsici demonstrou ser a espécie menos sensível. Os resultados deste trabalho demonstram a presença de pelo menos cinco espécies de Colletotrichum responsáveis pela antracnose do pimentão no país e evidenciam a presença de importantes diferenças entre essas, que devem ser consideradas durante o manejo da doença. / In several countries, anthracnose is one of the most serious diseases in pepper. C. gloeosporioides has, for many years, been reported as the causal agent of anthracnose in Brazil. C. acutatum and C. capsici have only recently been reported as agents of anthracnose in some regions of the country. In this study, 56 isolates of Colletotrichum obtained from pepper from different areas of the country were characterized and identified based on the morphological characteristics of the conidia, as well as culture characteristics and PCR analysis with species-specific pairs of primers. Isolates representative of each identified species in the sampled population were also characterized according to their pathogenicity in pepper fruits (unripe, ripe, wounded and nonwounded) and also according to their sensitivity to fungicide (azoxystrobin, carbendazim, thiabendazole, tebuconazole, captan, chlorothalonil and benzalkonium chloride). The results have showed that C. acutatum is the most prevalent species found in the main production areas of pepper, present in about 72% of the sampled population. C. capsici was equivalent to 14% of the sampled population and found in the states of São Paulo and Minas Gerais. C. gloeosporioides was present in only 5% of the samples and it was restricted to the state of São Paulo and Distrito Federal. Only one isolate of C. coccodes was found in Rio Grande do Sul. Besides theses species, isolates of C. boninense were found in São Paulo and Rio Grande do Sul, with an occurrence of 7% in the sampled population. This seems to be the first report of C. boninense infecting pepper in Brazil and other parts of the world. The pathogenic characterization showed that representative isolates of all species were pathogenic in ripe, wounded, or nonwounded fruits. In wounded green fruit, only isolates of C. acutatum and C. capsici caused infection resulting in disease symptoms. No disease symptoms were observed in green nonwounded fruits inoculated with all Colletotrichum isolates, after 12 days of inoculation. C. acutatum was the most aggressive species with the shortest periods of latency and the highest rate of sporulation in either green wounded fruits or ripe fruits (wounded and nonwounded). Isolates of different species of Colletotrichum showed different sensitivity to the systemic fungicides evaluated. The isolates of C. acutatum were more sensitive to azoxystrobin, whereas C. gloeosporioides showed the lowest sensitivity to this fungicide. C. gloeosporioides and C. boninense isolates were the most sensitive to benzimidazoles fungicides (carbendazim and thiabendazole), whereas C. coccodes isolates showed the lowest sensitivity to these fungicides. The tebuconazol fungicide exerted the highest effect on mycelial growth for all Colletotrichum species. C. capsici showed to be less sensitive to this fungicide. The results of this work have shown the presence of at least five species of Colletotrichum responsible for anthracnose in pepper in Brazil and have made evident the importance of the differences between these species, which must be taken into account for the control of the disease.

Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium anisopliae, têm despertado grande interesse como agentes no controle de insetos-pragas. Estas espécies de fungos são especializadas na secreção de um complexo enzimático constituído de proteases, lipases e quitinases, entre outras, estando relacionadas com patogenicidade e virulência. Neste contexto a foi analisada a secreção de quitinases pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae var. anisopliae, como identificado molecularmente. Contudo, alguns aspectos morfológicos analisados mostram pequenas diferenças entre estes isolados. Para produção de quitinases, os isolados foram cultivados em fermentação submersa na presença e ausência de indutores e em fermentação em estado sólido, tendo crisálida como substrato. A maior síntese de quitinase intracelular foi obtida para IBCB 425 no meio contendo extrato de levedura mais glicose (EG). Visando a produção da enzima extracelular e disponibilidade de fonte de carbono, o meio extrato de levedura mais crisálida (EC), sob agitação foi padronizado para fermentação submersa (FSbm). Os maiores níveis enzimáticos intracelulares para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram obtidos entre 72 h e 216 h e para a forma extracelular entre 96h e 144h. A produção quitinásica em fermentação sólida (FSS) utilizando crisálida como fonte de carbono foi otimizada por delineamento composto central rotacional (DCCR, tendo como variáveis o tempo de crescimento e umidade. O melhor produtor de quitinase em FSS foi o isolado IBCB 360. A análise do secretoma mostrou um maior número de proteínas quando os isolados foram cultivados na presença do indutor, com destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas secretadas pelos isolados IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas, estando entre elas a endo-N-acetyl--D-glucosaminidase, enzima do complexo quitinolítico. As quitinases produzidas pelos quatro isolados foram parcialmente purificadas em DEAE Celulose, obtendo-se dois picos de atividade quitinásica. O processo de purificação foi continuado para o IBCB 384 em coluna de exclusão molecular, obtendo se um único pico de atividade quitinásica, analisado por electrospray. A temperatura ótima de atividade para as quitinases produzida em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 variou de 50ºC a 60ºC e pH ótimo de atividade ficou na faixa de 5,0 - 5,5. As quitinases dos isolados mantiveram-se estáveis nas temperaturas de 30ºC e 40ºC e em uma ampla faixa de pH. Os sais BaCl2 e MnCl2 ativaram as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 425. Além disso, todas as quitinases foram tolerantes ao - mercaptoetanol. O comportamento cinético de todas as quitinases foi Michaeliano e a maior afinidade pelo substrato foi para a quitinase do isolado IBCB 360. Já os experimentos in vivo e in vitro mostraram que o isolado IBCB 425 foi melhor na fase pré-infecção e isolado IBCB 384 foi melhor na fase pós infecção, sendo o mais virulento. Portanto, os isolados M. anisopliae têm se mostrado como bons produtores de quitinases, com boa estabilidade a temperatura e pH além de outras características distintas que provavelmente estão relacionadas com o potencial de patogenicidade e virulência de cada isolado. / Entomopathogenic fungi such as Metarhizium anisopliae, have been attracting great interest as agents to control insect pests. These species of fungi are specialized in the secretion of an enzymatic complex consisting of proteases, lipases and chitinases, among others which are related to pathogenicity and virulence. In this context the secretion of chitinase by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolated from M. anisopliae var. anisopliae molecularly identified, were analyzed. However, some structural features analyzed showed small differences among these isolates. For chitinase production, the isolates were grown in submerged culture in the presence and absence of inducers and under solid state fermentation with chrysalis as substrate. The enhanced synthesis of intracellular chitinase was obtained with IBCB 425 using yeast extract plus glucose (EG). Aiming to produce the extracellular enzyme and the carbon source available, the medium yeast extract and chrysalis (EC), was standardized to SbmF. The high intracellular enzymes levels produced by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates were obtained between 72 h and 216 h and for the extracellular form between 96h and 144h. The chitinase production in SSF using chrysalis as carbon source was optimized by CCRD, having the time of growth and moisture as variables. The best producer of chitinase in SSF was the isolated IBCB 360. The analysis of the secretome showed a great number of proteins when the isolates were grown in the presence of the inducer, especially for the isolated IBCB 425. Most of the proteins secreted by IBCB 167 and IBCB 384 isolates were identified. Among these proteins the endo-N-acetyl--D-glucosaminidase was identified, enzyme that participates in the chitinulitic complex. Chitinases produced by the isolates were partially purified on DEAE - cellulose, yielding two peaks of chitinase activity. The purification process was continued for IBCB 384 isolated using molecular exclusion chromatographic column, yielding only one peak of chitinase activity, analyzed by electrospray. The optimal temperature for the chitinase activity from IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates obtained in SSF, ranged from 50 ºC to 60 ºC and the optimum pH of activity was 5.0 to 5.5. All chitinases were stable at 30 ºC and 40 ºC, and wide pH range. The BaCl2 and MnCl2 salts activated the chitinases of IBCB 167 and IBCB 425 isolates. In addition, all chitinases were mercaptoethanol tolerant. The kinetic behavior of all chitinases was Michaelian with the highest affinity to the substrate observed for the chitinase of isolated IBCB 360. The in vivo and in vitro experiments showed that isolated IBCB 425 was better in pre -infection phase and the isolated IBCB 384 was better in the post infection phase. Therefore, the M. anisopliae isolates were good producers of chitinases with interesting temperature and pH stability, and other different characteristics that are probably related to the potential pathogenicity and virulence of each isolate.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Ripening is the phase which determines the aroma and flavour of a mature cheese, and it demands special care. One of these cares is the prevention of fungi development on its surface. The objective of this study was to control the development of fungi during maturation of Minas standard cheese, through the use of two anti-fungi in aqueous solution, after the salt process. The treatments included the control, natamicine at 0,05% and 0,1% concentrations, and the sorbate of potassium at 25% and at 30%. Physical - chemical and microbiological analysis were realized. The experiment was submitted to sensorial analysis by a non-trained panel. The results have shown that the natamicine, as well as, the potassium sorbate have retarded the microbic development, and did not affect, significantly, the sensorial quality of the cheese. However, it was concluded that the most effective treatment to prevent fungi development in Minas standard cheese was the potassium sorbate at 30%, because in the three analysis period was observes the least mould and yeast development than other treatments. / A maturação é a fase que determina o aroma e sabor de um queijo maturado, e exige cuidados especiais. Um destes cuidados é a prevenção do crescimento de fungos na sua superfície. O presente trabalho teve como objetivo controlar o crescimento de fungos durante a maturação do queijo Minas padrão, através do uso de dois antifúngicos em solução aquosa, após a salga. Os tratamentos constaram do controle, da natamicina nas concentrações de 0,05 % e 0,1 % e o sorbato de potássio a 25 % e a 30 %. Realizou-se análises físico-químicas e microbiológicas. O experimento foi submetido à análise sensorial por um painel não treinado. Os resultados demonstraram que tanto a natamicina como o sorbato de potássio retardaram o crescimento microbiano e não afetaram, de forma significativa, a qualidade sensorial dos queijos. Entretanto, conclui-se que o tratamento mais eficiente para prevenção do desenvolvimento de fungos em queijo Minas padrão foi o sorbato de potássio a 30 %, pois nos três períodos de análise observou-se a menor contagem de bolores e leveduras comparando com os outros tratamentos.

Made available in DSpace on 2017-06-01T18:20:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ok_ana_carla_rocha_carvalho.pdf: 8857203 bytes, checksum: e5ab297a3ba616891f1eb9a5e3a35e23 (MD5) Previous issue date: 2017-02-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Chitin and chitosan are co-polymers with great biotechnological applications today (in the food industry, biotechnology, materials science, drugs and pharmaceuticals, agriculture and environmental protection among others) and, can be obtained from filamentous fungus from biomass. In this sense, the growth profile of the new strain of Mucor subtilissimus and chitosan production was investigated in divers culture media using alternative substrates (glucose and soya extract), in combination. The growth of M. subitilissimus was evaluated in four different culture media (Extract Malt, Extract Soy, Sabouraud Dextrose Agar and Synthetic Environment for Mucorales), as well as the Index Growth Rate Mycelial (MIGS), growth rate and generation time. The selected medium plus alternate substrates was used for the production of biomass and chitosan. The results showed a growth rate M. subtilissimus of μEsp.h-1 0.035831 and 0.033431, with generation time 19,34504h-1 and 20.73360 h-1, respectively, to medium Extract soybean and Medium Synthetic Mucorales for being selected the medium with soy extract to be more economical. The results were statistically validated and can be verified by the results of the ANOVA Table, Pareto Diagram and Surface Graph showing that the combination glucose soy extract increases the production of biomass and chitosan. The absorption spectrum of the infrared ray confirmed the polymer extracted chitosan with the degree of deacetylation of 78.3 % and 87.5 % respectively for the conditions of 2 trials is 4. The bioprocess performed showed high potential M. subtilissimus the biotransformation alternate substrates in effective production of chitosan with low cost and excellent degree of deacetylation as regards the microbiological chitosan. / Quitina e quitosana são co-polímeros com grande aplicação biotecnológica na atualidade (na área alimentícia, biotecnologia, ciência dos materiais, drogas e produtos farmacêuticos, agricultura e proteção ambiental dentre outras) e, podem ser obtidos de fungos filamentosos a partir de biomassa. Neste sentido, foi investigado o perfil de crescimento da nova linhagem de Mucor subtilissimus e produção de quitosana em diferentes meios de cultivo utilizando substratos alternativos (glicose e extrato de soja), em associação. O crescimento de M. subitilíssimus foi avaliado em quatro diferentes meios de cultura (Extrato de Malte, Extrato de Soja, Sabouraud Dextrose Ágar e Meio Sintético para Mucorales), como também o Índice da Velocidade de Crescimento Micelial (IVCM), velocidade de crescimento e tempo de geração. O meio selecionado acrescido de substratos alternativo foi utilizado para a produção de biomassa e quitosana. Os resultados demonstraram uma velocidade de crescimento de M. subtilissimus de μEsp.h-1 de 0,035831 e 0,033431, com tempo de geração de 19,34504h-1 e 20,73360 h-1, respectivamente, para os meios Extrato de soja e Meio Sintético para Mucorales, sendo selecionado o meio com extrato de soja por ser mais econômico. Os resultados foram validados estatisticamente, e podem ser verificado pelos resultados da Tabela de ANOVA, Diagrama de Pareto e Gráfico de Superfície, que demonstram que a associação do extrato de soja à glicose aumenta a produção de biomassa e de quitosana. O espectro de absorção ao raio infravermelho confirmou o polímero extraído quitosana, com o grau de desacetilação de 78,3% e 87,5%, respectivamente para as condições dos ensaios 2 e 4. O bioprocesso realizado demonstrou elevado potencial do M. subtilissimus na biotransformação de substratos alternativo na produção efetiva de quitosana, com baixo custo e excelente grau de desacetilação no que se refere à quitosana microbiológica.

O segundo mensageiro cGMP está envolvido em diversas funções celulares incluindo a visão em mamíferos. Embora trabalhos anteriores mostrassem variações nos níveis de cGMP durante o ciclo de vida de Blastocladiela emersonii e evidências da existência de enzimas específicas envolvidas na sua síntese (guanilato ciclase) e degradação (cGMP fosfodiesterase), nenhum genoma de fungo publicado até o momento mostrou a existência de genes codificando estas enzimas. Este fato é atribuído por evolucionistas à completa perda de motilidade dos fungos em geral, já que cGMP está primordialmente associado a células com cílios. Blastocladiomicetos, como Blastocladiella, apresentam células móveis em pelo menos um estágio do seu ciclo de vida, o que poderia explicar a existência dessa via nesses fungos. Uma investigação no banco de ESTs de B. emersonii revelou a existência de cDNAs codificando parte de prováveis guanilato ciclases (BeGC1, BeGC2 e BeGC3) e uma possível cGMP fosfodiesterase (BePDE). Assim, este trabalho buscou confirmar a existência destas enzimas e caracterizar a sinalização por cGMP em B. emersonii. A proteína recombinante selvagem correspondente ao domínio catalítico de BePDE mostrou atividade de degradação sobre cGMP e a mutação E389A foi capaz de alterar a especificidade por cGMP. Com o sequênciamento do genoma de B. emersonii obteve-se as sequências completas das guanilato ciclases. Em BeGC2 não foi possível identificar o ligante responsável por sua ativação. Em BeGC3, a presença de um domínio Heme-Pas sugeriu sua ativação por óxido nítrico. A presença de um domínio rodopsina em BeGC1 sugeriu sua ativação por luz. Experimentos de microscopia por imunofluorescência localizaram BeGC1 no \"eyespot\", BeGC2 no capacete nuclear e BeGC3 no citoplasma de zoósporos de B. emersonii. Verificamos também que zoósporos realizam fototaxia em direção à luz verde e que a adição de hidroxilamina, inibidor de rodopsina, ou do inibidor de guanilato ciclase LY83583 tem efeito negativo na fototaxia, bem como impede o aumento dos níveis de cGMP observado em zoósporos expostos à luz verde. O bloqueio da síntese de retinal por Norflurazon também inibiu a fototaxia sendo esta restaurada quando adicionamos retinalA1. Estes dados, juntamente com o fato de o domínio rodopsina de BeGC1 ser a única rodopsina presente no genoma, indicam que BeGC1 é responsável pela fototaxia nos zoósporos de B. emersonii. O genoma do fungo apresenta ainda um possível canal de potássio ativado por cGMP (BeCNG1) localizado na membrana plasmática de zoósporos, similar ao canal regulado por cGMP envolvido na visão em humanos. Ensaios de microfluorimetria também evidenciaram a presença de um canal ativado por cGMP relacionado com o influxo de potássio e a motilidade dos zoósporos. Um modelo para a via de sinalização da fototaxia em B.emersonii foi proposto e comparado com a sinalização presente na visão de mamíferos, destacando a existência de cGMP e rodopsina em ambos os processos e sugerindo uma possível origem comum. Portanto, os resultados obtidos suportam a existência da sinalização por cGMP em B. emersonii, além de indicar o papel dessa sinalização na fototaxia dos zoósporos, sendo esta a primeira via de sinalização por cGMP caracterizada em fungos. / The second messenger cyclic GMP is involved in a wide array of cellular processes including vision in mammals. Although previous studies demonstrated changes in cGMP levels during the life cycle of Blastocladiela emersonii and evidences of specific enzymes involved in its synthesis (guanylyl cyclase) and hydrolysis (cGMP-phosphodiesterase), no fungal genome published so far shows the presence of genes encoding these enzymes. Evolutionists attribute the absence of cGMP signaling pathways in higher fungi to the sedentary life style of these organisms, since cGMP is primarily associated with ciliated cells. However, blastocladiomycetes like Blastocladiella, have motile cells in at least one stage of their life cycle, which could explain the existence of this pathway in these primitive fungi. Inspection of B. emersonii EST data bank, revealed cDNAs encoding part of three putative guanylyl cyclases (BeGC1, BeGC2 e BeGC3) and one possible cGMP phosphodiesterase (BePDE). Thus, the purpose of this study was to confirm the existence of these enzymes and characterize the cGMP signaling pathway in this model. The recombinant protein containing the wild type catalytic domain of BePDE presented activity towards hydrolysis of cGMP and the E389A mutation of this domain changed the cGMP specificity of this enzyme. The complete nucleotide sequence of the guanylyl cyclases were obtained by sequencing of B. emersonii genome. In BeGC2 we were unable identify the ligand responsible for its activation, but in BeGC3, the presence of a Heme-Pas domain suggested its activation by nitric oxide. The presence of a rhodopsin domain in BeGC1 suggested its activation by light. Immunofluorescence microscopy localized BeGC1 in the \"eyespot\" structure, BeGC2 in the nuclear cap and BeGC3 in the cytoplasm of zoospores of B. emersonii. We found that Blastocladiella zoospores performed phototaxis toward green light and photobleaching of rhodopsin function using hydroxylamine prevented both phototaxis and the increased cGMP levels observed when zoospores were exposed to green light. The same effect was observed using the guanylyl cyclase inhibitor LY83583. Inhibition of retinal synthesis using Norflurazon prevented the phototaxis response, which could be restored by zoospore complementation with retinalA1. The BeGC1 gene is the only rhodopsin found in the draft assembly of B. emersonii genome, which indicates that BeGC1 is responsible for phototaxis observed in zoospores. We also found in the genome a possible cGMP-activated potassium channel (BeCNG1), localized in the plasma membrane of the zoospores, which is similar to the cGMP-activated channel involved in human vision. In addition, microfluorimetry assays revealed the presence of a cGMP-activated potassium channel involved in potassium influx and zoospore motility. The signaling model of B. emersonii phototaxis was proposed and compared with the mammalian vision system, with cGMP and rhodopsin acting in both signaling pathways, suggesting a common origin. Altogether our data indicate that Blastocladiella emersonii has a cGMP signaling system involved in phototaxis, being the first cGMP signaling pathway characterized in fungi.