Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie présentant des résistances aux antibiotiques toute particulière. Elle est aujourd’hui largement impliquée dans de nombreuses maladies nosocomiales et dans l’infection de patients immunodéprimés. Les lectines sont des glycoprotéines formant des interactions faibles et réversibles avec les saccharides, et elles sont impliquées dans les mécanismes de protection et de virulence de la bactérie. Afin d’augmenter l’affinité des sucres pour celle-ci nous utilisons la multivalence conduisant à des leurres moléculaires ciblant les lectines I et II de PA. Notre stratégie consiste à synthétiser des glycoclusters conjugués à une étiquette ADN permettant leur criblage par des puces à ADN. Nous décrivons le design, la synthèse et l’assemblage des différents blocs de construction composant les glyco-oligonucléotides en s’appuyant sur la chimie "Click" (CuAAc) et la chimie oligonucléotidique. Le criblage des glyco-oligonucléotides est complété par des études de modélisation moléculaire et par RMN STD. Les meilleurs composés issus du criblage sont synthétisés sans leur étiquette ADN afin d’évaluer leur capacité inhibitrice de la formation du biofilm par PA. / Pseudomonas aeruginosa (PA) is a bacteria with a strong resistance to antibiotics.It’s an opportunistic germ involved in nosocomial infections and the infection of immunocompromised patients. Lectins are glycoproteins that bind saccharides reversibly with a low affinity. They are involved in bacteria protection mechanisms and virulence. In order to increase the affinity of saccharides to PA lectins I and II, we used multivalence and synthesized molecular decoys. Our strategy involves the synthesis of glycoclusters conjugated with a DNA tag in order to easily screen them on DNA arrays. We described here the design, the synthesis and the assembly of different building blocks allowing the synthesis of glyco-oligonucleotides,based on "Click" chemistry (CuAAc) and oligonucleotide chemistry. The screening of theglyco-oligonucleotides was completed by studies of molecular modelisation and by STD NMR.The best compounds from the screening were synthesized without the DNA tag in order to evaluate their abilities of inhibiting the biofilm formation of PA.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-25Bitstream added on 2014-06-13T20:29:48Z : No. of bitstreams: 1 pesquero_nc_me_araiq.pdf: 1328191 bytes, checksum: b43c0dd0e4c51db5570dd9acd342760e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / No presente trabalho foi avaliada a equivalência entre as formas nativa e recombinante da lectina Artin M utilizando como ligante a peroxidase de raiz forte (HRP) por meio da técnica de microbalança a cristal de quartzo. Para tal foi preparado um biossensor por meio da imobilização da lectina, tanto nativa como recombinante, na superfície do cristal de quartzo piezelétrico. A imobilização das lectinas foi realizada por meio da construção de uma monocamada auto organizada utilizando dois alcanotióis, ácido 11-mercaptoundecanóico e o 2-mercaptoetanol. Para o acoplamento das proteínas foram utilizados N-etil-N- (dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidoxisuccinimida (NHS) que formam com os grupamentos carboxílicos um intermediário reativo. Após a preparação do biossensor foi utilizado um sistema de injeção em fluxo acoplado à microbalança de cristal a quartzo para o estudo da interação lectina-glicoconjugado. Desta forma, as interações da Artin M nativa e recombinante com a glicoproteína peroxidase de raiz forte foram estudadas por meio da determinação das suas constantes de afinidade aparente e de associação cinética, sendo que foram encontrados os valores de constante de afinidade aparente (4,6 ± 0,9) x 103 e (2,6 ± 0,5) x 103 L mol -1 para as interações jArtinM-HRP e rArtinM-HRP, e os valores de constante cinética (7 ± 3) x 103 e (7 ± 2) x 103 L mol -1 para as interações jArtinM-HRP e rArtinM-HRP. Os valores das constantes de interação obtidos evidenciaram a equivalência entre ambas as formas da lectina Artin M. Neste trabalho também foi determinada a constante de associação cinética da interação entre a lectina Artin M recombinante e linhagens celulares de leucemia mielóide aguda humana (NB4, K562 e U937), no intuito de melhor entender a diferença na citotoxicidade observada da Artin M sobre estas células... / In the present work was evaluated the equivalence between the native and recombinant forms of Artin M using horseradish peroxidase as ligand by means the quartz crystal microbalance technique. In this way, a biosensor was prepared immobilizing the lectin, native and recombinant forms, on piezoelectric quartz crystal surface. Lectins immobilization was realized constructing self assembled monolayers using the alkanethiols 11-mercaptoundecanoic acid and 2-mercaptoethanol. To the binding of proteins was used N-ethyl-N-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), which form with carboxylic groups a reactive intermediary. After biosensor preparation was utilized a flow injection system coupled to quartz crystal microbalance to study the lectin-glycoconjugated interaction. Thus the native Artin M and recombinant Artin M interaction with horseradish peroxidase glycoprotein were studied by determining its apparent affinity constant and association kinetic constants. The values obtained to apparent affinity constant were (4,6 ± 0,9) x 103 e (2,6 ± 0,5) x 103 L mol -1 to jArtinM-HRP e rArtinM-HRP interactions, and the values obtained to association kinetic constant were (7 ± 3) x 103 e (7 ± 2) x 103 L mol -1 to jArtinM-HRP e rArtinM-HRP interactions. These constant values evidence the equivalence between native and recombinant forms of Artin M lectin. During this work were also determined the association kinetic constant of the interaction between recombinant Artin M and leukemic lineages from human acute myeloid leukemia (NB4, K562 and U937), with the purpose of a better understanding in the different cytotoxic effect of Artin M on these cells. In this way the values of association kinetic constant obtained was (0,3 ± 0,1) x 10-7 , (0,9 ± 0,1) x 10-7 e (2,7 ± 0,3) x 10-7 mL cel -1 to the interactions between Artin M and NB4, K562 and U937, respectively

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1333665 bytes, checksum: 2f915f0ace8bbb6bb5fbbb794e7c40d5 (MD5) Previous issue date: 2013-06-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In many parts of the world leguminous plant is one of the most widely known plants previously reported. There are many different types of plants in the family leguminous used as food, in this case, the genus Canavalia comprises a group of some 48 species. The term lectin (derived from the latin word legere, meaning, among other things, to select) represent a heterogeneous group of proteins ranging from size, structure, molecular organization and constitution of interaction points as well as performing several biological activities such as anti-inflammatory, antifungal and antibiotic. Until now, the lectins of plants are one of the most studied, although some lectins in animals are well-specified. This research aim to isolate, purify and define biological activities of a new lectin present in the seeds of the Canavalia maritime. The results indicate the presence of a new lectin with a preference to agglutinate native erythrocytes of rabbit. These lectins were both purified in column chromatography of Sephadex G-50 and chitin, molecular exclusion in HPLC system, respectively. The purity and molecular weight (approximate) of the new lectin (from 50 to 55 kDa) was detected by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The new lectin did not cause hemolysis in human erythrocytes type A, O and AB, it reflects the interaction level of the sugars. According to sugar inhibition assays, the new lectin (content 71,5μg) indicates it is specific for arabinose, fructose, maltose, saccharose and xylose. On the other hand, the new lectin did not prevent the growth of tested bacterial strains, however, it is able to promote the proliferation these microorganisms. It also presented an anti-inflammatory activity as peritonitis induced by carrageenan in mice reducing the migration of neutrophils in the peritoneum of mice and permeability of the blood vessels. It also produced antifungal activity on the growth of the fungus C. neoformans, on its growth assay, evidenced by CIM determination, in this case, the results demonstrates no growth in the presence of the new lectin. / As leguminosas estão entre as plantas mais conhecidas pelas pessoas de diversas partes do mundo. Nesta família, muitas são as plantas que usamos como alimento. O gênero Canavalia ao qual pertence o feijão da praia, dentro da família Leguminosae, é formado por um pequeno grupo de 48 espécies. O termo lectina (do latim legere , que significa escolher, selecionar), representa um grupo heterogêneo de proteínas que variam amplamente em tamanho, estrutura, organização molecular, bem como na constituição de seus sítios de interação, desempenhando atividades biológicas diversas como antiinflamatórias, antifúngicas e antibióticas. As lectinas de plantas são as mais estudadas até então, embora algumas presentes em animais e microorganismos já tenham sido bem caracterizadas. O objetivo geral deste trabalho foi isolar, purificar e determinar atividades biológicas de uma nova lectina presente em sementes da leguminosa Canavalia maritima. Os resultados indicaram a presença de uma nova lectina com preferência em aglutinar eritrócitos nativos de coelho, purificada através de cromatografias de afinidade em Sephadex G-50 e quitina, e de exclusão molecular em sistema HPLC, respectivamente. Por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS, foi constatada a pureza e o peso molecular aproximado da nova lectina de 50 a 55 kDa. A nova lectina não promoveu hemólise em eritrócitos humanos dos tipos A, O e AB, em graus variáveis, o que reflete a sua especificidade de interação com diferentes açúcares. Com uma composição de 71,5 μg de carboidratos, a nova lectina demonstrou, pelo teste de inibição por açúcares, especificidade para os açúcares arabinose, frutose, maltose, sacarose e xilose. Por outro lado, a nova lectina, não inibiu o crescimento das linhagens bacterianas testadas, entretanto, observou-se que ela é capaz de promover a proliferação destes microorganismos. Apresentou atividade antiinflamatória, no modelo de peritonite induzido por carragenina em camundongos, reduzindo a migração dos neutrófilos no peritônio de camundongos e a permeabilidade dos vasos sanguíneos. Também produziu atividade antifúngica sobre o crescimento dos fungos C. neoformans, nos ensaios de crescimento das cepas, evidenciado pela determinação da CIM, onde os resultados demonstraram que não houve crescimento na presença da nova lectina.

Made available in DSpace on 2015-04-17T15:03:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 259478 bytes, checksum: 7981f32021e8381b533257b3f580230e (MD5) Previous issue date: 2010-02-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The human unconventional or alternative feeding consists of foods or parts not normally used, whose nutritional value has been evaluated over the past years. This made the seeds of various plant species to become alternative sources of proteins and lipids for human consumption. The isolation and physicochemical characterization of new molecules of plant foods, with a view to their physiological action in the human body, are used as potential source for the discovery of new bioactive molecules. A particular group of these molecules, the lectins, are proteins of nonimmune origin containing at least one non-catalytic domain of specific binding, and reversible, the carbohydrates. Several lectins have been studied, both in terms of physicochemical and biological characterization. In this context, okra Abelmoschus esculentus (L.) Moench, (Malvaceae), a vegetable widespread in Northeastern Brazil, besides the easy access and low cost, seems to be a promising source in the search for new lectins. However, research on its purification and isolation are still incipient. The objective of this study was to evaluate the nutritional quality of okra seeds, and to detect, purify, and characterize the physicochemical aspects, and to evaluate the herbal and pharmacological potential ( antinocicepitive,cytotoxic anti-inflammatory and antifungal activity) of the isolated lectin present in Abelmoschus esculentus seeds.showed a predominance of total carbohydrates represented by fibers (30.81%) and soluble carbohydrates (6.69%), proteins (22.14%) and lipids (14.01%). The lectin from seed flour was extracted with 0.1 M Tris pH 7.4 with 0.15 M NaCl. The detection of the presence of lectins AES was determined by testing hemagglutination activity and human erythrocytes shows that B (24.00 UH.mP-1), O (21.00 UH.mP-1) and rabbits treated and untreated (74.41 UH. mP-1) were agglutinated by the lectin.The lectin was purified by precipitation with ammonium sulfate and eluted in ion exchange column. Rabbit erythrocytes were selected for testing the inhibition of the hemagglutinating activity (UA) in carbohydrates. Its hemagglutinating activity was inhibited by lactose, fructose and manose. The protein profile of AES analyzed by PAGE-SDS demonstrates that the lectin is purified, presenting two bands of apparent molecular mass between 25 and 14 kDa. The analysis by mass spectrometry showed the monomeric form with 10.29 kDa and its dimer of 20.58 kDa. The biological activity tests of the lectin from AES flour previously purified presented anti-inflammatory and antinociceptive activity and showed no cytotoxicity when compared to erythrocytes from the ABO system. The intravenous pretreatment of animals with AES (0.01, 0.1 and 1 mg / kg) before the administration of the phlogistic agent (carrageenan) significantly reduced the edema by about 15%, 21.6%, 44%. This inhibition is dose dependent with maximum effect at 1mg/kg. The lectin from Albemoschus esculentus shows antinociceptive activity in writhing test induced by acetic acid and the okra seed extracts are able to recognize and inhibit the growth of the dermatophyte Tricophytum rubrum fungus. / A alimentação humana não convencional ou alternativa é composta por alimentos ou suas partes não habitualmente utilizadas, cujo valor nutritivo vem sendo avaliado ao longo dos últimos anos. Isso fez com que sementes de várias espécies vegetais tornassem recursos alternativos de proteínas e lipídeos para a alimentação humana. O isolamento e a caracterização físico-química de novas moléculas de alimentos vegetais, com vistas à sua ação fisiológica no organismo humano, utilizada como fonte potencial para o descobrimento de novas moléculas bioativas. Um grupo particular dessas moléculas, as lectinas, são proteínas de origem não imune contendo pelo menos um domínio não catalítico de ligação específica, e reversível, a carboidratos. Várias lectinas têm sido estudadas, tanto do ponto de vista de caracterização físico-química quanto biológica. Nesse contexto, o quiabo Abelmoschus esculentus (L.) Moench, (Malvaceae), hortaliça bastante difundida na região Nordeste do Brasil, além de fácil acesso e baixo custo, apresenta-se como uma fonte bastante promissora na busca por novas lectinas. Entretanto, pesquisas relativas à sua purificação e ao seu isolamento ainda são incipientes. Objetiva-se com este trabalho avaliar a qualidade nutricional das sementes do quiabo, detectar, purificar e caracterizar físico-quimicamente, avaliar o potencial fitoterápico e farmacológico (antinocicepitivo, citotóxico, antiinflamatório e antifúngico) da lectina isolada de sementes de Abelmoschus esculentus. As sementes apresentaram uma predominância de carboidratos totais representados pelas fibras (30,81%) e carboidratos solúveis (6,69%), proteinas (22,14%) e lipídeos (14,01%). A lectina da farinha das sementes foi extraída com Tris 0,1M pH 7,4 com NaCl 0,15M. A detecção da existência de lectinas (AES) foi determinada através de ensaio de atividade hemaglutinante e revela que eritrócitos humanos B (24.00 UH.mP-1), O (21.00 UH.mP-1) e coelho tratado e não tratado (74.41 UH.mP-1) foram aglutinados pela lectina. A lectina foi purificada por precipitação com sulfato de amônio e purificada em coluna de troca iônica. Eritrócitos de coelho foram utilizados para os testes de inibição da atividade hemaglutinante (UH) com carboidratos. Sua atividade hemaglutinante foi inibida por lactose, frutose e manose. O perfil protéico da AES analisado por PAGE-SDS demonstra que a lectina encontra-se purificada, apresentando duas bandas de massa molecular aparente entre 25 e 14 kDa. A análise por espectrometria de massa mostrou a forma monomérica com 10,29 kDa e seu dímero de 20,58 kDa. Os testes de atividade biológica da lectina de farinha de sementes previamente purificada apresentaram atividade antiinflamatória, antinociceptiva e não apresentou citotoxicidade frente a hemácias do sistema ABO. O pré-tratamento endovenoso dos animais com a AES (0,01; 0,1 e 1mg/kg), antes da administração do agente flogistico (carragenina), reduziu significativamente o edema em cerca de 15%, 21,6%, 44%. Esta inibição é dose dependente tendo seu máximo efeito na dose de 1mg/kg. A lectina de Abelmoschus esculentus apresenta atividade antinociceptiva no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético e os extratos da semente de quiabo são capazes de reconhecer e inibir o crescimento do fungo dermatófito Tricophytum rubrum.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DanielleSM.pdf: 1455943 bytes, checksum: 8efcc0f4d0f0ac8dfc93b332700f07cb (MD5) Previous issue date: 2008-02-29 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Four different sponge species were screened using Ouchterlony agarose gel and immunodiffusion tests to identify cross-reactivity with the polyclonal antibody IgG anti-deglicosilated CvL, a lectin from Cliona varians. Crude extract from the sponge Cinachyrella apion showed cross-reactivity and also a strong haemmaglutinating activity towards human erythrocytes of all ABO groups. Thus, it was submitted to acetone fractionation, IgG anti-deglicosilated CvL Sepharose affinity chromatography, and Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC-AKTA) gel filtration on a Superose 6 10 300 column to purify a novel lectin. C. apion lectin (CaL) agglutinated all types of human erythrocytes with preference for papainized type A and O erythrocytes. The haemagglutinating activity is independent of Ca2+, Mg2+ and Mn2+ ions, and it was strongly inhibited by the disaccharide D-lactose, up to a minimum concentration of 6.25 mM. CaL molecular mass determined by FPLC-AKTA gel filtration on a Superose 12 10 300 column and SDS gel electrophoresis was approximately 124 kDa, consisting of eight subunits of 15.5 kDa, assembled by hydrophobic interactions. The lectin was relatively heat- and pH-stable. Leishmania chagasi romastigotes were agglutinated by CaL, indicating that lactose receptors could be presented in this parasite stage. These findings are indicative of the physiological defense roles of CaL and its possible use in the antibiosis of pathogenic protozoa / Uma varredura de lectinas foi realizada em extratos prot?icos de quatro esp?cies de esponjas utilizando t?cnicas de imunodifus?o para identificar lectinas imunorreativas ao anticorpo policlonal gerado contra CvL, uma lectina de Cliona varians. O extrato bruto da esponja Cinachyrella apion foi imunorreativo e apresentou atividade hemaglutinante a eritr?citos humanos de todos os grupos do sistema ABO. Assim, ele foi submetido ao fracionamento com acetona, ? cromatografia de afinidade com IgG anti-CvL desglicosilada ligada a Sepharose e ? romatografia de gel filtra??o em uma coluna Superose 6 10 300 GL em istema FPLC-AKTA (Fast Protein Liquid Chromatography) para a purifica??o de uma lectina imunorreativa ao anticorpo IgG anti-CvL. A lectina de C. apion (CaL) aglutinou todos os tipos de eritr?citos humanos, com prefer?ncia por eritr?citos papainizados dos tipos A e O. A atividade hemaglutinante mostrou-se independente dos ?ons Ca2+, Mg2+ e Mn2+, e foi fortemente inibida pelo dissacar?deo D-lactose, at? a concentra??o m?nima de 6,25 mM. A massa molecular da CaL, determinada por gel filtra??o em uma coluna Superose 12 10 300 GL em sistema FPLC-AKTA e eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, foi de aproximadamente 124 kDa, consistindo de oito subunidades de 15,5 kDa, unidas por intera??es hidrof?bicas. A lectina foi relativamente est?vel em extensas faixas tanto de pH quanto de temperatura. Promastigotos de Leishmania chagasi foram aglutinados por CaL, indicando que receptores de lactose podem estar presentes nesse est?gio do parasita. Esses achados s?o indicativos do papel de defesa fisiol?gica da CaL e do seu poss?vel uso na antibiose de protozo?rios patog?nicos

Orientador: Paulo Roberto Bueno / Banca: Marcelo Mulato / Banca: Maria Cristina Roque Antunes Barreira / Resumo: No presente trabalho foi avaliada a equivalência entre as formas nativa e recombinante da lectina Artin M utilizando como ligante a peroxidase de raiz forte (HRP) por meio da técnica de microbalança a cristal de quartzo. Para tal foi preparado um biossensor por meio da imobilização da lectina, tanto nativa como recombinante, na superfície do cristal de quartzo piezelétrico. A imobilização das lectinas foi realizada por meio da construção de uma monocamada auto organizada utilizando dois alcanotióis, ácido 11-mercaptoundecanóico e o 2-mercaptoetanol. Para o acoplamento das proteínas foram utilizados N-etil-N- (dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-hidoxisuccinimida (NHS) que formam com os grupamentos carboxílicos um intermediário reativo. Após a preparação do biossensor foi utilizado um sistema de injeção em fluxo acoplado à microbalança de cristal a quartzo para o estudo da interação lectina-glicoconjugado. Desta forma, as interações da Artin M nativa e recombinante com a glicoproteína peroxidase de raiz forte foram estudadas por meio da determinação das suas constantes de afinidade aparente e de associação cinética, sendo que foram encontrados os valores de constante de afinidade aparente (4,6 ± 0,9) x 103 e (2,6 ± 0,5) x 103 L mol -1 para as interações jArtinM-HRP e rArtinM-HRP, e os valores de constante cinética (7 ± 3) x 103 e (7 ± 2) x 103 L mol -1 para as interações jArtinM-HRP e rArtinM-HRP. Os valores das constantes de interação obtidos evidenciaram a equivalência entre ambas as formas da lectina Artin M. Neste trabalho também foi determinada a constante de associação cinética da interação entre a lectina Artin M recombinante e linhagens celulares de leucemia mielóide aguda humana (NB4, K562 e U937), no intuito de melhor entender a diferença na citotoxicidade observada da Artin M sobre estas células ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the present work was evaluated the equivalence between the native and recombinant forms of Artin M using horseradish peroxidase as ligand by means the quartz crystal microbalance technique. In this way, a biosensor was prepared immobilizing the lectin, native and recombinant forms, on piezoelectric quartz crystal surface. Lectins immobilization was realized constructing self assembled monolayers using the alkanethiols 11-mercaptoundecanoic acid and 2-mercaptoethanol. To the binding of proteins was used N-ethyl-N-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), which form with carboxylic groups a reactive intermediary. After biosensor preparation was utilized a flow injection system coupled to quartz crystal microbalance to study the lectin-glycoconjugated interaction. Thus the native Artin M and recombinant Artin M interaction with horseradish peroxidase glycoprotein were studied by determining its apparent affinity constant and association kinetic constants. The values obtained to apparent affinity constant were (4,6 ± 0,9) x 103 e (2,6 ± 0,5) x 103 L mol -1 to jArtinM-HRP e rArtinM-HRP interactions, and the values obtained to association kinetic constant were (7 ± 3) x 103 e (7 ± 2) x 103 L mol -1 to jArtinM-HRP e rArtinM-HRP interactions. These constant values evidence the equivalence between native and recombinant forms of Artin M lectin. During this work were also determined the association kinetic constant of the interaction between recombinant Artin M and leukemic lineages from human acute myeloid leukemia (NB4, K562 and U937), with the purpose of a better understanding in the different cytotoxic effect of Artin M on these cells. In this way the values of association kinetic constant obtained was (0,3 ± 0,1) x 10-7 , (0,9 ± 0,1) x 10-7 e (2,7 ± 0,3) x 10-7 mL cel -1 to the interactions between Artin M and NB4, K562 and U937, respectively / Mestre

A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma doença endêmica, crônica, grave e de alta letalidade se não tratada. Os estudos apontam a proteína Lectina Ligante de Manose (MBL), codificada pelo gene MBL2, como uma peça-chave na imunidade inata, dada a sua função no reconhecimento microbiano, na eliminação, inflamação e morte celular. Neste trabalho realizamos um estudo do tipo caso-controle que teve como objetivo investigar a associação entre variantes no gene MBL2 e a suscetibilidade à LV em indivíduos residentes em áreas endêmicas da Ilha de São Luís-MA. A amostra foi constituída por 322 indivíduos, sendo 161 casos com LV, não aparentados, de ambos os sexos, residentes em áreas endêmicas da doença na Ilha de São Luís e 161 controles saudáveis, não infectados e não aparentados da mesma região. A identificação dos casos de LV se deu por meio do contato constante com os principais hospitais e ambulatórios de referência para a doença na cidade. Também foram feitas buscas de pacientes com LV em ambiente domiciliar, a partir de registros da FUNASA-MA. A análise molecular consistiu na genotipagem de 6 variantes localizadas na região promotora [posições -550 (C>G), -221(G>C), +4(C>T)] e codificadora [códons 52 (C>T), 54 (G>A) e 57 (G>A)] do gene MBL2, através da reação em cadeia da polimerase e sequenciamento automático. A dosagem da proteína MBL no soro foi realizada pelo teste de ELISA. Verificamos que os fenótipos MBL dependem do conjunto de alelos presentes no gene MBL2, sendo nítido o efeito que as variantes defectivas causam nos níveis da proteína. Não encontramos diferença significativa entre casos e controles em relação à distribuição dos genótipos MBL2 e dos níveis séricos de MBL. As frequências alélicas das variantes exônicas na amostra total mostram que o alelo A é o mais comum (74,8%) e que os alelos defectivos (B, C e D) se encontram principalmente em heterozigose (36,6%), o que reforça a ideia de que alelos MBL2 defectivos são mantidos na população por conferirem vantagem seletiva aos heterozigotos. Em relação aos 3 principais polimorfismos existentes na região promotora, verificamos ser a variante -221G (Y) a mais frequente (88%) seguida de +4C (P) (73%) e de -550C (L) (67%). Identificamos oito haplótipos em MBL2 num total de 644 cromossomos avaliados, em 30 combinações diferentes, sendo HYPA e LYQA os mais frequentes e HYPD e HYPB os mais raros. Todos os portadores de combinações de haplótipos homozigotos para alelos defectivos apresentaram níveis séricos de MBL indetectáveis. Os genótipos LYQA/LYQA e HYPA/HYPA apresentaram as maiores concentrações médias de MBL no soro. A combinação entre SNPs no éxon 1 e na região promotora do gene MBL2 resulta em grande variação nas concentrações de MBL em indivíduos saudáveis. Consideramos que o conjunto de dados gerados é uma contribuição valiosa que poderá ser expandida para outros cenários. / Visceral leishmaniasis (VL), also known as kalazar, is an endemic, chronic, severe and highly lethal disease when not treated. Studies have shown that the protein Mannose-biding lectin (MBL), encoded by the gene MBL2, is the major player in innate immune system due its role in microbial recognition, elimination and inflammation as well as in the cell death. In the current work, we conducted a case-control study which aimed to investigate the association between variants in the gene MBL2 and the susceptibility to VL in individuals living in endemic areas of the São Luís - MA. 322 individuals participated in this study. Of these, 161 were VL cases being unrelated individuals of both sexes, and inhabitants from endemic areas of the disease in São Luís. The other 161 individuals were uninfected healthy controls, being unrelated and from the same region. The identification of VL cases occurred by visiting reference hospitals and clinics in the city. VL patients were identified in the household environment through the records of FUNASA-MA. Molecular analysis consisted in genotyping six variants located in the promoter region [positions -550 (C> G), -221 (G> C), +4 (C> T)] and coding region [codons 52 (C> T), 54 (G> A) and 57 (G> A)] of the MBL2 gene by polymerase chain reaction and automated DNA sequencing. The concentrations of MBL protein in the serum was performed by ELISA. We found that MBL phenotypes depend on the number of alleles present in the gene MBL2, being clear the consequence of the defective variants in the protein levels. There was no significant difference between cases and controls regarding the distribution of MBL2 genotypes and MBL serum levels. The allele frequencies of exon variants in the overall sample showed that the A allele is the most common (74.8%) and that the defective alleles (B, C and D) are mainly heterozygous (36.6%). This highlights the idea that defective MBL2 alleles are maintained in the population to confer selective advantage to heterozygotes. Concerning the three main existing polymorphisms in the promoter region, we noticed that the variant-221G (Y) is more frequent (88%) followed by +4 C (P) (73%) and 550C-(L) (67%) variants. We identified eight haplotypes in MBL2 in a total of 644 chromosomes evaluated in 30 different combinations, being the HYPA and LYQA the most frequent haplotypes and HYPD and HYPB the rarest ones. All carriers with combinations of homozygous haplotypes for defective alleles had undetectable serum levels of MBL. Genotypes LYQA / LYQA and HYPA / HYPA had the highest mean concentrations of MBL in the serum. Combination between SNPs in exon 1 and in the promoter region of the gene MBL2 results in a great variation of MBL concentrations in healthy individuals. We consider that the data set that was generated is a valuable contribution that can be expanded to others cenarios.

Os estudos sobre o mecanismo de enovelamento das proteínas é o resultado de um estudo intenso utilizando métodos bioquímicos, biofísicos e teóricos. \"In vitro\", o estado inicial deste estudo é a proteína desnaturada. Neste trabalho, temos estudado o reenovelamento, após desnaturação térmica, de uma glicoproteína denominada frutalina; da família das lectinas. A característica principal desta classe de proteínas é sua habilidade para interagir com carboidratos e, portanto, combinar-se com glicocomponentes da superfície da célula, induzindo suas propriedades biológicas. A frutalina é uma lectina tetramérica extraída das sementes de Artocarpus incisa. Ela é ligante de D-galactose e o espectro de CD (dicroísmo circular) de sua estrutura nativa foi identificado como sendo dominado por folhas ?. A desnaturação térmica e as etapas do reenovelamento foram monitoradas por espectroscopia de CD, fluorescência e também pela perda da atividade hemaglutinante. As condições de desnaturação utilizadas foram aquecimento à 60°C por 30 a 60 minutos, dependendo do tempo de estocagem (a -18°C) da proteína na forma nativa. Os resultados indicaram que o reenovelamento é promovido por um processo de congelamento na presença de PBS contendo 0,l M de D-galactose seguida por centrífugoconcentração em Centriprep 3. A hemaglutinação positiva ocorreu tanto para a fração nativa quanto para a fração reenovelada. O reenovelamento da frutalina desnaturada também ocorreu com PBS contendo 0,1 M de solução de D-glicose. Quando a forma desnaturada foi concentrada antes do congelamento em PBS sem D-galactose ou em PBS contendo xilose, o reenovelamento não ocorreu. Estes resultados mostraram que o reenovelamento da frutalina foi dependente da ligação com a D-galactose ou D-glicose, bem como a importância do congelamento para obter a forma biologicamente ativa. A análise da estrutura secundária utilizando o programa CCA forneceu um resultado importante: para a forma nativa da frutalina obtivemos 85% de folhas ? paralelas e antiparalelas, incluindo voltas ?, enquanto que para a forma reenovelada obtivemos 73%, mostrando que a estrutura reenovelada, a nível secundário, se aproximou satisfatoriamente da nativa, concordando com os resultados obtidos nos testes de hemaglutinação. / Our current understanding of the protein folding mechanism is the result of intense study employing biophysical, biochemical and theoretical methods. \"In vitro\", the initial state of the protein in this puzzle is its unfolded form. In the present work we have studied the refolding, after thermal denaturation, of the glycoprotein frutalin, a member of the lectin class. The main characteristic of these proteins is their ability to interact with carbohydrates and thus combine with glycocomponents of the cell surface, leading to their biological properties. Frutalin is a tetrameric lectin extracted from the seeds of Artocarpus incisa. It is D-galactose specific and its native CD spectrum was identified as being dominated by ? -sheet. The thermal unfolding and refolding steps were measured by CD and fluorescence spectroscopies together with the loss of hemagglutinating activity. The unfolding conditions used were 60°C for 30 to 60 minutes, depending on the protein storage time. The results indicate that refolding is promoted by the freezing process in the presence of 0,1 M D-galactose-PBS followed by three-fold concentration in a Centriprep 3. Positive hemagglutination occurred for both the native and refolded forms. Refolding of denatured frutalin also occurred with PBS containing 0,1 M D-glucose. When the unfolded form was concentrated before freezing in PBS without D-galactose or in PBS containing xylose, refolding did not occur. These results show that the refolding of frutalin is dependent on the binding of D-galactose or D-glucose, and demonstrate the importance of freezing in order to obtain the biologically activity form. An analysis of secondary structure using the CCA program showed an important result: the native form, presented 85% ? -sheet/ ?-turns, while in the refolded form, this content fell to 73%. These results show that the refolded form is very similar to the native protein, which is in agreement with the hemagglutination results.

O estudo de enovelamento de proteínas tem sido um problema de fundamental importância em biofísica e biologia molecular. Neste trabalho, estudamos os processos de desnaturação e renovelamento das lectinas jacalina e frutalina. Estas lectinas são tetraméricas, apresentam alta homologia estrutural, porém diferem em atividade biológica, sendo a frutalina mais potente. Apesar desta homologia, estas lectinas diferem também nos processos de desnaturação e renovelamento como função da temperatura e o comportamento frente ao desnaturante químico hidrocloreto de guanidina (GndHCl). Ambas proteídas foram desnaturadas pela ação de GndHCl e suas curvas de desnaturação medidas por espectroscopia de fluorescência e CD. As medidas de fluorescência da frutalina deram valores de estabilidade conformacional de 17,12 kJ/mol e 12,34 kJ/mol, na presença e na ausência de D-Galactose, enquanto a jacalina forneceu valores de 8,12 kJ/mol para a transição NI e 5,61 kJ/mol para a transição IU em PBS. Os valores na presença de açúcar foram similares. NOs estudos da frutalina foram separadas as formas nativa, desnaturada, renovelada e uma forma molecularmente distinta chamada mal-enovelada, por cromatografia de exclusão molecular. Estas formas foram analisadas por atividades hemaglutinante e espectroscopias de CD e fluorescência. Todos os resultados obtidos confirmaram a ocorrência do renovelamento de ambas lectinas e que os monômeros renovelados, depois de alcançarem sua estrutura tridimensional, se associam espontaneamente para a formação dos tetrâmeros. / Protein refolding is currently a fundamental problem in biophysics and molecular biology. We have studied the refolding process of jacalin and frutalin. They are tetrameric lectins that present structural homology, buti jacalin shows a more marked biological activity than the latter. These proteins, despite their homology, have different unfolding/refolding behaviors as function of temperature and chemical agents. Both proteins were unfolded induced by guanidine hydrochlroide and their dnaturation curves mesuared by fluorescence emission and CD. Fluorescence measurments of frutalin gave values of conformational stability of 17.12 kJ/mol and 12.32 kJ/mol, in the presence and absence of D-Galactose, while jacaline gave values of 8.12 kJ/mol for NI transition and 5.61 kJ/mol for IU transition in PBS. In sugar presence the values are similar. In the frutalin studies were separeted the native, unfolded, refolded and a distinct molecular form denoted misfolded, by Size Exclusion Chromatography. These forms were analyzed for hemagglutination activity, CD and fluorescence spectroscopy. All the results obtained confirmed the successful refolding of the both lectins and the refolded monomers, after adopting their native three-dimensional structures, spontaneously assembled to form tetramers.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As sementes de Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff, uma espÃcie pertencente à famÃlia Leguminosae, subfamÃlia Papilionoideae, tribo Dalbergieae, possuem uma lectina glicose/manose especÃfica, que aglutina eritrÃcitos de coelhos nativos ou tratados com enzimas proteolÃticas. A lectina de sementes de Andira surinamensis foi purificada atravÃs de cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-Manose seguida por cromatografia de troca iÃnica em matriz de DEAE-Sephacel. Esse procedimento resultou na lectina purificada, nomeada de ASL. O processo de purificaÃÃo da ASL foi monitorado pela atividade hemaglutinate especÃfica e SDS-PAGE, onde se observou que essa lectina à composta por seis bandas protÃicas, uma de maior peso molecular aparente de aproximadamente 20 kDa e outras cinco bandas de menor peso molecular aparente entre 15 e 12 kDa. A massa molecular intacta da lectina purificada foi determinada atravÃs da tÃcnica de espectrometria de massa com IonizaÃÃo por Eletrospray (ESI). A anÃlise do espectro de massa intacta mostrou a presenÃa de dois Ãons majoritÃrios de massa molecular de 12.220+ 2 e 13.258 + 2 Da. ASL tambÃm teve sua estrutura primÃria parcialmente sequenciada atravÃs de espectrometria de massa sequencial. Essa lectina à uma glicoproteÃna e demonstra elevada estabilidade, sendo capaz de manter sua atividade hemaglutinante em uma ampla faixa de pH e apÃs exposiÃÃo a temperaturas de atà 80 ÂC por 1hora. ApÃs diÃlise contra o agente quelante EDTA, ASL teve sua atividade hemaglutinante diminuÃda, porÃm recuperou sua atividade apÃs a adiÃÃo de metais, mostrando-se dependente de cÃtions metÃlicos divalentes. Foi avaliado tambÃm o efeito da ASL no crescimento planctÃnico bacteriano e na formaÃÃo de biofilmes e observou-se que ela interferiu no crescimento planctÃnico de duas diferentes cepas bacterianas gram-positivas (Streptococcus mitis e Streptococcus salivarius) e na formaÃÃo de biofilme por Staphylococcus aureus e Streptococcus salivarius. / Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff seeds, a species belonging to the Leguminosae family, Papilionoideae subfamily, Dalbergieae tribe, have a glucose/mannose specific lectin rabbit erythrocytes that agglutinate native or treated with proteolytic enzymes. The lectin from Andira surinamensis seeds was purified by affinity chromatography on Mannose-Sepharose matrix followed by ion exchange chromatography on DEAE-Sephacel matrix. This procedure resulted in a purified lectin, named ASL. ASL purification process was monitored by specific hemagglutinating activity and SDS-PAGE, where it was observed that this lectin is composed of six protein bands, a higher molecular weight of approximately 20 kDa and five other bands of lower apparent molecular weight between 15 and 12 kDa.The intact molecular mass of the purified lectin was determined by mass spectrometry with electrospray ionization (ESI). The analysis of the intact mass spectrum showed the presence of two majority ions of molecular mass 12.220+ 2 and 13.258 + 2 Da. ASL also had its primary structure partially sequenced by mass spectrometry sequence. This lectin is a glycoprotein and shows high stability, being able to maintain their hemagglutinating activity in a wide pH range and after exposure to temperatures up to 80 ÂC for 1 hour. After dialysis against the chelating agent EDTA, ASL had its hemagglutinating activity decreased, but recovered its activity after the addition of metals, being dependent on divalent metal cations. We also evaluate the effect of ASL on planktonic bacterial growth and biofilm formation and found that it interfered with the growth of two different planktonic gram-positive bacterial strains (Streptococcus mitis and Streptococcus salivarius) and biofilm formation by Stafilococcus aureus e Streptococcus salivarius.