Cryopreservation and transplantation of germ cells in fish provides a suitable tool for preserving genetic information. By method of surrogate reproduction, the offspring with characters of the chosen donor can be obtained. In this case of our commercially important species common carp. However, for the successful cryopreservation of the germ cells, a suitable protocol for each species must be established. Several cryoprotectants were tested. The best of them, Me2SO, regarding the viability of spermatogonia, was tested for its different concentrations depending also on the rate of freezing. Further testing, related to the effect of tissue size, incubation time and added sugar, was performed. The result of the assay identified best cryomedium composed of 2.5M dimethylsulfoxide, added sugar of 0.3M glucose, 1.5% BSA and 25nM Hepes dissolved in PBS. The most suitable size of tissue was 100 mg, incubation time was 30 min and coolig rate was -1 ° C/min. This protocol ensures the highest viability rate of cryopreserved spermatogonia of common carp. The second part of the work was to verify the success of the transplantation of cryopreserved and fresh spermatogonia into a suitably chosen recipient, the goldfish, which shares similar reproductive characteristics with carp, but also offers reduction of space requirements or resistance to koi-herpes virus. The transplanted germ cells colonized the germ line and started gametogenesis in 42.5% (cryopreserved spermatogonia) and 52.5% (fresh spermatogonia) goldfish recipients, which demonstrated that the transplantation of cryopreserved spermatogonia of common carp can be successfully achieved.

abstract: For a (N+1)-bus power system, possibly 2N solutions exists. One of these solutions is known as the high-voltage (HV) solution or operable solution. The rest of the solutions are the low-voltage (LV), or large-angle, solutions. In this report, a recently developed non-iterative algorithm for solving the power- flow (PF) problem using the holomorphic embedding (HE) method is shown as being capable of finding the HV solution, while avoiding converging to LV solutions nearby which is a drawback to all other iterative solutions. The HE method provides a novel non-iterative procedure to solve the PF problems by eliminating the non-convergence and initial-estimate dependency issues appeared in the traditional iterative methods. The detailed implementation of the HE method is discussed in the report. While published work focuses mainly on finding the HV PF solution, modified holomorphically embedded formulations are proposed in this report to find the LV/large-angle solutions of the PF problem. It is theoretically proven that the proposed method is guaranteed to find a total number of 2N solutions to the PF problem and if no solution exists, the algorithm is guaranteed to indicate such by the oscillations in the maximal analytic continuation of the coefficients of the voltage power series obtained. After presenting the derivation of the LV/large-angle formulations for both PQ and PV buses, numerical tests on the five-, seven- and 14-bus systems are conducted to find all the solutions of the system of nonlinear PF equations for those systems using the proposed HE method. After completing the derivation to find all the PF solutions using the HE method, it is shown that the proposed HE method can be used to find only the of interest PF solutions (i.e. type-1 PF solutions with one positive real-part eigenvalue in the Jacobian matrix), with a proper algorithm developed. The closet unstable equilibrium point (UEP), one of the type-1 UEP’s, can be obtained by the proposed HE method with limited dynamic models included. The numerical performance as well as the robustness of the proposed HE method is investigated and presented by implementing the algorithm on the problematic cases and large-scale power system. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Electrical Engineering 2015

Submitted by ANGEL ANDRÉS ARIAS VIGOYA null (lakotah1@gmail.com) on 2017-01-25T17:53:42Z No. of bitstreams: 1 TESE VERSAO DEFINITIVA.pdf: 6803879 bytes, checksum: 2803b2bfb33863aee3dc638d6b31456b (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-01-27T13:30:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ariasvigoya_aa_dr_jabo.pdf: 6803879 bytes, checksum: 2803b2bfb33863aee3dc638d6b31456b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-27T13:30:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ariasvigoya_aa_dr_jabo.pdf: 6803879 bytes, checksum: 2803b2bfb33863aee3dc638d6b31456b (MD5) Previous issue date: 2016-12-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Nos vertebrados, a espermatogênese é um processo de desenvolvimento celular altamente conservado e organizado, no qual uma pequena população de espermatogônias tronco produz continuamente milhões de espermatozóides, os quais são os responsáveis pela propagação do genótipo dos machos. Este processo é sustentado pelas espermatogônias tronco através da sua capacidade de auto-renovação e diferenciação. Vários aspectos relacionados com a regulação da atividade e fisiologia das espermatogônias tronco são ainda desconhecidos nos peixes teleósteos. Portanto, a técnica de transplante de células germinativas torna-se uma poderosa abordagem para melhorar o conhecimento da biologia das espermatogônias tronco e da espermatogênese. Resumidamente, a técnica envolve a transferência de células germinativas isoladas de um doador fértil para os testículos de um receptor estéril, e as células transplantadas são capazes de restaurar a gametogênese do receptor. Neste contexto, realizamos uma caracterização morfológica e estereológica dos diferentes tipos de células encontradas na espermatogênese da carpa comum (Cyprinus carpio). Também caracterizamos fenotipicamente as potenciais espermatogônias tronco. Portanto, descrevemos cinco tipos espermatogôniais na carpa comum: espermatogônias indiferenciadas do tipo A (Aund* - Aund), espermatogônias diferenciadas do tipo A (Adiff) e espermatogônias do tipo B (inicial e final). Nesta espécie, o processo espermatogênico durou aproximadamente uma semana. Nossos resultados demonstraram que a população espermatogonial expressa as proteínas c-Kit, Gfrα-1 e POU2. Neste estudo, também foi padronizada a técnica de transplante de espermatogônias na carpa comum. Assim, células germinativas isoladas de kinguios sexualmente maduros foram transplantadas através da papila urogenital de carpas macho quimicamente esterilizadas. As células germinativas derivadas dos doadores foram capazes de colonizar e se desenvolver nos testículos dos receptores. Em geral, nossos resultados reforçam a compreensão da biologia das células germinativas, em especial das potenciais células tronco. Além disso, o transplante, padronizado aqui, é uma abordagem com implicações significativas para a conservação e manejo das espécies valiosas e/ou ameaçadas de extinção. / In vertebrates, spermatogenesis is a highly conserved and organized developmental process, in which a small population of spermatogonial stem cells (SSC) continuosly produce millions of spermatozoa, which are responsible for spreading the male genotype. Likewise other stem cells, SSC are capable of either self-renew or differentiate. Several aspects related to the regulation of SSC activity and physiology are still unknown in teleost fish. Thus, the germ cell transplantation technique becomes a powerful approach to improve the knowledge of SSC biology and spermatogenesis. Briefly, the technique involves the transfer of germ cells isolated from a fertile donor into the testes of a sterile recipient, and transplanted donor germ cells are able to restore the recipient gametogenesis. Taking advantage of this background, we performed morphological and stereological characterization of the different cell types found in the common carp (Cyprinus carpio) spermatogenesis. We also characterized the putative SSC candidates by morphology. Therefore, we described five spermatogonial types in common carp: type A undifferentiated spermatogonia (Aund* - Aund), type A differentiated spermatogonia (Adiff) and type B spermatogonia (early and late). In this species, the spermatogenic process lasted approximately one week. Our findings demonstrated that the spermatogonial population expressed the c-Kit, Gfrα1 and POU2 proteins. Donor germ cells isolated from goldfish were transplanted non-surgically through urogenital papilla into the sexually mature cytoablated common carp recipients. Donor transplanted germ cells were able to colonize and develop in recipients’ testes. Overall, our results strengthens the knowledge of germ cell biology, focusing on stem cells. Finally, transplantation, standardized here, is an approach with significant implications for the conservation and management of endangered and valuable fish species. / CAPES: 15213-12-9

Orientador: José Francisco Lopes Filho / Banca: Javier Telis Romero / Banca: Eduardo Micotti da Gloria / Resumo: Foi monitorada a hidratação dos germes dos grãos de milho macerados a 52ºC e 180 rpm, em 9 soluções formadas pelas combinações de três níveis de SO2 (0,0 ; 0,1 e 0,2%) e três níveis de ácido lático (0,0 ; 0,55 e 1,0%) em intervalos de tempos de 10 minutos até 36 horas. Para determinar os coeficientes efetivos de difusão da água no germe foi utilizada a solução proposta por Crank (1975) para a Segunda Lei de Fick. Os coeficientes de difusão foram da ordem de 10-6 cm2/s, valores até 10 vezes maiores que os reportados na literatura para o grão inteiro. Verificou-se que o ácido lático dificultou a hidratação nas primeiras 2 horas e facilitou em 24 horas de maceração, ao passo que o SO2 dificultou a hidratação em 24 horas de maceração. Numa segunda etapa, macerou-se 1kg de grãos de milho em 4 tratamentos que apresentaram maior hidratação e no tratamento convencional (36 horas, 0,2% SO2 e 0,55% ácido lático), determinando-se o rendimento, a porcentagem de danificação e o teor de óleo nos germes. Foi verificado que a primeira moagem do processo úmido deve ocorrer somente após o germe atingir umidade próxima de 50% b.u. e que o SO2 e o ácido lático são imprescindíveis para se obter germe de boa qualidade. / Abstract: Moisture content was measured at 15 steep times, from 10 minutes to 36 hours at 9 steep solutions made by combination between three levels of SO2 (0,0; 0,1; 0,2%) and three levels of lactic acid (0,0; 0,55; 1,0%). The solution of Fick's Second Law proposed by Crank (1975) was used to find the water effective diffusivity coefficients. The coefficients were in the order of 10-6cm2/s, and were up to 10 times faster them the values reported on the literature for diffusivity in the whole grain. Lactic acid decreased germ hydration during the first two hours of steeping and increased hydration at steeping time of 24 hours. SO2 decreased hydration for steeping time of 24 hours. On the second part of this work, 1kg of corn grains on the four treatments that showed to be of highest hydration and the conventional steeping treatment (36 hours, 0,2% SO2 and 1,0% lactic acid) were wet milled to recovery germ fraction. Percentage of germ yields, damages and oil content were determined and compared. Results showed that the first milling of the corn wet milling processes must occur only after the germ moisture content achieves approximately 50% w. b., and that SO2 and lactic acid are indispensable to obtain a high quality germ. / Mestre

Introdução: a alta prevalência do câncer e o aumento significativo da sobrevivência em longo prazo geraram interesse quanto à preservação da fertilidade em mulheres jovens expostas a quimioterapia e radioterapia. Neste sentido estudos de congelamento de tecido ovariano para posterior transplante, abriram uma nova perspectiva de aplicação no tratamento e prevenção da infertilidade feminina. Objetivos: comparar dois protocolos de congelamento de tecido ovariano, um lento não automatizado e um por vitrificação, com o intuito de avaliar a viabilidade dos tecidos para posterior transplante autólogo. Método: Foram utilizadas 30 camundongos fêmea CF1 com aproximadamente 8 semanas e pesando 29,29g±2,9. •Os ovários extraídos foram vitrificados ou congelados, mantidos em nitrogênio líquido por 30 dias e descongelados. Após o descongelamento, o ovário esquerdo foi destinado às análises histológicas e caracterização por imuno histoquímica para o marcador mouse vasa homologue (MVH) e o ovário direito foi utilizado para os testes de viabilidade celular com exclusão por azul de trypan. Resultados: Nas análises de Hematoxilina e Eosina (HE) foram contados folículos primordiais, primários, pré-antrais e antrais. Não houve diferença significativa na proporção de folículos primordiais, primários e pré-antrais após descongelamento entre os grupos testados. A contagem de folículos antrais foi significativamente maior no grupo de vitrificação (p = 0,004). No ensaio de imunohistoquímica para o marcador MVH, folículos MVH + e MVH- foram contados e comparados com o número total de folículos. O grupo congelamento lento apresentou maior número de células não marcadas (p = 0,012). Conclusão: Embora ambos os protocolos tenham apresentado resultados semelhantes na análise histológica das contagens foliculares, o protocolo de vitrificação foi significativamente melhor para preservar a população de células tronco ovarianas. / Introduction: The high prevalence of cancer and the significant increase in long-term survival have generated interest as the preservation of fertility in young women exposed to chemotherapy and radiotherapy. Experimental techniques have been tried in an attempt to reverse the ovarian failure induced by these treatments. In this regard studies of ovarian tissue freezing for subsequent transplantation disclose a new application perspective in the treatment and prevention of female infertility. Objective: two ovarian tissue freezing protocols were tested, a non-automated slow-freezing and by vitrification, in order to assess the viability of the tissues for subsequent autologous transplantation. Methods: as ovaries donors, were used 30 female CF1 mice approximately 8 weeks and weighing 29,29g±2,9. • The ovaries were vitrified or frozen, stored in liquid nitrogen for 30 days and thawed. After thawing, the left ovary was intended for histological and immunohistochemical characterization by histochemical marker for MVH and right ovary was used for the tests with cell viability by trypan blue exclusion. Results: In HE slides was counting primordial, primary, pre antral and antral follicles. No significant difference was found in the proportion of high-quality primordial, primary and pre antral follicles after thawing/warming in the slow-freezing and vitrification group, respectively. The antral follicle counting was significant higher in vitrification group (p=0,004). In immunohistochemistry assay for MVH Antibody , MVH+ and MVH- follicles were counted and compared with the total number of follicles and slow freeze group had a higher number of not marked cells (p=0,012). Conclusion: Although both protocols showed similar results in the histological analysis for follicular counts, the vitrification protocol was significantly better for preserve the ovarian stem cell population.

O transplante de células germinativas tem sido uma importante abordagem experimental para o estudo da preservação genética de espécies ameaçadas de extinção ou economicamente importantes. A técnica consiste na remoção das células germinativas indiferenciadas das gônadas do animal doador e na transferência das mesmas para a gônada de um indivíduo receptor. A fim de aumentar a eficiência da técnica, a identificação prévia das células germinativas a serem transplantadas torna-se preferível, visto que a cavidade que as receberá apresenta tamanho limitado. Sendo assim, é importante o desenvolvimento de marcadores moleculares que identifiquem precisamente as células a serem transplantadas na cavidade do individuo receptor, e os genes mais utilizados para esta finalidade são o dead end e o gene vasa, os quais são expressos apenas nas células da linhagem germinativa. Devido à importância do Colossoma macropomum (tambaqui) para a economia brasileira, esta espécie foi escolhida como uma espécie modelo de preservação para este estudo. Através do isolamento e sequenciamento dos genes dead end e vasa, desenvolvemos sondas de hibridização capazes de reconhecer as células onde estes genes são expressos e estudar o seu padrão de expressão nas gônadas. Ambos os genes apresentaram intensa expressão nos oócitos pré-vitelogênicos e fraca expressão em algumas espermatogônias. Pela primeira vez na literatura, diferentes isoformas causadas por splicing alternativo foram identificadas no gene dead end. A quantificação da expressão temporal dos diferentes transcritos mostrou que o padrão de expressão da sequência completa do gene teve uma tendência distintiva comparada ao padrão dos transcritos curtos, sugerindo que as diferentes isoformas desempenham papéis específicos e importantes para o desenvolvimento da linha germinativa nesta espécie. / Germ cell transplantation has been an important experimental approach to the study of the genetic preservation of endangered or economically important species. The technique consists in removing undifferentiated germ cells from the donor animal's gonads and transferring them to the gonad of a recipient individual. In order to increase the efficiency of the technique, the prior identification of the germ cells to be transplanted becomes preferable, since the receiving cavity presents limited size. Therefore, it is important to develop molecular markers to precisely identify the cells to be implanted in the recipient cavity, and the genes most used for this purpose are the dead end and the vasa genes, which are expressed only in germline cells. Due to the importance of Colossoma macropomum (tambaqui) for the Brazilian economy, this species was chosen as a model species for preservation in this study. By isolating and sequencing the dead end and vasa genes, we developed hybridization probes capable of recognizing the cells where these genes are expressed and better studying their expression pattern in the gonads. Both genes presented intense expression in pre-vitellogenic oocytes and poor expression in some spermatogonia. For the first time in the literature, different isoforms caused by alternative splicing were identified in the dead end gene. Quantification of the temporal expression of the different transcripts showed that the expression pattern of the full-length sequence had a distinctive tendency compared to the short transcripts pattern, suggesting that the different isoforms play specific roles for the germline development in this species.

O estudo visou elucidar o desenvolvimento embrionário e fetal de pacas (Agouti paca) e demarcação dos sítios germinativos nos embriões em diferentes estágios. Foram utilizados sete espécimes de Agouti paca, sendo dois embriões e três fetos doados do pacário mantido pela UNESP - Jaboticabal e, dois doados do acervo da FMVZ-USP. Os fetos 1 e 2 apresentaram imaturidade facial acentuada, olhos recobertos por uma lente proeminente e lóbulos das orelhas; os fetos 3 e 4, mostravam-se com orelhas bem desenvolvidas, membros torácicos e pélvicos em grau equalitário de desenvolvimento, como vibrissas ao redor das bordas nasais e olhos também protegidos; no feto 5, haviam pêlos distribuídos por todo o corpo, membros torácicos e pélvicos com garras, vibrissas na face, olhos proeminentes e orelhas bem desenvolvidas. O embrião 1, apresentou a vesícula óptica com pigmentação da retina, o quarto ventrículo encefálico e curvatura cervical acentuada e broto dos membros em desenvolvimento; o embrião 2, possuiu divisão dos arcos branquiais e neuróporo cranial aberto; presença da área cardíaca e fígado; vesícula óptica sem pigmentação da retina, abertura do tubo neural na região do quarto ventrículo encefálico, rombencéfalo e mesencéfalo em desenvolvimento. Na microscopia de luz, visualizamos a medula espinhal, abertura do 4º ventrículo encefálico, presença das vesículas encefálicas (prosencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo), coluna vertebral, hipófise, cavidades oral e nasal, olho, átrio e ventrículo cardíacos, pulmão e diafragma, além das cristas metanéfrica e mesonéfrica, fígado, intestino e pedículo umbilical. Nas reações de imunohistoquímicas para OCT-4 não houve marcação expressiva em órgãos tais como pulmão, intestino e somitos, o coração apresentou uma leve positividade à reação, enquanto que nas cristas meso e metanéfrica e fígado obtiveram uma marcação expressiva, sendo mais acentuada no último. Nos testes com vimentina todos os órgãos mostraram-se imunopositivos em diferentes áreas; e em se tratando da reação a testes com actina apenas a região de somitos não obteve marcação positiva. Concluímos que o período embrionário/fetal da paca não pode ser comparado com o modelo clássico de roedor; sua embriogênese pode ser comparada à de ratos, Guinea pig, coelhos e humanos. A imunolocalização positiva de OCT-4 apresenta diferenças de acordo com a idade gestacional, devido às mudanças embriológicas dos tecidos. A imunolocalização positiva de OCT-4 apresenta diferenças de acordo com a idade gestacional, devido às mudanças embriológicas dos tecidos. A vimentina como marcador de mesênquima se expressou positivamente em todos os órgãos do embrião de paca. A actina como imunomarcador de músculo liso foi expressiva nas áreas contendo musculatura. / The study aimed elucidates the development of embryonic and fetal of pacas (Agouti paca) and demarcation of the germ sites in embryos at different stages. Seven specimens were used; two embryos and three fetuses from UNESP- Jaboticabal and other two fetuses were from FMVZ-USP collection. The fetuses 1 and 2 showed immaturity facial sharp, eyes covered by a lens and prominent lobes of the ears, the fetuses 3 and 4, showed up with well-developed ears, members thoracic and pelvic in equal level of development, vibrisses around the nasal edges and eye also protected;. The fetus 5 had hairs distributed throughout the body, members thoracic and pelvic with claws, vibrisses on the face, prominent eyes and ears well developed. The embryo 1, presented the optic vesicle with pigmentation of the retina, the fourth encephalic ventricle and cervical curvature and button members in development. The embryo 2, had split the branchial arches and open neuropore cranial; heart and liver were identified, optical vesicle without pigmentation of the retina, the neural tube was opening in the region of the fourth encephalic ventricle, rombencephalon and mesencephalon were in development. Light microscopy, shows the spinal cord, 4 th encephalic ventricle, resence of encephalic vesicles (prosencephalon, mesencephalon and rombencephalon), vertebral column, pituitary gland, oral and nasal cavities, eye, atrium and ventricle heart, lung and diaphragm, as well the metanephron and mesonephron, liver, intestine and mbilical pedicle. The immunohistochemical reactions for OCT-4 were non expressive in organs such as lung, intestine and somites; heart presented a discrete positive reaction, while kidneys and liver obtained an expressive expression, more pronounced in the last one. Vimentina\'s tests showed that all organs stained in different areas, and the reaction whit the actin was negative just in the region of somites. We conclude that the period embryonic/fetal of paca can not be compared with the classical model of rodents; its embryogenesis can be compared with the rats, Guinea pig, rabbits and humans ones. The positive immunolocalization of OCT-4 presents differences according to the gestational age, due to changes embryological tissue. The vimentine as a mesenchyme marker is expressed positively in all organs of the embryo of paca. The actin as immunomarker of smooth muscle was expressive in areas containing muscles.

Células germinativas embrionárias são células pluripotentes derivadas das células germinativas primordiais que surgem no período do desenvolvimento embrionário. Sendo precursoras na maturação dos gametas sendo para a proliferação e formação de novas gerações de células germinativas. Estudos em modelos animais com células troncos embrionárias pluripotentes têm sido realizados com sucesso no tratamento de muitas doenças genéticas, principalmente em modelos caninos devido a homologia com humanos. Portanto, objetivamos estabelecer um estudo da biologia das células erminativas caninas para futuras pesquisas, visando sua viabilidade terapêutica. Foram utilizadas fêmeas de cães sem raça definida (SRD), foram submetidas à ovario-salpinge-histerectomia, oriundas de campanhas de castração realizadas por associações e/ou organizações não governamentais na cidade de Pirassununga. Os embriões coletados foram analisados através de um cronograma histológico e também mensurados através da medida Crown-Rump(CR), em seguida em condições ésteres micro-dissecados na região paramesonéfrica próximo a região dos somitos. Os fragmentos foram isolados e colocados em cultivo com meio apropriado para o desenvolvimento e propagação das células germinativas primordiais (PGCs). Obteve-se sucesso nos cultivos com embriões em idades gestacionais próximas a 24 á 32 dias de gestação, nos quais demonstraram uma morfologia arredondada, pequena. Na microscopia eletrônica de varredura e transmissão observamos tamanhos variados entre as células aderidas umas as outras, mostrando um núcleo bem evidente e em seu citoplasma observou-se diversos tipos de organelas celulares, principalmente mitocôndrias. A análise imunohistoquímica revelou a presença de marcadores Oct4, sugerindo a presença de células pluripotentes e germinativas. Imunofenotípicamente as células através da citometria de fluxo revelou baixa expressão para o marcadore Oct4 enquanto que para os marcadores CD 34, C-Kit houve expressão.RT-PCR mostrou expressão do marcador para pluripotencialidade Oct4 e Sox2 e pela técnica de Western Blotting identificou a expressão da proteína específica para Oct4. Portanto estes achados sugerem com sucesso o estabelecimento de cultivo e proliferação e desenvolvimento das células germinativas primordiais caninas. / Embryonic germ cells are pluripotent cells derived from primordial germ cells which arise during embryonic development. These cells are precursors in the maturation of gametes and for proliferation and formation of new generations of germ cells. Studies using animal models for pluripotent embryonic stem cells have been conducted successfully in the treatment of many genetic diseases, especially using canine models, due the homology between canine and humans. Therefore, we aimed to establish a study of canine biology of germ cells for future research, aiming viability therapy. For this study, we used female mongrel dogs (SRD), which underwent ovary- salpingo- hysterectomy, arising from castration campaigns run by associations and/or NGOs in Pirassununga city. The embryos collected were analyzed using histology methods following the timeline and measure by measuring Crown-Rump (CR) then in an environment without contaminants (sterile) the embryos were micro-dissected focusing in the paramesonephric region near the region of somite where the germ cells are. The fragments were isolated and placed in culture with a specific media for the development and spread of primordial germ cells (PGCs). Success was achieved in cultures with embryos at a gestational age close to 22 to 30th days of gestation, in which the cells showed a rounded morphology and small. In electron microscopy and transmission analyses, sizes were observed between the cells attached to each other, showing a conspicuous nucleus and in the cytoplasm was observed several types of cell organelles, especially mitochondria. Immunohistochemical analysis revealed the positive immunolabeling for Oct4, suggesting the presence of pluripotent cells and germ cells. The analyses using immunophenotyping by flow cytometry showed low expression for Oct4 while for CD34 and C-kit markers had positive expression. RT-PCR showed expression of the pluripotency markers Oct4 and Sox2. By the technique of Western Blotting identified protein expression specific for Oct4. Thus these findings suggest the successful establishment of culture, proliferation and development of primordial germ cells canine.

Orientadores: Rejane Maira Góes, Maria Etelvina Pinto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T07:52:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Christante_CarolineMaria_M.pdf: 8386652 bytes, checksum: 6c501e195d790722221976fe7452ee67 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os gonócitos são os precursores das células germinativas masculinas, encontrados durante o período fetal e neonatal. Sua diferenciação neonatal é fundamental para a função reprodutora e envolve retomada da atividade proliferativa, movimentação para a base do epitélio seminífero e diferenciação em espermatogônia. Sabe-se que, no período fetal, a atividade proliferativa dessas células é andrógeno dependente, e que a obesidade altera o cenário dos hormônios sexuais, levando a um aumento dos níveis de andrógenos em mulheres. Contudo, pouco é conhecido sobre os efeitos da obesidade materna sobre o desenvolvimento do aparelho genital masculino, em particular no período neonatal, e as implicações com o cenário hormonal. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi avaliar se a obesidade materna interfere no desenvolvimento neonatal do testículo de ratos Wistar, tanto no que se refere às suas características morfológicas gerais, quanto à diferenciação das células germinativas. A obesidade materna foi induzida pelo tratamento, por 15 semanas, com dieta contendo 20% de lipídeos saturados. Foram utilizados filhotes machos de mães normais e obesas nas idades de 0,5, 4,5, 7,5 e 14,5 dias pós-parto (dpp). Os testículos foram processados para microscopias de luz e eletrônica de transmissão. Os cortes histológicos submetidos à reação imunocitoquímica para hormônio anti-Mülleriano (AMH) foram utilizados para a determinação da densidade numérica (Nv) de gonócitos e estimativa da densidade de gonócitos reposicionados para a periferia do túbulo. Também foi avaliado os níveis de apoptose, após imunocitoquímicas para Caspase 3 ativada, e a localização dos receptores de andrógeno (AR) e de estrógeno (ER? e ER?). Nossos resultados revelaram uma diminuição no peso dos filhotes de mães obesas, ao nascimento, mas nenhuma variação foi observada para a distância anogenital. O peso das gônadas foi significantemente menor para os animais obesos de 4,5 dpp, resultando em uma variação do índice gonadossomático, nessa idade. A Nv de gonócitos e os níveis de apoptose não variaram nos neonatos de mães obesas em comparação com o grupo controle, em nenhuma das idades consideradas. No entanto, o número de gonócitos reposicionados para a base do epitélio seminífero, aos 4,5 dpp, foi aproximadamente o dobro nos testículos de animais controle em comparação com os submetidos à obesidade materna. Também foi observado que esse tipo celular não possui imunoreatividade para AR. Entretanto, as células de origem mesenquimal e o citoplasma das células de Leydig fetais, de maneira geral, são imunomarcados. Com relação aos níveis de andrógenos, verificou-se que as médias obtidas para os animais sujeitos à obesidade materna, de 4,5 até 14,5 dpp, são muito semelhantes às encontradas para as idades anteriores no grupo controle, sendo possível inferir que a obesidade materna afete a esteredoigênese e promova alterações na concentração de testosterona, no período peri-natal. De maneira geral, nossos dados indicam que a obesidade materna afeta os níveis de esteroides sexuais e, consequentemente, o padrão de diferenciação dos gonócitos. Contudo, tais alterações parecem ocorrer nos primeiros dias de vida, principalmente na idade de 4,5 dpp, com uma recuperação do desenvolvimento testicular ainda no período pré-púbere / Abstract: The gonocytes are the precursors of male germ cells, found during fetal and neonatal period. Their differentiation is critical for neonatal reproductive function and involves resumption of proliferative activity, drive to the base of the seminiferous epithelium and differentiation into spermatogonia. It is also known that in the neonatal period the proliferative activity of these cells is androgen-dependent, and that the obesity changes the sex hormones scenario, leading to increased androgens levels in women. However, little is known about the effects of maternal obesity on the male genital tract development, particularly in the neonatal period, and the implications with hormonal scenario. Therefore, the objective of this study was to evaluate whether maternal obesity interferes with rat testis development, both with regard to their overall morphology, as the differentiation of germ cells. Obesity was induced by treating, for 15 weeks, with a diet containing 20% of saturated lipids. We used male offspring from normal and obese mothers at 0.5, 4.5, 7.5 and 14.5 days postpartum (dpp). The testes were processed for light microscopy and transmission electron microscopy. The sections subjected to immunocytochemistry for anti- Müllerian Hormone (AMH) were used to determine the numerical density (Nv) of gonocytes and density estimation of repositioned gonocytes to the periphery of the tubule. We also assessed the apoptosis levels after immunocytochemistry for activated Caspase 3, and location of androgen receptors (AR) and estrogen (ER? and ER?). Our results showed a decrease in the weight of pups born from obese mothers, at birth, but no change was observed for the anogenital distance. The gonad weight was significantly lower in obese animals at 4.5 dpp, resulting in a variation of the gonadosomatic index in this age. The Nv of gonocytes and apoptosis levels did not differ in newborns subjected to maternal obesity compared with the control group, for any age considered. However, the number of repositioned gonocytes to the base of the seminiferous epithelium at 4.5 dpp was approximately twice in control group compared with the maternal obesity group. It was also observed that this cell type has no AR immunoreactivity. However, mesenchymal cells and the cytoplasm of the fetal Leydig cells generally are immunostained. With respect to androgens levels, it was found that the mean for the animals subjected to maternal obesity from 4.5 to 14.5 dpp are very similar to those found in earlier ages in the control group, it is possible to infer that maternal obesity affects steroidogenesis and promotes changes in testosterone concentration, in the perinatal period. Overall, our data indicate that maternal obesity affects the sex steroids levels and, consequently, the pattern of differentiation of gonocytes. However, these changes seem to occur in the first days of life, especially at the age of 4.5 dpp, with a recovery of testicular development in the pre-pubertal age / Mestrado / Biologia Celular / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Irani Quagio Grassiotto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T07:25:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wildner_DanielDantas_M.pdf: 4539782 bytes, checksum: 657949aff7cd6fcd4b59c61e584bebac (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Na maioria dos Teleostei o desenvolvimento gonadal é periódico e acompanha as estações reprodutivas anuais. Ao longo da vida reprodutiva feminina a renovação das células germinativas é constante e responde pela produção ilimitada dos folículos ovarianos. Aqui a dinâmica de renovação das células germinativas femininas, que resulta na formação dos folículos ovarianos, foi estudada em duas diferentes espécies de Ostariophysi com distintos comportamentos reprodutivos: o Serrasalmus maculatus (Characiformes) e o Pimelodus maculatus (Siluriformes). O estudo teve por base dados biométricos, morfométricos e a análise histológica das gônadas, interpretado segundo novas propostas de classificação dos estágios do desenvolvimento oocitário e das fases do ciclo reprodutivo. Adicionalmente, a formação dos folículos ovarianos a partir das oogônias isoladas presentes no epitélio das lamelas, sua proliferação formando ninhos e entrada em meiose dando origem aos oócitos, é descrita tendo como modelo S. maculatus. Os estágios do desenvolvimento oocitário são caracterizados para ambas as espécies. S. maculatus com período reprodutivo longo compreendido principalmente entre os meses de inverno e primavera (hemisfério sul), tem fecundidade indeterminada. Em S. maculatus a foliculogênese é mais intensa nos ovários em Regeneração, reconhecidos por conterem apenas oócitos pré-vitelogênicos, alguns já com alvéolos corticais. No epitélio das lamelas os ninhos contendo oogônias em proliferação são proporcionalmente mais numerosos do que as oogônias isoladas. Nas gônadas em Desenvolvimento, os ninhos contendo oogônias e aqueles contendo oócitos profásicos iniciais, predominam em relação às oogônias isoladas. Nelas, parte dos oócitos pré-vitelogênicos entram e avançam na vitelogênese. Nas gônadas consideradas Aptas à Desova, a quantidade de ninhos de oogônias e oócitos profásicos iniciais é menor relativamente às demais fases e as oogônias isoladas aparecem com maior frequência. Os oócitos vitelogênicos tardios e completamente desenvolvidos convivem com os oócitos pré-vitelogênicos. Resultantes da liberação dos oócitos maduros aparecem os complexos foliculares vazios. Nos ovários em Regressão, a retomada da proliferação das oogônias é detectada pelo aumento do número de ninhos, alguns deles já contendo oócitos profásicos iniciais. A atresia dos folículos contendo oócitos não liberados convive com os oócitos pré-vitelogênicos. Pimelodus maculatus com período reprodutivo nos meses de verão (hemisfério sul), tem fecundidade determinada. Também nessa espécie, os eventos iniciais da foliculogênese são mais intensos nos ovários em Regeneração, nos quais os únicos oócitos presentes são os pré-vitelogênicos. No epitélio das lamelas, os ninhos contendo oogônias em proliferação são proporcionalmente mais frequentes que as oogônias isoladas e ninhos contendo oócitos profásicos iniciais. Nas gônadas em Desenvolvimento, a frequência do numero de ninhos contendo oogônia difere estatisticamente da frequência de ninhos de oócitos e as oogônias isoladas no epitélio. Nessas gônadas parte dos oócitos pré-vitelogênicos entram em vitelogênese. Nos ovários Aptos à Desova, os ninhos de oogônias e oócitos profásicos iniciais aparecem em menor quantidade relativamente às oogônias isoladas. Neles, os oócitos completamente desenvolvidos predominam sobre aqueles vitelogênicos e pré-vitelogênicos. Nos ovários em Regressão, a retomada da proliferação das oogônias é detectada pelo aumento do número de ninhos, alguns deles contendo oócitos profásicos iniciais. A atresia dos folículos contendo oócitos não liberados convive com os oócitos pré-vitelogênicos / Abstract: In most Teleostei the gonadal development is cyclical and follows the annual reproductive seasons. Throughout the female reproductive life the germ cell renewal is constant, and accounts for the unlimited production of ovarian follicles. Here the dynamics of female germ cell renewal, resulting in the formation of ovarian follicles was studied in two different species of Ostariophysi with different reproductive strategies: Serrasalmus maculatus (Characiformes) and Pimelodus maculatus (Siluriformes). The study was based on biometrics, morphometric and histological analysis of gonads, interpreted according to new proposals for the classification of the phases of the reproductive cycle and for the stages of the oocytes development. Additionally, using S. maculatus as a model, we describe the formation of ovarian follicles from the isolated oogonia present in the lamellar epithelium, their proliferation forming cell nests and entrance into meiosis giving rise to the oocytes. The stages of the oocyte development are characterized for both species. S. maculatus with long reproductive period comprising the months of winter and spring (southern hemisphere) has an indeterminate fecundity. In S. maculatus the folliculogenesis is more intense in the Regenerating ovaries, recognized by containing only pre-vitellogenic oocytes, some of them with cortical alveoli. At this time, in the lamellar epithelium the nests with proliferating oogonia are proportionally more numerous than the isolated oogonia. In the Developing ovaries, the nests containing oogonia and those with the early prophase oocytes, are predominate over the isolated oogonia. In them, the part of the pre-vitellogenic oocytes enters and advances in vitellogenesis. In the Spawning Capable ovaries, the number of nests of oogonia and early prophase oocytes is lower compared with other reproductive phases as the isolated oogonia appear more frequently. In these, the late vitellogenic and full-grown oocytes co-occur with pre-vitellogenic ones. The postovulatory follicle complex appear resulting from the release of mature oocytes. In the Regressing ovaries, the resumption of oogonia proliferation is detected by an increase in the number of nests, some of them already containing early prophase oocytes. Atresia of follicles, containing oocytes that were not released, co-occurs with the pre-vitellogenic oocytes. Pimelodus maculatus with a reproductive period concentrated in the summer (southern hemisphere), has a determinate fecundity. Also in this species, the initial events of folliculogenesis in the ovaries are more intense in Regenerating phase, in which only oocytes present are the pre-vitellogenic ones. In the lamellar epithelium the nests containing proliferating oogonia are proportionally more frequent than the isolated oogonia and than the nests containing early prophase oocytes. In the Developing ovaries, the frequency of the number of nests containing oogonia differs statistically from the frequency of nests with oocytes and from the isolated oogonia and in the epithelium. In these gonads of the pre-vitellogenic oocytes enter in vitellogenesis. In the Spawning Capable ovaries, the nests of oogonia and early prophase oocytes appear in a lower number than the isolated oogonia. In them, the full-grown oocytes predominate over those pre-vitellogenic and vitellogenic. In the Regressing ovaries, the resumption of the oogonia proliferation is detected by an increase in the number of nests, some containing early prophase oocytes. Atresia of follicles, containing oocytes that were not released, co-occurs with the pre-vitellogenic / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural