Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-12-23T12:26:14Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 716349 bytes, checksum: 491af184849bdcb2477fa46e3081a75f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-23T12:26:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 716349 bytes, checksum: 491af184849bdcb2477fa46e3081a75f (MD5) Previous issue date: 2016-07-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os insetos respondem à infecção através da montagem de reações imunes do tipo celular e humoral. Os reguladores primários dessas respostas são células chamadas hemócitos, os quais medeiam importantes respostas celulares, incluindo a fagocitose, encapsulamento, nodulação, e também segregam fatores humorais, tais como opsoninas, fatores de melanização e peptídeos antimicrobianos. Os hemócitos circulam ao longo da hemocele (cavidade corporal do inseto) pelo fluxo rápido da hemolinfa (sangue), além disso, partes desses hemócitos também existem como células sésseis que estão associados aos tecidos. As larvas de Galleria mellonella são uma alternativa viável para os modelos tradicionais dos mamíferos para estudar a eficácia de drogas antimicrobianas e a patogênese de microrganismos in vivo. No entanto, apesar da sua importância como um modelo de infecção, aspectos biológicos sobre as células do sistema imunológico, tais como a densidade e dinâmica dos hemócitos das larvas são mal compreendidos. No presente trabalho, investigamos a resposta imune celular dos hemócitos circulantes das larvas de G. mellonella contra diferentes cepas da bactéria Gram-negativa Actinobacillus pleuropneumoniae: baixa virulência (780), alta virulência (1022), e cepas de referência do sorotipo 8 (R8). Os hemócitos foram classificados com base no seu tamanho, morfologia, coloração e seus papeis na resposta imune, incluindo cinco tipos: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos, esferulócitos, e oenocitóides. Contagem total de hemócitos, contagem diferencial de hemócitos, atividade dos fagolisossomos, resposta autofágica, viabilidade celular, e a ativação da caspase-3 (como indicador de apoptose) foram determinados em hemócitos circulantes provenientes de larvas desafiadas e controle. Demostramos pela primeira vez no modelo de G. mellonella que os plasmatócitos e granulócitos ativam suas respostas autofágicas através da formação dos autofagossomos após o contato com A. pleuropneumoniae. Além disso, nossos dados demonstram que a imunidade celular do presente modelo de infecção muda dependendo do grau de virulência das cepas bacterianas. / Insects respond to infection by mounting cellular and humoral immune reactions. The primary regulators of these immune responses are cells called hemocytes, which mediate important cellular immune responses including phagocytosis, encapsulation, nodulation and also secrete immune factors such as opsonins, melanization factors and antimicrobial peptides. Hemocytes circulate through the hemocoel (body cavity) by the swift flow of hemolymph (blood), and part of these hemocytes population are sessile and are attached to tissues. Larvae of Galleria mellonella is a widely used factitious host as a viable alternative to traditional mammalian models to study the efficacy of antimicrobial drugs and the microbial pathogenesis in vivo. However, despite their importance as an infection model, biological aspects about the immune cells, such as density and hemocyte dynamic of larvae are poorly understood. In the present study, we investigated the cellular immune response of hemocytes from G. mellonella larvae against three strains of the gram-negative bacterium Actinobacillus pleuropneumoniae: low virulent (780), high virulent (1022), and the serotype 8 reference strain (R8). Five types of larval hemocytes, prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes, oenocytoids, and spherulocytes, were distinguished according to size, morphology, detection by molecular probes, dye-staining properties, and their role in the immune response. Total hemocyte count, differential hemocyte count, lysosome activity, autophagic response, cell viability, and caspase-3 activation were determined in circulating hemocytes of naïve and infected larvae. Granulocytes and plasmatocytes were the major hemocyte types involved in the cellular defense against A. pleuropneumoniae; these hemocytes activated phagolysosome activities associated with an autophagic response against the bacteria. Moreover, our results showed that apoptosis in circulating hemocytes after exposure to virulent bacterial strains was related to an excessive autophagic cell death response induced by stress and subsequent caspase-3 activation.

Os invertebrados impedem o estabelecimento de uma infecção através de uma resposta imune eficiente. Esta resposta envolve reações celulares e humorais. Existem poucos trabalhos sobre a imunidade das aranhas. O principal objetivo deste estudo foi verificar o papel dos hemócitos e dos peptídeos antimicrobianos na resposta imune da aranha Acanthoscurria gomesiana. Inicialmente, a localização relativa da gomesina e da acanthoscurrina foi determinada, mostrando que 58% dos hemócitos armazenam os dois peptídeos antimicrobianos. Além disso, foi verificado que a gomesina é direcionada aos grânulos dos hemócitos da forma de pró-peptídeo. Observou-se ainda, que após um desafio, os hemócitos migram para o sítio de infecção, onde deve secretar componentes da cascata de coagulação e peptídeos antimicrobianos. Além disso, os resultados mostraram que a fagocitose não é o principal mecanismo ativado após uma infecção. Assim sendo, as principais respostas imunes da aranha são através da coagulação e secreção dos peptídeos antimicrobianos. / Invertebrates avoid the infection establishment through an efficient immune response. This response consists in cellular and humoral reactions. Few data are available concerning the spider\'s immunity. The main aim of this study was to determine the role of hemocytes and antimicrobial peptides on the immunity of the spider Acanthoscurria gomesiana. Initially, the localization of gomesin and acanthoscurrin was determined, showing that 58% of hemocytes store both antimicrobial peptides. Moreover, our results show that gomesin is addressed to the hemocyte granules as a pro-peptide. We also demonstrate, by in vivo and in vitro experiments, that hemocytes migrate to the site of microbial infection. Once at the site of infection, hemocytes might secrete components of coagulation cascade and antimicrobial peptides. Besides, our results suggest that phagocytosis is not the major defense mechanism activated after microbial challenge. Therefore the main reactions involved in the spider defense might be through the coagulation and antimicrobial peptides secretion.

Neste estudo avaliamos a ocorrência de fagocitose por parte de alguns tipos celulares presentes na hemolinfa do carrapato bovino B. microplus e a produção de espécies reativas de oxigênio durante a resposta imune. As técnicas empregadas para avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio foram luminescência amplificada por luminol, oxidação de fenol vermelho, microscopia de fluorescência e fluorimetria com o corante dihidrorrodamina 123 (DHR). Observamos um aumento da luminescência amplificada por luminol quando hemócitos foram incubados na presença de bactérias Micrococcus luteus ou zimosam ou PMA. Esta luminescência foi inibida por superóxido dismutase (SOD) e por catalase (CAT), enzimas antioxidantes que removem superóxido e peróxido de hidrogênio, respectivamente. LPS não elicitou aumento da luminescência dos hemócitos em relação ao controle. Através da oxidação de fenol vermelho em reação inibida por CAT, verificamos aumento nos níveis de H2O2 produzido pelos hemócitos quando estimulados com PMA e Micrococcus luteus, enquanto não houve aumento quando o estímulo foi LPS, corroborando os resultados da luminescência. Usando microscopia de fluorescência para avaliar a produção de ERO pelos hemócitos, encontramos que cerca de 25% dos hemócitos fluorescem com maior intensidade quando estimulados com zimosam, sendo esta fluorescência inibida por CAT. Através de fluorimetria usando DHR observamos um aumento na intensidade de fluorescência dos hemócitos estimulados com PMA em reação inibida por cisteína, substância redutora que remove peróxido de hidrogênio e peroxinitrito. Nosso conjunto de resultados permitem concluir que os hemócitos do carrapato bovino produzem espécies reativas de oxigênio durante a resposta imune, semelhantemente ao que ocorre em vertebrados e em invertebrados como moluscos, crustáceos e insetos. Este é o primeiro trabalho mostrando produção de ERO pelos hemócitos de aracnídeos. / The phagocytic activity and the reactive oxygen species (ROS) production during immune response of some hemocytes of the cattle tick Boophilus microplus were evaluated in this study. The ROS production was evaluated by luminol amplified luminescence, phenol red oxidation, dyhydrorhodamine (DHR) fluorescence microscopy and fluorimetry. The luminol-amplified luminescence increased when hemocytes were incubated with bacteria (Micrococcus luteus) or zymosam or phorbol 12-miristate 13 acetate (PMA). The superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), antioxidant enzymes that removes superoxide and hydrogen peroxide, respectively, inhibited this luminescence. Lipopolysaccharide (LPS) did not elicit luminescence of hemocytes in relation to controls. The catalase-inhibittable phenol red oxidation assay also showed an increase in the level of hydrogen peroxide produced by hemocytes stimulated with PMA or Micrococcus luteus. LPS did not stimulate the hemocytes, similarly to the observed by luminescence assay's. We also evaluated ROS production by fluorescence microscopy and we found approximately 25% more fluorescent hemocytes when zymosam was used. This fluorescence was inhibited by catalase. In DHR fluorimetry assay we observed an increase in the intensity of fluorescence in PMA stimulated hemocytes. This fluorescence was inhibited by cystein, a reducing agent that removes hydrogen peroxide and peroxinitrite. We conclude that hemocytes of the tick, like other invertebrate such as mollusks, crustaceans and insects and vertebrate, produce reactive oxygen species during the immune response. This is the first report of reactive oxygen species production by arachnid hemocytes.

As formigas-cortadeiras do gênero Atta são apontadas como os principais herbívoros da região Neotropical, sendo capazes de causar grandes danos à agricultura, às pastagens e à silvicultura em especial. No controle químico dessa praga, a tática mais usual e efetiva tem sido o uso de iscas granuladas tóxicas. Todavia, têm-se procurado métodos alternativos para o controle de cortadeiras, sobretudo por pressão de agências certificadoras de manejo florestal como o FSC (Forest Standarship Council). Recentemente, isolados de Trichoderma spp. começaram a ser testados no controle de formigas-cortadeiras em razão das suas propriedades antagonísticas ao fungo simbionte por elas cultivados. Além disso, destacam-se substâncias que têm o potencial de inibir a resposta imune inata dos insetos. Por exemplo, alguns elementos químicos como, cádmio e zinco. O presente trabalho objetivou o preparo de uma formulação com iscas granuladas e encapsuladas do fungo Trichoderma harzianum. Para encapsulação do fungo, utilizou-se uma mistura de alginato de sódio, farelo de trigo, suco concentrado de laranja e micélio triturado do antagonista. Esta mistura foi gotejada em solução (0,25 M) de CaCl2, o que permitiu a formação de grânulos esféricos de diâmetro regular. Paralelamente testou-se iscas contendo sulfato de zinco ZnSO4 (0,25 g/L), produzidas a partir da mistura de alginato, farelo de trigo e suco concentrado de laranja. Após o fornecimento das iscas fez-se a contagem total de hemócitos das operárias a fim de verificar alterações da sua resposta imune. Não ocorreu declínio na quantidade de hemócitos. Apesar das iscas não terem promovido a morte das colônias, elas apresentaram boa aceitação pelas operárias e promoveram a redução do volume do fungo simbionte. O cloreto e o sulfato de zinco foram empregados nas concentrações de 0,15; 0,25; 0,5; 1,5; 2;5 e 5;0 g/L em placas de Petri em meio BDA para o teste de desenvolvimento dos fungos simbionte e antagonista, e os resultados mostraram inibição no crescimento nas doses máximas tanto em Leucoagaricus gongylophorus como em Trichoderma harzianum. As operárias foram imersas em soluções de sulfato de zinco com as mesmas concentrações daquelas empregadas no teste de inibição dos fungos. Após o tempo de 24 e 48 horas fez-se a contagem total de hemócitos e verificou-se um decréscimo dos mesmos em altas concentrações. Conclui-se que as iscas contendo T. harzianum e sulfato de zinco apresentaram boa aceitação por parte das colônias, elas não promoveram a morte das colônias, no entanto, reduziram o volume do fungo simbionte. Altas doses de cloreto e sulfato de zinco inibem o desenvolvimento do fungo antagonista e do fungo simbionte e elevadas concentrações zinco e o maior tempo de exposição das operárias ao mesmo afetam o seu sistema imune. / The leaf-cutting ants of the genus Atta are cited as the main herbivores of the Neotropical region, being capable of causing major damage to agriculture, pasture and forestry in particular. In the chemical control of this plague, the most common and effective tactic has been the use of toxic granular baits. However, there have been alternative methods for control of cutting, especially by pressure certifying agencies forest management as the FSC (Forest Standarship Council). Recently, Trichoderma spp. They began to be tested in the control of leaf-cutting ants because of their antagonistic properties to the symbiotic fungus cultivated by them. Furthermore, they highlight substances that have the potential of inhibiting the innate immune response of the insects. For example, some chemical elements such as cadmium and zinc. This study aimed to the preparation of a formulation with granulated baits and encapsulated fungus Trichoderma harzianum. For encapsulation fungus, a mixture of sodium alginate was used wheat bran, concentrated orange juice and triturated antagonist mycelium. This mixture was dripped into solution (0,25 M) CaCl2, which allowed the formation of spherical granules of regular diameter. Parallel tested for baits containing zinc sulfate ZnSO4 (0,25 g/L) produced from the mixture of alginate, wheat bran and concentrated orange juice. After the supply of baits made up the total count of hemocytes of the workers in order to verify changes in their immune response. There was no decline in the amount of hemocytes. Despite the baits have not promoted the death of the colonies, they had good acceptance by workers and promoted the reduction of the symbiont fungus volume. Chloride and zinc sulfate were used in concentrations of 0.15; 0.25; 0.5; 1.5; 2, 5 and 5; 0 g /L in Petri dishes on PDA medium for the development and test of antagonist symbiont fungi, and the results showed growth inhibition in both maximal doses Leucoagaricus gongylophorus as Trichoderma harzianum. The ants were dipped in zinc sulfate solutions with the same concentrations of those employed in the fungal inhibition assay. After time 24 and 48 hours we made the total hemocytes count and there was a decrease in high concentrations thereof. We conclude that the baits containing T. harzianum and zinc sulfate showed good acceptance by the colonies, they did not promote the death of the colonies, however, reduced the volume of the symbiont fungus. High doses of zinc chloride and sulfate inhibit the development of the antagonist fungus and symbiont fungus and high concentrations of zinc and the longer exposure time of workers at the same affect your immune system.

Neste estudo avaliamos a ocorrência de fagocitose por parte de alguns tipos celulares presentes na hemolinfa do carrapato bovino B. microplus e a produção de espécies reativas de oxigênio durante a resposta imune. As técnicas empregadas para avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio foram luminescência amplificada por luminol, oxidação de fenol vermelho, microscopia de fluorescência e fluorimetria com o corante dihidrorrodamina 123 (DHR). Observamos um aumento da luminescência amplificada por luminol quando hemócitos foram incubados na presença de bactérias Micrococcus luteus ou zimosam ou PMA. Esta luminescência foi inibida por superóxido dismutase (SOD) e por catalase (CAT), enzimas antioxidantes que removem superóxido e peróxido de hidrogênio, respectivamente. LPS não elicitou aumento da luminescência dos hemócitos em relação ao controle. Através da oxidação de fenol vermelho em reação inibida por CAT, verificamos aumento nos níveis de H2O2 produzido pelos hemócitos quando estimulados com PMA e Micrococcus luteus, enquanto não houve aumento quando o estímulo foi LPS, corroborando os resultados da luminescência. Usando microscopia de fluorescência para avaliar a produção de ERO pelos hemócitos, encontramos que cerca de 25% dos hemócitos fluorescem com maior intensidade quando estimulados com zimosam, sendo esta fluorescência inibida por CAT. Através de fluorimetria usando DHR observamos um aumento na intensidade de fluorescência dos hemócitos estimulados com PMA em reação inibida por cisteína, substância redutora que remove peróxido de hidrogênio e peroxinitrito. Nosso conjunto de resultados permitem concluir que os hemócitos do carrapato bovino produzem espécies reativas de oxigênio durante a resposta imune, semelhantemente ao que ocorre em vertebrados e em invertebrados como moluscos, crustáceos e insetos. Este é o primeiro trabalho mostrando produção de ERO pelos hemócitos de aracnídeos. / The phagocytic activity and the reactive oxygen species (ROS) production during immune response of some hemocytes of the cattle tick Boophilus microplus were evaluated in this study. The ROS production was evaluated by luminol amplified luminescence, phenol red oxidation, dyhydrorhodamine (DHR) fluorescence microscopy and fluorimetry. The luminol-amplified luminescence increased when hemocytes were incubated with bacteria (Micrococcus luteus) or zymosam or phorbol 12-miristate 13 acetate (PMA). The superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), antioxidant enzymes that removes superoxide and hydrogen peroxide, respectively, inhibited this luminescence. Lipopolysaccharide (LPS) did not elicit luminescence of hemocytes in relation to controls. The catalase-inhibittable phenol red oxidation assay also showed an increase in the level of hydrogen peroxide produced by hemocytes stimulated with PMA or Micrococcus luteus. LPS did not stimulate the hemocytes, similarly to the observed by luminescence assay's. We also evaluated ROS production by fluorescence microscopy and we found approximately 25% more fluorescent hemocytes when zymosam was used. This fluorescence was inhibited by catalase. In DHR fluorimetry assay we observed an increase in the intensity of fluorescence in PMA stimulated hemocytes. This fluorescence was inhibited by cystein, a reducing agent that removes hydrogen peroxide and peroxinitrite. We conclude that hemocytes of the tick, like other invertebrate such as mollusks, crustaceans and insects and vertebrate, produce reactive oxygen species during the immune response. This is the first report of reactive oxygen species production by arachnid hemocytes.

Os invertebrados impedem o estabelecimento de uma infecção através de uma resposta imune eficiente. Esta resposta envolve reações celulares e humorais. Existem poucos trabalhos sobre a imunidade das aranhas. O principal objetivo deste estudo foi verificar o papel dos hemócitos e dos peptídeos antimicrobianos na resposta imune da aranha Acanthoscurria gomesiana. Inicialmente, a localização relativa da gomesina e da acanthoscurrina foi determinada, mostrando que 58% dos hemócitos armazenam os dois peptídeos antimicrobianos. Além disso, foi verificado que a gomesina é direcionada aos grânulos dos hemócitos da forma de pró-peptídeo. Observou-se ainda, que após um desafio, os hemócitos migram para o sítio de infecção, onde deve secretar componentes da cascata de coagulação e peptídeos antimicrobianos. Além disso, os resultados mostraram que a fagocitose não é o principal mecanismo ativado após uma infecção. Assim sendo, as principais respostas imunes da aranha são através da coagulação e secreção dos peptídeos antimicrobianos. / Invertebrates avoid the infection establishment through an efficient immune response. This response consists in cellular and humoral reactions. Few data are available concerning the spider\'s immunity. The main aim of this study was to determine the role of hemocytes and antimicrobial peptides on the immunity of the spider Acanthoscurria gomesiana. Initially, the localization of gomesin and acanthoscurrin was determined, showing that 58% of hemocytes store both antimicrobial peptides. Moreover, our results show that gomesin is addressed to the hemocyte granules as a pro-peptide. We also demonstrate, by in vivo and in vitro experiments, that hemocytes migrate to the site of microbial infection. Once at the site of infection, hemocytes might secrete components of coagulation cascade and antimicrobial peptides. Besides, our results suggest that phagocytosis is not the major defense mechanism activated after microbial challenge. Therefore the main reactions involved in the spider defense might be through the coagulation and antimicrobial peptides secretion.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-09-05T17:16:10Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Elisabeth Korte Stein - 2017.pdf: 1890648 bytes, checksum: 23075cfcc3f4fb866b17fa8be2766d80 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-09-15T15:14:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Elisabeth Korte Stein - 2017.pdf: 1890648 bytes, checksum: 23075cfcc3f4fb866b17fa8be2766d80 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T15:14:56Z (GMT). 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In order to develop alternative methods to control M. domestica, this study investigated Bacillus thuringiensis strains able to act as promising biological control agents. Twenty two strains of B. thuringiensis were tested in a screening assay for selecting the most virulent ones; one third of them were virulent to M. domestica larva, and two of them were selected for the next tests. Bioassays were conducted with the strains S601 and S599 to determine the larval treatment efficiency; they showed efficiency to control larva of M. domestica in all concentrations tested. The current study also characterized the hemocytes from hemolymph of larva of M. domestica by their identification and quantification; also, we evaluated the effect of the strain S599 of B. thuringiensis infection to the total hemocytes counts, and number and size of hemocyte types, using optical microscopy. Collections were made at the times of 12, 24, 48 and 72 hrs. Five hemocyte types were found: prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes, oenocytoids and spherulocytes, in which plasmatocytes were found in superior number. Prohemocytes were the smallest cells observed, and oenocytoids were the biggest ones. The treatment of M. domestica larva with B. thuringiensis did not change morpholigical characteristics of hemocytes, as well as it did not modify the counts of hemocyte types. The total number of hemocytes in the hemolymph, however, increased significantly 48 hours after the larval treatment. B. thuringiensis strains selected in the current study are promising agents for biological control of M. domestica. / Musca domestica é considerada umas das pragas mais prejudiciais à produção intensiva de aves poedeiras devido seu alto poder reprodutivo e elevado potencial de agir como vetor mecânico de vários agentes causadores de doenças. Atualmente a sociedade vem procurando novas formas de controle de pragas, já que o uso constante e indiscriminado de produtos químicos tem levado a casos de intoxicação em humanos e animais, além de selecionar populações cada vez mais resistentes, deixar resíduos no ambiente e nos alimentos e prejudicar insetos importantes para o equilíbrio biológico. No intuito de desenvolver outra forma de controle para M. domestica, o presente trabalho selecionou estirpes de Bacillus thuringiensis promissoras para atuarem como agentes de biocontrole de M. domestica. Dessa forma, no teste seletivo foram testadas 22 estirpes de B. thuringiensis, onde duas mostraram-se virulentas para larvas da mosca. Bioensaios para determinação de eficácia do tratamento larval foram realizados e as estirpes testadas (S601 e S599) mostraram-se promissoras para o controle de larvas de M. domestica em todas as concentrações testadas (20; 15; 10; 5; 1; 0,5; 0,25; 0,125mg/g). Em outra etapa, o estudo caracterizou os hemócitos da hemolinfa de larvas de M. domestica por identificação e quantificação dos tipos celulares presentes na hemolinfa, estudou ainda o efeito do tratamento com a estirpe S599 de B. thuringiensis na contagem total das células, contagem diferencial celular e no tamanho das células, utilizando-se para esta finalidade a microscopia ótica. Realizou-se coletas nos tempos de 12, 24, 48 e 72 hrs. Foram encontrados cinco tipos celulares: pró-hemócitos, plasmatócitos, granulócitos, oenocitoides e esferulócitos, sendo os plasmatócitos as células em maior número, os pró-hemócitos as menores células encontradas e os oenocitoides as maiores células encontradas. O tratamento com B. thuringiensis não alterou as características morfológicas dos hemócitos, assim como não alterou a contagem diferencial das células; no entanto, o número total de hemócitos na hemolinfa aumentou significativamente 48 horas após tratamento das larvas. As estirpes de B. thuringiensis selecionadas são possíveis agentes de biocontrole de M. domestica.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-24T15:20:41Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 490085 bytes, checksum: aee05299fbca9ca829816b7f973e717d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-24T15:20:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 490085 bytes, checksum: aee05299fbca9ca829816b7f973e717d (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A monocultura reduz o equilíbrio ambiental, o que favorece o surgimento de pragas. O uso de biopesticidas no controle biológico é uma alternativa eficiente, mas pode afetar inimigos naturais, o que tem motivado a busca de métodos seletivos aos organismos alvo. Insetos têm sistema imunológico para combater entomopatógenos, mas a tolerância e a dinâmica do sistema imune em vespas sociais são, ainda, pouco conhecidas. Vespas sociais são predadores importantes no controle biológico e estão em constante contato com organismos entomopatogênicos. O objetivo do trabalho foi caracterizar as células da hemolinfa de fêmeas adultas de Polybia platycephala Richards (Hymenoptera: Vespidae) e avaliar o impacto dos fungos Beauveria bassiana (isolado ESALQ PL 63) e Metarhizium anisopliae (isolado ESALQ E9) na sobrevivência e na resposta hemocitária desta vespa social. A descrição morfológica dos hemócitos foi realizada por meio de microscopia de luz. Alterações na sobrevivência e dinâmica hemocitária de P. platycephala foram estudadas em duas categorias: 1) diferentes concentrações de solução fúngica e 2) diferentes intervalos de tempo. Quatro tipos de hemócitos foram identificados durante a descrição da morfologia dessas células: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e oenocitóides. Os hemócitos de P. platycephala apresentaram o mesmo padrão morfológico de outras espécies da ordem Hymenoptera. Nas maiores concentrações de M. anisopliae no tratamento tópico (1 x 108 e 1 x 109 esporos/mL) reduziram a sobrevivência e o número de granulócitos e prohemócitos de P. platycephala. O fungo B. bassiana foi patogênico em todas as concentrações testadas por contato, diminuindo a sobrevivência e o número de granulócitos de P. platycephala. Nos tratamentos por ingestão, B. bassiana mostrou-se patogênico com 1 x 109 esporos/mL. Metarhizium anisopliae (isolado ESALQ E9) não reduziu a sobrevivência das vespas nas concentrações 1 x 106 e 1 x 107 esporos/mL, o que é importante para programas de manejo integrado de pragas. No entanto, o impacto negativo de B. bassiana (isolado ESALQ PL 63) em todas as concentrações testadas indica a incompatibilidade deste fungo com P. platycephala. / Monoculture reduces the environmental equilibrium, which favors the emergence of pests. The use of biopesticides in biological control is an effective alternative, but can affect natural enemies, which has motivated the search for selective methods to target organisms. Insects have immune system to defend against entomopathogen, but tolerance and the dynamics of the immune system in social wasps are still little known. Social wasps are important predators in biological control and are in constant contact with entomopathogenic organisms. The aim of the study was to identify and characterize the hemolymph cells of adult female Polybia platycephala Richards (Hymenoptera: Vespidae) and evaluate the impact of fungi Beauveria bassiana (isolated ESALQ PL 63) and Metarhizium anisopliae (isolated ESALQ E9) on survival and response hemocyte this social wasp. The morphological description of the hemocytes was performed by light microscopy. The dynamic changes in survival of P. platycephala hemocyte were studied in two categories: 1) different concentrations of fungal solution and 2) different time intervals. Four types of hemocytes were identified during the description of the morphology of these cells: prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes and oenocytoids cells. The hemocytes of P. platycephala showed the same morphological pattern of other species of Hymenoptera. M. anisopliae high concentrations in the topical treatment (1 x 108 and 1 x 109 spores/ml) decreased survival and the number of granulocytes and prohemocytes P. platycephala. B. bassiana is pathogenic at all concentrations by contact, reducing the survival and the granulocyte number of P. platycephala. In the treatments if swallowed, B. bassiana was shown to be pathogenic to 1 x 109 spores/mL. Metarhizium anisopliae (isolated ESALQ E9) did not reduce the survival of wasps in low concentrations, which is important for integrated pest management programs. However, the negative impact of B. bassiana (isolated ESALQ 63) at all concentrations tested indicates incompatibility this fungus with P. platycephala.

Submitted by Stephany Silva (stephany.silva@cpqam.fiocruz.br) on 2016-09-16T13:23:38Z No. of bitstreams: 1 2016portela-junior-nc.pdf: 1366854 bytes, checksum: b935336bcc69c9cc7ad7b64725f9fb61 (MD5) / Approved for entry into archive by Adagilson Silva (adagilson@cpqam.fiocruz.br) on 2016-09-16T19:29:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016portela-junior-nc.pdf: 1366854 bytes, checksum: b935336bcc69c9cc7ad7b64725f9fb61 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T19:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016portela-junior-nc.pdf: 1366854 bytes, checksum: b935336bcc69c9cc7ad7b64725f9fb61 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O gênero Biomphalaria possui espécies de grande relevância médica uma vez que atuam como hospedeiros intermediários naturais do parasita Schistosoma mansoni, causador da esquistossomose. Dentro desse gênero de moluscos, três espécies são tidas como hospedeiros naturais do parasita, Biomphalaria glabrata, B. straminea e B. tenagophila. O perfil de suscetibilidade à infecção por S. mansoni dentro do gênero é muito variado e muitas pesquisas buscam elucidar a dinâmica da relação parasita-hospedeiro intermediário na finalidade de criar novas medidas de controle da doença. Por isso, esse estudo tem como objetivo determinar o perfil bidimensional de proteínas que podem estar envolvidas na resposta imune contra o S. mansoni comparando duas espécies com diferentes perfis de susceptibilidade B. glabrata, B. straminea além de uma refratária ao S. mansoni, a B. straminea R3. Para isso, os caramujos de cada espécie foram divididos em dois grupos: Infectado, expostos aos miracídios do S. mansoni; e Controle, submetidos ao estresse do processo de infecção livre de miracídios. A hemolinfa foi retirada 24 horas após a exposição. Foi feito o extrato proteico total e determinada a concentração das proteínas totais para cada grupo investigado. As proteínas foram separadas por eletroforese bidimensional onde foi obtido o ponto isoelétrico e peso molecular de todos os spots nos géis. Estes géis foram comparados entre as condições expostos e não expostos ao parasita e os spots que se mostraram diferenciais foram utilizados para uma busca por homologia em bancos de dados de proteínas já descritas. Na dosagem proteica, a espécie B. glabrata se mostrou estável nas duas condições, enquanto que podemos observar aumento na concentração proteica nas duas linhagens de B. straminea. A presença de diversas proteínas homólogas envolvidas em processos metabólicos de adesão e reconhecimento celular, homeostase de ions entre outras relacionadas à resposta imune foram identificadas entre as espécies e na linhagem resistente (AU)

Universidade Federal de Uberlândia / CHAPTER II: Infection in insects stimulates a complex defensive response. Recognition of pathogens may be accomplished by plasma or hemocyte proteins that bind specifically to bacterial or fungal polysaccharides. Several morphologically distinct hemocyte cell types cooperate in the immune response. Hemocytes attach to invading organisms and then isolate them by phagocytosis, by trapping them in hemocyte aggregates called nodules, or by forming an organized multicellular capsule around large parasites. In the current investigation the cellular population in the hemolymph third instar larvae of M. scutellaris has been characterized by means of light microscopy analysis and phagocytosis assays were performed in vivo by injection of 0,5μm fluorescence beads in order to identify the hemocyte types involved in phagocytosis. Four morphotypes of circulating hemocytes were found in 3rd instar larvae: prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes and oenocytoids. The results presented plasmatocytes and granulocytes involved in phagocytic response of foreign particles in 3rd instar larvae of M. scutellaris. CHAPTER III: Insects are continuously exposed to potentially pathogenic microorganisms and eukaryotic parasites, but only a few encounters result in infection. Insects possess a complex and efficient system of biological defense against pathogens and parasites. This system involves the following: the integument and gut as physical barriers to infection, coordinated responses of several subpopulations of hemocytes when these barriers are breached, and the induced synthesis of antimicrobial peptides and proteins, primarily by the fat body. The purpose in the present study was to verify a Toll receptor (MsToll) expression in Melipona scutellaris. By semiquantitative RT-PCR we evaluate the MsToll levels at different development stages and in different M. scutellaris workers tissues. The MsToll expression in the immune response was evaluated by real time RT-PCR in workers infected with Escherichia coli (gram-negative). Our data showed lower MsToll expression in the larval stage compared with other development stages. The specific tissue analysis showed that its expression in intestine was significantly higher compared with other tissues analyzed. Furthermore, the MsToll levels in innate immune response of M. scutellaris showed four folds enhanced in bees infected with E. coli compared with control. / CAPITULO II: Infecção em insetos estimula uma resposta defensiva complexa. O reconhecimento de patógenos pode ser realizado pelos hemócitos ou proteínas que se ligam especificamente em microorganismos com padrões moleculares específicos, os chamados (PAMPs). Diferentes células da hemolinfa cooperam na resposta imune. Os hemócitos reconhecem os patógenos e os isolam por fagocitose, formando nódulos ou, cápsula multicelular em torno do parasita. Nesse trabalho foram identificadas as células da hemolinfa da abelha sem ferrão Melipona scutellaris e caracterizados os hemócitos envolvidos no processo de fagocitose utilizando beads de 0,5μm de diâmetro, em média, com fluorescência vermelha. Na hemolinfa do 3° instar larval de M. scutellaris foram distinguidos quatro tipos de hemócitos: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e oenocitóides. No ensaio de fagocitose foram identificados plasmatócitos e granulócitos, com beads fluorescentes fagocitados no citoplasma. CAPITULO III: Insetos são continuamente expostos a microrganismos potencialmente patogênicos, mas apenas alguns contatos resultam em infecção. Insetos possuem um complexo e eficiente sistema de defesa contra patógenos e parasitas, que envolve o tegumento e intestino como barreiras físicas para infecção; respostas coordenadas de vários tipos de hemócitos quando estas barreiras são violadas e a síntese de peptídeos antimicrobianos e proteínas, principalmente pelo corpo gorduroso. Nosso objetivo foi clonar e sequenciar parcialmente um gene do sistema imune inato MsToll da abelha Melipona scutellaris. Por análises de RT-PCR semiquantitativo avaliou-se os níveis de expressão de MsToll em diferentes estágios do desenvolvimento e em diferentes tecidos de operárias de M. scutellaris. A expressão de MsToll na resposta imune foi avaliada por RT-PCR tempo real em operarias infectadas com Escherichia coli (gram-negativa). Os resultados mostraram menor expressão do gene MsToll nos estágios larvais quando comparados com os demais estágios do desenvolvimento. A análise tecido específico de MsToll mostrou que em intestino sua expressão foi significativamente maior quando relacionado com os demais tecidos analisados. Com relação aos níveis de MsToll na resposta imune observou-se o aumentou de quatro vezes dos níveis desse transcrito em abelhas infectadas com E. coli comparadas com o controle. / Mestre em Genética e Bioquímica