Ausgangsphase für die Entwicklung eines Softwaresystems sind die Modellierungen eines Wirklichkeitsausschnitts. Der Wirklichkeitsausschnitt muß zunächst erklärt, analysiert, strukturiert und modelliert werden, bevor ein brauchbares Informationssystem erstellt werden kann. Das Ergebnis dieser Modellierung bezeichnet man als Datenmodell. Der Schlüssel der Datenmodellierung liegt darin, einen Wirklichkeitsausschnitt genau zu erfassen und in adäquater Weise abzubilden, d.h. den Ausschnitt widerspruchsfrei, vollständig, formal richtig und möglichst ohne Redundanz zu beschreiben. Zwei Grundtypen der Datenmodelle sind satzorientierte und objektorientierte Datenmodelle. Im satzorientierten Datenmodell werden Informationen über einen Wirklichkeitsausschnitt als Sätze dargestellt, im objektorientierten Datenmodell als Objekte. Objekte sind Ausprägungen der Klassen. Klassen sind formalisierte Begriffe, die wir durch Abstraktionen von Gegenständen der Wirklichkeit gewonnen haben. Der objektorientierte Ansatz bietet mehrere Vorteile: adäquate einfache Modellierung (Entsprechung der menschlichen Denkweise); Wiederverwendbarkeit, Wartbarkeit, Erweiterbarkeit, Änderbarkeit von Programmen; Lokalisieren von Änderungen; Modellierbarkeit der komplexen Objekte, schneller Zugriff auf Objekte; Reduzierung der Entwicklungszeit und des Entwicklungskostens des Programms; Reduzierung der Komplexität des Problems; zentrales Konzept vieler Anwendungen; drahtloser Übergang zwischen Phasen der Softwareentwicklung usw. Alle diese Vorteile ergeben sich aus dem Klassenkonzept. Trotz der Vorzüge, die das objektorientierte Datenmodell aufweist, bereitet die Umsetzung objektorientierter Konzepte Schwierigkeiten. Die Ursachen sind verschiedener Art. Zum einen ist die Theorie aufgrund ihrer Komplexität eher verwirrend als wegweisend. Es gibt noch keinen klaren theoretischen Hintergrund. Zum anderen resultiert aus einer komplexen Sicht auf den Objektbegriff eine Reihe von Forderungen und Möglichkeiten, die derzeit nicht berücksichtigt wer den. Die Grundbegriffe der Objektorientierung sind nicht genug scharf definiert. Sie enthalten Unklarheiten und sollen deshalb präzisiert werden. Diese Arbeit befaßt sich mit den Grundbegriffen der objektorientierten Datenmodellierung. Das Ziel der Arbeit besteht darin, diese Grundbegriffe zu präzisieren, zu klären und zu begründen und damit ein besseres Verständnis des objektorientierten Ansatzes zu ermöglichen. Diese Begriffe sind nicht nur aus der Sicht der Informatik, der Logik, sondern auch aus der ontologischen Sicht zu untersuchen. Der Schwerpunkt der Arbeit liegt auf der ontologischen Untersuchung solcher Begriffe.

Die vorliegende Arbeit behandelt das Thema multimediales Lernen. Der praktische Teil der Arbeit beschreibt die Vorbereitung und Durchführung einer Unterrichtseinheit mit dem Zweck der Wortschatz vertiefung und -erweiterung durch multimediales Lernen in der sechsten Klasse im Deutschunterricht an einer schwedischen Grundschule. Die Methode der Arbeit besteht aus der Dokumentation und Auswertung von drei durchgeführten Unterrichtsstunden, die eine multimediale Präsentation, Schüler*innen-Feedback, digitales Vokabeltraining und Abfragen der erlernten Vokabeln ein schließen. Die Fragestellung lautet: Aus welchen Gründensoll multimediales Lehrmaterial im Unterricht angeboten werden? Auf welche Weise kann Unterrichtsmaterial zum multimedialen Lernen sinnvoll gestaltet werden? Wie reagieren die Schüler*innen auf eine multimediale Präsentation? Das Ergebnis zeigt, dass multimediale Lehrinhalte die Absicht haben, das Lernen zufördern und zu verbessern. Bei der Gestaltung von multimedialen Lehrmaterialien bietet die wissenschaftliche Forschung fünfzehn Grundsätze, als Anhaltspunkte. Die Rückmeldungen der Schüler*innen auf die multimediale Präsentation sind positiv. Beim digitalen Vokabeltraining, das selbstbestimmt und im eigenen Taktdurch geführt werden kann, wird Neugierde sowie rege Beteiligung gezeigt. Als Konsequenz daraus wird digitales Vokabeltraining auch künftig angeboten so wie eine weitere multimediale Unterricht seinheit im Verlauf des Schuljahres durchgeführt.

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Das Ubiquitin-Proteasom-System gewährleistet in eukaryontischen Zellen den regulierten Abbau der meisten intrazellulären Proteine und ist mit der Generierung von T-Zell-Epitopen grundlegend an der Immunantwort beteiligt. Wegen der Komplexität des Systems stand ein in vitro Verfahren zur 26S proteasomalen Prozessierung eines ubiquitinierten Modellsubstrates erstmals im Jahr 2000 zur Verfügung. In der vorliegenden Arbeit gelang es, diese von Thrower et al. publizierte Methode hinsichtlich einer größeren Proteinquantität zu optimieren und auf die in vitro Ubiquitinierung und Degradation von Proteinen anzuwenden, deren proteasomaler Abbau unter dem Aspekt der Epitopgenerierung immunologisch von besonderer Relevanz ist. Die biochemische und massenspektrometrische Analyse der 26S proteasomalen Degradation von penta-ubiquitinierten Derivaten des tumorassoziierten Glykoproteins Mucin1 zeigte erstens, dass die Prozessierung der Substrate zu einem 26S proteasomalen gating-Effekt führt, der von Substratbindung und -deubiquitinierung sowie von ATP-Hydrolyse abhängig ist. Zweitens ließ sich als Folge der Substratprozessierung eine Instabilisierung des 26S Proteasoms beobachten, die auf einen Assoziations-Dissoziations-Zyklus hindeutet. Drittens ergab die Untersuchung zum Einfluss des Proteasom-Aktivators PA28 auf den Abbau eines Mucin1-Polyepitops, dass PA28 eine erhöhte Quantität an 26S proteasomal generiertem Epitop verursacht. Viertens war unter Zuhilfenahme des Inhibitors clasto-Lactacystin und anhand der ubiquitinierten Mucin1-Derivate erstmals für ubiquitinierte Substrate nachweisbar, dass die proteasomale katalytische Untereinheit beta5 für die Proteindegradation durch den 26S-Komplex nicht essentiell ist. Das in der vorliegenden Arbeit etablierte Abbausystem hat zudem sein Potential unter Beweis gestellt, als ein in vivo-nahes in vitro Testsystem zu fungieren, um die Wirksamkeit von Proteasom-Inhibitoren sowie die Prozessierbarkeit von Polyepitop-Vakzinen zu bewerten. / The ubiquitin-proteasome pathway plays a major role in cellular protein degradation. By generating T-cell epitopes it contributes essentially to the immune response. The complexity of the system impeded the establishment of an in vitro approach that would make a detailed analysis of the protein degradation by the 26S proteasome possible. Finally, in 2000 Thrower et al. published an in vitro method enabling the synthesis and degradation of an ubiquitinated model substrate by the 26S proteasome. In the study presented here the approach of Thrower et al. was improved by scaling up and by the synthesis of substrates the degradation of which by the 26S proteasome is of great importance immunologically, mainly in regard to the generation of T-cell epitopes. In vitro synthesised penta-ubiquitinated versions of the tumor-associated glycoprotein mucin1 were processed by purified 26S proteasomes. The analysis of substrate degradation and product generation by biochemistry and mass spectrometry showed firstly, that substrate processing initiated a 26S proteasomal gating effect which depends on substrate binding to the proteasome, deubiquitination and proteasomal ATP-hydrolysis. Secondly, a disassembly of the 26S proteasome was observed following substrate processing which suggests a regulated association-dissociation cycle of the proteasome. Thirdly, supplementation of the degradation approach with the proteasome activator PA28 led to a higher quantity of epitope generated by the 26S proteasome out of a mucin1 polyepitope string. Fourthly, use of the proteasome inhibitor clasto-Lactacystin revealed, for the first time, that the catalytic proteasome subunit beta5 is not essential for the degradation of ubiquitinated protein substrates by the 26S proteasome. In addition, the in vitro approach established in the presented study has shown its potential to function as an in vivo-like system which helps to assess proteasome inhibitors and potential polyepitope vaccines.

Immune genes of the major histocompatibility complex (MHC) constitute a central component of the adaptive immune system and play an essential role in parasite resistance and associated life-history strategies. In addition to pathogen-mediated selection also sexual selection mechanisms have been identified as the main drivers of the typically-observed high levels of polymorphism in functionally important parts of the MHC. The recognition of the individual MHC constitution is presumed to be mediated through olfactory cues. Indeed, MHC genes are in physical linkage with olfactory receptor genes and alter the individual body odour. Moreover, they are expressed on sperm and trophoplast cells. Thus, MHC-mediated sexual selection processes might not only act in direct mate choice decisions, but also through cryptic processes during reproduction. Bats (Chiroptera) represent the second largest mammalian order and have been identified as important vectors of newly emerging infectious diseases affecting humans and wildlife. In addition, they are interesting study subjects in evolutionary ecology in the context of olfactory communication, mate choice and associated fitness benefits. Thus, it is surprising that Chiroptera belong to the least studied mammalian taxa in terms of their MHC evolution. In my doctoral thesis I aimed to gain insights in the evolution and diversity pattern of functional MHC genes in some of the major New World bat families by establishing species-specific primers through genome-walking into unknown flanking parts of familiar sites. Further, I took a free-ranging population of the lesser bulldog bat (Noctilio albiventris) in Panama as an example to understand the functional importance of the individual MHC constitution in parasite resistance and reproduction as well as the possible underlying selective forces shaping the observed diversity. My studies indicated that the typical MHC characteristics observed in other mammalian orders, like evidence for balancing and positive selection as well as recombination and gene conversion events, are also present in bats shaping their MHC diversity. I found a wide range of copy number variation of expressed DRB loci in the investigated species. In Saccopteryx bilineata, a species with a highly developed olfactory communication system, I found an exceptionally high number of MHC loci duplications generating high levels of variability at the individual level, which has never been described for any other mammalian species so far. My studies included for the first time phylogenetic relationships of MHC genes in bats and I found signs for a family-specific independent mode of evolution of duplicated genes, regardless whether the highly variable exon 2 (coding for the antigen binding region of the molecule) or more conserved exons (3, 4; encoding protein stabilizing parts) were considered indicating a monophyletic origin of duplicated loci within families. This result questions the general assumed pattern of MHC evolution in mammals where duplicated genes of different families usually cluster together suggesting that duplication occurred before speciation took place, which implies a trans-species mode of evolution. However, I found a trans-species mode of evolution within genera (Noctilio, Myotis) based on exon 2 signified by an intermingled clustering of DRB alleles. The gained knowledge on MHC sequence evolution in major New World bat families will facilitate future MHC investigations in this order. In the N. albiventris study population, the single expressed MHC class II DRB gene showed high sequence polymorphism, moderate allelic variability and high levels of population-wide heterozygosity. Whereas demographic processes had minor relevance in shaping the diversity pattern, I found clear evidence for parasite-mediated selection. This was evident by historical positive Darwinian selection maintaining diversity in the functionally important antigen binding sites, and by specific MHC alleles which were associated with low and high ectoparasite burden according to predictions of the ‘frequency dependent selection hypothesis’. Parasite resistance has been suggested to play an important role in mediating costly life history trade-offs leading to e.g. MHC- mediated benefits in sexual selection. The ‘good genes model’ predicts that males with a genetically well-adapted immune system in defending harmful parasites have the ability to allocate more resources to reproductive effort. I found support for this prediction since non-reproductive adult N. albiventris males carried more often an allele associated with high parasite loads, which differentiated them genetically from reproductively active males as well as from subadults, indicating a reduced transmission of this allele in subsequent generations. In addition, they suffered from increased ectoparasite burden which presumably reduced resources to invest in reproduction. Another sign for sexual selection was the observation of gender-specific difference in heterozygosity, with females showing lower levels of heterozygosity than males. This signifies that the sexes differ in their selection pressures, presumably through MHC-mediated molecular processes during reproduction resulting in a male specific heterozygosity advantage. My data make clear that parasite-mediated selection and sexual selection are interactive and operate together to form diversity at the MHC. Furthermore, my thesis is one of the rare studies contributing to fill the gap between MHC-mediated effects on co-evolutionary processes in parasite-host-interactions and on aspects of life-history evolution. / Innerhalb des adaptiven Immunsystems spielen die Gene des MHC (Major Histocompatibility Complex) eine zentrale Rolle. Neben ihrer Funktion für die körpereigene Parasitenabwehr haben sie auch einen entscheidenden Einfluss auf damit verbundene ‚life-history’ Strategien. Typischerweise sind die funktional für die Pathogenerkennung wichtigen Genabschnitte hoch variabel, was evolutiv nicht nur durch die Vielfalt der Pathogene bedingt ist, sondern im Zuge der sexuellen Selektion durch entsprechende Partnerwahl gefördert wird. Dabei wird die individuelle MHC-Konstitution sehr wahrscheinlich über körpereigene Duftstoffe vermittelt, denn MHC Gene bestimmen nicht nur den individuellen Körpergeruch, sondern liegen in chromosomaler Kopplung mit olfaktorischen Rezeptorgenen. Außerdem werden sie auch auf Sperma- und Trophoplastenzellen exprimiert, so dass MHC-bedingte sexuelle Selektionsmechanismen nicht nur über die direkte Partnerwahl, sondern auch durch kryptische Mechanismen während der Fortpflanzung wirken können. Fledermäuse und Flughunde (Chiroptera) bilden die zweitgrößte Säugetiergruppe und gelten als wichtiges Reservoir und Überträger für den Menschen und andere Wildtiere hoch infektiöser Krankheiten. Innerhalb der evolutionären Ökologie sind sie außerdem auf Grund ihrer z.T. komplexen olfaktorischen Kommunikation während der Partner-wahl und den damit verbundenen fitness relevanten Vorteilen interessante Forschungsobjekte. In Anbetracht dessen ist es erstaunlich, dass bisher so gut wie nichts über den MHC in dieser Säugergruppe bekannt ist. Das Ziel meiner Dissertation war es, zum einen Einblicke in die Evolution und Diversität funktional wichtiger MHC Gene (MHC Klasse II DRB) bei Fledermäusen zu erhalten, und zum anderen zu untersuchen, inwieweit die individuelle MHC-Konstitution am Beispiel der kleinen Hasenmaulfledermaus (Noctilio albiventris) einen Einfluss auf Parasitenresistenz und Fortpflanzung hat und welche Selektionsmechanismen dabei für das entstandene genetische Diversitätsmuster verantwortlich sind. Meine Arbeit zeigt, dass Prozesse, die bei anderen Vertebratenordnungen das Diversitätsmuster am MHC hervorrufen, wie balancierende und positive Selektion, Rekombination und Genkonversion ebenfalls für Fledermäuse zutreffen. In der Anzahl exprimierter DRB loci unterscheiden sich die untersuchten Fledermausarten allerdings beträchtlich. Bemerkenswert ist die extrem hohe Anzahl DRB loci bei Saccopteryx bilineata, die in dieser Ausprägung noch bei keiner anderen Säugetierart beschrieben wurde, einer Fledermaus mit einem hoch entwickelten olfaktorischen Kommunikations-system. Die hier erstmals durchgeführten phylogenetischen Untersuchungen zeigen, dass sich anders als für die meisten anderen Säugetiergruppen beschrieben, die duplizierten DRB Loci unabhängig voneinander entwickelt haben. Dieser mono-phyletische Ursprung duplizierter Loci innerhalb von Fledermausfamilien bestätigte sich für alle Bereiche des Genes: dem hochvariablen Exon 2, das für den funktional entscheidenden Pathogen-bindenden Bereich des Proteins kodiert, sowie für Exon 3 und 4, die für die Molekülstruktur erhaltende Bereiche des Proteins kodieren. Innerhalb der Gattungen (Noctilio, Myotis), basierend auf Exon 2, fand ich das für andere Säugergruppen typische Bild eines ‚trans-species polymorphism’, bei dem MHC-Allele von verschiedenen Arten sich untereinander ähnlicher sein können als Allele der gleichen Art. Meine Ergebnisse sind ein wichtiger Beitrag zum Verständnis der MHC Evolution in der Gruppe der Fledermäuse und liefern hilfreiche Kenntnisse für zukünftige Studien zum MHC in dieser Säugetierordnung. Meine Studien an einer frei lebenden Population der kleinen Hasenmaulfledermaus zeigten dass der exprimierte DRB Locus typische Anzeichen pathogenbedingter aber auch sexueller Selektionsmechanismen zeigt. Ich fand eine ausgeprägte populations-weite Heterozygotie, positive darwinsche Selektion, die den Polymorphismus in Codons die direkt an der Pathogenerkennung beteiligt sind erhält, sowie spezifische Allele die entweder mit einer erhöhten oder einer geringen Parasitenbelastung einhergehen, entsprechend den Annahmen der ‚Frequenz-abhängigen Selektions-Hypothese’. Die individuelle Parasitenresistenz gilt als ein wichtiger Faktor um ressourceabhängige ‚life-history’ Strategien auszuloten. Vor allem Männchen mit einem effektiven Immunsystem, sollten mehr Energien für die Fortpflanzung zur Verfügung haben (‚good-genes model’). Meine Daten bestätigen diese Annahme, Männchen die stärker parasitisiert waren, waren weniger häufig reproduktiv aktiv und trugen häufiger ein DRB-Allele das mit erhöhter Parasitenbelastung einherging. Genetisch unterschieden sie sich darin nicht nur von den reproduktiv aktiven Männchen der Population sondern auch von den Jungtieren. Die Jungtiere trugen zudem häufiger ein für die Parasitenabwehr vorteilhaftes Allel. Die Ergebnisse zeigen dass die individuelle MHC-Konstitution einen nicht zu unterschätzenden Einfluss auch auf den Reproduktionserfolg eines Männchens haben kann und vorteilhafte Allele sich bereits in nachfolgenden Generationen durchsetzen. Meine Doktorarbeit gehört damit zu einer der seltenen Studien, die nicht nur zeigen konnte inwieweit der MHC an co-evolutionären Prozessen der Parasit-Wirt-Interaktion beteiligt ist, sondern dass er darüber hinaus auch direkt für die individuelle ‚life-history’ Entwicklung von Bedeutung ist.

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Einleitung: In der zahnärztlichen Literatur findet man klinische Studien, welche die Modifikation der sagittalen Kompensationskurve (SKK) aufgrund ihrer Entstehung, ihres Verhaltens während des Wachstums oder in Abhängigkeit von anderen Faktoren untersuchen. Zahlreichen Veränderungen und Variationen der SKK während des Zahnwechsels bzw. im Laufe des Lebens unterliegen dem Einfluss von Wachstum, kraniofazialer Morphologie, Kaukraft, Frontzahnmorphologie, Ausprägung der Okklusion und der relativen Lage der Kiefergelenke zur Mandibula sowie von weiteren Faktoren. Ziel: Das Ziel dieser Studie war eine Untersuchung der Variation der SKK in erneut aufgestellten Gipsmodellen von Doktorandin (D) und Studenten (S) in Neutralverzahnung. Im Rahmen der Überlegungen zur Biomechanik erhob sich die Frage, ob und gegebenenfalls wie sich die Ausprägung der SKK bei wiederholter Aufstellung in Neutralverzahnung trotz identischer Anatomie der Zähne verändert. Nach Überlegungen zur Okklusion und Morphologie ist bei der Verwendung von identischen Zähnen und idealer Aufstellung in Neutralverzahnung theoretisch nur eine Variante der Zahnbogenform und somit der SKK möglich. Es sollte untersucht werden, ob die Ausprägung der Kurve mit anderen Elementen wie Länge, Breite und Symmetrie des Zahnbogens korreliert. Es sollten Durchschnittstiefe beider Kieferseiten, die Position der tiefsten Stelle sowie Minimal- und Maximalwerte der SKK ermittelt werden. Modelle der Doktorandin (D) und Studenten (S) sollten verglichen werden. Material und Methoden: Das Ober- und Unterkiefer-Gipsmodell eines ausgesuchten Patientenfalls (Urmodell, Abschlussmodell nach kieferorthopädischer Behandlung, Neutralverzahnung) wurde 65-mal dubliert und die Zähne vom Zahnkranz separiert, so dass ein Puzzle der Okklusion erneut erstellt werden musste. Die Doktorandin stellte 20 Modelle und 45 Studenten jeweils ein Modell in Neutralverzahnung auf. Von den 65 so entstandenen Modellen wurden 58 ausgewertet. Vermessen wurden die Ausprägung der SKK, Zahnbogenbreite, Zahnbogenlänge sowie Symmetrie des Zahnbogens anhand Messschieber, Millimeterfolie sowie einer individuellen Messapparatur. Zur statistischen Auswertung wurden Korrelationsberechnungen, Hypothesentests (T-Test/ Welch-Test) sowie Boxplotdiagramme zur grafischen Darstellung erstellt. Ergebnisse: Es wurde eine negative Korrelation (r= -0,61) der Zahnbogenbreite mit der Zahnbogenlänge ermittelt. Es bestanden keine weiteren Korrelationen der SKK mit den übrigen Messwerten größer als r =0,6 oder kleiner als r= -0,6. Die S-Modelle waren breiter aufgestellt als die D-Modelle. Die SKK der D-Modelle waren in beiden Quadranten deutlich tiefer. Die Gesamtheit aller Modelle wies im 4. Quadranten tiefere Kurven als im 3. Quadranten auf. Durchschnittlich wiesen alle Modelle einen kürzeren dritten Quadranten auf. Aus der Horizontalebene betrachtet, verlief der Zahnbogen im vierten Quadranten steiler. Der tiefste Punkt der SKK ist der mesio-bukkale Höcker des ersten Molaren beidseits. Schlussfolgerung: Es konnte keine signifikante Abhängigkeit der Ausprägung der SKK von übrigen Messgrößen nachgewiesen werden. Betrachtet man die erstellten Modelle einzeln, so entstanden unterschiedlichste Ausprägungen der SKK, Zahnbogenbreiten und –längen bei funktioneller Okklusion. Die Mittelwerte aller vermessenen Modelle (Zahnbogenbreite und –länge) sind fast identisch mit denen des Urmodells ( 1,0mm). Das bestätigt zum Teil die Theorie, dass die Zahnbogenform durch die Zahnform vorgegeben ist. Die Mittelwerte schwanken um die Morphologie des Urmodells. Das Spiel für die Anordnung der Morphologie und Streubreite der Zahnbogenform ist größer als vorerst vermutet. Es müssen weitere Studien auf diesem Gebiet erfolgen, um den Sachverhalt genau zu prüfen. Als ein Ziel der kieferorthopädischen Behandlung wird das Abflachen einer ausgeprägten SKK empfohlen, um eine Neutralverzahnung weitestgehend einzustellen. Der Behandler sollte ausreichende Kenntnis über den idealen Verlauf der SKK besitzen, damit beim Gebrauch von starren Bögen während der terminalen Behandlung mit Straight-Wire-Technik eine Neutralverzahnung im Molarbereich gewährleistet bleibt.

Das Proteasom ist eine ATP- abhängige Protease, die sich aus vielen Untereinheiten zusammensetzt. Es ist für die Generierung der MHC Klasse I- restringierten Peptide verantwortlich, die im Folgenden auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Nicht-funktionelle Proteine, die als so genannte defective ribosomal products (DRIP) bezeichnet werden, stellen eine wichtige Quelle für die Generierung von antigenen Peptiden, insbesondere jedoch von viralen Peptiden dar. Generell wird die Lehrmeinung vertreten, dass der Abbau von polyubiquitinierten Proteinen durch das 26S Proteasom zur Generierung von MHC Klasse I- Liganden führt. Allerdings ist weiterhin unklar, ob virale Proteine Ubiquitin- abhängig vom Proteasom abgebaut werden. Demnach sollte im Rahmen dieser Arbeit der Proteasom- abhängige Abbau des mCMV ie pp89 Proteins vor allem hinsichtlich einer Ubiquitinierung untersucht werden. Folglich wurden Konstrukte sowohl für ein rekombinantes pp89 (rek pp89) als auch für ein ODCpp89 Fusionsprotein entworfen. Somit konnten sowohl der in vitro Abbau dieser Proteine als auch die Prozessierung des spezifischen MHC Klasse I H2-Ld Epitops verfolgt werden. Experimente zum Nachweis von Ubiquitin- Protein- Konjugaten wurden in vivo mit stabil transfizierten Mausfibroblasten (B8 Zellen) durchgeführt. Die experimentellen Daten sprechen für einen schnellen in vitro Abbau des rek pp89 durch das 20S Proteasom. Das MHC Klasse I pp89 Epitop bzw. dessen 11mer Precursorpeptid wurden dabei mit hoher Präzision generiert. Spezifische CTL Assays weisen auf die Generierung des korrekten Epitops bzw. des Precursors hin. Nach Verdau des ODCpp89 Fusionsproteins durch 26S Proteasomen in Anwesenheit von Antizym konnten mit diesem Test ebenfalls das 9mer Epitop respektive das 11mer des pp89 nachgewiesen werden. Eine potentielle Ubiquitinierung des pp89 wurde in vivo in Zellkulturen untersucht. Nach Gabe von Proteasomeninhibitoren zu Mausfibroblasten konnte eine starke Akkumulierung von Ubiquitin- Konjugaten beobachtet werden. Allerdings konnte in den verschiedenen Versuchsansätzen kein Nachweis von pp89- Ubiquitin- Konjugaten erbracht werden. Demzufolge ist für die Generierung von viralen Epitopen ein Proteasom- abhängiger, aber Ubiquitin- unabhängiger Abbauweg denkbar. / The proteasome, an ATP-dependent, multisubunit protease, is responsible for the generation of most MHC class I restricted epitopes presented on the cell surface. Non-functional proteins, also known as defectice ribosomal products (DRiP), represent an important source for the generation of antigenic peptides in general and of viral epitopes in particular. It is widely accepted that the degradation of polyubiquitinated proteins by the 26S proteasome is a prerequisite for the generation of MHC class I ligands. However, the ubiquitin dependence for the proteasomal degradation of viral proteins is an issue so far unresolved. Therefore, the aim of this study was to analyze the proteasomal degradation of the mCMV ie pp89 in respect to an anticipated ubiquitinylation. Thus, a recombinant pp89 (recpp89) as well as an ODCpp89 fusion protein were generated. The in vitro processing of these proteins and the generation of a MHC class I H2-Ld epitope by proteasomes was further studied. Murine fibroblast cell lines (B8 cells) were used to analyze any in vivo evidence for potentially existing ubiquitin-protein conjugates. The experiments show that the recpp89 protein is rapidly degraded in vitro by the 20S proteasomes and that the correct MHC class I pp89 epitope or its 11mer precursor are generated with high fidelity. Furthermore, CTL assays, indicating the generation of the specific pp89 epitope or the 11mer precursor, also suggested a 26S proteasome-dependent degradation of the mCMV pp89-ODC fusion protein in the presence of antizyme. Treating cell cultures with proteasome inhibitors resulted in a significant accumulation of ubiquitin-conjugates in vivo. However, higher molecular weight pp89-ubiquitin conjugates were not detectable throughout the entire experimental set-up. Consequently, a proteasome-dependent, but ubiquitin-independent pathway can be postulated for the generation of viral epitopes.

Im Kampf gegen eine Virusinfektion spielen CD8+ T Zellen des adaptiven Immunsystems eine besondere Rolle. Sie patroullieren im Körper und entdecken spezifische Virusepitope, welche mittels MHC Klasse I Molekülen auf der Oberfläche infizierter Zellen präsentiert werden. Wird eine virus-infizierte Zelle erkannt, kann diese schnell und effizient eliminiert. Für die Generierung viraler Peptide, welche auf MHC Klasse I Komplexe geladen werden, ist das Ubiquitin-Proteasom-System von essentieller Bedeutung. Kürzlich wurden weitere Funktionen des Immunoproteasoms aufgedeckt wie zum Beispiel der Schutz gegen oxidativen Stress. Innerhalb der vorliegenden Arbeit konnte die Fähigkeit des Immunoproteasoms gegen eine Akkumulation oxidativ geschädigter Proteine zu schützen mit der Generierung von MHC Klasse I Liganden kombiniert und neu interpretiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass während einer Virusinfektion in Nicht-Immunzellen die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies durch die alternative NADPH Oxidase Nox4 eine bedeutende Rolle spielt. Die Aktivierung von Nox4 resultiert in der Akkumulation oxidativ geschädigter Proteine. Innerhalb von zwei Stunden nach dem Eintreten von Viruspartikeln in die Zellen wurden strukturelle Virusproteine oxidiert und anschließend ubiquityliert. Die gleichzeitige, virus-induzierte Expression von Immunoproteasomen führte zu einem schnellen und effizienten Abbau ubiquitylierter Virusantigene. Infolgedessen konnten immundominante Virusepitope vermehrt freigesetzt werden. Folglich wurde ein soweit unbekannter Mechanismus gefunden, welcher Substrate für das Proteasom zur Generierung von MHC Klasse I Liganden bereitstellt. Zusammenfassend konnte innerhalb dieser Arbeit gezeigt werden, dass das Immunoproteasom den Schutz vor oxidativen Stress mit der Generierung antigener Peptide verbindet, wodurch eine effektive adaptive Immunantwort etabliert werden kann. / An efficient immune control of virus infection is predominantly mediated by CD8+ T cells which patrol through the body and eliminate infected cells. Infected cells are recognized when they present viral antigenic peptides on their surface via MHC class I molecules. To make antigenic peptides available for loading on MHC class I complexes, the ubiquitin proteasome system plays a crucial role. Moreover, the induction of the i-proteasome is known to support the generation of MHC class I ligands. Recently, new functions of the i-proteasome have been discovered. Evidence is increasing that the i-proteasome is involved in the protection of cells against oxidative stress. Within this thesis the characteristic of the i-proteasome to protect cells against the accumulation of oxidant-damaged proteins could be linked to its role in improving the generation of MHC class I ligands. It could be demonstrated that during a virus infection in non-immune cells the production of reactive oxygen species by the alternative NADPH oxidase Nox4 is of critical importance resulting in the accumulation of potentially toxic oxidant-damaged proteins. Indeed, within two hours of infection structural virus proteins were oxidized and subsequently poly-ubiquitylated. The concomitant formation of i-proteasomes led to a rapid and efficient degradation of ubiquitylated virus antigens thereby improving the liberation of immunodominant viral epitopes. In conclusion, a so far unknown mechanism to fuel proteasomal substrates into the MHC class I antigen presentation pathway has been revealed. A new protein pool consisting of exogenously delivered viral proteins provides proteasomal substrates in the very early phase of a virus infection. Within the scope of this thesis the i-proteasome has been shown to link the protection against oxidative stress, initiated directly by pathogen recognition, with the generation of antigenic peptides. Together, an effective adaptive immune response is triggered.

Die Expression von Haupthistokompatibilitätsantigenen auf der Zelloberfläche kernhaltiger Zellen ist die Hauptursache für die Detektion durch das Immunsystem und die Rejektion allogener Transplantate. Eine vielversprechende Strategie, die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche zu senken, ist der Einsatz intrazellulär lokalisierter Antikörpern, sogenannter Intrabodies. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals versucht, eine die Expression an MHC-I-Molekülen auf der Zelloberfläche durch den Einsatz von anti-MHC-I-Intrabodies zu verhindern. Ein Hauptproblem in der Transplantation ist der Mangel an geeignetem Spendermaterial. Um diesem Zustand entgegenzuwirken, wird versucht, adäquaten Organersatz durch Tissue Engineering bereitzustellen. Die in vitro-Züchtung autologer epithelialer Zellen zur Generierung transplantierbarer Hautstücke spielt heute bereits eine große Rolle bei der Transplantation artifizieller Gewebe. Ferner werden diverse vollsynthetische Materialien für diesen Zweck hergestellt. Eine Verbesserung in diesen Bereich würde die Generierung von nicht-immunogenen allogenen Keratinozyten darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden primäre Rattenkeratinozyten mit anti-MHC-I-Intrabodies transfiziert. Diese Zellen zeigten einen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp - eine starke Expression der Intrabodies war jedoch essentiell für die vollständige Zurückhaltung aller MHC-I-Moleküle in der Zelle. Neben der Applikation von Intrabodies in Rattenkeratinozyten konnte die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche von 293-Zellen und primären humanen Keratinozyten ebenfalls durch die Expression von anti-MHC-I-Intrabodies vermindert werden. Im Vergleich mit dem ebenfalls MHC-I-bindenden adenoviralen Protein p19 bewirkten die eingesetzten anti-MHC-I-Intrabodies bei gleich starker Expression eine wesentlich stärkere "Downregulation" der MHC-I-Oberflächenexpression von 293-Zellen. Intrabody-exprimierende Zellen zeigten keine signifikanten morphologischen oder physiologischen Veränderungen gegenüber untransfizierten Zellen: Wachstum, die Expression anderer Oberflächenmoleküle und morphologische Erscheinung waren unverändert. Es konnte lediglich eine verstärkte intrazelluläre Akkumulation von MHC-I-Molekülen detektiert werden. Die funktionelle Bedeutung der MHC-I-"Downregulation" durch Intrabodies konnte durch die stark verminderte zytolytische Aktivität zytotoxischer T-Zellen gegenüber Intrabody-exprimierender Rattenkeratinozyten im Vergleich zu unmodifizierten Zellen gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit ist es erstmals gelungen, Zellen mit einem vollständigen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp zu erzeugen - bisherige Modifikationen der MHC-I-Oberflächenexpression durch die Generierung _2-Mikroglobulin- oder TAP-defizienter Mäuse führte zu keinem restlosen Verlust der Klasse-I-Moleküle auf der Zelloberfläche. MHC-I-"downregulierte" Keratinozyten könnten in der Hauttransplantation anstelle der limitiert zur Verfügung stehenden autologen Zellen eingesetzt werden oder in Kombination mit synthetischen Materialien verwendet werden, wo sie durch die Sekretion von heilungsfördernden Faktoren eine Verbesserung des Wundheilungsprozesses bewirken würden. / The expression of major histocompatibility antigens on the surface of eucaryotic cells is the predominant reason for immunologic detection and the rejection of allogeneic transplants. A promising strategy to lower the MHC I expression on the cell surface is the use of intracellular localized antibodies, termed intrabodies. In this work it has been tried for the first time to prevent the expression of MHC class I molecules on the cell surface by intrabody expression. A major problem in transplantation is the shortage of suitable donor material. To overcome this situation tissue engineering has and will continue to enlarge the scope of organ grafting. Today, the in vitro culture of autologous epithelial cells to generate transplantable skin sheets plays an important role in the transplantation of artificial tissues. Furthermore various fully synthetic materials are produced for transplantation. An improvement in this field could be the generation of non-immunogeneic allogeneic keratinocytes. Within this work primary rat keratinocytes have been transfected with anti-MHC-I-Intrabodies. These cells show a MHC I "knockout" phenotype - yet a strong intrabody expression was essential for the complete retention of all MHC I molecules inside the cell. Besides the application of intrabodies in keratinocytes the MHC I expression on the surface of 293 cells and human primary keratinocytes could be reduced by anti-MHC I intrabodies as well. In comparison with the also employed adenoviral protein p19 the applied intrabodies generated at the same expression level a much stronger down-regulation of the MHC I surface expression of 293 cells. Intrabody expressing cells did not show any significant morphologic or physiologic alterations compared to untransfected cells: growth, the expression of other surface molecules and the morphological appearance were unaltered. Merely an enhanced intracellular accumulation of MHC I molecules could be detected. The functional relevance of the MHC I down-regulation by intrabodies could be shown by the strong diminished cytolytic activity of cytotoxic T cells to intrabody expressing rat keratinocytes in comparison to unmodified cells. In this work cells with a completely MHC I knock-out phenotype has been successfully generated for the first time - modifications of the MHC I surface expression by generation of _2-microglobulin or TAP deficient mice did not lead to a complete loss of all MHC I molecules on the cell surface so far. MHC I down-regulated keratinocytes could be employed in skin transplantation instead of the limited available autologous cells or utilized in combination with synthetic materials where they would induce an improvement of the healing process by the secretion of cytokines.