A criopreservação de embriões de peixes vem sendo investigada há mais de duas décadas, no entanto todos os protocolos testados até o momento falharam. A utilização de oócitos, mais recentemente, foi relatada como uma alternativa, no entanto, a maioria dos estudos foram realizados utilizando uma única técnica - o congelamento lento controlado - não alcançando nenhum êxito. A vitrificação é um método de criopreservação livre de gelo, apresentando diversas vantagens que podem contribuir para superar algumas das dificuldades relacionadas com a criopreservação de oócitos de peixes. No presente estudo desenvolveu-se um protocolo de vitrificação para folículos ovarianos de zebrafish em estádio III. Uma série de crio-soluções foram formuladas e testadas quanto à sua capacidade de vitrificação empregando diferentes dispositivos (palheta plástica, bloco de vitrificação e fibreplugTM). A toxicidade das soluções de vitrificação foi avaliada através da análise de integridade da membrana dos folículos ovarianos utilizando coloração com trypan blue. Além disso, foi investigado o efeito do protocolo de vitrificação sobre os folículos em nível sub-celular, através da medição da concentração de ATP citoplasmático e da distribuição e atividade mitocondrial, utilizando sonda fluorescente JC-1 e microscopia confocal. Após a vitrificação, os folículos ovarianos apresentaram integridade de membrana de 59,9 ± 18,4% quando o fibreplug e a solução V16 (1.5 M metanol + 4.5 M propileno glicol) foram empregados. Quando vitrificados em V2 (1.5 M metanol + 5.5 M DMSO) a integridade de membrana diminuiu para 42,0 ± 21,0%. Observou-se que os folículos localizados no meio do fragmento foram mais protegidos de injúrias apresentando satisfatória aparência quanto a sua morfologia mesmo 2 h após o aquecimento. A integridade mitocondrial das células da camada da granulosa foi claramente prejudicada pelo protocolo de vitrificação e o nível de ATP nos folículos diminuiu significativamente (P < 0,05) após o aquecimento. A vitrificação de folículos ovarianos de zebrafish em estádio III e seu efeito em nível de subcelular são relatados aqui pela primeira vez. As informações obtidas a partir deste estudo serão muito úteis para guiar o desenvolvimento e otimização de um protocolo para a criopreservação de oócitos de peixes no futuro. / Cryopreservation of fish embryos has been under investigation for over two decades; however every protocol tested so far has failed. The use of oocytes has more recently been reported as an alternative, nevertheless most of the studies were carried out using a single technique - controlled slow cooling - and success also remains elusive. Vitrification is an ice-free cryopreservation method which offers several advantages that may contribute to overcome some of the difficulties involved with fish oocytes cryopreservation. In the present study we developed a vitrification protocol for stage III zebrafish ovarian follicles in ovarian tissue fragments. A series of cryo-solutions were designed and tested for their vitrifying ability using different devices (plastic straw, vitrification block and fibreplugTM). Toxicity of vitrification solutions was evaluated by assessing membrane integrity with trypan blue staining. In addition, we investigated the effect of vitrification protocol on the follicles at sub-cellular level by measuring the cytoplasmic ATP content and the mitochondrial distribution and activity using JC-1 probe and confocal microscopy. After vitrification, ovarian follicles showed membrane integrity of 59.9 ± 18.4% when fibreplug and V16 (1.5 M methanol + 4.5 M propylene glycol) solution were employed. When vitrified in V2 (1.5 M methanol + 5.5 M DMSO) the membrane integrity decreased to 42.0 ± 21.0%. We observed that follicles located in the middle of the fragments were more protected from injuries and some of them showed satisfactory morphological appearance even two hours post-warming. Mitochondria integrity of granulosa cells layer was clearly damaged by the vitrification protocol and ATP level in the follicles declined significantly (P < 0.05) after warming. Vitrification of stage III zebrafish follicles in ovarian tissue fragments and its effect at sub-cellular level is reported here for the first time. Information gained from this study will be very useful to guide development of a successful protocol for cryopreservation of fish oocytes in the future.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T18:59:28Z No. of bitstreams: 1 MIchel Francisco Abanto Marin_Tese.pdf: 17075383 bytes, checksum: 82ec8815a4daba1b96b41d8a1b92b852 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T18:59:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MIchel Francisco Abanto Marin_Tese.pdf: 17075383 bytes, checksum: 82ec8815a4daba1b96b41d8a1b92b852 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Vice Direção de Ensino, Informação e Comunicação. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Vibrio cholerae é o agente causal da cólera, uma infecção ancestral, epidêmica e pandêmica, que é um dos principais problemas de saúde pública no mundo. A humanidade já passou por, pelo menos, seis pandemias de cólera e, atualmente, vive no contexto da sétima pandemia. V. cholerae é classificado em mais de 200 sorogrupos e alguns biotipos. Linhagens de V. cholerae O1 do biotipo clássico e do biotipo El Tor estão relacionadas à sexta (1899–1923) e à sétima (1960 -….) pandemias de cólera, respectivamente. A sétima pandemia chegou à América Latina em 1991 sendo que, inicialmente, sua origem foi relacionada ao Sudoeste Asiático, região endêmica e epidêmica de cólera. Uma segunda hipótese sugere uma origem ambiental local. A partir do início deste século, a epidemia se extinguiu, restando apenas eventuais relatos de casos isolados. Sob a ótica da genética e genômica do V. cholerae, estudamos a linhagem da epidemia da América Latina (AL). Nossos objetivos eram inferir sua origem e identificar marcadores genômicos que possibilitassem seu monitoramento. Utilizamos informações obtidas in vitro e in silico para estabelecer relações genéticas entre isolados de V. cholerae de antes, durante e depois da epidemia que atingiu a América Latina. Analisamos regiões do genoma core e do genoma acessório. Realizamos análises de genômica comparativa com informação de 355 V. cholerae, clínicos e ambientais, de diferentes anos e regiões geográficas. Com base em três genes do genoma core, nossos resultados mostram que a linhagem da epidemia da AL pertence ao clado El Tor, e por sua vez, os genótipos dos principais determinantes de virulência ctxB e tcpA, (genoma acessório), os agrupa com isolados do início da sétima pandemia, incluindo o canônico N16961. As análises genômicas e filogenéticas revelaram a presença de um profago (WASA1) e de uma variante exclusiva da ilha genômica VSP-II. A VSP-II da linhagem da AL é caracterizada por seu gene da integrase e uma inserção de 7 Kb, que contém três genes putativos. Curiosamente, os dois marcadores, que fazem parte do genoma acessório desta linhagem, WASA1 e VSP-II, apresentam relação de similaridade com elementos genéticos identificados em Vibrio vulnificus/Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus/V. cholerae do ambiente, respectivamente. Estes marcadores seriam, portanto, uma fração do mobiloma que evoluiu e se fixou na linhagem de V. cholerae da epidemia da América Latina. / Vibrio cholerae is the causative agent of cholera, an ancestral, epidemic and pandemic infection, which is a major public health concern worldwide. Mankind has gone through at least six cholera pandemics and currently lives in the context of the seventh pandemic. V. cholerae is classified into more than 200 serogroups and some biotypes. V. cholerae O1 classical and El Tor biotype are related to the sixth (1899 to 1923) and seventh (1960 - ....) cholera pandemics, respectively. The seventh pandemic reached Latin America (LA) in 1991 and its origin was related, immediately, to Southwest Asia, where cholera is endemic and epidemic. A second hypothesis emerged suggesting a regional environmental origin. Since the beginning of this century, the LA epidemic ended, occurring only occasional case reports. Here, we studied, from the perspective of V. cholerae genetics and genomics, the lineage of the LA cholera epidemic. Our objectives were to infer their origin and identify genomic markers that would enable its monitoring. In order to establish the genetic relationships among V. cholerae strains isolated before, during and after the epidemic in Latin America, we used in vitro and in silico approaches. Comparative analyzes, targeting the core and accessory genome of 355 clinical and environmental V. cholerae strains, from different years and geographical regions, were performed. MLSA (multi locus sequence analysis), based on three genes of the core genome, revealed that the LA epidemic lineage belongs to the El Tor clade. Additionally, the genotypes of the major virulence determinants, ctxB and tcpA (accessory genome), show that the LA lineage is related with strains from the beginning of the seventh pandemic, including the canonical N16961. Considering this large set of genomes, we confirm the prophage WASA1 as a LA lineage marker. The LA lineage is also characterized by an unique VSP-II genomic island. The VSP-II AL harbors a particular integrase gene and a 7.0 kb insert which contains three putative genes. Interestingly, the two LA markers, WASA1 and VSP-II, which are part of its accessory genome, have similarity with genetic elements identified in Vibrio vulnificus / Vibrio parahaemolyticus and V. vulnificus / environmental V. cholerae, respectively. Therefore, these two elements are a fraction of the V. cholerae mobilome that evolved and fixed in the LA lineage.

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2007 / Inclui bibliografia / O presente trabalho tem como escopo analisar algumas transformações da sociedade no campo das ciências biomédicas, demonstrando que o Direito deve agir como uma ferramenta eficaz para regulamentar as inovações biotecnológicas relacionadas à Genética e ao / Il presente lavoro ha per scopo analizzare alcune trasformazioni della società nel campo delle scienze biomediche, dimostrando che il Diritto deve operare come uno strumento efficace a regolare le innovazioni biotecnologiche riguardanti la Genetica ed il

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2011 / Bibliografia: f. [65]-70 / Pesquisas envolvendo o Projeto Genoma Humano têm avançado bastante em relação ao mapeamento genético. Por conta disso, a quantidade de informações armazenadas em bases de dados gênicas tem aumentado muito rapidamente e análises manuais feitas por cientist / Researches involving the Human Genome Project have significantly advances in genetic mapping. For this reason, the amount of information stored in genetics datasets has increased very rapidly and scientists manual analyses take years to be completed. Anal

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T14:43:21Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 19226 bytes, checksum: 3311f50c2162c5bb897dc91d378af6b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T14:43:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 19226 bytes, checksum: 3311f50c2162c5bb897dc91d378af6b2 (MD5) Previous issue date: 2005-05-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Na busca de novos resultados para elucidar o papel de HAP1 e ROX1, que codificam um ativador do metabolismo oxidativo e um repressor do metabolismo oxidorredutivo, respectivamente, na levedura Crabtree negativa Kluyveromyces lactis cuja versatilidade metabólica pode ser explorada em vários campos da biotecnologia, inicialmente, foi identificado um gene ortólogo ROX1 à S. cerevisiae na seqüência genômica de K.lactis. O gene KlROX1 possui 40% de identidade daquele presente em S. cerevisiae e um motif característico do domínio HMG (High Mobility Group). Com base nessa seqüência uma linhagem mutante com deleção de ROX1 foi construída e confirmada. O fenótipo URA + e rox1 - dos transformantes obtidos, K.lactis ∆rox1::URA3, foram 100% estáveis sob condição seletiva. O gene putativo ROX1 de K.lactis teve a sua função em resposta ao oxigênio confirmada em culturas de K. lactis sob regime contínuo e desrepressão por glicose, pois, a deleção de ROX1 induziu a um aumento no nível do transcrito do gene hipóxico HEM13. A análise dos produtos do metabolismo permitiu inferir que a deleção do gene ROX1 em K. lactis aumentou a capacidade fermentativa dessa levedura sob aerobiose e de desrepressão catabólica. A investigação em culturas K. lactis ∆hap1 submetidas ao cultivo contínuo aeróbico sob desrepressão por glicose revelou um fenótipo relacionado ao metabolismo oxidorredutivo, ou seja, K. lactis ∆hap1 é mais fermentativa levando a diversidade de metabólitos em torno do piruvato. A proposta da via de regulação parcial negativa controlando a expressão de HEM13 foi confirmada nas culturas K. lactis. / The objective of this study was to search for new results in order to elucidate the role of HAP1 and ROX1, which codify an oxidative metabolism activator and an oxidoreductive metabolism repressor respectively, in the Crabtree-negative yeast Kluyveromyces lactis, whose metabolic versatility can be exploited in several biotechnology fields. Initially, a ROX1 gene orthologous to S. cerevisiae was identified in the genomic sequence of K. lactis. The KlROX1 gene has 40% identity with the one present in S. cerevisiae and a characteristic motif of the HMG (High Mobility Group) domain. Based on this sequence, a mutant line with ROX1 deletion was built and confirmed. The obtained transformant URA + and rox1 - phenotypes, K. lactis ∆rox1::URA3, were 100% stable under selective condition. The putative K. lactis ROX1 gene had its function in response to oxygen confirmed in cultures of K. lactis under continuous regime and glucose derepression, since ROX1 deletion induced an increase in the level of the HEM13 hypoxic gene transcript. The analysis of metabolism products allowed inferring that the deletion of gene ROX1 in K. lactis increased the yeast fermentative capacity under aerobic and catabolic derepression. The investigation in K. lactis ∆hap1 cultures under continuous aerobic cultivation and glucose derepressiom revealed a phenotype related to oxidoreductive metabolism, in other words, K. lactis ∆hap1 is more fermentative, leading to metabolite diversity around the piruvate. The proposal of the partial negative regulation pathway controlling the HEM13 expression was confirmed in K. lactis cultures.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / United Nations University (UNU-BIOLAC) / Formas tripomastigotas de T. cruzi expressam glicoproteínas de superfície da superfamília das trans-sialidases (TS), implicadas nos processos de invasão da célula hospedeira. As TSs constituem uma grande família gênica codificando grande número de proteínas de superfície. Populações de T. cruzi podem expressar diferentes formas antigênicas de TS. A identificação de genes TS localizados próximos aos telômeros sugeriu que as terminações cromossômicas poderiam atuar como local de geração de novas variantes TS. O objetivo deste trabalho é caracterizar as regiões teloméricas e subteloméricas do T. cruzi e investigar seu papel na recombinação e geração de variantes TS. Idfentificamos 49 “contigs” obtidos durante o projeto genoma que contém a repetição telomérica (TTAGGG). Destes “contigs”, em 45 a repetição telomérica está localizada em uma extremidade, e em quatro “contigs” está localizada internamente. A presença de repetições teloméricas internas poderia ser explicada por erros no alinhamento in silico das sequências ou por eventos de fusão de telômeros, formando cromossomos com repetições teloméricas intersticiais. Todos os contigs apresentam uma sequência conservada de 189 pb adjacente à repetição telomérica, denominada junção telomérica, que representa uma assinatura de extremidades cromossômicas de T. cruzi. Durante o trabalho, localizamos 40 dos 49 “contigs” teloméricos nos “contigs” cromossômicos de T. cruzi e relacionamos algumas extremidades cromossômicas às bandas cromossômicas separadas por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A estrutura das sequências subteloméricas de T. cruzi varia muito, principalmente como resultado de diferenças na quantidade e na organização de genes de proteínas de superfície (TS e DGF-1), genes “retrotransposon hot spot” (RHS), retroelementos e genes de RNA helicase e N–acetiltransferase entre as extremidades cromossômicas. As regiões subteloméricas possuem um grande número de pseudogenes, porém, também contêm genes completos, possivelmente expressos. Isto indica que estas regiões não representam apenas DNA não-funcional adjacente aos telômeros, mas formam parte do genoma expresso. O tamanho das regiões subteloméricas varia de 5 kb a 182 kb, sendo que as pequenas extremidades podem ter surgido de eventos recentes de quebra cromossômica e reparo dos telômeros. A falta de sintenia nas regiões subteloméricas sugere que genes localizados nestas regiões estão sujeitos a recombinação, o que aumenta sua variabilidade, inclusive em cromossomos homólogos. A presença de genes típicos subteloméricos pode facilitar a ocorrência de mecanismos de recombinação homóloga ou de recombinação mediada por micro-homologia, que podem usar estas regiões para o emparelhamento e recombinação de extremidades livres. Para verificar se eventos de recombinação envolvendo as extremidades cromossômicas estão ocorrendo no parasita construímos um cromossomo artificial de T. cruzi (TAC), uma construção linear que pode ser eficientemente introduzida em epimastigotas mantendo-se estável como um cromossomo do parasita. Estas construções (pTAC-gp85) não se integram ao genoma do parasita, e contém sequências subteloméricas, incluindo um pseudogene gp85, marcadores de seleção em ambos os braços e o gene repórter GFP. Após a eletroporação de epimastigotas com as construções, estas se mantiveram lineares epissomais e estáveis, por diversas gerações, mesmo na ausência de pressão seletiva com antibióticos. Ao longo do ciclo de vida do parasita, o cromossomo artificial se manteve estável, segregando-se junto aos outros cromossomos do parasita. Não foram detectados eventos de recombinação envolvedo deslocamento de genes do cromossomo articial para outro sítio genômico. Eventos de recombinação envolvendo genes TS subteloméricos podem estar ocorrendo em T. cruzi, mas possivelmente com menos frequência do que o esperado pela diversidade genética observada entre as linhagens e o grande número de variantes de antígenos de superfície no parasita. Eventos de recombinação em alguns parasitas da população dificilmente seriam detectados pela estratégia utilizada em nossos experimentos. O T. cruzi apresenta alta resistência aos efeitos da radiação ionizante, apresentando grande capacidade de reparo do DNA. A radiação gama causa a paralização do ciclo celular e fragmentação cromossômica, associada a quebras na dupla fita de DNA (DSBs – “double strand breaks”). No entanto, 48h após a irradiação, bandas cromossômicas de tamanho normal foram detectadas por PFGE. Embora tenha sido proposto que a recombinação mediada por Rad51 tenha papel importante no reparo de lesões do DNA, muitas dúvidas permanecem sobre a resposta do T. cruzi à radiação. Portanto, efetuamos experimentos para compreender o reparo dos cromossomos após a exposição de epimastigotas à radiação gama. Epimastigotas em crescimento exponencial (clone CL Brener e cepas G e CL) foram expostos a doses de 500 a 2000 Gy de radiação gama. Após a irradiação verificamos em intervalos regulares a sobrevivência das células, o crescimento celular, o dano e o reparo do DNA. A inibiçao do crescimento celular ocorreu imediatamente após a irradiação, e permaneceu por 96 h nos parasitas irradiados com 500 Gy e por até 12 dias nos parasitas irradiados com 1000 Gy. Parasitas irradiados com doses maiores (1500 e 2000 Gy) não sobreviveram. Utilizando ensaios que detectam DSBs (TUNEL) e fragmentação cromossômica (PFGE), avaliamos o efeito genotóxico da radiação em epimastigotas. Seis dias após a irradiação, a porcentagem de células irradiadas com 500 Gy marcadas positivamente com TUNEL é similar à de células não irradiadas e 3 vezes menor que nas células irradiadas com 1500 e 2000 Gy. Acreditamos que a fragmentação cromossômica e o número de células marcadas com o ensaio de TUNEL crescem conjuntamente. Comparamos o nível de sintenia entre parasitas irradiados e não irradiados pela análise de segmentos cromossômicos homólogos. Células irradiadas exibem uma impressionante conservação na organização dos genes em relação aos parasitas não irradiados. Nossos resultados confirmam a grande capacidade de reparo de DNA e de resistência à radiação apresentada pelo T. cruzi. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Gilvan Almeida (gilvan.almeida@icict.fiocruz.br) on 2016-09-20T14:28:59Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71971.pdf: 8611077 bytes, checksum: d7c7d933929609de42dfd8e3199d51cf (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-10-03T13:30:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71971.pdf: 8611077 bytes, checksum: d7c7d933929609de42dfd8e3199d51cf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T13:30:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71971.pdf: 8611077 bytes, checksum: d7c7d933929609de42dfd8e3199d51cf (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), as Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs), como a doença de Chagas, tripanossomíase africana, entre outras, afetam cerca de 1 bilhão de pessoas no mundo. Apesar do impacto causado por estas doenças, as mesmas continuam sendo pouco estudadas. O reino Protista, ao qual os agentes etiológicos dessas doenças pertencem, incluem espécies de importância veterinária que causam muitas perdas para a indústria pecuária. Com os avanços da genética molecular, técnicas como a genotipagem estão sendo usado cada vez mais utilizadas para o estudo de protozoários parasitos. Genes ortólogos conservados em protozoários podem ser utilizados como loci para genotipagem desses protozoários, de modo a obter uma melhor caracterização interespecífica. Neste estudo, foram utilizadas técnicas de PCR singleplex e multiplex para a genotipagem de 16 espécies de protozoários de três diferentes gêneros: Trypanosoma spp., Leishmania spp. (classe Kinetoplastea) e Plasmodium spp. (filo Apicomplexa). Como metodologia de biologia molecular foram utilizados PCR e sequenciamento, bem como em bioinformática, onde foi utilizado filogenia molecular. Para esta finalidade, foram desenhados 39 pares de iniciadores degenerados e usados com o DNA genômico de espécies de protozoários de dois grupos: filo Apicomplexa e classe Kinetoplastea, em seguida, as reações de PCR foram realizadas a fim de padronizar as reações para um PCR multiplex. Além disso, os seguintes parasitos de importância para a saúde pública: T. cruzi, Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, Plasmodium falciparum e P. Vivax, foram utilizados neste trabalho A partir dos 39 pares de iniciadores, 9 pares foram selecionados compreendendo 7 loci para o presente estudo: metionil-tRNA sintetase, leucil-tRNA sintetase, seril-tRNA sintetase, subunidade U5 snRNP do spliceossomo, mismatch repair ATPase, triosefosfato isomerase e GTP-binding protein. Os testes a partir de diluições seriadas dos DNAs de Trypanosoma spp., Leishmania spp. e Plasmodium spp., onde mostraram uma sensibilidade de até 1 pg/\03BCL de DNA (para o locus Leucyl-tRNA synthetase em Trypanosoma e Leishmania). A reação inicial de PCR singleplex padronizada foi eficiente para todos os loci, o que proporcionou o desenho da reação de PCR multiplex, onde o melhor resultado foi a reação número 5, a qual foi utilizada um conjunto de iniciadores dos genes GTP-binding protein, U5 snRNP spliceosome subunit e Leucyl-tRNA synthetase, que quando integrados permitiram a genotipagem multilocus de tripanossomatídeos dos gêneros Leishmania spp. e Trypanosoma spp. A metodologia aplicada para a genotipagem destas espécies de parasitas foi bem-sucedida, e pode-se destacar após a observação de conjunto de resultados que o melhor locus em termos de especificidade, sensibilidade e fidelidade aos dados encontrados na literatura, foi Leucyl-tRNA synthetase, que apresentou resultados satisfatórios em todas as análises / According to the World Health Organization (WHO), Neglected Tropical Diseases (NTDs), examples being Chagas disease, African trypanosomiasis, among others, affect about 1 billion people in the world. However, they are little studied, despite its great impact on health. Also, they include species of veterinary importance that cause great harm to the livestock industry. The kingdom Protista, containing etiological agents of NTDs, they include species of veterinary importance and that cause great harm to the livestock industry. With advances in molecular genetics, techniques such as genotyping are being used increasingly used for the study of parasitic protozoans. Orthologous genes conserved in protozoa can be used as loci for genotyping, in order to obtain a better interspecific characterization. In this study, we used singleplex and multiplex PCR techniques for genotyping of 16 species of three different genus of protozoans: Trypanosoma spp., Leishmania spp. (class Kinetoplastea) e Plasmodium spp. (phylum Apicomplexa). As molecular biology methods were used PCR and sequencing of PCR fragments, as well as bioinformatics, using molecular phylogeny. For this purpose, were designed 39 degenerated primers for species of 2 groups: phylum Apicomplexa and class Kinetoplastea, then, the PCR reactions were performed with the aim of standardizing multiplex PCR reactions. Moreover, parasites of importance to public health such as Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis, L. amazonensis, L. guyanensis, Plasmodium falciparum and P. vivax were used in this study Based on the 39 pairs of primers, 9 pairs were selected comprising 7 loci for this study: methionyl-tRNA synthetase, leucyl-tRNA synthetase, seryl-tRNA synthetase, subunit U5 snRNP the spliceosome, mismatch repair ATPase, triosephosphate isomerase, and GTP- binding protein. The tests from serial dilutions of DNA from Trypanosoma spp., Leishmania spp. and Plasmodium spp., which showed a sensitivity of up to 1 pg/\03BCL DNA (for Leucyl-tRNA synthetase locus on Trypanosoma and Leishmania). The initial standardized singleplex PCR reaction was efficient for all loci, which resulted in the design of multiplex PCR reaction, where the best result was the number 5 reaction which was used a set of primers of the GTP-binding protein genes, U5 snRNP spliceosome subunit and Leucyl-tRNA synthetase, which when integrated allowed genotyping trypanosomatides multilocus of the genus Leishmania spp. and Trypanosoma spp. The methodology used for genotyping of these parasite species was successful, and can highlight after observation of the result set that the best locus in terms of specificity, sensitivity and fidelity to data found in literature, was LeucyltRNA synthetase, which showed satisfactory results in all analyzes

O gênero Pestivirus, pertencente à família Flaviviridae, é constituído por espécies virais de importância na saúde animal no mundo todo, as quais podem afetar a economia dos países de forma impactante. São reconhecidas quatro espécies pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV): vírus da peste suína clássica (Classical Swine Fever Virus – CSFV), vírus da doença da fronteira (Border Disease Virus- BDV), vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (Bovine Viral Diarrhea Virus 1- BVDV-1) e 2 (BVDV-2). Algumas das espécies deste gênero- CSFV e BVDV- são de notificação obrigatória na Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), causando sanções econômicas importantes quando presentes. Recentemente, possíveis novas espécies vêm sendo caracterizadas, porém ainda não foram reconhecidas como espécies do gênero Pestivirus. Com o objetivo de gerar mais informações acerca da diversidade genética de pestivírus no país, o presente trabalho descreve os genomas completos e a caracterização genômica e filogenética de uma cepa de BVDV-1 subtipo i e duas de vírus ‘HoBi’-like. Os genomas completos foram obtidos através de sequenciamento de nova geração; as anotações, predição da poliproteína viral e dos sítios de clivagem foram feitos através do software Geneious, e a análise filogenética foi realizada através do software MEGA 6. O BVDV-1 subtipo i foi pela primeira vez isolado no Brasil, sendo também a primeira descrição de genoma completo deste subtipo de BVDV. Também foi descrito o genoma completo de duas cepas de vírus ‘HoBi’-like isolados no Brasil, além da caracterização de outras cepas de ‘HoBi’-like disponíveis em bancos de dados. Os dados moleculares destes isolados foram comparados com aqueles das demais espécies do gênero Pestivirus, e estas informações deverão auxiliar na futura classificação deste como espécie. Os resultados apresentados na dissertação adicionam conhecimento sobre a diversidade genética de BVDV-1 no Brasil além de informações acerca do vírus ‘HoBi’-like, reforçando esta espécie ainda não reconhecida como um novo membro do gênero Pestivirus, os ‘HoBi’-like vírus. / The genus Pestivirus, within the family Flaviviridae, includes species that are important pathogens affecting animal health that can cause impacting losses in the economy worldwide. According to the International Committee on Taxonomy of Virus (ICTV), there are four recognized species in this genus: Classical swine fever virus (CSFV), Bovine Viral Diarrhea Virus1 and 2 (BVDV -1, BVDV-2), and Border disease virus (BDV). Some of the species within this genus - CSFV and BVDV- are notifiable to the World Organization for Animal Health (OIE), and can cause exportation barriers or sanctions. Other putative new species have been characterized recently, but remain officially unrecognized. In order to generate data about the genetic diversity of pestivirus in Brazil, this study describes complete genomes and the genomic and phylogenetic characterization of an isolate of BVDV-1i and two isolates of ‘HoBi’-like virus. Complete genomes were sequenced through Next Generation Sequencing; genome annotations, polyprotein prediction and identification of cleavage sites were performed with software Geneious, and phylogenetic analysis with software MEGA 6. BVDV-1 subtype i was found in Brazil for the first time, and this is the first complete genome ever characterized for this subtype. Two strains of ‘HoBi-like’ virus isolated in Brazil were also described and characterized together with other ‘HoBi’-like strains available in databases. The molecular data obtained for these isolates were compared to those of other Pestivirus species. These data can help in future classification of these ‘HoBi’-like strains as a new recognized species. The knowledge on genetic diversity and the characterization of pestiviruses can contribute with surveillance programs and with appropriate animal health measures to control these viral diseases.

Falhas reprodutivas são importante causa de prejuízos econômicos na suinocultura. Elas implicam na diminuição do número de leitões nascidos vivos e aumentam o descarte de animais e as taxas de reposição de matrizes, levando à redução da produtividade do rebanho. Embora a maioria dos casos de natimortalidade sejam associados a fatores não infecciosos, os agentes infecciosos possuem um papel importante e ainda pouco conhecido na etiologia deste quadro. Até o presente, nenhum trabalho foi realizado visando o estudo do conjunto de vírus que possam estar presentes em matrizes com eventos de natimortalidade por ocasião do parto. Em função disso, o presente trabalho teve por objetivo examinar o viroma do soro de matrizes suínas com e sem casos de natimortalidade. Foram coletadas 94 amostras de soro de matrizes de seis granjas distribuídas em cinco municípios do Rio Grande do Sul. Em cada granja foram formados dois pools de soros: um composto por matrizes que pariram (um ou mais) natimortos e outro por matrizes que pariram leitegadas sem natimortos. Os pools foram submetidos à extração de ácido nucleico viral, enriquecimento e sequenciamento de alto desempenho, buscando a identificação de agentes que possam representar um fator de risco à natimortalidade em suínos Não foi possível identificar diferenças significativas nos viromas de matrizes correlacionadas à ocorrência de natimortalidade. Não obstante, foi possível identificar uma ampla variedade de genomas virais, a maioria deles correspondendo a vírus das famílias Anelloviridae. Este estudo permitiu ainda identificar 20 genomas completos de três espécies de vírus: torque teno vírus suíno 1a e 1b, circovírus suíno tipo 3 (PCV3) e vírus circulares DNA fita simples codificantes de replicase (CRESS), seis dos quais até o presente ainda não reportados em suínos. Em duas granjas, em matrizes que apresentaram natimortalidade, foram identificados genomas de PCV3, cuja participação como potencial causador de problemas reprodutivos precisa ser futuramente investigada. Não foram identificados vírus com genoma de RNA. Este estudo traz uma contribuição ao conhecimento do viroma em soros de matrizes suínas e, paralelamente, busca contribuir para o esclarecimento das possíveis causas de natimortalidade de origem infecciosa em suínos. / Reproductive failure in swine herds is an important cause of economic losses. It leads to a decrease in the number of piglets reared per sow and may imply in the need for replacement of sows, reducing the productivity in a herd. Although the majority of cases of stillbirths have been attributed to non-infectious causes, several infectious agents have been implicated in the etiology of such condition. Nevertheless, other as yet unknown agents may be involved in the pathogenesis of stillbirths. The aim of this work was to investigate the virome in sera of sows without and with one or more cases of stillbirth in the litter. Sera were collected from 94 sows of six commercial farms in five municipalities in the state of Rio Grande do Sul, Brazil. Two pools of sera were collected from each farm: one representative of sows that had at least on stillbirth in the last litter and another composed by sera of sows that had litters with no stillbirths. The pools were subjected to nucleic acid extraction, enrichment and high throughput sequencing. No significant differences were detected in the serum viromes of sows with or without stillbirth Nevertheless, it was possible to identify a wide variety of viral genomes, most of these representing viruses of Anelloviridae family. In addition, the present work allowed the identification of 20 complete genome sequences including torque teno sus virus 1a and 1b, porcine circovirus 3 (PCV3) and circular rep-encoding ssDNA viruses (CRESS), including six species not previously reported in swine. In two farms, PCV3 genomes were identified in the serum pools of sows which had cases of stillbirth. The role for this virus as a potential cause of reproductive failure needs additional investigations. No genomes of viruses with RNA genomes were identified. This study provides a contribution to the knowledge on the serum virome of pregnant sows. In addition, it is expected to aid in the identification of possible causes of stillbirth in swine.

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:02:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-09. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:19:24Z : No. of bitstreams: 1 000847289_20151210.pdf: 109983 bytes, checksum: 0805da618c3e8c3448f6b9e2d227a33b (MD5) Bitstreams deleted on 2015-12-11T11:22:37Z: 000847289_20151210.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-11T11:23:16Z : No. of bitstreams: 1 000847289.pdf: 738165 bytes, checksum: af1a367e9d0c1700d0efba7690754147 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Cromossomos B, também conhecidos como supernumerários, são considerados elementos dispensáveis ao organismo. Porém, alguns estudos têm apresentado evidências de uma possível funcionalidade destes cromossomos extras. São encontrados em muitas espécies de eucariotos, entre elas, Astatotilapia latifasciata, ciclídeo africano que possui de 1 a 2 cromossomos B. Os ciclídeos têm sido muito utilizados como organismos modelo para estudos genéticos e genômicos. Análises genômicas em larga escala prévias envolveram sequenciamento por next generation (Illumina HiSeq sequencing) de genomas sem cromossomo B (B-) e com cromossomo B (B+) de A. latifasciata e uma forma variante do gene hnRNP Q-like (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q-like) foi identificada. Esta sequência apresenta um alto número de cópias e características de retrogene no cromossomo B. Diante disso, foi objetivo do presente trabalho compreender a organização genômica, identificar os mecanismos de retro-inserção e fazer análises de expressão desta sequência, possibilitando um melhor entendimento da origem, evolução e possíveis efeitos deste cromossomo na espécie estudada. A partir de análises de bioinformática foram identificadas cópias variantes do gene hnRNP Q-like no genoma B+ e as regiões mais representativas foram selecionadas, de acordo com o grau de mutações, para demais estudos. Análises de fragmentos sequenciados e qPCR confirmaram que o gene possui maior número de cópias e ausência de íntrons no cromossomo B. Evidências de resquícios de domínios da transcriptase reversa de elementos transponíveis sugerem que o gene foi retroinserido no cromossomo B. Dados de qPCR em cDNA mostraram que, apesar de possuir mais cópias no genoma B+, o gene hnRNP Q-like não é diferencialmente expresso nos genomas B+ e B- / B chromosomes, also known as supernumerary, are considered dispensable elements to organisms. However, some studies have presented evidences of a possible functionality of this extras chromosomes. They are observed in many eukaryote species, such as in the African cichlid, Astatotilapia latifasciata, which might have one or two B chromosomes. Cichlids have been used as model organisms to genetics and genomics studies. Previous genomic analyses based on next generation sequencing (Illumina HiSeq sequencing) were realized in the whole genome without B chromosome (B-) and with B chromosomes (B+) of A. latifasciata and a variant form of hnRNP Q-like (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q-like) gene was identified. This sequence presented a high copy number and characteristics of a retrogene in B chromosomes. Thus, the aim of this study consists in comprehend genomic organization, identify retroinsertion mechanisms and perform expression analyses of the hnRNP Q-like gene, making it possible a better understanding of origin, evolution and possible effects of this chromosomes in the studied species. Bioinformatics analyses identified variant copies of hnRNP Q-like gene in B+ genome and the higher and lower variable regions of the gene were selected, based in mutation rates, for further analysis. Analyses from sequenced fragments and qPCR confirmed gene has a higher number of copies and do not present introns in B chromosome. Evidences of transposable element relics with reverse transcriptase domains suggest gene was retroinserted in B chromosome. The data of qPCR in cDNA showed that the hnRNP Q-like gene is not differentially expressed in both genomes (with and without B chromosome)