Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / In this study we aimed to validate a model of acute lung injury (ALI) induced by surgical muscle trauma, which attempts to reproduce the conditions of a skeletal muscle trauma that occurs in humans and, therefore, to provide a better understanding of this disease and its treatmentsâ alternatives. In the first step we evaluated the effect of the experimental model. Thirty-six male Wistar rats with average weight of 250g, were divided into 6 groups. In the first step we evaluated the effect of the experimental model. Saline Group (n = 6): animals received 2 ml of saline (i.v) at the same times of the Saline and trauma group; Saline and Trauma Group (n = 6): animals received saline 30 minutes before the induction of muscle trauma and again at 6 and 12 hours after the trauma; Dexamethasone Group (n = 6): animals received 2 doses of dexamethasone 2 mg / kg (i.p) at the same times of Dexamethasone and Trauma Group; Dexamethasone and Trauma Group (n = 6): animals received 2 doses, 2 hours before the occurrence of trauma and 10 hours after the trauma - this group was used as positive control. Surgical procedures were performed under anesthesia of tribromethanol 2.5% (1 ml/100g body weight). The induced trauma surgery was performed in the thigh of the animal and every muscle was detached from the knee to the hip joint. After 24 h of injury, the lungs were retreated to evaluate myeloperoxidase (MPO), glutathione (GSH), neutrophil infiltration, congestion, edema, necrosis and hemorrhage. In plasma only GSH was measured. It was observed that the muscle trauma was shown to induce ALI by promoting a significant reduction in GSH (8.53  1.22 versus 18.87  7.35 p <0.01) and a significant increasing activity of MPO (23.96  4.86 versus 24.50  7.45 p <0.001), neutrophil infiltration (71.00 versus 19.64  28.50  7.63 p <0.001), degree of congestion, edema, necrosis and hemorrhage (p <0.01), when compared with Saline Group without trauma. In Dexamethasone and Trauma Group, when compared to Saline and Trauma Group, Dexamethasone, by being an inhibitor of inflammatory gene, was able to modulate the inflammatory response in almost all parameters. Subsequently we evaluated the effect of L-alanyl-glutamine (L-Ala-Gln) on acute lung injury induced by muscle trauma surgery. 24 h after trauma it was made a comparison between the group treated with L-Ala-Gln and trauma (n = 6) and the saline and trauma group, and it was found that L-Ala-Gln promoted a statistically significant reduction in neutrophil infiltration ( 19.64  71.00 versus 28.50  7.63 p <0.001), in MPO activity (23.96  4.86 versus 12.90  2.01, p <0.001) and a significant increase in concentration of GSH (36.79  7.31 versus 8.53  1.22 p <0.001) in the lung. In histopathological evaluation it was also observed a significant decrease (p <0.01) in the degree of edema, hemorrhage and necrosis in lung tissue of the evaluated groups above. The possible mechanism to justify the observed effects could be that glutamine enhanced glutathione levels, the energy substrate for immune cells, and, additionally, increased the expression of heat shock proteins (HSP) and, as such, prevented the infiltration of neutrophils in tissues. These results suggest that the Ala-Gln treatment has the potential to reduce the inflammatory reaction that was installed in lungs after skeletal muscle trauma. / Nesse estudo procurou-se validar um modelo de lesÃo aguda pulmonar (LAP) induzida por um trauma muscular cirÃrgico que tenta reproduzir as condiÃÃes de um trauma muscular esquelÃtico que ocorre em seres humanos e com isso proporcionar um melhor entendimento da doenÃa e das suas alternativas de tratamento. Na primeira etapa foi avaliado o efeito do modelo experimental. Trinta e seis ratos machos Wistar, com peso mÃdio de 250g, foram distribuÃdos em 6 grupos. Grupo Salina (n=6): os animais receberam apenas 2 ml de salina (i.v.) nos mesmos tempos do grupo salina e trauma; Grupo Salina e trauma (n=6): os animais receberam salina 30 minutos antes do trauma muscular e novamente Ãs 6 e 12 horas depois do trauma. Grupo Dexametasona (n=6): os animais receberam 2 doses de Dexametasona 2mg/kg i.p. nos mesmos tempos do grupo Dexametasona e trauma; Grupo Dexametasona e trauma (n=6): os animais receberam 2 doses, 2 horas antes da ocorrÃncia do trauma e 10 horas depois do trauma, esse grupo foi utilizado como controle positivo. Os procedimentos cirÃrgicos foram realizados sob anestesia tribromethanol 2,5% (1 ml/100g de peso do animal). A operaÃÃo de induÃÃo do trauma foi realizada na coxa do animal e toda musculatura foi descolada desde o joelho atà a articulaÃÃo do quadril. ApÃs 24 h do trauma, retiraram-se os pulmÃes para avaliar mieloperoxidase (MPO), glutationa (GSH), infiltraÃÃo neutrofÃlica, congestÃo, edema, necrose e hemorragia. No plasma foi dosado apenas GSH. Observou-se que o trauma muscular mostrou ser capaz de induzir LAP por promover uma reduÃÃo significante GSH (8,53  1,22 versus 18,87  7,35 p <0,01), aumento significante na atividade de MPO (23,96  4,86 versus 24,50  7,45 p<0,001), do infiltrado neutrofÃlico (71,00 versus 19,64  28,50  7,63 p <0.001), no grau de congestÃo, edema, necrose, hemorragia (p<0,01), quando comparamos com grupo salina sem trauma. No grupo Dexametasona e trauma quando comparado ao grupo salina e trauma, a Dexametasona um inibidor do gene inflamatÃrio, foi capaz de modular a resposta inflamatÃria em quase todos os parÃmetros avaliados. Posteriormente avaliou-se o efeito da L-alanil-glutamina (L-Ala-Gln) sobre a lesÃo aguda pulmonar induzida por trauma muscular cirÃrgico. 24 h apÃs o trauma comparou-se o grupo tratado com L-Ala-Gln e trauma (n=6) com o grupo salina e trauma e verificou-se que a L-Ala-Gln promoveu uma reduÃÃo estatisticamente significante na infiltraÃÃo neutrofÃlica (71,00 versus 19,64  28,50  7,63 p <0.001), na atividade de MPO (23,96  4,86 versus 12,90  2,01, p <0,001), e um aumento significante na concentraÃÃo de GSH (36,79  7,31 versus 8,53  1,22 p <0,001) no pulmÃo. Na avaliaÃÃo histopatolÃgica tambÃm foi observada uma reduÃÃo significante (p< 0,01) no grau de edema, hemorragia e necrose no tecido pulmonar nos grupos acima avaliados. Os possÃveis mecanismos para justificar os efeitos da L-Ala-Gln em modular a resposta inflamatÃria no pulmÃo deve-se ao fato da glutamina ser precursora de glutationa, funciona como substrato energÃtico para cÃlulas do sistema imune, aumenta as expressÃes de proteÃnas de choque tÃrmico (HSP) e impede a infiltraÃÃo neutrofÃlica. Esses resultados sugerem que o tratamento com L-Ala-Gln tem potencial para reduzir o processo inflamatÃrio agudo no pulmÃo induzido por trauma muscular esquelÃtico cirÃrgico.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Foram investigados os efeitos da L-alanil-glutamina (L-ALN-GLN) sobre as concentraÃÃes sanguÃneas e teciduais de metabÃlitos (lactato, piruvato, glicose e corpos cetÃnicos), substÃncias reagentes ao Ãcido tiobarbitÃrico (TBARS), glutationa (GSH), mieloperoxidase (MPO) e avaliaÃÃo histopatolÃgica em gerbils. Tratou-se de um estudo experimental, controlado. Utilizaram-se 54 gerbils, machos, com peso mÃdio de 150g, distribuÃdos aleatoriamente em 3 grupos: salina com isquemia e reperfusÃo (SIR), salina sem isquemia e reperfusÃo (SSI), L-alanil-glutamina com isquemia e reperfusÃo (GIR), redistribuÃdos em 3 subgrupos: T0 (tempo mÃximo de isquemia), T30 (30 min de reperfusÃo) e T60 (60 min de reperfusÃo), com 6 animais cada. Foram prÃ-tratados com soluÃÃo salina 2,0 mL 0,9% endovenoso (e.v.) ou L-ALNGLN 0,75g/Kg (e.v.), 30 min antes do inÃcio dos experimentos. A isquemia cerebral foi induzida pela oclusÃo bilateral das artÃrias carÃtidas comuns (ACCs), por um perÃodo de 15 minutos. ApÃs todos os procedimentos cirÃrgicos as amostras (sangue e tecido) foram coletadas ao final dos trÃs tempos. Nas comparaÃÃes entre os grupos (SSI) e (SIR) houve um aumento significante nas concentraÃÃes de lactato no sangue no grupo SIR em T0 (0,756Â0,091 versus 3,596Â1,546); p=0,0122, T30 (0,869Â0,254 versus 3,316Â1,356); p=0,0015 e em T60 (0,858Â0,460 versus 2,409Â0,801); p=0,0021. No tecido cerebral houve um aumento significante do lactato em T0 (1,374Â0,172 versus 2,530Â0,850); p=0,0085, T30 (0,891Â0,697 versus 1,840Â0,530); p=0,0243 e em T60 (1,182Â0,136 versus 1,744Â0,463); p=0,0173 no grupo SIR. Para as concentraÃÃes de piruvato no sangue observou-se um aumento significante em T0 (p=0,0424); T30 (p=0,0271) e em T60 (p=0,0175) e no tecido cerebral em T0 (p=0,0369) no grupo SIR. Para as concentraÃÃes de glicose no sangue houve um aumento significante em T0 (0,493Â0,393 versus 1,116Â0,364); p=0,0174, T30 (0,617Â0,356 versus 1,502Â0,314); p=0,0010 e em T60 (0,998Â0,411 versus 1,718 Â 0,477); p=0,0190 e no tecido cerebral em T0 (0,292Â0,081 versus 0,952Â0,7140); p=0,0484, T30 (0,264Â0,080 versus 1,038Â0,609); p=0,0116 e em T60 (0,234Â0,089 versus 0,985Â0,533); p=0,0067, no grupo SIR. Verificou-se um aumento significante nos nÃveis enzimÃticos de MPO em T0 (p<0,0001), T30 (p=0,0269) e em T60 (p=0,0005) no grupo SIR. Na avaliaÃÃo histopatolÃgica no grupo SIR nas camadas piramidal interna e granular interna foram observados aumento significante de picnose, neurÃnios vermelhos, congestÃo e edema, em T0, T30 e T60. Nas comparaÃÃes entre grupos (SIR) e (GIR) houve diminuiÃÃo significante no grupo GIR no sangue de lactato em T0 (3,596Â1,546 versus 1,960Â0,450); p=0,0321, T30 (3,316Â1,356 versus 1,971Â 0,568); p=0,0490 e em T60 (2,409Â0,801 versus 1,516Â0,307); p=0,0290 e no tecido cerebral em T0 (2,530Â0,850 versus 1,540Â0,302); p=0,0228. No tecido cerebral no grupo GIR houve diminuiÃÃo significante de TBARS em T30 (0,110Â0,006 versus 0,057Â0,040); p=0,0102 e um aumento significante de GSH em T0 (3,454Â1,584 versus 10,054Â2,880); p=0,0006, T30 (10,949Â1,579 versus 81,767Â9,060); p<0,0001 e em T60 (101,83Â2,631versus 114,924Â6,311); p=0,0011. Na avaliaÃÃo histopatolÃgica no grupo GIR na camada piramidal interna foram observados diminuiÃÃo significante de picnose nos tempos T30 (3,00 (2,75 a 4,25) versus 1,50 (0,75 a 2,00); p=0,0086 e em T60 (4,00 (3,75 a 5,55) versus 2,00 (1,75 a 4,00); p=0,0379 e nos neurÃnios vermelhos em T30 (3,00 (2,00 a 4,25) versus 1,50 (0,75 a 2,00); p=0,0159 e em T60 (4,00 (3,75 a 4,75) versus 2,00 (1,75 a 4,00); p=0,0493. Na camada granular interna no grupo GIR houve diminuiÃÃo significante de picnose em T30 (2,00 (1,00 a 3,25) versus 1,00 (0,00 a 1,00); p=0,0208 e em T60 1,50 (0,00 a 1,00) versus 0,00 (1,00 a 3,50); p= 0,0412, neurÃnios vermelhos em T30 (2,00 (1,00 a 3,25) versus 1,00 (0,00 a 1,00); p=0,0208 e em T60 1,50 (0,00 a 1,00) versus 0,00 (1,00 a 3,50); p=0,0412 e no grau de edema em T30 (2,00 (1,00 a 2,00) versus 1,00 (0,75 a 1,00); p=0,0225. Portanto, o prÃ-condicionamento com L-ALN-GLN foi capaz de induzir glicÃlise cerebral e de promover um efeito protetor na lesÃo de isquÃmia e reperfusÃo em gerbils, uma vez que elevou a sÃntese de glutationa tanto na isquemia quanto na reperfusÃo, reduziu a peroxidaÃÃo lipÃdica durante a fase de reperfusÃo e diminuiu o grau de edema intracerebral, a quantidade de picnose e neurÃnios vermelhos no tecido cerebral. / We investigated the metabolic effects of L-alanyl-Glutamine (L-ALN-GLN) on blood and tissue concentrations of metabolites (lactate, pyruvate, glucose and ketone bodies), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), glutathione (GSH), myeloperoxidase (MPO) and histopathologic evaluation of gerbils. This was an experimental and controlled study. Fifty-four male gerbils with a mean weight of 150gwere used, and were divided randomly and equally into 3 groups: saline with ischemia and reperfusion (SIR), saline without ischemia and reperfusion (SSI), L-alanyl-glutamine ischemia and reperfusion (GIR). They were then redistributed into three subgroups: T0 (maximum time of ischemia), T30 (30 min of reperfusion) and T60 (60 min of reperfusion), containing 6 animals each. They were pretreated with saline 2.0 mL 0.9% intra-venous (iv) or ALN-L-GLN 0.75 g / kg (iv) 30 min before the start of the experiments. Cerebral ischemia was induced by bilateral occlusion of the common carotid arteries (CCAs) for a period of 15 minutes. After all surgical procedures, the samples (blood and tissue) were collected at the end of the three periods. When comparing SSI and SIR groups, a significant increase of lactate was found in SIR group in T0 (0.756Â0.091 versus 3.596Â1.546; p=0.0122, T30 (0.869Â0.254 versus 3.316Â1.356); p=0.0015, and T60 (0.858Â0.460 versus 2.409Â0.801); (p=0.0122). In brain tissue there was significant lactate increase in TO (1.374Â0.172 versus 2.530Â0.850); p=0.0085, T30 (0.891Â0.697 versus 1.840Â0.530); p=0.0243 and T60 (1.182Â0.136 versus 1.744Â0.463); p=0.0173, in SIR group. In blood and tissue concentrations of pyruvate was found a significant increase in T0 (p=0.424), T30 (p=0.0271) and T60 (p=0.0175), and in brain tissue in T0 (p=0.0369) in the SIR group. In glucose blood concentrations there was a significant increase in T0 (0.493Â0.393 versus 1.116Â0.364); p=0.0174, T30 (0.617Â0.356 versus 1.502Â0.314); p=0.0010 and T60 (0.998Â0.411 versus 1.718Â0.477); p=0.0190, and in brain tissue in T0 (0.292Â0.081 versus 0.952Â0.7140); p=0.0484, T30 (0.264Â0.080 versus 1.038Â0.609); p=0.0116 and T60 (0.234Â0.089 versus 0.985Â0.533); p=0.0067, in the SIR group. On blood ketone bodies there was a significant increase in T0 (p=0.0006) and T60 (p=0.0455), and in brain tissue in T0 (p=0.0428) in SIR group. There was a significant increase in MPO enzyme levels at T0 (p<0.0001), T30 (p=0.0269) and T60 (p=0.0005). In the histopathological evaluation in the internal pyramidal and granular layers in group CRS observed a significant increase of pyknosis, red neurons, congestion and edema, at T0, T30 and T60. In the comparison between the (SIR) and (GIR) groups, there was a significant decrease in T0 (3.596Â1.546 versus 1.960Â0.450); p=0.0321, T30 (3.316Â1.356 versus 1.971Â0.568); p=0.0490 and T60 (2.409Â0.801 versus 1.516Â0.307); p=0.0290, and in brain tissue there was significant decrease in T0 (2,530Â0,850 versus 1.540Â0,302); p=0.0228. In brain tissue was found significant decrease in TBARS concentrations in T30 (0.110Â0.006 versus 0.057Â0.040); p=0.0102, and a significant increase of GSH in T0 (3.454Â1.584 versus 10.054Â2.880), p=0.0006, T30 (10.949Â1.579 versus 81.767Â9.060); p<0.0001 and T60 (101.83Â2.631 versus 114.924Â6.311); p=0.0011 in GIR group. Regarding the histological examination, a significant decrease of pyknosis was found at T30 (3.00 (2.75 to 4.25) versus 1.50 (0.75 to 2.00); p= 0.0086 and T60 (4.00 (3.75 to 5.55) versus 2.00 (1.75 to 4.00); p=0.0379 and red neurons at T30 (3,00 (2,00 to 4.25) versus 1.50 (0.75 to 2.00); p=0.0159 and T60 (4.00 (3.75 to 4.75) versus 2,00 (1.75 to 4.00); p= 0.0493. in the internal pyramidal layer. In the Internal granular layer in GIR group there was a significant reduction of pyknosis at T30 (2.00 (1.00 to 3.25) versus 1.00 (0.00 to 1.00); p=0.0208 and T60 1.50 (0.00 to 1.00) versus 0.00 (1.00 to 3.50); p=0.0412, red neurons in T30 (2.00 (1.00 to 3.25) versus 1.00 (0.00 to 1.00); p=0.0208 and T60 1.50 (0.00 to 1.00) versus 0.00 (1.00 to 3.50); p=0.0412 and on the intracerebral edema level at T30 (2.00 (1.00 to 2.00) versus 1.00 (0.75 to 1.00); p=0.0225. Therefore, the preconditioning with L-GLN-ALN is able to induce brain glicolise and promote a protective effect on ischemic brain injury and reperfusion in gerbils, since it increased the glutathione synthesis both on ischemia and reperfusion, as well as decreasing lipid peroxidation during the reperfusion phase and decreased the intercerebral edema level, and the number of pyknosys and red neurons in brain tissue.

O estudo investigou o efeito de diferentes competições de ciclismo de estrada e de um período de descanso na Creatina Kinase (CK), Lactato Desidrogenase (LDH), Interleucina-1 (IL-1), Interleucina-6 (IL-6), Fator de necrose tumoral (TNF-<font face=\"symbol\">a), prostaglandina E2 (PGE2) e na razão Glutamina/Glutamato (Gln/Glu). Para isso, 12 ciclistas profissionais que completaram 3 diferentes competições. A primeira e a terceira (C1 e C3) competições foram de uma 1 etapa e a segunda foi uma volta ciclística (C2) de 7 dias. A C3 foi realizada após um período de 20 dias de descanso. Foram coletadas amostras de sangue 24 horas antes do início e 24 horas após o término de cada competição. Não houve diferenças significativas para nenhum dos mediadores inflamatórios (p<0,05). Aumentos (p<0,05) foram encontrados após o término da C2 e da C3 para CK e LDH e diminuição (p<0,05) na razão Gln/Glu C3. A conclusão foi a de que lesões musculares são diagnosticadas em ciclistas profissionais de estrada após o término de uma volta ciclística e de uma competição precedida de um período de descanso. / The objective of this research was to observe the effect of different road cycling competitions and a 20 days break period in Creatine Kinase (CK), Lactate Dehydrogenase (LDH), Interleukin-1(IL-1), Interleukin-6 (IL-6), Factor necrosis tumoral-alpha (TNF-<font face=\"symbol\">a), prostaglandin E2 (PGE2) and in the ratio of Glutamine/Glutamate (Gln/Glu). The hypothesis tests were conducted with a sample of 12 professional cyclists which have completed 3 different road cycling races. The first and third ones (C1 and C3) were mass start races. The second one was a stage racing (C2). One analysis was made after a 20 days break period (C3). Blood samples were collected 24 hours before and 24 hours after each competition. There were no significant differences for none of the inflammatory mediators (p<0,05). Increases (p<0,05) were detected after the end of C2 and C3 for CK and LDH and low (p<0,05) in the ratio of Gln/Glu at C3. The conclusion of the research was that muscular damages are diagnostified in professional road cyclists 24 hours after the end of the stage racing and after mass start competition preceded by 20 days a break period.

O desenvolvimento de uma resposta imune adequada é um processo extremamente importante para a manutenção da homeostase do organismo. Uma série de processos são desencadeados a partir do primeiro contato com micro-organismos patógenos até a efetivação da resposta imune de memória. Todos esses processos envolvem a participação e a complexa atuação de mediadores como as citocinas inflamatórias e também citocinas regulatórias, que exercerão efeitos controlando o processo inflamatório. Diversos mecanismos moleculares, subjacentes à resposta inflamatória, ainda não estão totalmente compreendidos, como por exemplo o controle da expressão de genes inflamatórios exercido pela IL-10. Os processos envolvidos na resposta inflamatória são mantidos às custas do consumo de nutrientes, dentre eles podemos destacar o aminoácido glutamina, que atua em nível molecular, fornecendo nitrogênio para a formação do material genético e fonte energética para determinadas células do sistema imunológico como os macrófagos. Portanto, neste trabalho, investigamos os efeitos da IL-10 na modificação de nucleossomos, evidenciando o papel dessa citocina em regular a expressão de genes inflamatórios em macrófagos. Avaliamos também a função da glutamina, modulando a expressão de RNAm de citocinas inflamatórias e regulatórias dessas células. E por último, desenvolvemos um modelo de restrição alimentar em camundongos, nos quais avaliamos os efeitos desse modelo considerando-se alguns aspectos hematológicos e estudamos as alterações na resposta inflamatória em células esplênicas e do peritônio, bem como avaliamos a suplementação de glutamina in vitro na produção das citocinas (IL-12, TNF-alfa, IL-10) e a expressão do fator de transcrição NFkB. Os resultados compilados mostraram que a IL-10 leva a uma rápida redução da acetilação de nucleossomos, modulando a arquitetura da cromatina de genes inflamatórios como a IL-12. A glutamina modula a expressão de citocinas inflamatórias, regulando positivamente a expressão de IL-10 e Interferon beta. E a restrição alimentar induz a redução de citocinas proinflamatórias (IL-12 e TNF-&#945;), influenciadas pelo aumento da produção de IL-10 e finalmente a suplementação com glutamina não interfere nesses parâmetros nas células peritoneiais e esplênicas do grupo submetido à restrição alimentar. Conclusão: a IL-10 modula a expressão gênica através da modificação de nucleossomos em macrófagos derivados da medula; a glutamina modula a expressão de IL-10 inibindo a resposta inflamatória, e a restrição alimentar modula alguns aspectos hematológicos e possui propriedades anti-inflamatórias. / The development of an appropriate immune response is an important process to the organism\'s homeostatic maintenance. A series of processes are triggered upon the very first contact with pathogens, up to the immunological memory establishment. These processes implicate in the participation of complex mediators, such as inflammatory and regulatory cytokines that will control the inflammatory process. Some mechanisms underlying the inflammatory response are not totally understood, the control of inflammatory genes exerted by IL-10 is an example. The processes involved in the inflammatory response are kept with nutrients expense, among these nutrients we can highlight the amino acid glutamine. It acts in a molecular level, supplying nitrogen to genetic material formation and as an energy supply for immune cells such as macrophages. Thus, we investigated the IL-10 effects on nucleosome modifications evidencing this cytokine role regulating inflammatory genes expression in macrophages. We also evaluated glutamine functions modulating inflammatory and regulatory cytokines mRNA expression on these cells. Ultimately, we developed a dietary restriction animal model where we evaluated it\'s effects on selected haematological aspects, analyzing the alteration in the inflammatory response of splenic and peritoneal cells. We also evaluated in vitro glutamine supplementation assessing cytokines production (IL-12, TNF-&#945;, and IL-10) and the expression of NFkB transcription factor. The compiled results a expressive reduction in nucleosome acetylation modifying the chromatin architecture of inflammatory genes such as IL-12 and IL-6. Glutamine modulates inflammatory cytokines gene expression upregulating the expression of IL-10 and interferon beta. The dietary restriction reduces proinflammatory cytokines production (IL-12 and TNF-&#945;), these results are influenced by the upregulated IL-10 production, glutamine supplementation have no effect on these parameters in the dietary restriction group. In conclusion, we can infer that IL-10 modulates gene expression trough nucleosome modification in bone marrow derived macrophages, glutamine has a potential effect on IL-10 expression, inhibiting the inflammatory response and dietary restriction modifies hematological parameters, presenting anti-inflammatory properties.

A glutamina e o glutamato são aminoácidos importantes no metabolismo bacteriano. A captação desses aminoácidos ocorre por meio de transportadores ativos do tipo ABC. No presente estudo avaliamos os sistemas de captação de glutamina/glutamato em Streptococcus mutans. Análises in silico revelaram a presença de dois operons que codificam sistemas de transporte de glutamina/glutamato: o operon gln, composto pelos genes e um segundo operon putativo composto pelos genes smu.1177c, smu.1178c e smu.1179c. Por meio de mutagênese sítio-específica foi possível obter a deleção do operon constituído pelos genes smu.1177c, smu.1178c e smu.1179c. O mutante (linhagem KG1) obtido apresentou redução na captação de glutamato e glutamina. O mesmo ocorreu em relação ao mutante deficiente no operon gln. O mutante KG1 apresentou maior capacidade de adesão a superfícies abióticas. Os resultados obtidos revelaram que tanto o operon gln como o operon definido pelos genes smu.1177c, smu.1178c e smu.1179c estão envolvidos na captação de glutamina e glutamato pelo S. mutans. / Glutamine and glutamate are important amino acids for bacteria metabolism. Their uptake occurs via active transporter systems of the ABC family. On the present study we evaluate the glutamine/glutamate transport systems of Streptococcus mutans. In silico analysis revealed the presence of two polycistronic operons related to transport of glutamine/glutamate: the gln operon and a putative operon composed by smu.1177c, smu.1178c and smu.1179c genes. A mutant deleted on the smu.1177c, smu.1178c and smu.1179c was successfully obtained by site-direct mutagenesis (KG1 strain), which demonstrated an impairment on glutamine and glutamate uptake, as shown by the mutant deleted on the gln operon. The KG1 strain demonstrated a gain on the abiotic surface adhesion The results revealed that both, gln operon and the operon consisted by smu.1177c, smu.1178c and smu.1179c, are involved to the internalization of glutamine and glutamate on S. mutans.

A sepse é a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva (UTIs) no mundo. A reduzida disponibilidade do aminoácido mais abundante do organismo, a glutamina contribui para o complicado estado catabólico da sepse. No presente estudo investigamos os efeitos da suplementação oral com L-glutamina e L-alanina (GLN+ALA), ambos na norma livre e como dipeptídeo, L-alanil-L-glutamina (DIP), sobre o eixo glutamina-glutationa (GSH), sistema imune, inflamação, proteínas de choque térmico (HSPs) e expressão de genes envolvidos com vias de sinalização proteica em animais endotoxêmicos. Camundongos C57/B6 foram submetidos à endotoxemia (Escherichia coli LPS, 5 mg.kg-1, grupo LPS) e suplementados por 48 horas com L-glutamina (1 g.kg-1) e L-alanina (0,61 g.kg-1, grupo GLN+ALA-LPS) ou 1,49 g.kg-1 de DIP (grupo DIP-LPS). A endotoxemia promoveu depleção da concentração de glutamina no plasma (71%), músculo esquelético (50%) e fígado (49%), quando comparado ao grupo CTRL, sendo restauradas nos grupos DIP-LPS e GLN+ALA-LPS (P<0,05), fato que atenuou a redução da GSH e o estado redox (taxa GSSG/GSH) em eritrócitos circulantes, musculo e fígado (P<0,05). A suplementação em animais endotoxêmicos resultou em uma upregulation dos genes GSR, GPX1 e GCLC no músculo e fígado. A concentração das citocinas plasmáticasTNF-&#945;, IL-6, IL-1&#946; e IL-10 foi atenuada pelas suplementações, bem como a expressão de mRNAs envolvidos com a resposta inflamatória, ativadas pela via do NF-&#954;B(P<0,05). Concomitantemente, verificou-se aumento da capacidade proliferativa de linfócitos T e B circulantes nos grupos GLN+ALA-LPS e DIP-LPS. A expressão de mRNAs e a concentração de HSPs no tecido muscular foi restabelecida pelas suplementações, contudo, a expressão mRNAs relacionados às vias de síntese e degradação proteica foi somente estimulada no tecido hepático(P<0,05). Os resultados do presente estudo demonstram que a suplementação por via oral com GLN+ALA ou DIP podem ser utilizados clinicamente como métodos nutricionais em reverter o quadro de depressão da disponibilidade de glutamina corporal da sepse induzida por LPS, tendo impacto no eixo glutamina-glutationa, sistema imune e inflamatório. / Sepsis is the leading cause of death inintensive care units (ICUs) in the world.The availability ofthe most abundant amino acid in the body, glutamine, is reduced in this situation, fact that contribute to the complicated catabolic state of sepsis. In the present study, we investigated the effects of oral supplementation with L-glutamine and L-alanine (GLN+ALA), both in their free form and as a dipeptide, L-alanyl-L-glutamine (DIP) on glutamine-glutathione axis (GSH), immune and inflammatory system, heat shock proteins (HSPs) expression and gene expressions involved in protein signaling pathways during endotoxemia. C57/B6 mice were subjected to endotoxemia (Escherichia coli LPS, 5 mg.kg-1, LPS group) and supplemented for 48 hours with L-glutamine (1 g.kg-1) plus L-alanine(0.61 g.kg-1, GLN+ALA-LPS group) or 1.49 g.kg-1of DIP (DIP-LPS group). Endotoxemia promoted depletion glutamine concentration in plasma (71%), skeletal muscle (50%) and liver (49%), when compared to the CTRL group, and was restored in the DIP-LPS e GLN+ALA-LPS (P<0.05), fact that attenuate the reduction of GSH and the redox state (GSSG/GSH rate) in circulating erythrocytes, liver and muscle (P<0.05). Supplementations in endotoxemic mice resulted in upregulation of GSR, GCLC and GPX1 genes in muscle and liver. Plasma concentration of TNF-&#945;, IL-6, IL-1&#946; and IL-10 were attenuated by supplementation as well as the expression of mRNAs involved in the inflammatory response, activated by NF&#954;-B pathway (P <0.05). At the same time, high proliferative capacity of circulating T and B lymphocytes GLN+ALA-LPS e DIP-LPS were observed. HSPs (protein and mRNAs) and in muscle were restored by the supplements, however, the mRNAs expression related to the synthesis and degradation of protein pathways was only stimulated in the liver (P <0.05). Our results demonstrate that oral supplementation with GLN+ALA or DIP can be used as clinically nutritional methods to reverse the depression of body glutamine availability during sepsis induced by LPS, impacting on the glutamine-glutathione axis, immune and inflammatory system.

A glutamina é o aminoácido livre mais abundante no plasma e músculo, sendo utilizada em elevadas taxas por diversas células na manutenção e promoção de funções essenciais à homeostasia celular. Entretanto, em algumas situações catabólicas, entre as quais exercícios físicos intensos e prolongados ou exaustivos é observada a redução na concentração de glutamina, o que pode comprometer as funções celulares. A suplementação com dipeptídeos de glutamina, tais como a L-alanil-L-glutamina (DIP) pode representar um eficiente meio de fornecimento de glutamina por via oral para o organismo. Desta forma, ratos Wistar machos foram treinados e suplementados com o DIP (1,49 g&#8226;kg-1) ou uma solução contendo os aminoácidos L-glutamina (1 g&#8226;kg-1) e L-alanina (0,61 g&#8226;kg-1) livres (GLN+ALA) ou água (CON), sendo sacrificados em dois tempos, antes (TR) e após (INT) um exercício intenso de natação. No plasma, a concentração de glutamina, glutamato, glicose, amônia, CK, LDH, TNF-&#945; e PgE2 foram avaliadas. No músculo sóleo e gastrocnêmio e no fígado foram determinadas as concentrações de glutamina, glutamato, GSH, GSSG e proteínas totais. Antes do exercício intenso, ambas as suplementações atenuaram a liberação de CK no plasma. O grupo DIP-TR apresentou maior concentração de glutamato, GSH e GSH/GSSG no sóleo e fígado. Maior concentração de glutamina, glutamato, GSH ou GSH/GSSG foi observada no sóleo e fígado do grupo GLN+ALA-TR. Após o exercício intenso, ambas as suplementações atenuaram a liberação de amônia e TNF-&#945;, e no grupo DIP-INT menor concentração de PgE2 foi observada. Maior concentração de glutamina, glutamato e GSH/GSSG no sóleo e glutamato no gastrocnêmio foram encontrados nos grupos DIP-INT e GLN+ALA-INT. No fígado foi encontrada também maior concentração de GSH e GSH/GSSG, decorrentes das suplementações. Os nossos resultados levam à conclusão de que a suplementação oral com L-glutamina e L-alanina na forma livre ou como dipeptídeo, L-alanil-L-glutamina, pode aumentar os estoques musculares e hepáticos de GSH e alterar o estado redox celular, atenuando lesão e a inflamação induzidas pelo exercício físico. / Glutamine is the most abundant free amino acid found in plasma and muscle, and is utilized at high rates by many cells for maintenance and promotion of cell function. However, in some catabolic situations, like intense and prolonged or exhaustive physical exercise, a reduction in GLN availability is observed, fact that may impair the cell functions. Oral supplementation with dipeptides of glutamine, like L-alanyl-L-glutamine may serve as an interesting way to deliver glutamine to the organism. Male Wistar rats were trained and supplemented with DIP (1,49 g&#8226;kg-1) or mixture containing free L-glutamine (1 g&#8226kg-1) and Lalanine (0,61 g&#8226;kg-1) or water (CON) and sacrificed in distinct times: before (TR) and immediately after (INT) intense exercise of swim. Plasma and serum concentrations of glucose, GLN, glutamate, ammonia, CK, LDH, TNF-&#8226; and PgE2 were evaluated. In muscles (soleus and gastrocnemius) and liver GLN, glutamate, GSH, GSSG and total proteins also were evaluated. Low concentration of CK in plasma was observed in both supplemented groups before the exhaustive test. The DIP-TR presented more concentration of glutamate, GSH e GSH/GSSG in the soleus muscle and liver. Higher concentration of glutamine, glutamate and GSH/GSSG was seen in GLN+ALATR group. Both groups supplemented with DIP and GLN+ALA after the exhaustive test, exhibit decreases in ammonia and TNF-&#945;, and the group DIP-INT, demonstrated decrease in PgE2. Glutamine, glutamate and GSH/GSSG increases in the soleus and glutamate in the gastrocnemius increases in groups DIP-INT and GLN+ALA-INT. Increases in GSH and GSH/GSSG in liver were found in the same groups, compared to CON-INT. Our results indicate that oral supplementation with free L-glutamine added to L-alanine or the dipeptide, Lalanyl-L-glutamine, may influence the muscle and liver stores of GSH and the cellular redox state, and this may attenuate damage and inflammation induced by severe physical exercise.

Nos organismos eucariotos, aproximadamente 50% das proteínas traduzidas no citoplasma são transportadas para as organelas, onde irão desempenhar suas funções. Com isso, surgiu um intricado sistema de transporte intracelular de proteínas. Nas plantas, a presença de uma segunda organela endossimbionte, o plastídio, tornou este sistema mais complexo e gerou demanda adicional por transporte. Ainda, grande maioria das proteínas mitocondriais e plastidiais são codificadas por genes nucleares e importadas do citosol. O dogma uma proteína-uma localização foi associado ao conceito de um gene-uma proteína na biologia celular. Entretanto, proteínas individuais podem ter mais de uma função, e mais recentemente, proteínas codificadas por um único gene foram identificadas em mais de um compartimento subcelular, o que deu origem ao conceito de duplo direcionamento (DD). Um exemplo bem estudado de DD vem das proteínas da família das aminoacil-tRNA sintetases (aaRS), que participam da síntese protéica ao acoplar o aminoácido ao seu tRNA cognato. Dentre as aaRSs, a glutamil-tRNA sintetase citosólica (GluRS), através de sua extensão N-terminal, parece estar envolvida com outras funções além da tradução. Em Arabidopsis thaliana, há dois genes nucleares que codificam a GluRS, um para uma proteína de duplo direcionamento (DD) e outro para uma proteína citosólica. Resultados recentes em nosso laboratório mostraram que a GluRS citosólica pode estar relacionada ao controle da localização subcelular de proteínas organelares em Arabidopsis. Para verificar um eventual papel desta proteína na localização subcelular de outras proteínas, foram realizados ensaios de duplo-híbrido em levedura, os quais mostraram interação entre a GluRS e a glutamina sintetase (GS) de Arabidopsis thaliana, proteína de DD para mitocôndrias e cloroplastos Esta interação foi confirmada in planta, sendo a sequência da GluRS responsável pela interação localizada na região N-terminal, do resíduo 207 ao 316. Análises filogenéticas apontam que esta região encontra-se ausente nas bactérias e que originou-se provavelmente em Archea, entre 2,6 e 1,8 bilhões de anos. Além disso, observa-se que esta sequência é conservada em fungos, musgos e plantas vaculares, tendo originado-se em Arabidopsis há cerca de 2 bilhões de anos. / In eukaryotic organisms, about 50% of cytoplasmic translated proteins are transported to the organelles, where they can play their roles. Thus, a complex system for intracellular transport was established. In plants, the presence of a second endosymbiont organelle, the plastid, turned this system still more intricated and required an additional transport mechanism. Besides, most of organellar proteins are coded by nuclear genes and imported from the cytosol. The one protein-one localization was associated to the idea of one gene-one protein, which has long been established in molecular biology. However, individual proteins can show more than one function, and recently, proteins coded by one single gene were identified in more than one subcellular compartment, which has originated the concept of dual targeting. One of the most studied example of dual targeted proteins is the aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) family, which are related to protein synthesis by attaching the correct amino acid onto the cognate tRNA molecule. Among the aaRSs, cytosolic glutamyl-tRNA synthetase (GluRS), through its N-terminal extension, seems to be involved in other cellular role beyond translation. In Arabidopsis thaliana, there are two genes encoding GluRS, one for a dual-targeted protein and other for a cytosolic protein. Recent results in our laboratory showed that GluRS interacts with proteins destinated to other organelles, which suggest that this protein might have a role in interfering on protein localization in Arabidopsis. In order to gain some information on the role of this protein in subcellular localization, yeast two-hybrid assays were performed. These studies showed the interaction between GluRS and glutamine synthetase (GS), a mitochondrial and chloroplastic dual-targeted protein. This interaction was confirmed in planta. In addition, the GluRS sequence associated to protein interaction was localized at its N-terminal portion, between the residues 207 316. Phylogenetic analysis revealed that this region is absent in bacteria and it probably arose from Archea between 2.6 and 1.8 billion years ago. Also, this sequence is conserved in fungi, moss and all the green plants investigated. Finally, datation analysis showed that this sequence arose in Arabidopsis between 2 and 1.7 billion years ago.

A regulação da localização de proteínas é um dos aspectos fundamentais na biologia celular vegetal. Os cloroplastos importam mais de 90% de suas proteínas do citosol, portanto, é importante caracterizar os fatores citosólicos que podem estar envolvidos no direcionamento de proteínas para as organelas. Um ensaio de duplohíbrido em leveduras com as proteínas cloroplastidiais HMPPK/TMPPase (TH1) e Glutamina Sintetase (GS) II usados como iscas revelou que a forma citosólica da glutamil-tRNA sintetase - GluRS (At5g26710) de Arabidopsis thaliana interagiu com ambas as proteínas. Estudos de Complementação da Fluorescência Bimolecular (BiFC) confirmaram tais interações in planta. Estudos com deleções na região Nterminal da GluRS mostraram que esta região é responsável pelas interações com HMPPK/TMPPase e GSII. Além disso, seis resíduos de aminoácidos parecem ser cruciais para a interação entre as proteínas. Curiosamente, foi mostrado que a GluRS está envolvida na localização de proteínas em leveduras. A fim de obter mais informações sobre o envolvimento da GluRS ns localização de proteínas nos cloroplastos, foram produzidos plantas de tabaco transgênicas expressando uma proteína quimérica, feita pela fusão do gene codificador da HMPPK/TMPPase, TH1- GFP, e GSII-GFP e posteriormente usados em ensaios de agroinfiltração com RNA de interferência (RNAi) para GluRS. Análises em microscópio confocal mostraram que TH1-GFP e GSII-GFP acumulam no citosol em vez de serem direcionados aos cloroplastos. Neste trabalho, mostramos pela primeira vez que a GluRS está envolvida na localização de proteínas cloroplastidiais em plantas e esse mecanismo é também conservado em Saccharomyces cerevisiae. / Regulation of protein localization is one of the key aspects in plant cell biology. Chloroplasts import more than 90% of their proteins from the cytosol, therefore, it is important to identify and characterize cytosolic factors that might be involved in protein delivery to the organelar envelope. A yeast two-hybrid screen with a chloroplastlocalized HMPPK/TMPPase protein and glutamine synthetase (GS), used as baits, revealed that the cytosolic form of the glutamyl-tRNA synthetase (GluRS) (At5g26710) from Arabidopsis thaliana interacted with both proteins. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) studies confirmed such interactions in planta. Deletion studies of GluRS showed that the N-terminal region of the protein is responsible for proteinprotein interactions (PPI) with TH1 and GS. In addition, six amino acid residues appeared to be crucial for PPI. Interestingly, GluRS has been also shown to be involved in regulating protein localization in yeast. In order to gain more information about the involvement of GluRS on protein localization in chloroplasts, we produced transgenic tobacco plants expressing a chimeric protein made by the fusion of TH1- GFP and GSIIGFP and agroinfiltrated with a RNA interference (RNAi) construct against GluRS. Confocal analysis showed that TH1-GFP and GSII-GFP accumulated in the cytosol instead of being targeted to chloroplasts. Here, we show for the same time that GluRS is involved in protein localization in plants and this mechanism is also conserved in Saccharomyces cerevisiae.

Introdução: A isquemia e reperfusão, que ocorre durante cirurgia renal, pode desencadear lesões que são mediadas por radicais livres produzidos na fase de reperfusão. A glutamina exerce propriedades positivas no sistema antioxidante por ação da glutationa. O pré- condicionamento isquêmico aumenta a tolerância a tecidos que sofrem isquemia. Objetivo: Avaliar a ação da glutamina associada ao pré-condicionamento isquêmico na isquemia e reperfusão renal em modelo animal. Métodos: Cinquenta ratos winstar machos foram submetidos à nefrectomia a direita. No oitavo dia de pós-operatório os animais foram randomizados em cinco grupos (n=10) que foram assim divididos: grupo I - grupo Sham, grupo II - grupo isquemia e reperfusão, grupo III - grupo pré-condicionamento isquêmico, grupo IV - grupo glutamina e grupo V- pré-condicionamento isquêmico associado a glutamina. Os grupos IV e V receberam glutamina através de gavagem por sete dias. Ao final do 14º dia da nefrectomia procedeu-se a isquemia renal esquerda por 45 minutos. Após 1 e 7 dias, cinco animais de cada subgrupo foram submetidos a nova cirurgia com coleta de sangue e retirada de tecido renal. Resultados: Após um dia de reperfusão o grupo V apresentou os níveis mais elevados de glutationa reduzida (2,55±0,34mmol/g tecido) quando comparado aos outros grupos. A atividade da enzima superóxido dismutase apresentou-se elevada no grupo V quando comparado ao grupo II (p=0.018). Já no sétimo dia de reperfusão o grupo V apresentou-se com a maior atividade da enzima glutationa peroxidase dentre todos os grupos (p=0.009), bem como a atividade da enzima glutationa reduzida (p=0,001). Neste mesmo dia a superóxido dismutase mostrou-se mais elevada no grupo V quando comparado aos grupos que sofreram intervenção isquêmica (p=0.02). No sétimo dia a caspase-3 e a proteína carbonilada do grupo V se mostraram com maiores valores quando comparados aos grupos restantes. A associação da glutamina ao pré-condicionamento isquêmico elevou a glutationa reduzida e superóxido dismutase no grupo no primeiro dia após a reperfusão. No sétimo dia após a reperfusão se observa uma persistente elevação da superóxido dismutase, enzimas glutationa peroxidase e glutationa redutase bem como os níveis de caspase-3 e proteína carbonilada. Conclusão: Neste modelo de isquemia renal por clampeamento de pedículo seguido de reperfusão se conclui que há uma potencialização do efeito antioxidante da associação da glutamina e pré-condicionamento isquêmico após 24 horas de reperfusão, entretanto tal efeito não é mantido até o sétimo dia após a reperfusão. / Introduction: Ischemia and reperfusion injury that occurs during renal surgery can trigger injuries that are mediated by free radicals generated in the reperfusion phase. Glutamine exerts positive properties in the antioxidant system by the action of glutathione. Ischemic preconditioning increases tolerance to tissue suffering ischemia. Objective: To evaluate the action of glutamine associated with ischemic preconditioning in ischemia and reperfusion in animal models. Methods: Fifty rats Winstar males underwent nephrectomy right. On the eighth day after the operation the animals were randomized into five groups (n = 10) were divided as follows: Group I - sham group, II - ischemia and reperfusion group, III - ischemic preconditioning group, IV - glutamine group and group V- ischemic preconditioning group associated with glutamine. Groups IV and V received glutamine via gavage for seven days. At the end of 14 days nephrectomy proceeded to the left renal ischemia for 45 minutes. After 1 and 7 days, five animals in each subgroup underwent new surgery with blood collection and removal of kidney tissue. Results: After one day reperfusion group V showed higher levels of reduced glutathione (2.55 ± 0,34mmol / g tissue) compared to other groups. The enzyme activity superoxide dismutase showed up high in the V group compared to group II (p = 0.018). In the seventh day of reperfusion group V presented with the increased activity of glutathione peroxidase enzyme among all groups (p = 0.009) as well as the activity of reduced glutathione (p = 0.001). On the same day the superoxide dismutase was shown to be higher in the V group compared to groups who have suffered ischemic intervention (p = 0.02). On the seventh day caspase- 3 and protein carbonyl group V are shown with larger values when compared to the other groups. The association of glutamine to ischemic preconditioning increased the reduced glutathione and superoxide dismutase in the group on the first day after reperfusion. On the seventh day after reperfusion is observed a persistent elevation of superoxide dismutase, glutathione peroxidase enzymes and glutathione reductase and the levels of caspase-3 and protein carbonyl. Conclusion: In this model of renal ischemia by clamping the pedicle followed by reperfusion is concluded that there is a potentiation of the antioxidant effect of glutamine association and ischemic preconditioning after 24 hours of reperfusion, however this effect is not maintained until the seventh day after reperfusion.