Orientador: Patricia de Oliveira Prada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas / Made available in DSpace on 2018-08-25T21:25:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reis_SabrinaKaren_M.pdf: 2044889 bytes, checksum: 02eeb1437ecda9df9b2500ae61a282e8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Obesidade está associada à inflamação crônica de baixo grau e ao desenvolvimento da resistência à insulina. A suplementação com L-glutamina tem sido utilizada para reduzir a inflamação em pacientes críticos. No entanto, os efeitos da suplementação deste aminoácido em doenças inflamatórias de baixo grau, como a obesidade, ainda não foram investigados. Por tanto o objetivo do presente estudo foi investigar se a suplementação oral com L-glutamina altera a massa corporal, circunferência da cintura, sensibilidade à insulina e os níveis séricos de hormônios relacionados ao metabolismo energético em indivíduos com sobrepeso e obesidade. Foi realizado um estudo clínico randomizado, simples cego com 67 voluntários adultos do Hospital Estadual de Sumaré (HES), classificados com sobrepeso (IMC 25 a 29,9 kg/m²) ou obesidade (IMC ? 30). Os indivíduos foram suplementados com 30 g/dia de glutamina ou alanina durante 14 dias. Os níveis séricos de insulina, leptina, adiponectina e GLP-1 foram avaliados no período pré e pós-suplementação, pelo método de ELISA. A glicose sérica foi avaliada pelo método da glicose oxidase. O índice de HOMA foi calculado. A massa corporal, o índice de massa corporal (IMC), a circunferência da cintura e o recordatório alimentar de 24 horas, também, foram avaliados pré e pós-suplementação. A suplementação oral com L-glutamina não alterou a massa corpórea e o IMC, no entanto reduziu a circunferência da cintura e os níveis séricos de leptina, sugerindo uma diminuição na massa adiposa. Não houve diferença significativa nos níveis séricos de glicose, adiponectina e GLP-1. Entretanto, houve uma redução nos níveis séricos de insulina e índice de HOMA, sugerindo uma redução na inflamação de baixo grau e uma melhora na sensibilidade à insulina. Os dados obtidos sugerem que a suplementação oral com L-glutamina em um curto período de tempo pode reduzir a massa adiposa de indivíduos com sobrepeso e obesidade. Essa redução refletiu nos níveis séricos de leptina e provavelmente nos níveis séricos de insulina, melhorando a sensibilidade à insulina. Por tanto, a suplementação com L-glutamina pode tornar-se uma abordagem terapêutica interessante para os indivíduos com sobrepeso e obesidade / Abstract: Obesity is associated with low-grade inflammation and insulin resistance. Glutamine supplementation has been used to reduce inflammation in critically ill patients. However, the effects of glutamine supplementation were not yet investigated in diseases with lowgrade inflammation such as obesity. Previous data showed that glutamine supplementation reduced inflammation, adipose mass and improved insulin sensitivity of obese rats. Thus, the aim of this study was to investigate whether oral glutamine supplementation alters body weight (BW), waist circumference (WC) and hormones levels and insulin sensitivity in overweight and obese humans. A randomized clinical trial, single blind with 67 adult volunteers from the State Hospital of Sumaré (HES), classified as being overweight (IMC 25 a 29,9 kg/m²) or obese (IMC ? 30) was performed. The subjects were supplemented with 30 g / day glutamine or alanine for 14 days. Serum levels of insulin, leptin, adiponectin and GLP-1 were evaluated before and after supplementation, by ELISA. Serum glucose was measured by glucose oxidase method. The HOMA index was calculated. The body weight, body mass index (BMI), waist circumference and 24-hour food record were also evaluated before and after supplementation. Glutamine supplementation did not change BW and BMI, however, reduced WC and serum leptin levels, suggesting a decrease in fat mass. Glutamine supplementation l did not alter serum adiponectin, GLP-1 and glucose levels. However, was reduced insulin levels and HOMA index, suggesting a reduction in low-grade inflammation associated with an improvement of insulin sensitivity. The data suggest that oral supplementation with L-glutamine in a short period of time can reduce fat mass in overweight and obese individuals. This reduction reflected in serum leptin levels and probably in serum insulin levels, improving insulin sensitivity. Thus, glutamine supplementation may become an interesting therapeutic approach for individuals with overweight and obesity / Mestrado / Nutrição / Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo

Orientador: Patricia de Oliveira Prada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas / Made available in DSpace on 2018-08-26T02:10:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_AlessandraZaninZambomde_M.pdf: 4234168 bytes, checksum: b7f596f6fcaa8a1d60980a17c3aeb76d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Introdução: Inúmeros fatores contribuem para o aumento da obesidade em todo o mundo. Recentemente, a microbiota intestinal ganhou destaque devido ao seu poder de predispor ou inibir o ganho de peso. Alguns nutrientes são capazes de alterar a composição da microbiota intestinal, o que pode trazer efeitos benéficos ou maléficos, como a obesidade. O aminoácido L-glutamina, além de suas inúmeras funções orgânicas e imunológicas, é conhecido por desempenhar importante papel no trofismo intestinal. O objetivo do presente estudo foi investigar alterações na composição da microbiota intestinal de indivíduos com sobrepeso ou obesidade após suplementação oral com L-glutamina. Métodos: Voluntários com sobrepeso ou obesidade foram selecionados para ingerir 30g de L-glutamina (GLN) por via oral ao dia, por um período de quatorze dias. O grupo controle recebeu L-alanina (ALA) no mesmo tempo e proporção. Amostras de sangue e fezes foram coletadas para análises. Para classificação taxonômica das bactérias intestinais, foi realizado sequenciamento do gene 16S RNA ribossomal. Análises de bioinformática foram conduzidas com base no banco de dados RDP (Ribosomal Database Project). Para análise dos dados, estratégias estatísticas variadas foram utilizadas. Resultados: Após quatorze dias de suplementação, os participantes do grupo GLN exibiram diferenças significativas nos filos Actinobacteria e Firmicutes e nos gêneros Dialister, Dorea, Pseudobutyrivibrio e Veillonella, comparados com o grupo ALA. A razão F / B (Firmicutes / Bacteroidetes), um bom biomarcador para a obesidade, reduziu de 0,85 para 0,57 no grupo GLN e ao contrário, aumentou de 0,91 para 1,12 no grupo ALA. Conclusão: A suplementação oral do aminoácido L-glutamina, em humanos com sobrepeso e obesidade, por um período de quatorze dias, promove alterações na composição da microbiota intestinal similares às promovidas pela perda de peso / Abstract: Introduction: Several factors contribute to the increase of obesity worldwide. Recently, the gut microbiota gained prominence due to its power to predispose or inhibit weight gain. Some nutrients are able to change the composition of the gut microbiota, what can bring beneficial or harmful effects, such as obesity. The amino acid L-glutamine, in addition to its numerous organic and immune functions, is known to play an important role in intestinal tropism. The aim of this study was to investigate changes in the composition of the gut microbiota of overweight or obese adults after oral supplementation with L-glutamine. Methods: Overweight or obese subjects were selected to orally ingest 30g of L-glutamine (GLN) daily for a period of fourteen days. The control group received L-alanine (ALA) in the same period and proportion. Blood and feces were collected for analysis. The 16S rRNA gene sequence was performed for taxonomic classification of intestinal bacteria. Bioinformatics analysis was conducted based on RDP (Ribosomal Database Project). For data analysis, varied statistical strategies were used. Results: After fourteen days of supplementation, participants in the GLN group showed significant differences in the Firmicutes and Actinobacteria phyla and Dialister, Dorea, Pseudobutyrivibrio and Veillonella genera, compared with the ALA group. The F / B (Firmicutes / Bacteroidetes) ratio, a good biomarker for obesity, decreased from 0.85 to 0.57 in GLN group and, as opposed, increased from 0.91 to 1.12 in the ALA group. Conclusion: Oral supplementation with the amino acid L-glutamine in overweight and obese humans, for a period of fourteen days, alters the composition of the gut microbiota in a similar way to weight loss / Mestrado / Nutrição / Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo

Trypanosoma cruzi, utiliza os aminoácidos como importantes metabólitos para sua manutenção e viabilidade, dentre eles glutamato e glutamina que participam no suprimento energético, metaciclogênese e síntese de pirimidinas. Neste trabalho a glutamina sintetase de T. cruzi (TcGS) foi estudada sob a hipótese de contribuir com a detoxificação de NH4+. Extratos de T. cruzi e a enzima recombinante pura foram utilizados na caracterização cinética e determinação da conformação oligomérica. Na forma amastigotas, observamos que TcGS é mais expressa e ativa. Além disso, a metionina sulfoximina (MS) inibiu TcGS de maneira competitiva e com alta afinidade e reduziu a proliferação de epimastigotas em excesso extracelular de NH4+, relacionando TcGS com a detoxificação dessa molécula. Assim, o tratamento com MS ao longo do ciclo intracelular reduziu a eclosão de formas tripomastigotas de células CHO-K1, ressaltanto a importância da GS no metabolismo de nitrogênio e no ciclo de vida de T. cruzi. / Trypanosoma cruzi uses amino acids as important metabolites for its maintenance and viability, glutamate and glutamine are involved in energy supply, metacyclogenesis and synthesis of pyrimidines. It was described here the glutamine synthetase of T. cruzi (TcGS), and its relation with the ammonium detoxification. Extracts of T. cruzi and pure recombinant enzyme were used to determine the kinetic parameters and the oligomeric conformation of the enzyme. In amastigote forms, we observed that TcGS is more expressed and active. In addition, methionine sulfoximine (MS) inhibited competitively the TcGS, with high affinity and reduced the epimastigotes proliferation exposed to extracellular ammonium excess, connecting TcGS to the ammonium detoxification. Therefore, the treatment with MS along the intracellular cycle reduced the trypomastigote bursting from the CHO-K1 cells, demonstrating the importance of GS on the T. cruzi life cycle establishment and nitrogen metabolism.

O objetivo neste trabalho foi avaliar a concentração de aminoácidos essenciais (Lisina e Metionina) considerada na literatura como ideal, de acordo com a via de fornecimento (sucedâneo ou concentrado inicial), e sua associação com a suplementação de Glutamato e Glutamina, para bezerros em dois sistemas de aleitamento: convencional ou programado. No primeiro experimento foi realizado o levantamento da composição bromatológica e em aminoácidos dos principais sucedâneos comercializados no Brasil. Nos segundo e terceiro experimentos foram utilizados 45 bezerros da raça Holandês, em delineamento de blocos casualizados distribuídos nos tratamentos: 1) Controle: sem suplementação; 2) Suplementação de lisina e metionina para atingir consumo de 17 e 5,3 g/d, respectivamente, com correção feita com base na análise do sucedâneo, 3) Suplementação de lisina e metionina, para atingir consumo de 17 e 5,3 g/d, respectivamente, com correção feita com base na análise do concentrado inicial. A diferença entre os experimentos foi o sistema de aleitamento ao qual os bezerros foram submetidos: no segundo experimento os animais receberam 6L/d de sucedâneo; enquanto no terceiro estudo os animais foram submetidos ao sistema de aleitamento programado (4L/d até a 2ª semana; 8L/d da 3ª a 6ª semana; 4L/d da 7ª a 8ª semana). No quarto experimento o mesmo delineamento foi utilizado para avaliar, em sistema de aleitamento convencional, os tratamentos: 1) Controle: sem suplementação; 2) Sucedâneo lácteo suplementado com Lisina e Metionina, para atingir consumo de 17 e 5,3g/d, respectivamente + 1% na MS de produto contendo 10% de glutamato e de glutamina; 3) Sucedâneo lácteo suplementado com Lisina e Metionina para atingir consumo de 17 e 5,3g/d + 0,6% na MS de produto contendo 10% de glutamato e de glutamina. Os animais foram alojados em abrigos individuais, com livre acesso a água e concentrado inicial. O consumo de concentrado inicial e o escore fecal dos animais foram registrados diariamente. Semanalmente, foram realizadas pesagens e medidas de crescimento corporal. Nas semanas 2, 4, 6, 8 e 10 de vida foram realizadas colheitas de sangue para determinação de metabólitos como marcadores do status protéico dos animais (albumina, proteína total, N-ureico), status energético (glicose e ?-hidroxibutirato), crescimento ósseo (fosfatase alcalina) e crescimento muscular (creatinina). A composição em aminoácidos dos sucedâneos comercializados no Brasil foi menor que o esperado para dieta que substitui o leite integral. Nos experimentos 2 e 3 a suplementação com lisina e metionina no sucedâneo ou no concentrado inicial para bezerros não resultou em benefícios no desempenho ou no metabolismo. No estudo 4, a suplementação do sucedâneo com lisina, metionina em associação com glutamato e glutamina não alterou o desempenho, a saúde intestinal ou o metabolismo de bezerros leiteiros. / The aim in this work was to evaluate the concentration of essential amino acids (Lysine and Methionine) considered in the literature as ideal, according to feeding route (milk replacer or starter concentrate), and its association with the supplementation of glutamate and glutamine to calves in two feeding systems: conventional or step-down. In the first study, the chemical composition was analyzed and in amino acids of main milk replacer marketed in Brazil. In the second and third studies, 45 Holstein calves were used, in randomized blocks distributed in treatments: 1) Control: without supplementation; 2) Supplementation with lysine and methionine to reach consumption of 17 and 5.3 g/d, respectively, with correction based on the analysis basis of the milk replacer, 3) Supplementation of lysine and methionine to reach consumption of 17 and 5.3 g/d, respectively, with correction based on the analysis basis of starter concentrate. The difference between the experiments was the feeding system applied to the calves: in the second study, the animals received 6 L/d of milk replacer; while in the third study, the animals were submitted to the step-down system (4L/d until the 2nd week; 8L/d of the 3nd to 6th week; 4L/d of the 7th to 8th week). In the fourth study, the same experimental design was used to evaluate, in a conventional feeding system, treatments: 1) Control: without supplementation; 2) AminoGut 0.6%: milk replacer supplemented with Lysine and Methionine, to reach consumption 17 and 5.3g/d, respectively + 0.6% product containing 10% of glutamate and glutamine; 3) AminoGut 1%: milk replacer supplemented with Lysine and Methionine to reach consumption 17 and 5.3g/d + 0.6% product containing 10% of glutamate and glutamine. The animals were housed in individual hutches, with free access to water and starter concentrate. The consumption of starter concentrate and fecal scores of animals were monitored daily. Body growth was weighed and measured weekly. In weeks 2, 4, 6, 8 and 10, blood samples were collected to determine the metabolites as markers of protein status of animals (albumin, total protein, N-urea), energy status (glucose and BHBA), bone growth (alkaline phosphatase) and muscular growth (creatinine). The composition of amino acids of the milk replacer marketed in Brazil was lower than expected for diet that replaces the whole milk. In study 2 and 3, the supplementation of the milk replacer or starter concentrate with lysine and methionine resulted in no benefit on dairy calves performance or metabolism. In study 4 the supplementation of the milk replacer with lysine and methionine in association with glutamate and glutmine had no effect on performance, gut health nor metabolism of dairy calves.

Haloferax mediterranei es un microorganismo halófilo extremo que se incluye dentro del Dominio Archaea. Es capaz de crecer utilizando carbohidratos, ácidos carboxílicos, alcoholes y aminoácidos como fuentes de carbono y energía. Además, puede crecer en medio definido en presencia de glucosa como única fuente de carbono, y con nitrato o nitrito como única fuente de nitrógeno a través de la vía de asimilación utilizando las nitrato y nitrito reductasas asimilativas. El nitrato lo utiliza reduciéndolo a amonio, el cual es incorporado a esqueletos carbonados vía glutamato deshidrogenasa (GDH) en condiciones de exceso de nitrógeno o mediante la ruta glutamina sintetasaglutamato sintasa (GS-GOGAT) bajo condiciones de deficiencia de nitrógeno. La glutamina sintetasa (GS; EC 6.3.1.2) se encuentra en todos los Dominios, que participa en la asimilación del amonio y en la biosíntesis de glutamina, actuando como donador de nitrógeno para la síntesis de proteínas y de ácidos nucleicos. Esta enzima cataliza la biosíntesis de glutamina mediante la reacción biosintética dependiente de magnesio o manganeso, a partir de glutamato, ATP y amonio. En el genoma de Hfx. mediterranei se localizaron tres genes que presentaron homología con glutamina sintetasa, en base a la presencia de tres dominios conservados (COG0174: transporte y metabolismo de aminoácidos; pfam00120: dominio catalítico y pfam03951: dominio beta-Grasp) que se utilizan para identificar a las GSs. También se observó que uno de los genes mantiene conservadas las tres secuencias consenso características de GSs (glnA), mientras que los otros dos genes (glnA-2 y glnA-3) contienen parcialmente conservada una de ellas. Con el objetivo de conocer qué funciones desempeñan estas tres proteínas en la asimilación del nitrógeno, y si concretamente glnA-2 y glnA-3 ejercen un papel importante en este proceso, cada una de las tres proteínas halofílicas se clonó y expresó heterólogamente en la cepa BL21 (DE3) de E. coli, utilizando el vector de expresión pET3a, obteniéndose las proteínas en forma de cuerpos de inclusión. Cada una de estas fracciones sólidas se solubilizaron utilizando urea 8 M, y posteriormente se diluyeron en un tampón conteniendo NaCl 2 M y DTT 5 mM para conseguir su renaturalización. Posteriormente, se llevó a cabo la purificación de cada una por separado mediante una única etapa a través de una cromatografía en DEAE-celulosa; obteniéndose puras cada una de las proteínas y concentradas de forma rápida y con un buen rendimiento. La caracterización de la GS (GlnA) recombinante indicó que se trataba de una enzima dependiente de metales catiónicos divalentes, regulada por los efectores 2-oxoglutarato y glutamina. La proteína fue activada por 2-oxoglutarato e inhibida por glutamina. Mediante la técnica de velocidad de sedimentación se determinó que su estructura oligomérica consistía en 12 subunidades y se clasificó como GS tipo I, incluida en la subdivisión α. Se generaron mutantes de deleción de glnA y glnA-3 en Hfx. mediterranei mediante la técnica pop-in pop-out, que permitió la sustitución de una secuencia concreta del genoma por otra modificada in vitro. Para la obtención de los mutantes se utilizó la cepa HM26 (ΔpyrE2) de Hfx. mediterranei. Primeramente, se construyó un cassette de deleción para la obtención de un producto de fusión de 1000 pb (versión incompleta del gen) que se clonó en el vector pMH101N, conteniendo una copia del gen pyrE2, el cual se utilizó como marcador genético. Los mutantes pop-in se seleccionaron en un medio carente de uracilo, ya que sólo las células que codificaron el gen pyrE2, presente en el plásmidos suicida, pudieron sintetizar de novo dicho compuesto y crecer. Posteriormente, el plásmido suicida se perdió y junto con él una de las copias del gen, delecionada u original (mutante pop-out). Finalmente se obtuvieron los mutantes de deleción para los genes glnA y glnA-3, de los cuales glnA resultó ser un gen esencial en la asimilación de amonio y en la síntesis de glutamina, puesto que aquellos mutantes que presentaron la deleción de glnA fueron incapaces de crecer en un medio definido carente de glutamina; se trató por tanto de mutantes auxótrofos para este aminoácido, que únicamente crecieron al adicionar glutamina en el medio de cultivo. Finalmente, para conocer el efecto que produce la fuente de nitrógeno sobre la expresión global de los genes en Hfx. mediterranei, se realizó un array de expresión de la cepa R4 (silvestre) y se determinó la expresión global de genes en tres medios de cultivo con diferentes fuentes de nitrógeno: cultivo con amonio como fuente de nitrógeno en fase estacionaria y exponencial de crecimiento, cultivo con nitrato en mitad de fase exponencial de crecimiento y cultivos con carencia de nitrógeno. Las principales diferencias en expresión de genes se detectaron en los medios de nitrato y carencia de nitrógeno con respecto a amonio, los resultados sugirieron que la ausencia de amonio fue el factor responsable para la expresión de genes implicados en la ruta de asimilación de nitrato. Concretamente, en carencia de nitrógeno la GS mostró una mayor expresión que en medio con amonio. Para analizar los cambios de expresión en los genes glnA-2 y glnA-3 se realizó un nuevo array de expresión de la cepa HM26-A (ΔpyrE2 ΔglnA) utilizando como control la cepa parental HM26 (ΔpyrE2). Se determinó la expresión en dos medios de cultivo, en medio complejo suplementado con glutamina 40 mM en mitad de fase exponencial de crecimiento y en medio con carencia en nitrógeno. Tanto en la cepa HM26-A con carencia en nitrógeno como en la cepa parental HM26 se detectaron cambios de expresión en los genes relacionados con la vía asimilativa del metabolismo del nitrógeno de esta arquea halófila. En la cepa HM26 en carencia de nitrógeno con respecto a medio complejo con gln 40 mM se mostró una menor expresión de los genes glnA-2 y glnA-3 y una sobreexpresión de glnA. Mientras que en la cepa HM26-A en medio complejo con glutamina frente a la cepa HM26 en medio complejo en carencia de nitrógeno, al delecionar glnA, los genes glnA-2 y glnA-3 mostraron un incremento de expresión.que en la cepa HM26-A en medio complejo con glutamina frente a la cepa HM26 en medio complejo en carencia de nitrógeno, al delecionar glnA, los genes glnA-2 y glnA-3 mostraron un incremento de expresión. En conclusión, la glutamina sintetasa de Hfx. mediterranei es una enzima de tipo GSI-α, dodecamérica, resultando ser una proteína esencial en la asimilación de amonio y en la síntesis de glutamina; siendo activa en condiciones de deficiencia de nitrógeno, a diferencia de las isoformas GlnA-2 y GlnA-3 que podrían ejercer un papel regulador de GlnA y posiblemente actúen en la célula en condiciones de abundancia de nitrógeno.

Haloferax mediterranei es un microorganismo perteneciente al Dominio Archaea que fue aislado por primera vez en las Salinas de Santa Pola, Alicante. Esta arquea halófila es capaz de crecer con glucosa como única fuente de carbono y con nitrato como única fuente de nitrógeno. En el interior celular, el nitrato se convierte en amonio mediante la nitrato y nitrito reductasas asimilativas. En función de su disponibilidad intracelular el amonio puede asimilarse mediante dos vías: a altas concentraciones de amonio, este se asimila mediante la vía de la glutamato deshidrogenasa (GDH), mientras que a bajas concentraciones de amonio, este se asimila por el ciclo glutamina sintetasa (GS)-glutamato sintasa (GOGAT). La GS (EC 6.3.1.2) es una enzima clave tanto en la asimilación de amonio como en la biosíntesis de glutamina y de otros aminoácidos. Está presente en todos los Dominios de la vida, considerándose como un buen reloj molecular de la evolución ya que su secuencia muestra homología en todos los organismos. La familia de la GS está dividida en tres clases (GSI, GSII y GSIII) dependiendo de su secuencia, el gen que la codifique y del organismo al que corresponda. El genoma de Hfx. mediterranei contiene tres marcos de lectura abiertos que muestran homología con la GS y están codificados por los genes glnA-1, glnA-2 y glnA-3. Los genes glnA-2 y glnA-3 se encuentran localizados muy próximos en el genoma, únicamente separados por 1,6 kb, y a su vez dichos genes están separados del gen glnA-1. La proteína codificada por el gen glnA-1 tiene una identidad del 51,9% y del 49,1% con las proteínas codificadas por los genes glnA-2 y glnA-3, respectivamente. Las proteínas GlnA-2 y GlnA-3 muestran una identidad entre sí de un 60,9%. La proteína GlnA-1 mantiene parcial o completamente conservadas las tres secuencias consenso características de las GS, mientras que las proteínas GlnA-2 y GlnA-3 únicamente mantienen parcialmente conservada una de ellas (putative ATP_binding región signature PS00181). Además, en base a la presencia de los dominios conservados se determinó que las tres proteínas GlnA de Hfx mediterranei presentan el dominio catalítico PF00120 (Gln-synt_C) utilizado para la identificación de las GS tipo l. Analizando los aminoácidos presentes en cada una de las tres proteínas GlnA, se identificó que, de los 18 residuos aminoacídicos característicos de las GSI conservados universalmente, la secuencia de la proteína GlnA-1 presenta todos ellos, además del residuo de adenilación. Sin embargo, 8 de los residuos clave para la biosíntesis de glutamina se encuentran sustituidos por otros en las proteínas GlnA-2 y GlnA-3, careciendo además ambas proteínas del residuo de adenilación. El análisis del transcriptoma en función de la fuente de nitrógeno de la cepa mutante de deleción del gen glnA-1 (HM26-ΔglnA-1) reveló que los genes glnA-2 y glnA-3 no pueden sustituir la función del gen glnA-1. Además, estos últimos genes presentaron un perfil de expresión diferente al de glnA-1 en la cepa parental de Hfx. mediterranei HM26. En condiciones limitantes de nitrógeno, la deleción del gen glnA-1 afectó al nivel de expresión de genes involucrados en diferentes procesos metabólicos perteneciendo en su mayoría al metabolismo del nitrógeno, al metabolismo de las vesículas de gas y los relacionados con los sistemas CRISPR, sistemas de transporte y con reguladores transcripcionales. El estudio de expresión a nivel transcripcional en función de la fuente de nitrógeno de los genes glnA mediante RT-PCR reveló que los genes glnA-1 y glnA-2 se expresan en todas las condiciones analizadas (medio complejo, medio definido con amonio o nitrato 40 mM y en medio definido carente de nitrógeno) mientras que el gen glnA-3 no se expresa en estas condiciones. El estudio de expresión a nivel traduccional en función de la fuente de nitrógeno de las proteínas GlnA mediante Western blotting confirmó que la proteína GlnA1 se expresa en todas las condiciones analizadas (en medio complejo, y en los medios definidos con amonio, nitrato o glutamina 40 mM y en medio definido carente de fuente de nitrógeno) durante todas las etapas de crecimiento analizadas. Del mismo modo, este análisis de expresión reveló que la proteína GlnA-2 se expresa en todas las condiciones analizadas excepto al emplear medio complejo, pudiendo estar implicado algún mecanismo de regulación postranscripcional en la expresión de la proteína GlnA-2 en esta condición. Asimismo, la proteína GlnA-3 no mostró expresión en ninguna de estas condiciones analizadas ni en presencia de otras fuentes de nitrógeno (glutamato) o de carbono (citrato) ensayadas. La proteína recombinante GlnA-1, obtenida mediante expresión heteróloga, mostró una mayor actividad GS que las proteínas GlnA-2 y GlnA-3. Sin embargo, las proteínas recombinantes GlnA-2 y GlnA-3 mostraron valores elevados de actividad y-glutamil putrescina sintetasa mientras que GlnA-1 solo tiene cierta actividad residual cuando se emplea putrescina como sustrato. Los niveles de actividad y-glutamil putrescina sintetasa de las proteínas GlnA-2 y GlnA-3 son unas 10 veces superiores a los valores de actividad GS. En los extractos de Hfx. mediterranei R4 crecidos en presencia de nitrato 40 mM como fuente de nitrógeno, en los cuales se expresan tanto la proteína GlnA-1 como GlnA-2, se observó una actividad GS mayor a la detectada en los extractos obtenidos a partir medio complejo. Por otra parte, Hfx. mediterranei R4 fue capaz de crecer con putrescina como única fuente de nitrógeno a diferentes concentraciones (20 - 250 mM), aunque las densidades ópticas alcanzadas fueron menores que las observadas al emplear otras fuentes de nitrógeno. En extractos proteicos obtenidos a partir de cultivos de Hfx. mediterranei empleando nitrato 40 mM o putrescina a diferentes concentraciones la actividad y-glutamil putrescina sintetasa fue mucho mayor a la detectada al emplear medio complejo como fuente de nitrógeno, condición donde la expresión de la proteína GlnA-2 no fue detectada. Para completar el análisis de las proteínas GlnA-2 y GlnA-3 se generaron mutantes de deleción de los genes glnA-2 y glnA-3 a partir de la cepa parental de Hfx. mediterranei HM26 (ΔpyrE2) mediante la técnica pop-in/pop-out. Los mutantes obtenidos del gen glnA-2 resultaron ser mutantes homocigotos mientras que los mutantes del gen glnA-3 resultaron ser heterocigotos. La cepa mutante HM26-ΔglnA-2 se caracterizó fisiológicamente en diferentes medios de cultivos: medio complejo y medio definido con amonio, nitrato o glutamina como fuentes de nitrógeno. El análisis estadístico de los parámetros de crecimiento reveló que existían diferencias de crecimiento significativas entre la cepa parental HM26 y la cepa mutante HM26-ΔglnA-2 al emplear altas concentraciones de amonio y/o nitrato. El análisis de expresión a nivel traduccional de la cepa mutante HM26-ΔglnA-2 confirmó que la deleción del gen glnA-2 no afectó a la expresión de la proteína GlnA-1 ni a la ausencia de expresión de GlnA-3. Sin embargo, la deleción del gen glnA-2 afectó de forma significativa a la actividad y-glutamil putrescina sintetasa al emplear nitrato 40 mM como fuente de nitrógeno, confirmando la función del gen glnA-2 como una y-glutamil putrescina sintetasa más que una glutamina sintetasa.

O presente trabalho teve o objetivo de verificar a influência da inoculação de ingredientes intra ovo aos 18 dias de incubação de ovos oriundos de matrizes jovens e de pesos distintos. Ovos oriundos de matrizes com 30 semanas de idade foram separados em ovos leves e pesados, sendo incubados na mesma máquina incubadora. Aos 18 dias de incubação, no momento da transferência para o nascedouro, os ovos foram inoculados com soluções de Maltose, Polivitamínico, Zinco-Glicina, Glutamina, Mistura de todos os produtos descritos anteriormente e Cloreto de Sódio (controle). Como via de inoculação, as soluções foram utilizadas como diluentes da vacina de Marek efetuada intra-ovo aos 18 dias de incubação. Após o nascimento, 2460 pintinhos machos foram enviados para o aviário experimental onde foram divididos em 60 boxes em um delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x6 (2 pesos e 6 soluções) totalizando 12 tratamentos com 5 repetições de 40 aves. Foram sacrificadas uma ave por repetição aos 00, 07 e 21 dias de idade para pesagem do saco da gema, intestino e fígado. Amostras de duodeno, jejuno e íleo foram enviadas para histologia para determinação de profundidade de criptas e altura de vilosidades. Amostras de sangue foram coletadas e enviadas para laboratório para determinação de nível de anticorpos contra reovírus e bronquite aviária. Os animais e a ração fornecida foram pesados semanalmente (07, 14, 21, 28, 35 e 42 dias) para determinação do peso, consumo e conversão alimentar. Aos 43 dias de idade 3 aves por repetição foram pesadas e sacrificadas para determinação do peso e rendimento de carcaça, peito com osso e pele e perna com osso e pele. Animais oriundos de ovos mais pesados obtiveram uma maior eclosão, peso ao nascimento e peso de fígado e intestino aos 00 dias. O peso aos 42 dias foi superior em aves oriundas de ovos pesados, produzindo uma carcaça e peito mais pesado, porém sem diferença de rendimento. Não houve diferença de conversão aos 42 dias de idade. Viabilidade de animais oriundos de ovos pesados foi superior de 00 a 07, 14 a 21 e 21 a 28 dias de idade, mas não afetou a viabilidade final. Peso do ovo não interferiu com o nível de anticorpos. As inoculações de soluções aos 18 dias de incubação obtiveram resultados variáveis dependendo do produto utilizado, tendo maior influência sobre altura de vilosidades e profundidade de criptas e sobre a produção de anticorpos. Não afetaram, entretanto, os parâmetros zootécnicos (ganho de peso, consumo de ração, conversão alimentar e viabilidade). A inoculação de produtos intra-ovo já é uma técnica possível de ser utilizada na avicultura industrial, entretanto, novos estudos devem ser ainda desenvolvidos no intuito de definir o melhor produto ou composto de produtos a ser utilizado / This trial had the objective to verify the influence of the in-ovo inoculation of ingredients at 18th day of incubation of eggs from different weights. Eggs from a broiler breeder flock with 30 weeks of age were separated in light and heavy eggs and were incubated in the same machine. At the 18th day of incubation, when the eggs were been transferred, they were inoculated with solutions of Maltose, Vitamins, Zinc-Glicine, Glutamine, mixture of all the ingredients and sodium chloride (control). The solutions were inoculated as Marek\'s vaccine diluter. After the eclosion, 2460 male chicks were send to the experimental house were they were divided on 60 boxes at a completely random design and a factorial 2x6 (two egg weigths and six solutions) design, summing 12 treatments with 5 repetitions of 40 chicks. One chick per repetition was sacrificed at 00, 07 and 21 days of age to weigth the yolk sac, intestine and liver. Samples of duodenum, jejunum and ileum were sent to histology to determinate villus high and cripts deep. Blood sample of the same birds were collected and sent to the laboratory to determinate anti body levels against reovirus and avian bronquitis. Animals and feed were weighted every week to determine the animal weight gain, feed consumption and feed conversion. At 43 days of age, 3 birds per repetition were weighted and sacrificed to determinate the carcass, breast and leg weight and yield. Animals from heavy eggs had a higher born weight, eclosion and liver and intestine weight at 00 days. At 42 days of age, birds from heavier eggs had a higher weight producing a heavier carcass and breast, but without yield variation. There was no difference on feed conversion at 42 days. Liveability of birds from heavier eggs were higher form 00 to 07, 14 to 21 and 21 to 28 days of age, but it didn\'t interfere the total livibility. Egg weight didn\'t interfere on the anti body level. The solutions inoculated at 18th day of incubation had variable results depending on the product utilized, influencing the villus height and cripts deep and anti body production. However, the solutions inoculation doesn\'t interfere on zoothecnical parameters as weight gain, feed consumption, feed conversion and livability. The in-ovo inoculation is a technique possible to be used on broiler production, however, new studies have to be done searching from the best product or ingredient to be used

Neste estudo focamos no papel de cinco transportadores da família ABC (ATP-binding cassete) envolvidos com a captação ativa de oligopeptídeos, poliaminas, fosfato inorgânico, glutamato e glutamina, em duas espécies bacterianas: Streptococcus mutans, que causa a cárie, e Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC), responsável por diarreias e síndrome hemolítica urêmica em humanos. Com relação a inativação do sistema de transporte de oligopeptídeos de S. mutans não observamos alteração do crescimento bacteriano ou da aderência à superfícies abióticas. A deleção do sistema de captação de poliaminas não interferiu com o crescimento em meio rico, porém aumentou a resistência à ambiente ácidos. Inativação do sistema de transporte de fosfato inorgânico reduziu a aderência de S. mutans. Sobre os sistemas de transporte de glutamato e glutamina, mutantes de S. mutans apresentaram alterações nas taxas de crescimento e adesão à superfícies. Inativação da proteína OppA de EHEC não afetou a produção da toxina Stx bem como a patogenicidade in vitro e in vivo de EHEC. Em suma, o presente estudo demonstra que o papel dos transportadores ABC na fisiologia e patogenicidade de bactérias pode variar de acordo com a espécies bem como com o substrato transportado. / This study focuses on the role of five ABC (ATP-binding cassette) transport systems related to active uptake of oligopeptides, polyamines, inorganic phosphate, glutamate and glutamine. In this work we study two bacterial species: Streptococcus mutans, which causes caries, and enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC), responsible for diarrhea and hemolytic uremic syndrome in humans. The inactivation of the S. mutans oligopeptide transport system did not change the bacterial growth and adherence to abiotic surfaces. Inactivation of the polyamine uptake system did not interfere with growth in rich medium, but increased the survival of bacteria in acid environments. Inactivation of the inorganic phosphate transport system reduced the adherence of S. mutans. Regarding the glutamate and glutamine transport systems, the S. mutans mutants showed changes in growth rates and adhesion to abiotic surfaces. Inactivation of the EHEC OppA protein, did not affect the production of the Stx toxin neither affected the in vitro and in vivo pathogenicity of the strain. Collectively, the present study shows that the roles of ABC transporters in the physiology and pathogenicity of bacteria may vary according to the species involved as well as the substrate transported.

A desnutrição proteico-energética (DPE) altera a hemopoese e, portanto, a geração de células imunológicas, bem como compromete o sistema imune. Desta forma, indivíduos desnutridos apresentam maior susceptibilidade a infecções. As células tronco mesenquimais (CTMs) possuem propriedades imunomodulatórias e são importantes na formação do estroma medular que sustenta a hemopoese. Visto que a L-glutamina (GLUT) é o aminoácido condicionalmente essencial mais consumido por CTMs, e que também apresenta capacidade imunomoduladora, investigou-se, neste trabalho, se a GLUT exerceria efeito sobre aspectos imunomodulatórios das CTMs em um modelo experimental de DPE. Para tanto, utilizou-se camundongos da linhagem BALB/c, os quais receberam rações normoproteica ou hipoproteica isocalóricas contendo, respectivamente, 12% e 2% de proteína por um período de 5 semanas. Após o isolamento e a caracterização de CTMs provenientes dos grupos controle (CTMct) e desnutrido (CTMdesn), cultivou-se essas células em 0, 0,6, 2 e 10mM GLUT, a fim de determinar a influência deste aminoácido sobre a expressão de fatores de transcrição e produção de citocinas por CTMct e CTMdesn. Adicionalmente, avaliou-se o efeito dos sobrenadantes das culturas de CTMct e CTMdesn sobre a proliferação e produção de citocinas por macrófagos e linfócitos esplênicos. Os animais desnutridos apresentaram anemia, leucopenia, hipoplasia medular e diminuição na concentração de proteínas séricas, albumina e préa-lbumina. A DPE não modificou a morfologia e o fenótipo das CTMs, bem como não alterou a expressão de proteínas reguladoras do ciclo celular. Por outro lado, a expressão de NFkB e STAT-3 e a produção de IL-1β, IL-6, IL-10 e TGF-β por CTMs foram alteradas pela DPE e variaram de acordo com as concentrações de GLUT testadas. O aumento na concentração de GLUT diminuiu a expressão de NFkB e induziu a expressão de STAT-3 por CTMs obtidas de ambos os grupos. Quanto a produção de citocinas por essas células, observou-se uma diminuição nos níveis de IL-β e IL-6 e uma elevação nos níveis de IL-10 e TGF-β com o aumento na concentração de GLUT. Variações na concentração desse aminoácido não alteraram a produção de IL-17 ou IFN-γ por CTMct e CTMdesn. Ademais, a concentração de GLUT alterou, de forma diretamente proporcional, a taxa de proliferação das CTMs. Os meios condicionados de CTMct e CTMdesn diminuíram a proliferação de macrófagos e linfócitos esplênicos estimulados com LPS, induziram aumento na produção da citocina antiinflamatória IL-10 por ambos os tipos celulares e diminuíram a produção das citocinas pró-inflamatórias IL-12 e TNF-α por macrófagos e IL-17 por linfócitos. Portanto, conclui-se que a GLUT possui efeito sobre a proliferação das CTMs, bem como a capacidade de imunomodular estas células. / Protein-energy malnutrition (PEM) alters hemopoiesis and, therefore, the generation of immune cells, and compromises the immune system. In this way, malnourished individuals are more susceptible to infections. Mesenchymal stem cells (MSCs) have immunomodulatory properties and are important in the formation of bone marrow stroma that supports hemopoiesis. Since L-glutamine (GLUT) is a conditionally essential amino acid, which is most consumed by MSCs, and present immunomodulatory capacity, this work investigated whether GLUT would have an effect on immunomodulatory aspects of MSCs in a PEM experimental model. For this purpose, BALB/c mice were used, which received isocaloric normoproteic or hypoproteic diets, containing respectively, 12% and 2% of protein for a period of 5 weeks. After isolation and characterization of MSCs from control (MSCct) and malnourished (MSCmaln) groups, these cells were cultured with 0, 0.6, 2 and GLUT 10mM in order to determine the influence of this amino acid on the expression of transcription factors and cytokine production by MSCct and MSCmaln. Besides that, the effect of MSCct and MSCmaln culture supernatants on proliferation and cytokine production by macrophages and splenic lymphocytes was evaluated. Malnourished animals presented anemia, leucopenia, marrow hypoplasia and decreased concentration of serum proteins, albumin and prealbumin. PEM did not change morphology and phenotype of MSCs or altered the expression of cell cycle regulatory proteins. On the other hand, the expression of NFkB and STAT-3 and the production of IL-1β, IL-6, IL-10 and TGF-β by MSCs were modified by PEM and varied according to the tested GLUT concentrations. An increase in GLUT concentration decreased NFkB expression and induced STAT-3 expression by MSCs obtained from both groups. Regarding the production of cytokines by these cells, an increase in GLUT concentration resulted in decreased IL-1β and IL-6 levels and increased IL- 10 and TGF-β levels. Changes in the concentration of this aminoacid did not alter IL- 17 or IFN-γ production by MSCct and MSCmaln. Furthermore, the concentration of GLUT changed, in direct proportion, the proliferation of MSCs. The conditioned media MSCct and MSCmaln decreased the proliferation of macrophages and splenic lymphocytes stimulated with LPS, induced an increase in the production of the antiinflammatory cytokine IL-10 by both cell types, and decreased the production of proinflammatory cytokines IL-12 and TNF-α by macrophages and IL-17 by lymphocytes. Therefore, it can be concluded that GLUT has an effect on the proliferation of MSCs and it has the capacity to immunomodulate these cells.

Este trabalho foi realizado com a finalidade de avaliar atividade da redutase do nitrato (RN), sintetase da glutamina (GS) e conteúdo de proteína total solúvel (PTS) em folhas de cafeeiro durante o desenvolvimento dos frutos em condições de campo. O experimento foi instalado em blocos ao acaso em esquema fatorial 3x6, constituído pela combinação de 3 doses de N (0, 150 e 350 kg ha-1) e avaliado em seis diferentes fases fenológicas (janeiro, fevereiro, março, abril, maio e junho), com sete repetições. No experimento foi utilizada a cultivar Catuaí Vermelho IAC 44 com seis anos implantada num Nitossolo Vermelho Eutroférrico, no município de Piracicaba-SP. Com relação à atividade da RN, GS e PTS em função das doses de N verificou incremento nos valores da atividade destas enzimas e do teor de proteína total solúvel em função da dose de N. As maiores atividades da RN foram obtidas no mês de janeiro (0,834, 1,370 e 1,781 µmol NO2 - g-1 MF h-1), bem como para a GS (82,47, 95,31 e 136,72 µmol γGH h-1 mg-1 PTS). O teor de proteína solúvel total (PTS) apresentou a mesma tendência (0,62, 5,66 e 6,52 mg mL-1). Estes valores foram obtidos em frutos na fase chumbinho. Durante o desenvolvimento dos frutos do cafeeiro a atividade das enzimas estudadas e o conteúdo de PTS foliar diminuíram, ao longo do tempo de janeiro a junho (maturação frutos). / The aim of this work was to evaluate the nitrate reductase (NR) and glutamine synthetase (GS) activity, total soluble protein content (PTS) in coffee leaves during the fruits development in field conditions. The study was carried out in ESALQ/USP (University of São Paulo), Piracicaba, São Paulo, Brazil in a Red Nitosol eutrofic. The experimental design was a complete randomized, in a factorial outline 3 x 6, constituted by combination of 3 levels (0, 150 and 350 kg ha-1) of nitrogen in six different periods (January, February, March, April, May and June) in plants (Cultivar Catuaí Vermelho IAC 44). The RN, GS activity and leaves PTS content was linear increased in relation of levels of N applied. In accordance with the present study, the enzymes had presented greater activity during the January than other months (0,834, 1,370 and 1,781 µmol NO2 - g-1 DF h-1) of RN; (82,47, 95,31 and 136,72 µmol γGH h-1 mg-1 PTS) of GS and (0,62, 5,66 and 6,52 mg mL-1) of total soluble protein (PTS), in the treatments T0, T1 and T2, respectively. In January, the fruits were young grains and this period the coffee plant has high enzymatic activity. However, the capacity of nitrate assimilation during the annual cycle of coffee plants can be change through the environment and climatic variations and this phase (January) was verified a great precipitation. During the coffee fruits development, the RN and GS activity and the foliar PTS content had decreased, this occur due to the process of senescence of leaves, promote it the remobilization to other plant organs, as seed filling.