Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-05T11:27:00Z No. of bitstreams: 1 alinespagnolfedoce.pdf: 675452 bytes, checksum: 4344f40e93111c7814a7762ac2f2a71a (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-10-05T11:33:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alinespagnolfedoce.pdf: 675452 bytes, checksum: 4344f40e93111c7814a7762ac2f2a71a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T11:33:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alinespagnolfedoce.pdf: 675452 bytes, checksum: 4344f40e93111c7814a7762ac2f2a71a (MD5) Previous issue date: 2010-07-29 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A síndrome metabólica (SM) é caracterizada por um grupo de distúrbios que predispõe a doenças cardiovasculares e ao diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Obesidade abdominal, resistência à insulina, hipertensão, dislipidemia e um estado pró-inflamatório crônico são os principais componentes desta síndrome. Uma correlação bidirecional entre a SM e a periodontite tem sido sugerida, a partir do estado pró-inflamatório crônico. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da hiperglicemia no desenvolvimento da periodontite crônica e nos níveis séricos de interleucina-10, em indivíduos portadores de SM. Foram avaliados 30 indivíduos distribuídos em três grupos: NSM (não portadores de SM; n= 10); SMNG (portadores de SM normoglicêmicos; n= 10) e SMHG (portadores de SM hiperglicêmicos; n=10). A condição periodontal (profundidade de bolsa (PB), perda de inserção clínica (PIC), índice de placa (IP), sangramento a sondagem (SS) e número de dentes perdidos) e a condição metabólica (exames antropométricos e laboratoriais: glicemia em jejum (GJ), teste oral de intolerância a glicose (TOTG), colesterol HDL e triglicérides (TG)) foram avaliados em cada indivíduo. Os resultados demonstram que os indivíduos do grupo SMHG apresentam porcentagem de sítios com PIC ≥ 3 mm, PIC ≥ 5 mm; PB ≥ 3 mm, IP, SS e número de dentes ausentes mais elevados em relação aos indivíduos do grupo SMNG, esta diferença, porém, não foi estatisticamente significativa. No grupo SMHG, os indivíduos portadores de DM (n= 5) apresentaram porcentagem de sítios com PIC ≥ 5 mm estaticamente superior aos indivíduos pré diabéticos (p= 0,016). A porcentagem de sítios com PIC ≥ 5 mm foi correlacionada positivamente com os níveis de glicemia em jejum. Os indivíduos portadores de SM apresentaram níveis séricos de interleucina-10 mais elevados e diferiram estatisticamente dos indivíduos não portadores de SM (p= 0,003). O presente estudo sugere que a hiperglicemia influencia a gravidade da periodontite crônica e que os níveis aumentados de interleucina-10 estão relacionados com a SM, independente da condição glicêmica. / The metabolic syndrome (MS) is caracterized by a group of disorders that predisposes to cardiovascular diseases and to type 2 diabetes mellitus (T2DM). Abdominal obesity, insulin resistance, hypertension, dyslipidemia and a chronic proinflammatory state are the main components of this syndrome. A bidirectional correlation between MS and periodontitis has been suggested, from the chronic proinflammatory state. The aim of this study was to evaluate the influence of hyperglycemia on the development of chronic periodontitis and serum levels of interleukin-10 in individuals with MS. 30 individuals divided into three groups: NSM (non-MS patients, n = 10); SMNG (normoglycemic patients with MS, n = 10) and SMHG (hyperglycemic patients with MS, n = 10). The periodontal status (pocket depth (PD), clinical attachment loss (CAL), plaque index (PI), bleeding on probing (BOP) and number of missing teeth) and metabolic status (anthropometric and laboratory tests: fasting glucose (FG), oral test of impaired glucose tolerance (OGTT), HDL cholesterol and triglycerides (TG)) were evaluated in each individual. The results show that SMHG group subjects present higher percentage of sites with CAL ≥ 3 mm, CAL ≥ 5 mm, PD ≥ 3 mm, IP, SS and missing teeth than subjetcs in SMNG group, this difference however, was not statistically significant. In group SMHG, subjects with T2DM (n = 5) showed greater percentage of sites with CAL ≥ 5 mm than pre-diabetic subjects (p = 0.016). The percentage of sites with CAL ≥ 5 mm was positively correlated with levels of fasting blood glucose. Individuals with MS showed serum levels of interleukin-10 increased and differed significantly from the NMS group (p = 0.003). The present study suggests that hyperglycemia influences the severity of chronic periodontitis and that increased levels of interleukin-10 are related to the SM, independently on the glycemic status.

Objetivo Avaliar, em indivíduos com diabetes (DM), a resposta de glicose e triglicerídeos duas horas após a ingestão de uma carga alimentar (CA) e sua associação com características clínicas e a presença de doenças crônicas. Metodologia Foram incluídos 915 indivíduos com DM, participantes da linha de base do estudo ELSA-Brasil. Coleta de sangue foi realizada em jejum e duas horas após o consumo da CA, contendo 455 kcal; 14 g de gordura saturada e 47 g de carboidratos. Regressão linear foi utilizada para investigar preditores dos níveis de excursão (diferença entre níveis pós-carga e de jejum) de glicemia e trigliceridemia (variáveis dependentes). Regressão logística foi realizada para descrever a associação da excursão de glicemia e trigliceridemia (variáveis independentes) e a presença de complicações do DM (doença coronariana, infarto, angina, acidente vascular cerebral, ou insuficiência cardíaca). Resultados A mediana da glicemia de jejum foi de 150 (123–198) mg/dL e da excursão de glicose foi 45 (16–79) mg/dL, enquanto que a trigliceridemia de jejum foi de 140 (103–199) mg/dL e a excursão de triglicerídeos foi de 26 (11–45) mg/dL. Maiores excursões de glicemia foram associadas com duração do DM (incremento de 5,7 mg/dL, IC95% 3,7–7,6, a cada 5 anos de doença), uso de insulina (58,5 mg/dL, IC95% 45,43–71,55), outro medicamento para DM (13,6 mg/dL, IC95% 2,5–24,8), idade (4,1 mg/dL, IC95% 0,43–7,69, a cada 10 anos), nível de glicose basal (5,2 mg/dL, IC95% 1,0–4,1, a cada 25 mg/dL); o índice de massa corporal associou-se a menor excursão (-6,8 mg/dL, IC95% -9,7 a -3,85, a cada 5 kg/m²). Maior excursão de trigliceridemia esteve associada com glicemia em jejum (2,5 mg/dL, IC95% 1,64–3,38, a cada 25 mg/dL), e menor excursão associada com triglicerídeos de jejum (-2,97 mg/dL, IC95% -3,24 – -2,69, a cada 25 mg/dL). Conclusão A resposta pós-prandial esteve associada ao tempo de doença, à necessidade de insulina ou outro medicamento para DM, ao índice de massa corporal, além da idade e níveis basais de glicose e triglicerídeos. As excursões de glicose e triglicerídeos estiveram associadas a presença de comorbidades potencialmente tidas como complicações do DM. / Objective We aimed to assess, in individuals with diabetes (DM), the excursions of glucose and triglyceride levels two hours after consumption of a food load (FL) and their association with clinical characteristics and the presence of chronic diseases. Design and Methods We included 915 subjects with DM, participants of in the ELSA-Brazil cohort. Blood sampling was performed at fasting and two hours after consumption of a 455 kcal, 14 g saturated fat and 47 g carbohydrate FL. Linear regression was used to investigate predictors of levels of excursion (difference between post-load and fasting levels) of glucose and triglycerides (dependent variables). Logistic regression was performed to describe the association of glucose excursion and triglycerides excursion (independent variables) and the presence of DM complications (coronary heart disease, myocardial infarction, angina pectoris, stroke, or heart failure). Results The median fasting glucose was 150 (123-198) mg/dL and glucose excursion was 45 (16-79) mg/dL, whereas fasting triglycerides was 140 (103-199) mg/dL and triglycerides excursion was 26 (11-45) mg/dL. Increase of glucose excursion were associated with DM duration (increase of 5.7 mg/dL, 95% CI 3.7 to 7.6, each 5 years of disease), insulin use (58.5 mg/dL, 95% CI 45.43 to 71.55), use of another drug for DM (13.6 mg/dL , 95% CI 2.5 to 24.8), age (4.1 mg/dL, 95% CI 0.43 to 7.69, each 10 years), fasting glucose (5.2 mg/dL, 95% CI 1.0 to 4.1, each 25 mg/dL) and body mass index (-6.8 mg/dL, 95% CI -9.7 to -3.85, each 5 kg/m²). The triglycerides excursion was associated with fasting glucose (2.5 mg/dL, 95% CI 1.64 to 3.38, each 25 mg/dL) and fasting triglycerides (-2.97 mg/dL, 95% CI -3.24 to -2.69, each 25 mg/dL). In logistic regression models adjusting for gender, age, fasting glucose, duration of diabetes, use of insulin and/or other drug for DM, the excursion of glucose was marginally associated with the presence of any complication of diabetes and coronary heart disease. Conclusion Greater glycemic postprandial response was positively associated with indicators of less pancreatic reserve and negatively associated with obesity, while and the size of the response in triglycerides presented only minimal associations. Associations of excursion size with diabetes complications were present.

A incidência de doenças crônicas não transmissíveis como a diabetes tipo 2 e complicações cardiovasculares tem aumentado significativamente, e tem-se associado principalmente às mudanças nos hábitos alimentares tradicionais. O objetivo do presente estudo foi caracterizar diferentes cultivares de feijão, lupino e grãos da região dos Andes quanto a seus compostos fenólicos antioxidantes, capacidade antioxidante e potencial anti-hiperglicêmico e anti-hipertensivo in vitro. Dependendo do tipo de cultivar, o feijão é uma fonte promissora de taninos condensados, antocianinas, e flavonóis; enquanto que o lupino andino destacou-se pela presença de isoflavonas. Após o tratamento térmico, o feijão e lupino andino inibiram significativamente a enzima conversora da angiotensina I, relevante na prevenção da hipertensão, enquanto o milho roxo andino inibiu a α-glicosidase, relevante na prevenção da hiperglicemia. Uma combinação apropriada de grãos tradicionais como parte da dieta poderia contribuir na modulação dos níveis de glicose e na prevenção das complicações relacionadas ao desequilíbrio óxido-redução. / Incidence of chronic diseases such as diabetes type 2 and related cardiovascular complications has increased significantly due mainly to current changes in traditional food dietary habits. The objective of this study was to characterize several bean and lupin cultivars along with grains from the Andean region in relation to their phenolic compounds, antioxidant capacity and anti-diabetes and anti-hypertension potential using in vitro assays. Depending on the cultivar, beans are interesting sources of condensed tannins, anthocyanins and flavonols, whereas major phenolic compounds in Andean lupins were isoflavones. Following thermal treatment, selected beans and Andean lupins inhibited significantly the hypertension relevant angiotensin I-converting enzyme and among Andean grains, the purple corn inhibited the hyperglycemia relevant α-glucosidase. A good combination of traditional grains as a part of the overall diet can contribute to effective dietary strategies for managing Type 2 diabetes and associated complications linked to unbalanced cellular redox status.

O diabetes mellitus é um grupo heterogêneo de distúrbios metabólicos caracterizado pela hiperglicemia. Indivíduos diabéticos possuem maior susceptibilidade a infecções comparado a indivíduos sadios e a hiperglicemia é um dos principais fatores que contribuem para isso, em parte, por alterar a resposta imune. Sendo assim, os macrófagos, como células essenciais para a resposta inflamatória, podem apresentar importante papel na resposta imune alterada de indivíduos diabéticos. Neste estudo, investigamos como a hiperglicemia modula os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) sob um estímulo inflamatório. Para realizar este estudo, os BMDMs de camundongos C57BL/6 machos não diabéticos e diabéticos (60 mg/kg de aloxana, iv) (CEUA / FCF / USP-488) foram cultivados sob condições normais de glicose (5,5 mM) e alta concentração de glicose (25 mM ou 40 mM) e estimuladas ou não com lipopolissacarídeo (LPS, 100 ng/mL). Em comparação com os BMDMs dos camundongos não diabéticos, os BMDMs dos camundongos diabéticos estimulados com LPS apresentaram menor expressão de CD38 no tempo basal e após 24 horas, além de menor expressão de receptor do tipo Toll (TLR)-4 na superfície celular, menor capacidade fagocítica e redução na secreção de óxido nítrico, lactato, fator de necrose tumoral- e interleucina (IL)-10, porém apresentaram maior expressão de CD80, CD86 e MHC-II, maior consumo de oxigênio e maior fosforilação em quinase ativada por estresse/quinase Jun-amino-terminal (SAPK/JNK) subunidade p46 e em quinase regulada por sinal extracelular (ERK) subunidade p42, proteína quinase B (AKT) e proteína quinase C (PKC)-δ assim como maior secreção de IL-6. Quando os BMDMs dos camundongos não diabéticos foram cultivados sob condições de alta concentração de glicose in vitro e estimulados com LPS, a expressão de TLR4 e os níveis de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio foram reduzidos. Por outro lado, os BMDMs diabéticos que também foram cultivados em alta concentração de glicose in vitro apresentaram níveis aumentados de lactato e fosforilação reduzida em AKT e PKC-δ, porém apresentaram fosforilação aumentada em p46 SAPK/JNK. A alta concentração de glicose parece modificar o comportamento dos macrófagos, afetando diferentes aspectos dos BMDMs diabéticos e não diabéticos sob estímulo de LPS, assim a hiperglicemia deixa um legado de glicose, induzindo uma memória glicêmica, alterando o estado basal dos macrófagos, modificando a via de sinalização do TLR4 contribuindo para a susceptibilidade de indivíduos diabéticos a infecções. / Diabetes mellitus is a heterogeneous group of metabolic disorders characterized by hyperglycemia. Diabetic individuals are more susceptible to infections compared to healthy subjects, and hyperglycemia is one of the major contributing factors, partly because they alter the immune response. Thus, macrophages, as essential cells for the inflammatory response, may play an important role in the altered immune response of diabetic individuals. In this study, we investigated how hyperglycemia modulates bone marrow derived macrophages (BMDMs) under an inflammatory stimulus. To perform this study, BMDMs from non-diabetic male and diabetic C57BL/6 mice (60 mg / kg aloxane, iv) (CEUA / FCF / USP-488) were cultured under normal glucose conditions (5.5 mM) and high glucose concentration (25 mM or 40 mM) and stimulated or not with lipopolysaccharide (LPS, 100 ng / ml). Compared to non-diabetic mice BMDMs, the BMDMs of LPS-stimulated diabetic mice showed lower expression of CD38 at baseline and after 24 hours, as well as lower Toll-like receptor (TLR)-4 on the cell surface, lower secretion of lactate, tumor necrosis factor-, and interleukin (IL)-10, but showed higher expression of CD80, CD86 and MHC-II, higher oxygen consumption and greater phosphorylation in stress-activated kinase/Jun-amino-terminal kinase (SAPK / JNK) p46 subunit and in extracellular signal regulated kinase (ERK) p42 subunit, protein kinase B (AKT) and protein kinase C (PKC)-δ as well as higher secretion of IL-6. When the BMDMs of nondiabetic mice were cultured under conditions of in vitro high glucose concentration and stimulated with LPS, the levels of TLR4 expression, nitric oxide and hydrogen peroxide were reduced. On the other hand, diabetic BMDMs that were also cultured in high glucose concentration of glucose in vitro showed increased levels of lactate and reduced phosphorylation in AKT and PKC-δ, but showed increased phosphorylation in p46 SAPK/JNK. A high glucose concentration seems to modify the behavior of macrophages, affecting different aspects of diabetic and non-diabetic BMDMs under the same LPS stimulus. Hyperglycemia leaves a glucose legacy, inducing a glycemic memory, altering the basal state of macrophages, modifying the TLR4 signaling pathway, and may play a key role in the high susceptibility of diabetic individuals to infections.

A angiogênese é um processo essencial para a formação placentária. Dentre os muitos fatores envolvidos neste evento biológico, destaca-se de forma preponderante o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), cuja produção é controlada por genes, que podem apresentar variantes polimórficas diversas. As conseqüências funcionais destas variações não estão ainda completamente elucidadas, embora algumas tenham sido já associadas a um comprometimento da angiogênese em diversos sistemas biológicos. Por outro lado, alterações morfológicas na formação, distribuição e arranjo dos vasos placentários foram descritas na placenta de gestantes com distúrbios hiperglicêmicos como a Diabete mellitus e a hiperglicemia moderada. Particularmente nos casos de hiperglicemia moderada, a adaptação vascular observada parece estar relacionada à manutenção da capacidade funcional placentária. Na diabete, este achado foi correlacionado à expressão protéica e gênica atípica de determinados fatores angiogênicos na interface materno-fetal, enquanto que em outras condições hiperglicêmicas a provável participação destes fatores ainda não foi completamente determinada. Desta forma, partindo da hipótese de que as alterações placentárias vasculares em gestantes hiperglicêmicas podem ser decorrentes da expressão ou produção atípica do VEGF e que esta por sua vez pode ser decorrente de polimorfismos gênicos, o objetivo deste estudo foi avaliar polimorfismos do gene deste fator de crescimento em placentas de gestantes com distúrbios hiperglicêmicos. Foi realizada a análise dos polimorfismos -460C/T, -634G/C e 936C/T do gene do VEGF em fragmentos de vilos coriônicos de gestantes normoglicêmicas, com hiperglicemia moderada e com Diabete mellitus prévia à gestação, denominados respectivamente de grupo IA, IB e IIB. Todo o material foi fornecido pelo Serviço de Diabetes e Gravidez da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP. A genotipagem dos polimorfismos do VEGF foi realizada através da Reação de Polimerase em Cadeia (PCR), seguida de digestão por enzima de restrição. As freqüências de distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos do VEGF foram comparadas entre os grupos hiperglicêmicos (IB e IIB) e 6 o grupo controle. As freqüências genotípicas estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Foram observadas diferenças significantes nas freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo -460C/T do gene do VEGF em placentas de gestantes hiperglicêmicas (grupos IB e IIB) quando comparadas entre si, mas não com o grupo controle. Diferenças estatísticas nas freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo -634G/C VEGF foram detectadas nos grupos hiperglicêmicos em geral comparados ao grupo controle. Não foram identificadas diferenças nas freqüências genotípicas e alélicas do polimorfismo 936C/T do VEGF entre os grupos avaliados. Em conjunto, nossos achados sugerem que a resposta placentária a distúrbios hiperglicêmicos pode estar correlacionada à presença dos dois polimorfismos: -460C/T e 634C/G. No entanto, nenhuma correlação direta funcional positiva foi observada com a angiogênese observada nas placentas de gestações associadas à hiperglicemia moderada. / The angiogenesis is a process essential for placental formation. Among the many factors involved in this biological event, the factor most active is the vascular endothelial growth factor (VEGF), whose production is controlled by genes, which may present different polymorphic variants. The functional consequences of these changes are not yet fully elucidated, although some have been associated with an impairment of angiogenesis in various biological systems. Moreover, morphological changes in distribution and arrangement of the placental vessels were described in the placenta of pregnant women with hyperglycemic disorders such as diabetes mellitus and mild hyperglycemia. Particularly in cases of mild hyperglycemia, the observed vascular adaptation seems to be related to the maintenance of functional placenta. In diabetes, this finding was correlated with the atypical gene and protein expression of certain angiogenic factors in maternalfetal interface, while in other hyperglycemic conditions the likely participation of these factors has not been fully determined. Thus, based on the hypothesis that placental vascular changes in hyperglycemic pregnant women may be due to atypical expression or production of VEGF and that this in turn may be caused by gene polymorphisms, the objective of this study was to assess polymorphisms of this gene factor growth in placentas of women with hyperglycemic disorders. The analysis of the polymorphisms of the VEGF gene was performed in fragments of chorionic villi of normoglycemic, mild hyperglycemic and diabetic pregnant women, respectively named of group IA, IB and IIB. All specimens were provided by the Serviço de Serviço de Diabetes e Gravidez da Faculdade de Medicina de Botucatu UNESP. Genotyping of the VEGF gene polymorphisms -460C/T, -634G/C and 936C/T was done by the polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism methods. The frequency of VEGF alleles and genotype distribution were compared among the hyperglycemic and control groups. The genotype frequencies were in Hardy-Weinberg equilibrium. We have observed significant differences of VEGF -460C/T polymorphism between the hyperglycemic placentas (IB X IIB), but not compared to control group. Statistical differences in the genotypic and allelic frequencies of C of VEGF -634G/C were detected 8 in hyperglycemic groups in general in comparison to controls. There were no significant differences in allelic or genotype frequencies among the evaluated groups. Taken together our findings suggest that the placental response to hyperglycemic disturbs may be correlated to the presence of both -460C/T and -636C/G polymorphism of the VEGF gene. However, no direct functional correlation was detected between these VEGF polymorphisms and the intense angiogenesis seen in placentas of mild hyperglycemiaassociated gestation.

INTRODUÇÃO: a ação dos hormônios contrarreguladores da insulina na cetoacidose diabética tem sido estudada desde a década 1970-80, e é sabido que seus níveis elevados, aumentando a resistência à insulina, têm papel importante na gênese da CAD. Leptina e ghrelina foram mais recentemente associadas à homeostase da glicose, no entanto, seu papel na CAD ainda é controverso. Os objetivos deste estudo foram: avaliar as alterações nas concentrações séricas de leptina e ghrelina presentes ao diagnóstico da CAD durante os primeiros três dias de seu tratamento e após a estabilização completa do quadro, as correlações com a insulina e outros contrarreguladores, comparando com indivíduos saudáveis. MÉTODOS: foram analisados 25 episódios de cetoacidose diabética em 22 pacientes admitidos no setor de emergência pediátrica de um hospital terciário em São Paulo, Brasil, entre março de 2010 e julho de 2013. Os episódios de cetoacidose foram manejados com reposição endovenosa de fluidos e eletrólitos e análogos de ação ultrarrápida de insulina subcutânea intermitente. Amostras para glicose, insulina, leptina, ghrelina, GH, cortisol e catecolaminas foram obtidas no momento da admissão (T0), durante o tratamento da cetoacidose (após 2, 4, 6, 12, 24 e 72 horas) e em um momento estável após a alta (TE). Os dados foram analisados utilizando-se os testes ANOVA ou Kruskal-Wallis para a comparação de variáveis contínuas durante o tratamento, Teste t de Student ou Mann Whitney para a comparação entre pacientes e grupo controle, e testes de Pearson ou Spearman para correlação entre as variáveis; p < 0.05 foi considerado significativo. RESULTADOS: observamos três fases distintas (a): o diagnóstico de CAD (T0) em que prevalecem hiperglicemia, insulinopenia e elevação de hormônios contrarreguladores; nesse momento, as concentrações de leptina foram menores que no grupo controle, provavelmente relacionadas à insuficiência de energia, estado hipercatabólico e elevação dos hormônios contrarreguladores; as concentrações de ghrelina foram menores que no grupo controle, apesar do hipercatabolismo, da hipoinsulinemia e da hiperglucagonemia, todas situações que fisiologicamente elevariam seus níveis, possivelmente devido à hiperglicemia marcante do momento; (b) durante o tratamento da CAD (T2 a T72): com redução gradual da glicemia até T24, elevação gradual da insulina, redução de glucagon, GH, cortisol e norepinefrina; nesse período, ocorreu elevação gradual da leptina após o início do tratamento com insulina, que atingiu níveis comparáveis ao GC no T72; redução da ghrelina (T4 menor que T72), provavelmente inibida pela hiperglicemia e por doses suprafisiológicas de insulina; e (c) após a resolução da CAD (TE): com hiperinsulinização; GH, cortisol e norepinefrina comparáveis ao GC, glucagon reduzido em relação ao GC, possivelmente supresso pelos altos níveis de insulina; as concentrações de leptina foram maiores que em T0 e comparáveis ao GC; os níveis de ghrelina, comparáveis ao diagnóstico e durante o tratamento da CAD, ainda significativamente menores que no GC, provavelmente influenciados pela hiperglicemia, hiperinsulinemia e baixos níveis de glucagon. CONCLUSÕES: as concentrações de leptina diminuídas ao diagnóstico de CAD tornam-se semelhantes em pacientes com DM1 estáveis em relação a indivíduos saudáveis, podendo ser um marcador de hipercatabolismo. As concentrações de ghrelina permaneceram baixas durante todo o estudo em pacientes diabéticos, independentemente da descompensação / INTRODUCTION: The role of glucoregulatory hormones in diabetic ketoacidosis have been investigated since 1970-80s and the elevation of growth hormone, cortisol and norepinephrine reduce the sensitivity to insulin. Leptin and Ghrelin have more recently been shown to regulate glucose and insulin metabolism; however, their functions in DKA are still controversial. The aims of this study were to analyze leptin, ghrelin and their relationships with other glucoregulatory hormones on diagnosis of diabetic ketoacidosis, during the first 72 hours of treatment and after recovery compared with healthy subjects. METHODS: We examined 25 DKA episodes in 22 patients who were admitted to the pediatric emergency department of a tertiary hospital in São Paulo, Brazil, from March 2010 to July 2013. These episodes were managed with fluids and electrolytes replacement and intermittent subcutaneous fast-acting insulin analogues. Samples for blood glucose, insulin, leptin, ghrelin, GH, cortisol, and catecholamines were obtained on admission (T0), during treatment (after 2, 4, 6, 12, 24 and 72 hours) and after discharge (TS). The control group (CG) was comprised by 21 healthy subjects, who submitted a single blood sample. Data were analyzed by ANOVA or Kruskal-Wallis to compare continuous variables during treatment, student t-test or Mann Whitney for comparisons between patients and controls, and Pearson or Spearman correlations between variables; p < 0.05 was considered to be significant. RESULTS: we observed three distinct phases: (a) on diagnosis of DKA (T0) where hyperglycemia, insulinopenia, and elevated glucoregulatory hormones prevail; leptin concentrations were lower than CG at this moment, probably related to energy insufficiency, hypercatabolic state, and elevated glucoregulatory hormones; ghrelin concentrations were lower than CG at this moment, despite hypercatabolism, hypoinsulinemia and hyperglucagonemia, situations that physiologically would increase them, possibly related to marked hyperglycemia at T0; (b) during DKA treatment (T2 to T72): with gradual reduction of blood glucose until T24, gradual rise of insulin; reduction of glucagon, GH, cortisol and norepinephrine. Leptin levels rises gradually after the start of insulin treatment and is comparable to control group at T72; reduction of ghrelin (T4 lower than T72), possibly inhibited by hyperglycemia and supraphysiological doses of insulin, all lower than CG; and (c) After DKA (TS), in an outpatient setting: with marked hyperinsulinization, GH, cortisol and norepinephrine were comparable to CG. Glucagon was lower than CG, possibly suppressed by high insulin levels; leptin was higher than T0 and comparable to CG; ghrelin levels were comparable to all samples during DKA treatment, and still significantly lower than CG, probably influenced by hyperglycemia, hyperinsulinemia and low glucagon levels. CONCLUSIONS: Low leptin levels were a marker of hypercatabolic state, with normalization of its concentrations with DKA resolution. Ghrelin was low in diabetic patients independent of metabolic derangements

Endometriumkrebs ist eine der häufigsten gynäkologischen Malignomen weltweit und wird in einen Typ I eingeteilt, welcher östrogenabhängig ist, und in eine Typ-II-Östrogen-unabhängige Form. Typ I ist der häufigste Fall und kommt in etwa für 75% bis 85% aller diagnostizierten Fälle in Frage. Erhöhte Östrogenspiegel haben gezeigt, das Risiko von Gebärmutterkrebsentwicklung zu erhöhen, genauso wie Östrogen die Proliferation von Endometriumzellen stimuliert und die Apoptose hemmt. Die Insulinresistenz scheint eine zentrale Rolle in der endometrialen Karzinogenese zu spielen und darüber hinaus werden Erkrankungen mit Insulinresistenz, wie zum Beispiel das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) und Adipositas, sowie Typ II-Diabetes mellitus (DM) als signifikantes Risiko angesehen, Faktoren für die Entwicklung und Progression von Typ-I-Endometrium-Krebs zu sein. Zusätzlich können PCOS-Patienten durch eine Fettleibigkeit in einem normoglykämischen Status eine unabhängige Insulin-Resistenz haben. In diesem Fall scheint die Hyperinsulinämie der fördernde Faktor zu sein, nicht nur für die Entwicklung als auch für die Tumorprogression.Aber auch erhöhte Blutzuckerspiegel tragen zum Wachstum und die Karzinogenese in Endometriumkarzinom bei und dienen als wichtige Verbindung zwischen dem beobachteten erhöhten Krebsrisiko bei Patienten mit Typ-II-DM. Die Behandlung mit einem Anti-Diabetikum, welches den Insulinspiegel senken kann, könnte einen allgemeinen Ansatz bieten gegen die Entwicklung von Krebs und zur Verringerung der Metastasierung. Das Ziel dieser Studie war es, die Wirkung einer 0,1 mM Metformin-Dosis auf das proliferative und metastatische Potential von Endometriumkrebszellen bewerten zu können, sowie die Analyse der Auswirkungen von kurz- und langfristigen Behandlungen auf intrazelluläre Signalwege der Endometriumkrebszellen.(Fortsetzung) (Fortsetzung)Ebenso soll der Zusammenhang der Entwicklung und der Progression von Krebszellen untersucht werden, wenn sie einer Umgebung mit unterschiedlichen Glucosekonzentrationen und hohen Insulinspiegeln ausgesetzt werden. Darüber hinaus ist eine endometriale dreidimensionale (3D) Cokultur zu standardisieren, für eine viabele Kultur bei 20 Tagen Kultivierung. Das proliferative Potential wurde unter Verwendung des CellTitle-Glo-Tests durchgeführt, und das metastatische Potential wurde unter Verwendung von Transwell-Migration und Invasion untersucht. Die mRNAExpression von MKI67, mTOR, NOTCH1, NOTCH3 und JAG1 Gene wurden durch real-time PCR gemessen. Die kumulative Populationsverdopplungsrate wurde durch das Replikationsverhalten einer Endometriumkrebszelllinie durchgehend von 20 Tagen nach einer Behandlungsdauer bestimmt. In allen Assays wurden die Zellen durch Medien mit normaler (5,5 mM) oder hoher (17 mM) Glucosekonzentration, sowie in verschiedenen Gruppen behandelt: Kontrolle, Insulin, Metformin und Insulin+Metformin. Das 3D-Kokulturmodell wurde unter Verwendung von endometrialen Primärzellen und einer Endometriumkrebszelllinie hergestellt, wobei die Modellkonstruktion durch Matrigel® als extrazelluläre Matrix verwendet wurde. In dieser Studie hemmte die 0,1 mM Metformin-Dosis die Insulinwirkung stark und verringerte die Fähigkeit der endometrialen Krebszelllinie, in einer hohen und normalen Glukoseumgebung zu migrieren und einzudringen.(Fortsetzung) (Fortsetzung) Auf das proliferative Potential wurde dieser Effekt nicht beobachtet, allerdings reagierte die relative Zellproliferation empfindlich auf Metformin im Bereich zwischen 1 und 5 mM, unabhängig von der vorliegenden Glucosekonzentration. In den intrazellulären molekularen Mechanismen wurde beobachtet, dass die hohe Glukosekonzentration eine optimale Umgebung für endometriale Krebszellen schafft, um einen aggressiveren Genotyp und eine Resistenz gegenüber Metformin während einer Langzeitbehandlung zu zeigen. Darüber hinaus blieb das endometriale 3DKokulturmodell über 20 Kulturtage lebensfähig. Daher zeigte sich, trotz der Endometriumkrebszellen, eine Resistenz gegenüber dem Metformin-Effekt, wenn sie einer hohen Glucoseumgebung ausgesetzt waren. Die 0,1 mM Metformin-Dosis war in der Lage, die Insulinwirkung zu hemmen und das metastatische Potential der Zellen zu verringern, was darauf hindeutet, dass Metformin klinisch in Verbindung mit Insulin wirkt, sowie die indirekten und direkten Effekte als potentieller Wirkstoff in der Krebstherapie eingesetzt werden könnten. / O câncer de endométrio é uma das neoplasias ginecológicas com maior incidência, classificado como tipo I, estrógeno dependente, e tipo II, estrógeno nãodependente. O tipo I é a forma mais comum, ocorrendo em torno de 75 – 85 % dos casos de câncer de endométrio. Altos níveis de estrogênio têm sido relacionados ao aumento do risco de desenvolvimento do câncer de endométrio, pois estimula a proliferação celular e inibe a apoptose. A resistência à insulina parece desempenhar um papel central nesta neoplasia, e as doenças associadas à resistência à insulina como obesidade, Diabetes Mellitus (DM) tipo II e Síndrome dos Ovários Policísticos (PCOS) também são consideradas fatores de risco significantes para o desenvolvimento e progressão do câncer de endométrio tipo I. Adicionalmente, pacientes com PCOS podem apresentar um quadro de resistência à insulina independente de obesidade, permanecendo em um estado glicêmico normal. Neste caso, a hiperinsulinemia isolada seria um fator tanto para a promoção, como também para a progressão do câncer. Entretanto, o aumento de níveis séricos de glicose, a hiperglicemia, também é considerada um fator independente para o desenvolvimento e progressão do câncer de endométrio sendo um elo crítico entre o aumento do risco do desenvolvimento de câncer observado em pacientes com DM tipo II Dessa forma, tratamento utilizando agentes insulino-sensibilizantes, que atuam diminuindo a resistência à insulina e consequentemente reduzindo seus níveis pode ser uma estratégia interessante para prevenir o câncer e reduzir a disseminação metastática. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o efeito da dose de 0,1 mM de metformina sobre o potencial proliferativo e metastático das células de câncer de endométrio, assim como, avaliar o efeito do tratamento a curto e a longo prazo sobre vias de sinalização intracelular relacionadas ao desenvolvimento e progressão do câncer de endométrio quando exposta a um ambiente com diferentes concentrações de glicose e níveis elevados de insulina. Por fim, a padronização de um modelo tridimensional (3D) de cocultura de células de endométrio que permanecesse viável ao longo de 20 dias de cultivo. O potencial proliferativo foi determinado pelo método luminescente CellTitle Glo, e o potencial metastático pelo o ensaio transwell de migração e invasão. Análises de expressão do mRNA dos genes MKI67, mTOR, NOTCH1, NOTCH3 e JAG1 foram realizadas a partir da técnica de PCR em tempo real. O índice de duplicação populacional cumulativo das células determinou o comportamento de replicação da linhagem de câncer de endométrio ao longo do período de tratamento de 20 dias. Em todas os ensaios as células foram cultivadas em meio contendo concentrações normais (5,5 mM) ou altas (17 mM) de glicose, e divididas nos diferentes grupos de tratamento: controle, insulina, metformina e metformina associado a insulina. A padronização do modelo 3D de cocultura de células de endométrio foi realizado utilizando células primárias e células de linhagem de câncer de endométrio, a Matrigel® foi a matriz extracelular temporária utilizada para a construção do modelo. Neste estudo, a concentração de 0,1 mM de metformina inibiu a ação da insulina, diminuindo a habilidade de migração e invasão das células de câncer de endométrio independente da concentração de glicose presente no meio. Entretanto, este efeito não foi observado sobre o potencial proliferativo, sendo observada uma redução da proliferação das células de câncer de endométrio ao serem utilizadas concentrações maiores de metformina. Em relação aos mecanismos moleculares intracelulares, foi observado que na presença de altas concentrações de glicose as células de câncer de endométrio adquirem um genótipo mais agressivo e apresentam resistência ao efeito da metformina na dose de 0,1 mM durante o tratamento agudo. Além disso, foi possível a padronização de um modelo 3D de cocultura de células de câncer de endométrio que permanecesse viável ao longo dos 20 dias de cultivo. Contudo, apesar das células de câncer de endométrio apresentarem resistência ao efeito da metformina na presença de altas concentrações de glicose, a dose de 0,1 mM foi capaz de inibir o efeito da insulina e diminuir o potencial metastático dessas células, sugerindo que a metformina ao atuar clinicamente em combinação com seus efeitos indiretos e diretos pode ser um potencial agente adjuvante na terapia contra o câncer. / Endometrial cancer is one of the most common gynecological malignancies worldwide and is classified into a type I, which is estrogen-dependent, and a type II estrogen-independent form. The type I is the most common, accounting to 75%-85% of all cases of endometrial cancer. Elevated estrogen levels have been shown to increase the risk of endometrial cancer development, as estrogen stimulates endometrial cell proliferation and inhibits apoptosis. The insulin resistance seems to play a central role in endometrial carcinogenesis, furthermore, diseases associate with insulin resistance, as seen in polycystic ovary syndrome (PCOS), and obesity, as well as type II diabetes mellitus (DM) are considered as significant risk factors for the development and progression of type I endometrial cancer. Additionally, PCOS patients may have an insulin resistance independent of obesity remaining in a normoglycemic status. At this case, the hypeinsulinemia seems to be the promoter factor not only for the development but also for the cancer progression. However, also increased blood glucose levels are contributing to the growth and carcinogenesis in endometrial cancer and are acting as a critical link between the observed increased cancer risk in patients with type II DM. Therefore, the treatment with insulin-sensitizing agents that act through reducing insulin levels, could offer a general approach to prevent the development of cancer and reduce metastasis The aim of this study was to evaluate the effect of 0.1 mM metformin dose on the proliferative and metastatic potential of endometrial cancer cells, as well as, analyze the effects of short and long-term treatment on intracellular signaling pathways related to endometrial cancer development and progression when exposed to an environment with different glucose concentrations and high insulin levels. Additionally, the endometrial three-dimensional (3D) coculture standardization to remain viable over 20 culture days. The proliferative potential was performed by using CellTitle Glo assay, and the metastatic potential was performed by using transwell migration and invasion assay. The mRNA expression of MKI67, mTOR, NOTCH1, NOTCH3 and JAG1 genes were measured by real time PCR. The cumulative population doubling rate was evaluated to determine the replication behavior of an endometrial cancer cell line throughout 20 days of treatment period. In all assays the cells were cultured in medium containing normal (5.5 mM) or high (17 mM) glucose concentration, and treated in different groups: control, insulin,metformin or combined treatment The 3D coculture model was established by using endometrial primary cells and an endometrium cancer cell line, to the model construction Matrigel® was used as an extracellular matrix. In this study, the 0.1 mM metformin dose potently inhibited the insulin action, decreasing the ability of the endometrial cancer cell line to migrate and invade in a high and normal glucose environment. On the proliferative potential this effect was not observed, however, relative cell proliferation sensitivity to metformin was observed in the range between 1 and 5 mM regardless of the present glucose concentration. In the intracellular molecular mechanisms, it was observed that the high glucose concentration creates an optimal environment for endometrial cancer cells to exhibit a more aggressive genotype and resistance to metformin during a long-term treatment. Moreover, the endometrial 3D coculture model remained viable throughout 20 culture days. Therefore, despite of endometrial cancer cells show resistance to the metformin effect when exposed to high glucose environment, the 0.1 mM metformin dose was able to inhibit the insulin action and decrease the metastatic potential of the cells, suggesting that metformin is acting clinically in combination with indirectly and direct effects could emerge as a potential agent in cancer therapy.

INTRODUÇÃO: a ação dos hormônios contrarreguladores da insulina na cetoacidose diabética tem sido estudada desde a década 1970-80, e é sabido que seus níveis elevados, aumentando a resistência à insulina, têm papel importante na gênese da CAD. Leptina e ghrelina foram mais recentemente associadas à homeostase da glicose, no entanto, seu papel na CAD ainda é controverso. Os objetivos deste estudo foram: avaliar as alterações nas concentrações séricas de leptina e ghrelina presentes ao diagnóstico da CAD durante os primeiros três dias de seu tratamento e após a estabilização completa do quadro, as correlações com a insulina e outros contrarreguladores, comparando com indivíduos saudáveis. MÉTODOS: foram analisados 25 episódios de cetoacidose diabética em 22 pacientes admitidos no setor de emergência pediátrica de um hospital terciário em São Paulo, Brasil, entre março de 2010 e julho de 2013. Os episódios de cetoacidose foram manejados com reposição endovenosa de fluidos e eletrólitos e análogos de ação ultrarrápida de insulina subcutânea intermitente. Amostras para glicose, insulina, leptina, ghrelina, GH, cortisol e catecolaminas foram obtidas no momento da admissão (T0), durante o tratamento da cetoacidose (após 2, 4, 6, 12, 24 e 72 horas) e em um momento estável após a alta (TE). Os dados foram analisados utilizando-se os testes ANOVA ou Kruskal-Wallis para a comparação de variáveis contínuas durante o tratamento, Teste t de Student ou Mann Whitney para a comparação entre pacientes e grupo controle, e testes de Pearson ou Spearman para correlação entre as variáveis; p < 0.05 foi considerado significativo. RESULTADOS: observamos três fases distintas (a): o diagnóstico de CAD (T0) em que prevalecem hiperglicemia, insulinopenia e elevação de hormônios contrarreguladores; nesse momento, as concentrações de leptina foram menores que no grupo controle, provavelmente relacionadas à insuficiência de energia, estado hipercatabólico e elevação dos hormônios contrarreguladores; as concentrações de ghrelina foram menores que no grupo controle, apesar do hipercatabolismo, da hipoinsulinemia e da hiperglucagonemia, todas situações que fisiologicamente elevariam seus níveis, possivelmente devido à hiperglicemia marcante do momento; (b) durante o tratamento da CAD (T2 a T72): com redução gradual da glicemia até T24, elevação gradual da insulina, redução de glucagon, GH, cortisol e norepinefrina; nesse período, ocorreu elevação gradual da leptina após o início do tratamento com insulina, que atingiu níveis comparáveis ao GC no T72; redução da ghrelina (T4 menor que T72), provavelmente inibida pela hiperglicemia e por doses suprafisiológicas de insulina; e (c) após a resolução da CAD (TE): com hiperinsulinização; GH, cortisol e norepinefrina comparáveis ao GC, glucagon reduzido em relação ao GC, possivelmente supresso pelos altos níveis de insulina; as concentrações de leptina foram maiores que em T0 e comparáveis ao GC; os níveis de ghrelina, comparáveis ao diagnóstico e durante o tratamento da CAD, ainda significativamente menores que no GC, provavelmente influenciados pela hiperglicemia, hiperinsulinemia e baixos níveis de glucagon. CONCLUSÕES: as concentrações de leptina diminuídas ao diagnóstico de CAD tornam-se semelhantes em pacientes com DM1 estáveis em relação a indivíduos saudáveis, podendo ser um marcador de hipercatabolismo. As concentrações de ghrelina permaneceram baixas durante todo o estudo em pacientes diabéticos, independentemente da descompensação / INTRODUCTION: The role of glucoregulatory hormones in diabetic ketoacidosis have been investigated since 1970-80s and the elevation of growth hormone, cortisol and norepinephrine reduce the sensitivity to insulin. Leptin and Ghrelin have more recently been shown to regulate glucose and insulin metabolism; however, their functions in DKA are still controversial. The aims of this study were to analyze leptin, ghrelin and their relationships with other glucoregulatory hormones on diagnosis of diabetic ketoacidosis, during the first 72 hours of treatment and after recovery compared with healthy subjects. METHODS: We examined 25 DKA episodes in 22 patients who were admitted to the pediatric emergency department of a tertiary hospital in São Paulo, Brazil, from March 2010 to July 2013. These episodes were managed with fluids and electrolytes replacement and intermittent subcutaneous fast-acting insulin analogues. Samples for blood glucose, insulin, leptin, ghrelin, GH, cortisol, and catecholamines were obtained on admission (T0), during treatment (after 2, 4, 6, 12, 24 and 72 hours) and after discharge (TS). The control group (CG) was comprised by 21 healthy subjects, who submitted a single blood sample. Data were analyzed by ANOVA or Kruskal-Wallis to compare continuous variables during treatment, student t-test or Mann Whitney for comparisons between patients and controls, and Pearson or Spearman correlations between variables; p < 0.05 was considered to be significant. RESULTS: we observed three distinct phases: (a) on diagnosis of DKA (T0) where hyperglycemia, insulinopenia, and elevated glucoregulatory hormones prevail; leptin concentrations were lower than CG at this moment, probably related to energy insufficiency, hypercatabolic state, and elevated glucoregulatory hormones; ghrelin concentrations were lower than CG at this moment, despite hypercatabolism, hypoinsulinemia and hyperglucagonemia, situations that physiologically would increase them, possibly related to marked hyperglycemia at T0; (b) during DKA treatment (T2 to T72): with gradual reduction of blood glucose until T24, gradual rise of insulin; reduction of glucagon, GH, cortisol and norepinephrine. Leptin levels rises gradually after the start of insulin treatment and is comparable to control group at T72; reduction of ghrelin (T4 lower than T72), possibly inhibited by hyperglycemia and supraphysiological doses of insulin, all lower than CG; and (c) After DKA (TS), in an outpatient setting: with marked hyperinsulinization, GH, cortisol and norepinephrine were comparable to CG. Glucagon was lower than CG, possibly suppressed by high insulin levels; leptin was higher than T0 and comparable to CG; ghrelin levels were comparable to all samples during DKA treatment, and still significantly lower than CG, probably influenced by hyperglycemia, hyperinsulinemia and low glucagon levels. CONCLUSIONS: Low leptin levels were a marker of hypercatabolic state, with normalization of its concentrations with DKA resolution. Ghrelin was low in diabetic patients independent of metabolic derangements

Endometriumkrebs ist eine der häufigsten gynäkologischen Malignomen weltweit und wird in einen Typ I eingeteilt, welcher östrogenabhängig ist, und in eine Typ-II-Östrogen-unabhängige Form. Typ I ist der häufigste Fall und kommt in etwa für 75% bis 85% aller diagnostizierten Fälle in Frage. Erhöhte Östrogenspiegel haben gezeigt, das Risiko von Gebärmutterkrebsentwicklung zu erhöhen, genauso wie Östrogen die Proliferation von Endometriumzellen stimuliert und die Apoptose hemmt. Die Insulinresistenz scheint eine zentrale Rolle in der endometrialen Karzinogenese zu spielen und darüber hinaus werden Erkrankungen mit Insulinresistenz, wie zum Beispiel das polyzystische Ovarialsyndrom (PCOS) und Adipositas, sowie Typ II-Diabetes mellitus (DM) als signifikantes Risiko angesehen, Faktoren für die Entwicklung und Progression von Typ-I-Endometrium-Krebs zu sein. Zusätzlich können PCOS-Patienten durch eine Fettleibigkeit in einem normoglykämischen Status eine unabhängige Insulin-Resistenz haben. In diesem Fall scheint die Hyperinsulinämie der fördernde Faktor zu sein, nicht nur für die Entwicklung als auch für die Tumorprogression.Aber auch erhöhte Blutzuckerspiegel tragen zum Wachstum und die Karzinogenese in Endometriumkarzinom bei und dienen als wichtige Verbindung zwischen dem beobachteten erhöhten Krebsrisiko bei Patienten mit Typ-II-DM. Die Behandlung mit einem Anti-Diabetikum, welches den Insulinspiegel senken kann, könnte einen allgemeinen Ansatz bieten gegen die Entwicklung von Krebs und zur Verringerung der Metastasierung. Das Ziel dieser Studie war es, die Wirkung einer 0,1 mM Metformin-Dosis auf das proliferative und metastatische Potential von Endometriumkrebszellen bewerten zu können, sowie die Analyse der Auswirkungen von kurz- und langfristigen Behandlungen auf intrazelluläre Signalwege der Endometriumkrebszellen.(Fortsetzung) (Fortsetzung)Ebenso soll der Zusammenhang der Entwicklung und der Progression von Krebszellen untersucht werden, wenn sie einer Umgebung mit unterschiedlichen Glucosekonzentrationen und hohen Insulinspiegeln ausgesetzt werden. Darüber hinaus ist eine endometriale dreidimensionale (3D) Cokultur zu standardisieren, für eine viabele Kultur bei 20 Tagen Kultivierung. Das proliferative Potential wurde unter Verwendung des CellTitle-Glo-Tests durchgeführt, und das metastatische Potential wurde unter Verwendung von Transwell-Migration und Invasion untersucht. Die mRNAExpression von MKI67, mTOR, NOTCH1, NOTCH3 und JAG1 Gene wurden durch real-time PCR gemessen. Die kumulative Populationsverdopplungsrate wurde durch das Replikationsverhalten einer Endometriumkrebszelllinie durchgehend von 20 Tagen nach einer Behandlungsdauer bestimmt. In allen Assays wurden die Zellen durch Medien mit normaler (5,5 mM) oder hoher (17 mM) Glucosekonzentration, sowie in verschiedenen Gruppen behandelt: Kontrolle, Insulin, Metformin und Insulin+Metformin. Das 3D-Kokulturmodell wurde unter Verwendung von endometrialen Primärzellen und einer Endometriumkrebszelllinie hergestellt, wobei die Modellkonstruktion durch Matrigel® als extrazelluläre Matrix verwendet wurde. In dieser Studie hemmte die 0,1 mM Metformin-Dosis die Insulinwirkung stark und verringerte die Fähigkeit der endometrialen Krebszelllinie, in einer hohen und normalen Glukoseumgebung zu migrieren und einzudringen.(Fortsetzung) (Fortsetzung) Auf das proliferative Potential wurde dieser Effekt nicht beobachtet, allerdings reagierte die relative Zellproliferation empfindlich auf Metformin im Bereich zwischen 1 und 5 mM, unabhängig von der vorliegenden Glucosekonzentration. In den intrazellulären molekularen Mechanismen wurde beobachtet, dass die hohe Glukosekonzentration eine optimale Umgebung für endometriale Krebszellen schafft, um einen aggressiveren Genotyp und eine Resistenz gegenüber Metformin während einer Langzeitbehandlung zu zeigen. Darüber hinaus blieb das endometriale 3DKokulturmodell über 20 Kulturtage lebensfähig. Daher zeigte sich, trotz der Endometriumkrebszellen, eine Resistenz gegenüber dem Metformin-Effekt, wenn sie einer hohen Glucoseumgebung ausgesetzt waren. Die 0,1 mM Metformin-Dosis war in der Lage, die Insulinwirkung zu hemmen und das metastatische Potential der Zellen zu verringern, was darauf hindeutet, dass Metformin klinisch in Verbindung mit Insulin wirkt, sowie die indirekten und direkten Effekte als potentieller Wirkstoff in der Krebstherapie eingesetzt werden könnten. / O câncer de endométrio é uma das neoplasias ginecológicas com maior incidência, classificado como tipo I, estrógeno dependente, e tipo II, estrógeno nãodependente. O tipo I é a forma mais comum, ocorrendo em torno de 75 – 85 % dos casos de câncer de endométrio. Altos níveis de estrogênio têm sido relacionados ao aumento do risco de desenvolvimento do câncer de endométrio, pois estimula a proliferação celular e inibe a apoptose. A resistência à insulina parece desempenhar um papel central nesta neoplasia, e as doenças associadas à resistência à insulina como obesidade, Diabetes Mellitus (DM) tipo II e Síndrome dos Ovários Policísticos (PCOS) também são consideradas fatores de risco significantes para o desenvolvimento e progressão do câncer de endométrio tipo I. Adicionalmente, pacientes com PCOS podem apresentar um quadro de resistência à insulina independente de obesidade, permanecendo em um estado glicêmico normal. Neste caso, a hiperinsulinemia isolada seria um fator tanto para a promoção, como também para a progressão do câncer. Entretanto, o aumento de níveis séricos de glicose, a hiperglicemia, também é considerada um fator independente para o desenvolvimento e progressão do câncer de endométrio sendo um elo crítico entre o aumento do risco do desenvolvimento de câncer observado em pacientes com DM tipo II Dessa forma, tratamento utilizando agentes insulino-sensibilizantes, que atuam diminuindo a resistência à insulina e consequentemente reduzindo seus níveis pode ser uma estratégia interessante para prevenir o câncer e reduzir a disseminação metastática. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o efeito da dose de 0,1 mM de metformina sobre o potencial proliferativo e metastático das células de câncer de endométrio, assim como, avaliar o efeito do tratamento a curto e a longo prazo sobre vias de sinalização intracelular relacionadas ao desenvolvimento e progressão do câncer de endométrio quando exposta a um ambiente com diferentes concentrações de glicose e níveis elevados de insulina. Por fim, a padronização de um modelo tridimensional (3D) de cocultura de células de endométrio que permanecesse viável ao longo de 20 dias de cultivo. O potencial proliferativo foi determinado pelo método luminescente CellTitle Glo, e o potencial metastático pelo o ensaio transwell de migração e invasão. Análises de expressão do mRNA dos genes MKI67, mTOR, NOTCH1, NOTCH3 e JAG1 foram realizadas a partir da técnica de PCR em tempo real. O índice de duplicação populacional cumulativo das células determinou o comportamento de replicação da linhagem de câncer de endométrio ao longo do período de tratamento de 20 dias. Em todas os ensaios as células foram cultivadas em meio contendo concentrações normais (5,5 mM) ou altas (17 mM) de glicose, e divididas nos diferentes grupos de tratamento: controle, insulina, metformina e metformina associado a insulina. A padronização do modelo 3D de cocultura de células de endométrio foi realizado utilizando células primárias e células de linhagem de câncer de endométrio, a Matrigel® foi a matriz extracelular temporária utilizada para a construção do modelo. Neste estudo, a concentração de 0,1 mM de metformina inibiu a ação da insulina, diminuindo a habilidade de migração e invasão das células de câncer de endométrio independente da concentração de glicose presente no meio. Entretanto, este efeito não foi observado sobre o potencial proliferativo, sendo observada uma redução da proliferação das células de câncer de endométrio ao serem utilizadas concentrações maiores de metformina. Em relação aos mecanismos moleculares intracelulares, foi observado que na presença de altas concentrações de glicose as células de câncer de endométrio adquirem um genótipo mais agressivo e apresentam resistência ao efeito da metformina na dose de 0,1 mM durante o tratamento agudo. Além disso, foi possível a padronização de um modelo 3D de cocultura de células de câncer de endométrio que permanecesse viável ao longo dos 20 dias de cultivo. Contudo, apesar das células de câncer de endométrio apresentarem resistência ao efeito da metformina na presença de altas concentrações de glicose, a dose de 0,1 mM foi capaz de inibir o efeito da insulina e diminuir o potencial metastático dessas células, sugerindo que a metformina ao atuar clinicamente em combinação com seus efeitos indiretos e diretos pode ser um potencial agente adjuvante na terapia contra o câncer. / Endometrial cancer is one of the most common gynecological malignancies worldwide and is classified into a type I, which is estrogen-dependent, and a type II estrogen-independent form. The type I is the most common, accounting to 75%-85% of all cases of endometrial cancer. Elevated estrogen levels have been shown to increase the risk of endometrial cancer development, as estrogen stimulates endometrial cell proliferation and inhibits apoptosis. The insulin resistance seems to play a central role in endometrial carcinogenesis, furthermore, diseases associate with insulin resistance, as seen in polycystic ovary syndrome (PCOS), and obesity, as well as type II diabetes mellitus (DM) are considered as significant risk factors for the development and progression of type I endometrial cancer. Additionally, PCOS patients may have an insulin resistance independent of obesity remaining in a normoglycemic status. At this case, the hypeinsulinemia seems to be the promoter factor not only for the development but also for the cancer progression. However, also increased blood glucose levels are contributing to the growth and carcinogenesis in endometrial cancer and are acting as a critical link between the observed increased cancer risk in patients with type II DM. Therefore, the treatment with insulin-sensitizing agents that act through reducing insulin levels, could offer a general approach to prevent the development of cancer and reduce metastasis The aim of this study was to evaluate the effect of 0.1 mM metformin dose on the proliferative and metastatic potential of endometrial cancer cells, as well as, analyze the effects of short and long-term treatment on intracellular signaling pathways related to endometrial cancer development and progression when exposed to an environment with different glucose concentrations and high insulin levels. Additionally, the endometrial three-dimensional (3D) coculture standardization to remain viable over 20 culture days. The proliferative potential was performed by using CellTitle Glo assay, and the metastatic potential was performed by using transwell migration and invasion assay. The mRNA expression of MKI67, mTOR, NOTCH1, NOTCH3 and JAG1 genes were measured by real time PCR. The cumulative population doubling rate was evaluated to determine the replication behavior of an endometrial cancer cell line throughout 20 days of treatment period. In all assays the cells were cultured in medium containing normal (5.5 mM) or high (17 mM) glucose concentration, and treated in different groups: control, insulin,metformin or combined treatment The 3D coculture model was established by using endometrial primary cells and an endometrium cancer cell line, to the model construction Matrigel® was used as an extracellular matrix. In this study, the 0.1 mM metformin dose potently inhibited the insulin action, decreasing the ability of the endometrial cancer cell line to migrate and invade in a high and normal glucose environment. On the proliferative potential this effect was not observed, however, relative cell proliferation sensitivity to metformin was observed in the range between 1 and 5 mM regardless of the present glucose concentration. In the intracellular molecular mechanisms, it was observed that the high glucose concentration creates an optimal environment for endometrial cancer cells to exhibit a more aggressive genotype and resistance to metformin during a long-term treatment. Moreover, the endometrial 3D coculture model remained viable throughout 20 culture days. Therefore, despite of endometrial cancer cells show resistance to the metformin effect when exposed to high glucose environment, the 0.1 mM metformin dose was able to inhibit the insulin action and decrease the metastatic potential of the cells, suggesting that metformin is acting clinically in combination with indirectly and direct effects could emerge as a potential agent in cancer therapy.

Submitted by MARIANA PINTO SIRIMARCO null (mpsirimarco@yahoo.com.br) on 2016-04-08T03:04:00Z No. of bitstreams: 1 VERSÃO FINAL 2 08-04.pdf: 1774461 bytes, checksum: 13e24ee503bed7a9ca8d50a2f58cd2aa (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-04-08T16:39:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sirimarco_mp_me_bot.pdf: 1774461 bytes, checksum: 13e24ee503bed7a9ca8d50a2f58cd2aa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-08T16:39:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sirimarco_mp_me_bot.pdf: 1774461 bytes, checksum: 13e24ee503bed7a9ca8d50a2f58cd2aa (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / JUSTIFICATIVA – desde agosto de 2011 o Serviço Especializado de Diabetes e Gravidez da Faculdade de Medicina de Botucatu/Unesp (SEDG-FMB/Unesp) adotou o novo protocolo diagnóstico para o DMG recomendado pela ADA/IADPSG. Entretanto, o Perfil Glicêmico (PG) continuou associado ao TOTG 75g, para diagnosticar a Hiperglicemia Gestacional Leve (HGL), reconhecida e tratada em nosso Serviço como se fosse DMG. A controvérsia sobre o custo-benefício do novo protocolo da ADA/IADPSG e a dúvida sobre a necessidade de manutenção do PG no protocolo do Serviço justificam o presente estudo. OBJETIVOS – avaliar o impacto do novo protocolo da ADA/IADPSG na prevalência de HGL e de DMG, na ocorrência de resultados perinatais adversos (RPNA) e na associação TOTG 75g e PG para diagnóstico de HGL no SEDG-FMB/Unesp. MÉTODO – estudo de corte transversal, incluindo gestantes, e seus recém-nascidos (RN), submetidas aos protocolos diagnósticos e que realizaram pré-natal e parto no Serviço, antes (janeiro de 2008 a 14 de agosto de 2011) e após (15 de agosto de 2011 a dezembro de 2014) à mudança do protocolo, definindo uma amostra por conveniência. Considerando os dois períodos, foram comparadas a prevalência de DMG e de HGL e a ocorrência de RN-GIG, macrossomia, primeira cesárea e tempo de internação dos RN. Na análise estatística foram utilizados análise de Poison e teste t-Student, teste do Qui-quadrado ou Exato de Fischer e cálculo de risco (RR e IC 95%) para os desfechos avaliados. O limite de significância estatística foi de 95% (p < 0,05). RESULTADOS – o NOVO protocolo resultou em aumento no número de mulheres com DMG e deixou de identificar 17,3% do total de gestantes, que mantiveram o diagnóstico de HGL, apesar do TOTG 75g normal. O novo protocolo ADA/IADPSG não influenciou o desfecho perinatal. CONCLUSÕES – esses resultados reforçam a validade da manutenção do PG no protocolo diagnóstico do SEDG-FMB/Unesp. Para concluir sobre o custo-benefício do NOVO protocolo, são necessários grandes estudos, multicêntricos e com tamanho amostral adequado. / BACKGROUND - since August 2011 the Specialized Center of Diabetes and Pregnancy of the Botucatu Medical School / Unesp (SEDG-FMB / Unesp) has adopted a new diagnostic protocol for Gestational Diabetes Mellitus (GDM) recommended by the ADA / IADPSG guidelines. However, the glycemic profile (GP) remained associated with the 75g OGTT to diagnose Mild Gestational Hyperglycemia Lite (MGH), recognized and treated in our department as if it were GDM. The controversy over the cost-effectiveness of the new ADA / IADPSG guideline and doubt about the need for GP maintenance in the service protocol justify this study. OBJECTIVES - To assess the impact of the new ADA / IADPSG guideline in the prevalence of MGH and GDM, in the incidence of adverse perinatal outcomes (APNO) and in the association 75g OGTT and PG for diagnosis of MGH at the SEDG-FMB / Unesp. METHOD - cross-sectional study, including pregnant women and their newborns (NB) that underwent diagnostic protocols and had their prenatal care and delivery at the service before (January 2008 to August 14, 2011) and after (15 August 2011 to December 2014) the protocol modification, defining a convenience sample. Considering the two periods, the prevalence of GDM and MGH and the occurrence of LGA-NB, macrosomia, first cesarean delivery and NB hospital stay were compared. For statistical analysis, Poison analysis and Student's t test, chi-square or Fisher's exact test were used and risk estimate (RR and 95% CI) for the assessed outcomes. The statistical significance threshold was 95% (p <0.05). RESULTS - The new protocol resulted in a increase in the number of women with GDM, but failed to identify 17.3% of pregnant women who maintained the diagnosis of MGH, despite normal 75g OGTT. The new ADA / IADPSG guideline did not influence the perinatal outcome. CONCLUSIONS - These results reinforce the validity of maintaining the GP in the diagnosis protocol at the SEDG-FMB / Unesp. To conclude on the cost-effective of the new protocol, large multicenter studies with adequate sample size are required