O estudo de enovelamento de proteínas tem sido um problema de fundamental importância em biofísica e biologia molecular. Neste trabalho, estudamos os processos de desnaturação e renovelamento das lectinas jacalina e frutalina. Estas lectinas são tetraméricas, apresentam alta homologia estrutural, porém diferem em atividade biológica, sendo a frutalina mais potente. Apesar desta homologia, estas lectinas diferem também nos processos de desnaturação e renovelamento como função da temperatura e o comportamento frente ao desnaturante químico hidrocloreto de guanidina (GndHCl). Ambas proteídas foram desnaturadas pela ação de GndHCl e suas curvas de desnaturação medidas por espectroscopia de fluorescência e CD. As medidas de fluorescência da frutalina deram valores de estabilidade conformacional de 17,12 kJ/mol e 12,34 kJ/mol, na presença e na ausência de D-Galactose, enquanto a jacalina forneceu valores de 8,12 kJ/mol para a transição NI e 5,61 kJ/mol para a transição IU em PBS. Os valores na presença de açúcar foram similares. NOs estudos da frutalina foram separadas as formas nativa, desnaturada, renovelada e uma forma molecularmente distinta chamada mal-enovelada, por cromatografia de exclusão molecular. Estas formas foram analisadas por atividades hemaglutinante e espectroscopias de CD e fluorescência. Todos os resultados obtidos confirmaram a ocorrência do renovelamento de ambas lectinas e que os monômeros renovelados, depois de alcançarem sua estrutura tridimensional, se associam espontaneamente para a formação dos tetrâmeros. / Protein refolding is currently a fundamental problem in biophysics and molecular biology. We have studied the refolding process of jacalin and frutalin. They are tetrameric lectins that present structural homology, buti jacalin shows a more marked biological activity than the latter. These proteins, despite their homology, have different unfolding/refolding behaviors as function of temperature and chemical agents. Both proteins were unfolded induced by guanidine hydrochlroide and their dnaturation curves mesuared by fluorescence emission and CD. Fluorescence measurments of frutalin gave values of conformational stability of 17.12 kJ/mol and 12.32 kJ/mol, in the presence and absence of D-Galactose, while jacaline gave values of 8.12 kJ/mol for NI transition and 5.61 kJ/mol for IU transition in PBS. In sugar presence the values are similar. In the frutalin studies were separeted the native, unfolded, refolded and a distinct molecular form denoted misfolded, by Size Exclusion Chromatography. These forms were analyzed for hemagglutination activity, CD and fluorescence spectroscopy. All the results obtained confirmed the successful refolding of the both lectins and the refolded monomers, after adopting their native three-dimensional structures, spontaneously assembled to form tetramers.

HCMV is a common viral pathogen that infects most of the world's population by early adulthood. It is typically asymptomatic in immunologically healthy individuals but causes severe disease in immunocompromised patients and congenitally infected infants. HCMV glycoproteins are highly polymorphic, and various types of associations have been suggested between glycoprotein types and the pathogenicity of the virus. Several studies on viruses other than HCMV have related the glycosylation of the viral glycoproteins to virulence. This project aimed to determine whether there is a robust relationship between the individual glycoprotein sequence and its glycosylation, how this influences the growth characteristic of the virus and whether this is related to its pathogenicity. Glycosylation patterns of 89 clinical specimens of different infection categories and specimen types were correlated with genetic sequence alterations of the virus glycoproteins (gB, gH, gL, gM, gN, gO), followed by determining whether mutation results in specific changes in glycosylation. The aim was approached using a cell culture model and a quantitative lectin-based assay (ELLA). A significantly increased glycosylation level for the following genotypes: mixed gH, gN4a, gO4, mixed gL was detected. Whereas a decreased pattern was found to be associated with gH1, gH2, gN3a, gO1a and gL2 genotypes (P < 0.05). Glycoproteins of strains isolated from respiratory specimens were significantly highly glycosylated compared to the blood and urine samples, and from blood specimens compared to the urine samples (P < 0.05). Furthermore, strains from congenitally infected infants and urine samples had a significantly higher growth rate than others tested. No direct association between the virus growth and its virulence was found. These findings demonstrate that glycosylation of glycoproteins in HCMV is affected by the glycoprotein polymorphisms and signifies a potentially important mechanism for avoidance of antibody-mediated neutralization, which, in turn, facilitates HCMV pathogenicity. This phenomenon requires further study and may have application for the selection of novel targets for diagnosis, vaccine development and other preventive measures to combat diseases caused by this virus.

A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma doença endêmica, crônica, grave e de alta letalidade se não tratada. Os estudos apontam a proteína Lectina Ligante de Manose (MBL), codificada pelo gene MBL2, como uma peça-chave na imunidade inata, dada a sua função no reconhecimento microbiano, na eliminação, inflamação e morte celular. Neste trabalho realizamos um estudo do tipo caso-controle que teve como objetivo investigar a associação entre variantes no gene MBL2 e a suscetibilidade à LV em indivíduos residentes em áreas endêmicas da Ilha de São Luís-MA. A amostra foi constituída por 322 indivíduos, sendo 161 casos com LV, não aparentados, de ambos os sexos, residentes em áreas endêmicas da doença na Ilha de São Luís e 161 controles saudáveis, não infectados e não aparentados da mesma região. A identificação dos casos de LV se deu por meio do contato constante com os principais hospitais e ambulatórios de referência para a doença na cidade. Também foram feitas buscas de pacientes com LV em ambiente domiciliar, a partir de registros da FUNASA-MA. A análise molecular consistiu na genotipagem de 6 variantes localizadas na região promotora [posições -550 (C>G), -221(G>C), +4(C>T)] e codificadora [códons 52 (C>T), 54 (G>A) e 57 (G>A)] do gene MBL2, através da reação em cadeia da polimerase e sequenciamento automático. A dosagem da proteína MBL no soro foi realizada pelo teste de ELISA. Verificamos que os fenótipos MBL dependem do conjunto de alelos presentes no gene MBL2, sendo nítido o efeito que as variantes defectivas causam nos níveis da proteína. Não encontramos diferença significativa entre casos e controles em relação à distribuição dos genótipos MBL2 e dos níveis séricos de MBL. As frequências alélicas das variantes exônicas na amostra total mostram que o alelo A é o mais comum (74,8%) e que os alelos defectivos (B, C e D) se encontram principalmente em heterozigose (36,6%), o que reforça a ideia de que alelos MBL2 defectivos são mantidos na população por conferirem vantagem seletiva aos heterozigotos. Em relação aos 3 principais polimorfismos existentes na região promotora, verificamos ser a variante -221G (Y) a mais frequente (88%) seguida de +4C (P) (73%) e de -550C (L) (67%). Identificamos oito haplótipos em MBL2 num total de 644 cromossomos avaliados, em 30 combinações diferentes, sendo HYPA e LYQA os mais frequentes e HYPD e HYPB os mais raros. Todos os portadores de combinações de haplótipos homozigotos para alelos defectivos apresentaram níveis séricos de MBL indetectáveis. Os genótipos LYQA/LYQA e HYPA/HYPA apresentaram as maiores concentrações médias de MBL no soro. A combinação entre SNPs no éxon 1 e na região promotora do gene MBL2 resulta em grande variação nas concentrações de MBL em indivíduos saudáveis. Consideramos que o conjunto de dados gerados é uma contribuição valiosa que poderá ser expandida para outros cenários. / Visceral leishmaniasis (VL), also known as kalazar, is an endemic, chronic, severe and highly lethal disease when not treated. Studies have shown that the protein Mannose-biding lectin (MBL), encoded by the gene MBL2, is the major player in innate immune system due its role in microbial recognition, elimination and inflammation as well as in the cell death. In the current work, we conducted a case-control study which aimed to investigate the association between variants in the gene MBL2 and the susceptibility to VL in individuals living in endemic areas of the São Luís - MA. 322 individuals participated in this study. Of these, 161 were VL cases being unrelated individuals of both sexes, and inhabitants from endemic areas of the disease in São Luís. The other 161 individuals were uninfected healthy controls, being unrelated and from the same region. The identification of VL cases occurred by visiting reference hospitals and clinics in the city. VL patients were identified in the household environment through the records of FUNASA-MA. Molecular analysis consisted in genotyping six variants located in the promoter region [positions -550 (C> G), -221 (G> C), +4 (C> T)] and coding region [codons 52 (C> T), 54 (G> A) and 57 (G> A)] of the MBL2 gene by polymerase chain reaction and automated DNA sequencing. The concentrations of MBL protein in the serum was performed by ELISA. We found that MBL phenotypes depend on the number of alleles present in the gene MBL2, being clear the consequence of the defective variants in the protein levels. There was no significant difference between cases and controls regarding the distribution of MBL2 genotypes and MBL serum levels. The allele frequencies of exon variants in the overall sample showed that the A allele is the most common (74.8%) and that the defective alleles (B, C and D) are mainly heterozygous (36.6%). This highlights the idea that defective MBL2 alleles are maintained in the population to confer selective advantage to heterozygotes. Concerning the three main existing polymorphisms in the promoter region, we noticed that the variant-221G (Y) is more frequent (88%) followed by +4 C (P) (73%) and 550C-(L) (67%) variants. We identified eight haplotypes in MBL2 in a total of 644 chromosomes evaluated in 30 different combinations, being the HYPA and LYQA the most frequent haplotypes and HYPD and HYPB the rarest ones. All carriers with combinations of homozygous haplotypes for defective alleles had undetectable serum levels of MBL. Genotypes LYQA / LYQA and HYPA / HYPA had the highest mean concentrations of MBL in the serum. Combination between SNPs in exon 1 and in the promoter region of the gene MBL2 results in a great variation of MBL concentrations in healthy individuals. We consider that the data set that was generated is a valuable contribution that can be expanded to others cenarios.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / No presente trabalho à feita a descriÃÃo de trÃs genes distintos que codificam lectinas ou proteÃnas relacionadas à lectina de Vatairea macrocarpa. As sequÃncias foram obtidas pela amplificaÃÃo de DNA genÃmico e cDNA de folhas utilizando primers semi-degenerados construÃdos a partir da informaÃÃo da sequÃncia de aminoÃcidos da lectina VML depositada no GenBank. O resultado do sequenciamento revelou a presenÃa de trÃs contigs. O contig1 corresponde à lectina VML desde que se assuma que a lectina depositada VML contenha heterogeneidades ou ambiguidades decorrentes na degradaÃÃo de Edman. A traduÃÃo dos contigs 2 e 3 mostram identidade de sequÃncia de 77% quando comparadas com VML. As sequÃncias, apesar de apresentar regiÃes conservadas, mostram diferenÃas de aminoÃcidos nos sÃtios de N-glicosilaÃÃo, sÃtios de ligaÃÃo a carboidrato e metais alÃm da presenÃa de resÃduos de cisteÃna sugerindo que tais proteÃnas podem ter outras atividades biolÃgicas. A anÃlise da sequÃncia obtida pelo 3â RACE se mostrou complementar ao contig3. Sendo assim, a sequÃncia hÃbrida contig3/contigA possui 2 resÃduos de cisteÃna alÃm de revelar diferenÃas de aminoÃcidos na regiÃo C-terminal quando alinhada com outras lectinas de leguminosas. AnÃlises filogenÃticas revelaram que os contigs observados formam um grupo monofiletico e tem alta similaridade com as lectinas de Sohora japonica e Robinia pseudoacacia, alÃm da proteÃna relacionada à lectina de Cladrastis lutea. / In this paper is made a description of three distinct genes that encode Vatairea macrocarpa lectin and related proteins. The sequences were obtained by amplification of genomic DNA and cDNA of leaves using semi - degenerate primers constructed from the information of the amino acid sequence of VML lectin deposited in GenBank. The result of sequencing rev eals the presence of three different genes, called contig 1, 2 and 3 . The VML lectin corresponds to contig1 long as one assumes that the lectin contains heterogeneities deposited VML or ambiguities arising in the Edman degradation . The translation of cont igs 2 and 3 show sequence identity of 77% compared to VML. Sequences, despite having conserved regions show differences in amino acid N - glycosylation sites, carbohydrate binding sites and metals and the presence of cysteine residues suggests that these pro teins may have other biological activities . The analysis of the sequence obtained by 3 'RACE proved complementary to contig3. Thus, the sequence contig3/contigA hybrid has two cysteine residues in addition to revealing differences in amino acid C - terminal region when aligned with other legume lectins. Phylogenetic analysis revealed that the observed contigs form a monophyletic group and has high similarity with lectins from Robinia pseudoacacia Sohora japonica and, in addition to the lectin - related protein Cladrastis lutea .

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Lectinas sÃo proteÃnas de origem nÃo imune que possuem pelo menos um domÃnio de ligaÃÃo especÃfica e reversÃvel a carboidratos, sem aÃÃo enzimÃtica. Estas proteÃnas sÃo amplamente distribuÃdas na natureza. As lectinas isoladas de sementes de leguminosas estÃo entre as mais estudadas e possuem homologia, sendo importantes marcadores moleculares da evoluÃÃo dentro desta famÃlia vegetal. Existem poucas informaÃÃes sobre as lectinas das tribos da base da subfamÃlia Papilionoideae e novas informaÃÃes sÃo importantes para solidificar os conhecimentos sobre as lectinas dessas tribos. Este trabalho teve como objetivo purificar uma nova lectina de sementes de Swartzia laevicarpa, caracteriza-la fÃsicoquimicamente e por espectrometria de massas e testa-la quanto a sua capacidade de causar inflamaÃÃo e dor e quanto a sua toxidade contra nÃuplios de Artemia sp. A lectina foi purificada por fracionamento por sulfato de amÃnio seguido de cromatografia de troca iÃnica e exclusÃo molecular. Denominada de SLA, a lectina apresenta o perfil eletroforÃtico de uma cadeia de 30 kDa e, diferente de SLL, apresenta subunidades por volta de 13 e 17 kDa. Possui afinidade por GalNAc e derivados de galactose, e apresenta caracterÃsticas termodinÃmicas de ligaÃÃo diferente para Gal e GalNAc. A lectina em estudo causou inflamaÃÃo em modelo de edema de pata de camundongos e hipernocicepÃÃo ligada a inflamaÃÃo. SLA tambÃm apresentou toxicidade contra nÃuplios de fase II de Artemia sp. A lectina isolada e caracterizada nesse trabalho demonstra ser uma ferramenta taxonÃmica interessante para corroborar o posicionamento de Swartzeae alÃm de demonstrar tambÃm um potencial biotecnolÃgico no estudo de modelos de inflamaÃÃo e dor. AtravÃs da espectrometria de massas foi possÃvel verificar que SLA apresenta pelo menos duas isoformas e apresenta glicoformas. Possui aproximadamente 250 resÃduos de aminoÃcidos e nesse trabalho foram determinados 179 deles. SLA apresentou similaridade com lectinas de outras tribos basais como VML e SJA, corroborando com a classificaÃÃo de Swartzieae como tribo de Papilionoideae e demonstrando a utilizaÃÃo de lectinas como ferramenta taxonÃmica. / Lectins are proteins of non-immune origin that have at least one specific and reversible carbohydrate binding domain without enzymatic action. These proteins are widely distributed in nature. Lectins isolated from legume seeds are among the most studied, have homology and are important markers of evolution within this plant family. There is little information about the lectins of the basal tribes of the subfamily Papilionoideae and new information is important to solidify your knowledge of the lectins of these tribes. This study aimed to purify a new lectin from Swartzia laevicarpa, to characterize its physical-chemical and mass spectrometry proprieties and test as its ability to cause inflammation and pain and their toxicity against Artemia sp. The lectin was purified by ammonium sulfate fractionation followed by ion exchange chromatography and molecular exclusion. Named SLA, the lectin shows the electrophoretic profile of a chain of 30 kDa and, unlike SLL presents subunits around 13 and 17 kDa. Has affinity for GalNAc and Gal derivatives, and presents thermodynamic binds characteristics of different for Gal and GalNAc. SLA caused inflammation in a model of paw edema of mice and hypernociception linked to inflammation. SLA also showed toxicity against stage II nauplii of Artemia sp. The lectin isolated and characterized in this work proves to be an interesting tool and corroborate the taxonomic placement of Swartzeae. SLA also demonstrate the biotechnological potential in the study of models from inflammation and pain. By mass spectrometry we found that SLA has at least two isoforms and provides glycoforms. It has approximately 250 amino acid residues and in this work were determined 179 of them. SLA showed similarity with lectins from other basal tribes as VML and SJA, corroborating the classification as Swartzieae Papilionoideae tribe and demonstrating the use of lectins as a taxonomic tool.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A frutalina, lectina &#945;-D-galactose ligante, foi expressa e processada num sistema heterÃlogo para expressÃo de proteÃnas utilizando a levedura metilotrÃfica Pichia pastoris. Para atingir os objetivos esperados foram desenvolvidas trÃs estratÃgias: identificar o gene que codifica para a frutalina a partir do DNA genÃmico obtido de folhas de A. incisa; sintetizar, por uma empresa especializada, o gene que codifica para as cadeias polipeptÃdicas da frutalina, otimizando-o para a expressÃo em P. pastoris e isolar o gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA presente em sementes maduras e frescas, para obtenÃÃo do cDNA utilizando a tÃcnica da RT-PCR. Enquanto na primeira estratÃgia, foi obtido apenas o gen da cadeia beta, nas duas outras estratÃgias o gen completo foi obtido. No entretanto, a estratÃgia que mostrou melhor expressÃo da frutalina recombinante em P. pastoris foi a da obtenÃÃo do gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA. A expresÃo foi tempertura dependente e a frutalina recombinante apresentou uma massa molecular aparente de 17 kDa, sugerindo a presenÃa do peptÃdeo de ligaÃÃo e da cauda de histidina. / Frutalin, the Artocarpus incise alfa-D-galactose binding seed lectin was expressed and processed in a heterologous system for protein expression, using the metilotrophic yeast Pichia pastoris. In order to obtain the proposed objectives, three strategies were followed: identify the frutalin gene from the genomic DNA, obtained from the leaves; obtain, from the GenScript Corporation, the synthetic frutalin polypeptide chains gene, optimized for expression in Pichia system; and isolate frutalin gene, from mRNA present in fresh seeds in order to obtain the cDNA, using the RT-PCR technique. The obtained genes were inserted in the Pichia genome, in order to evaluate the lectin expression. While in the first strategy only the beta chain gene was obtained, in the other two the complete frutalin gene was obtained. The best results were obtained from the third strategy. The expression process was temperature dependent, with the optimum at 18 &#959;C and the recombinant frutalin showed an apparent molecular mass of 17 kDa, which suggest the presence of both the linker peptide and the histidine tag.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Lectinas de algas marinhas tÃm-se mostrado importantes ferramentas biotecnolÃgicas. Objetivou-se estudar as atividades antinociceptivas e antiinflamatÃrias da lectina da alga marinha vermelha Pterocladiella capillacea (Pc). A Pc, apresentando atividade hemaglutinante contra eritrÃcitos tripsinizados de coelho, foi obtida a partir da aplicaÃÃo do extrato protÃico total em cromatografia de troca iÃnica em coluna de DEAE-celulose seguida da cromatografia de afinidade em coluna de goma de guar. A seguir, foi utilizada nos ensaios de nocicepÃÃo e inflamaÃÃo, utilizando camundongos machos Swiss e ratos machos Wistar, respectivamente. Pc (0,9; 8,1 ou 72,9 mg/kg; i.v) foi administrada 30 min antes de cada estÃmulo nocigÃnico, ou seja, antes da injeÃÃo i.p de Ãcido acÃtico a 0,8% (10 &#956;L/mL), da injeÃÃo intraplantar de formalina a 1% (20 &#956;L/pata) ou do teste da Placa quente (51Â1 ÂC), e comparada a animais nÃo tratados ou prÃ-tratados com Indometacina ou Morfina, ambas a 5 mg/kg; s.c. Observou-se que a Pc (0,9; 8,1 ou 72,9 mg/kg) reduziu significantemente o nÃmero de contorÃÃes abdominais induzidas pelo Ãcido acÃtico em 29,2%; 39,3%, e 51,9%, respectivamente. Pc (72,9 mg/kg) tambÃm reduziu (p<0,05) a fase 1 (neurogÃnica) e a fase 2 (inflamatÃria) observadas apÃs administraÃÃo da formalina, em 58% e 87%, respectivamente. Entretanto, a Pc (72,9 mg/kg) nÃo foi capaz de reduzir a nocicepÃÃo observada no teste da Placa Quente, quando comparada à morfina. Os efeitos antinociceptivos da Pc foram abolidos quando a Pc foi prÃ-incubada com a glicoproteÃna mucina (1,25 mg/mL), inibidora de sua atividade hemaglutinante. Sugere-se, portanto, que a atividade antinociceptiva da Pc possa ser predominante via inibiÃÃo de mecanismos perifÃricos. Assim, seguiram-se os ensaios de induÃÃo da migraÃÃo neutrofÃlica para cavidade peritoneal ou do edema de pata de ratos por Carragenana (Cg-tipo l; 500 g/cavidade ou pata), onde observou-se que a administraÃÃo da Pc (8,1 mg/kg; i.v) 30 min antes da Cg reduziu significativamente a contagem do nÃmero de neutrÃfilos em 84%. No entanto, a Pc nÃo foi capaz de prevenir o edema de pata induzido pela Cg. Desta forma, sugere-se que esta proteÃna foi capaz de reduzir o mecanismo de migraÃÃo de neutrÃfilos, possivelmente ligando-se à molÃculas especÃficas celulares, como por exemplo, selectinas. Para confirmar sua seguranÃa, a PC (8,1 mg/kg) foi administrada em camundongos diariamente e no 7 dia foram coletadas amostras sanguÃneas para dosagens de urÃia e transaminases (TGO e TGP), e pesados rins e fÃgado. Observou-se que a Pc nÃo causou alteraÃÃes significativas, sugerindo portanto, ser segura no perÃodo de administraÃÃo avaliado. Dessa forma, considerando os dados em conjunto, conclui-se que a Pc possui propriedades antinociceptiva e antiinflamatÃria com aÃÃo perifÃrica. / Marine algae lectins had been showing important biotechnical tools. Our objectives were to study the antinociceptive and anti-inflammatory activities of the lectin from the marine red alga Pterocladiella capillacea (Pc). The Pc, presenting haemagglutinating activity against trypsin-treated erytrocytes from rabbit, was purified by application of crude extract (0.025 M Tris-HCl buffer, pH 7.5) on ion exchange chromatography on DEAE-cellulose followed by affinity chromatography on guar-gum column. To proceed, it was used in the nocicepÃÃo and inflammation assays, using male Swiss mice and male Wistar rats, respectively. Pc (0.9; 8.1 or 72.9 mg/kg; i.v) it was administered 30 min before each challenge, that is, before the injection i.p of acetic acid 0.8% (10 &#956;l/mL), of the intraplantar injection of 1% formalin (20 &#956;L/paw) or of the Hot Plate test (52Â1 ÂC), and compared to non treated animals or to pre-treated by Indomethacin or Morphine, both at 5 mg/kg; s.c. It was observed that the Pc (0.9; 8.1 or 72.9 mg/kg) reduced significantly the number of writhes induced by acetic acid (29.2%; 39.3%, and 51.9%, respectively). Pc (72.9 mg/kg) also reduced (p<0.05) the 1st phase (neurogenic) and the 2nd phase (inflammatory) observed after administration of the formalin (58% and 87%, respectively). However, the Pc (72.9 mg/kg) was not capable to reduce the nociception evaluated by Hot Plate test, compared to morphine. These antinociceptive effects were abolished when the Pc was pre-incubated with mucin (1.25 mg/mL), inhibitory glycoprotein of its haemagglutinating activity. Therefore, it is suggested that the antinociceptive activity of the Pc can be predominant by inhibition of peripheric mechanisms. After this, was realized the assays of neutrophil migration for peritoneal cavity or of the paw edema of mice by Carragenan (Cg-type l; 500 g/cavity or paw), where was observed that the administration of the Pc (8,1 mg/kg) 30 min before Cg reduced the neutrophil counts significantly by 84%. However, Pc was not capable to prevent the paw edema induced by Cg. This way, it is suggested that this protein was capable to reduce neutrophil migration by previous mechanism to migration, possibly linking to cellular specific molecules as, for example, selectins. Then, to confirm its safety, the Pc (8.1 mg/kg) was administered daily in mice and observed their behaviors, and at the 7th day, sanguine samples were collected for urea and transaminases (TGO and TGP) dosages, and heavy kidneys and liver. It was observed that Pc did not cause significant alterations, suggesting be safety for the administration period. Considering the data together, it is ended that the Pc possesses antinociceptive and anti-inflammatory properties with peripheral action.

A Ipomoea carnea é uma planta tóxica amplamente distribuída no Brasil e em outros países tropicais. Durante os períodos de seca esta planta se mantém verde, podendo servir como fonte de alimento para os animais de produção. A intoxicação natural é de caráter crônico e ocorre quando ruminantes particularmente, caprinos ingerem a planta, estes animais desenvolvem, principalmente, sintomatologia de origem nervosa. Dois tipos de princípios ativos tóxicos foram isolados desta planta, um alcalóide nortropânico, as calisteginas B1, B2, B3 e C1 e principalmente o alcalóide indolizidínico, a suainsonina, cujo mecanismo de ação tóxico se estabelece por inibição de duas enzimas a &alpha;-manosidase lisossomal, levando ao acúmulo de oligossacarídeos não metabolizados no interior de lisossomos, promovendo a degeneração vacuolar intracitoplasmática, perda de função e até mesmo morte celular e a manosidase II do Complexo de Golgi, causando alterações na síntese, no processamento e no transporte de glicoproteínas. Histologicamente esta intoxicação é caracterizada pela presença de vacúolos lisossomais no sistema nervoso central (SNC), tireóide, fígado, pâncreas e rins. Recentemente, pesquisas, relativas à toxicidade perinatal desta planta, vêm mostrando que a Ipomoea carnea possui efeitos teratogênicos, em ratos, caprinos e coelhos, porém até o momento não se sabe se a placenta poderia estar envolvida na gênese desta patologia ou se os efeitos deletérios no feto seriam devidos diretamente à passagem transplacentária do princípio ativo tóxico. Portanto o principal objetivo desta pesquisa foi verificar o possível efeito placentotóxico da planta. Assim, o resíduo aquoso final da planta (RAF) foi administrado, via oral, por gavage para ratas Wistar gestantes, nas doses de 1,0; 3,0 e 7,0 g/kg no período do 6º ao 19º dias de gestação, já os animais do grupo controle e peer-feeding, receberam apenas água pela mesma via e período que os animais tratados. Durante o período de tratamento estes animais foram inspecionados diariamente e o consumo de água e ração, bem como o ganho de peso mensurados à cada 3 dias. No final da gestação parte dos animais foram, destinados a secção cesariana, para principalmente avaliação do tecido placentário e os outros animais seguiram a gestação até o nascimento a termo para análise das proles. Dos animais provenientes da secção cesariana, foram coletados os fetos e suas respectivas placentas, sendo estas encaminhadas para análise anatomopatológica, histoquímica (lectinas e TUNEL) e morfométrica, assim como os fetos mensurados quanto ao seu tamanho e peso e avaliados para malformações externas e análise óssea e visceral e realizado o desempenho reprodutivo destas fêmeas. As gestantes que seguiram até o nascimento de suas prole, as quais foram avaliadas quanto ao seu desenvolvimento físico e reflexológico diariamente e nos dias 4, 8, 15 e 22 de lactação, um filhote de cada mãe foi eutanasiado para coleta de fragmentos representativos do fígado, rim, SNC e pâncreas para avaliação histopatológica, este procedimento também foi realizado naquelas mães submetidas a secção cesariana no 20º dia de gestação, bem como nas mães lactantes no 22º dia de lactação. Os resultados obtidos evidenciam claramente o potencial teratogênico produzido pela Ipomoea carnea, visto que tanto os fetos quanto os filhotes apresentaram algumas anomalias congênitas, diminuição do peso ao nascimento e também o retardo na geotaxia negativa. No fígado e nos rins das mães e dos filhotes foi observada a degeneração vacuolar, evidenciando a toxicidade materna e fetal promovida pela planta expostos durante o período gestacional. Um dado importante aqui observado se refere à avaliação do tecido placentário, o qual apresentou algumas alterações histopatológicas, como o espessamento da zona de labirinto e a redução de espessura da zona juncional, porém a degeneração vacuolar não fora observada neste órgão, porém quando realizada a técnica de lectina-histoquímica, foi possível observar o acúmulo de alguns açúcares nas células em diversas regiões da placenta, evidenciando desta forma que este tecido também sofreu injúria promovida pela ação da planta, não sendo mais possível considerar este órgão apenas como um local de passagem para estes princípios ativos tóxicos. / Ipomoea carnea is a toxic plant widely distributed in Brazil and other tropical countries. During periods of drought, animals graze on this plant which grows even in the presence of adverse climatic conditions. After prolonged periods of plant intake, the animals exhibit a variety of clinical signs as depression, general weakness, body weight loss, staggering gait, muscle tremors, ataxia, posterior paresis, and paralysis. Two kinds of toxic principles were isolated from the plant, the nortropane alkaloids calystegines B1, B2, B3 and C1 and mainly the indolizidine alkaloid swainsonine. The latter alkaloid is a potent inhibitor of two distinct intracellular enzymes, the lysosomal &alpha;-mannosidase which results in lysosomal accumulation of incompletely processed oligosaccharides moieties inside vacuoles, which progresses to cellular function loss and, ultimately, to cell death and the Golgi mannosidase II enzyme causes alteration of the N-linked glycoprotein process, modifying the glycoprotein synthesis, processing and carrier. Histologically, cellular vacuolization of Purkinje cells, thyroid follicles, exocrine pancreas, liver and kidney cells have been observed. Recently, many studies in our laboratory have shown that Ipomoea carnea have teratogenic effects in rats, goats and rabbits. However, it is not known yet if the alterations observed in the fetuses are due to alterations in the placenta or if they can be directly related to the transplacental transfer of the active principle. The present study was performed to evaluate the effects of Ipomoea carnea in the placental tissue and in the litter of female rats treated during. Pregnant rats of the experimental groups were treated orally by gavage, once a day from GD6 to GD19, with 1,0; 3,0; 7,0 g/kg of Ipomoea carnea AF. The control and peer-feeding group received tap water by gavage. Total body weight gain, water and food consumption were measured each three days during the experimental period. At the end of pregnancy period some animals were, for cesarean section, mainly for evaluation of placental tissue and the other animals followed the pregnancy until the birth to the term analysis of offspring. From the animals that came from the cesarean section, were collected the fetuses and their placental, those being collected for anatomopathological, histochemistry (lectins and TUNEL) and morphometric analysis, as the fetuses measured about their sizes and weight and assessed to external malformation and bone and visceral analysis and performed the reproductive performance of those females. The pregnants that followed up to the birth of their offspring, which were assessed regarding their physical and reflexology development daily and at days 4, 8, 15 e 22 of lactation, an offspring of each mother was euthanized so representatives fragments of the liver, kidney, SNC and pancreas could be collected for a histopathological assessment, this procedure was also performed at those mothers submitted to the cesarean section at the 20th pregnancy day, as well as at the breastfeeding at the 22nd lactation day. The obtained results clearly show the teratogenic potential produced by the Ipomoea carnea, because both the fetuses as the pups had some congenital anomalies, decrease in birth weight and the delayed negative geotaxis. At both the mother and offsprings liver and kidneys was observed a vacuolar degeneration, showing the maternal and fetal toxicity promoted by the plant exposed during the pregnancy period. An important data noted here refers to the placental tissue assessment, which showed some histopathological alterations, as the labirinth zone thickening and the reduction of the junctional zone thickness, however the vacuolar degeneration was not observed in this organ, although when performed the lectin-histochemistry technique, it was possible to observe the accumulation of some sugars in some cells located at several regions of the placenta, this way showing that this tissue has also suffered some injury promoted by the plant action, not being possible anymore to consider this organs just as a plac of passage for these toxic active principle.

A galectina-1 (Gal-1) é uma proteína que reconhece -galactosídeos e participa de vários processos biológicos, incluindo a modulação da resposta imunológica. Vários relatos da literatura reportam o potencial uso terapêutico da Gal-1 para doenças auto-imunes, inflamatórias, degenerativas e infecciosas. Entretanto, são escassos os relatos sobre o envolvimento da Gal-1 na doença causada por Tripanosoma cruzi. O presente trabalho tem como objetivos o estudo da participação da Gal-1 endógena e exógena na evolução da infecção aguda experimental por T. cruzi. Galectina-1 recombinante, camundongos C57BL/6 deficientes (nocaute - Gal-1-/-) ou não (selvagem - Gal-1+/+) do gene da galectina-1 e macrófagos desses animais foram utilizados em experimentos de infecção in vivo e/ou in vitro. Os animais foram infectados com tripomastigotas de T. cruzi da cepa Y, por via intraperitoneal. Os parâmetros analisados na caracterização do processo de infecção foram: parasitemia e sobrevivência; histopatologia do tecido cardíaco; dosagem de óxido nítrico, pelo método de Griess; imunofenotipagem de leucócitos, por citometria de fluxo; dosagem de citocinas por ELISA e taxa de liberação de parasitas em cultura de macrófagos. Os camundongos Gal-1-/- ou Gal-1+/+ tratados com Gal-1 exógena apresentaram as menores taxas de parasitemia. De modo interessante, todos os camundongos Gal-1-/- sobreviveram à infecção, enquanto que os selvagens apresentaram uma drástica redução de sobrevivência após o desafio com T. cruzi. A ausência da Gal-1 endógena ou o tratamento com a Gal-1 exógena provocou no músculo cardíaco de camundongos infectados uma significativa redução infiltrado inflamatório. As dosagens de citocinas séricas indicaram que animais selvagens infectados e tratados com Gal-1 apresentaram uma diminuição de IFN- em relação aos não tratados. Além disso, soros de animais nocautes infectados apresentaram níveis inferiores de diferentes citocinas (TNF-, IFN- , IL-4, IL-10 e IL-12) em comparação com amostras séricas de animais selvagens infectados. As porcentagens de diferentes tipos de células esplênicas (T, B, macrófagos, NKT e NK) foram, geralmente, maiores em camundongos selvagens do que em nocautes após a infecção por T. cruzi. Curiosamente, na cavidade peritoneal de camundongos Gal-1-/- ocorreu um aumento de neutrófilos e macrófagos após 12h ou 24h da infecção, respectivamente. O pico de produção de NO induzido por T. cruzi em macrófagos Gal-1-/- foi mais precoce e intenso do que o obtido por macrófagos Gal-1+/+. Além disso, os macrófagos Gal-1-/- liberaram menos parasitas in vitro em comparação como os macrófagos Gal-1+/+. Com base nesse conjunto de resultados sugerimos que a ausência de Gal-1 endógena ou o tratamento de animais com Gal-1 exógena promoveram perfis imunológicos (resposta inata e adaptativa) favorecedores da resolução da infecção experimental aguda por T. cruzi. / Galectin-1 (Gal-1) is a -galactoside-binding protein and participates in several biological processes, including modulation of immune response. In the literature, there are several reports about the potential therapeutic use of Gal-1 for autoimmune diseases, inflammatory, degenerative and infectious diseases. However, there are few reports on the involvement of Gal-1 in disease caused by Trypanosoma cruzi. Thus, this work was conducted to study the participation of endogenous and exogenous Gal-1 in acute experimental infection by T. cruzi. Recombinant Gal-1, galectin-1-deficient mice (KO - Gal-1-/-) or wild type (WT - Gal-1+/+) mice and macrophages from these animals were used to perform the in vivo and in vitro assays. The animals were infected with trypomastigotes of T. cruzi (strain Y), intraperitoneally. The biological parameters analyzed were parasitemia and survival; histopathology of heart tissue, measurement of nitric oxide by Griess reaction; leukocyte immunophenotyping by flow cytometry; cytokine detection by ELISA and the release rate of parasites in cultured macrophages. Infected-Gal-1-/- mice or infected-Gal-1+/+ mice treated with Gal-1 showed the lowest levels of parasitemia. Interestingly, all infected-KO mice survived after the infection, whereas the infected-WT mice showed a drastic reduction in survival. The absence of endogenous Gal-1 or the exogenous Gal-1 treatment promoted a drastic reduction on inflammatory cells infiltrate in the cardiac muscle of infected mice. The sera of infected-WT mice treated with Gal-1, but not untreated animals, showed high levels of IFN-. Additionally, sera from infected-KO mice showed lower levels of different cytokines (TNF-, IFN-, IL-4, IL-10 and IL-12) compared with serum samples from infected-WT animals. The number of spleen cells (T, B cells, macrophages, NK and NKT) were generally higher in WT mice than in KO mice after infection with T. cruzi. Interestingly, the peritoneal cavity of infected-KO mice presented an increased numbers of neutrophils and macrophages after 12h or 24h of infection, respectively. The peak of NO production induced by T. cruzi in Gal-1-/- macrophages was earlier and more intense than that obtained by Gal-1+/+ macrophage. Furthermore, Gal-1-/- macrophage released fewer parasites in vitro in comparison to Gal-1+/+ macrophages. Taken together, these results suggest that the absence of endogenous Gal-1 or treatment with exogenous Gal-1 promoted immunological profiles (innate and adaptative responses) that cooperate to the resolution of acute experimental infection by T. cruzi

In the post smallpox era, vaccinia virus (VACV) has emerged as an important candidate vaccine vector. As yet, the binding receptors and entry mechanisms utilised by the two infectious forms, IMV and EEV, in dendritic cells (DCs) are unknown. We have investigated the interactions between VACV and C-type lectin receptors (CLRs) that are known to be utilised by many other viruses for binding and entry in DCs. Using a variety of CLR ligands and inhibitors we were unable to inhibit IMV or EEV binding to MDDCs and we conclude that they do not bind to CLRs. We have also investigated VACV entry in MDDCs and show that both IMV and EEV enter MDDCs via an endocytic pathway. Using a variety of drugs that inhibit cellular processes we found IMV and EEV entry to be actin- and calcium-dependent. EEV entry was also cholesterol- and energy-dependent, whereas IMV entry was only partially dependent on these factors. Both IMV and EEV colocalised with endolysosomal markers. This data suggests that EEV may enter DCs via caveolin-mediated endocytosis whereas IMV entry can occur via multiple complementary mechanisms, including endocytosis and fusion. Macropinocytosis may also constitute a minor route of entry for IMV as entry was partially inhibited by dimethyl amiloride and the virus colocalised with dextran. Finally we have provided a comprehensive flow cytometric analysis of Toll-like receptor (TLR) expression at the protein level in MDDCs and monocyte-derived Langerhans cells (MDLCs) as models for different myeloid DC subsets. We found TLR expression to be cell type-specific and MDDCs expressed the full repertoire of TLRs 1-9, including small amounts of TLR8 and TLR9 on the cell surface. The expression of these TLRs that recognise nucleic acids on the surface of cells may constitute an early warning system for signalling the presence of viral invaders that would normally subvert the function of DCs. We also found TLR expression in mature cells to be dependent on the nature of the maturation stimulus (lipopolysaccharide versus cytokine/prostaglandin cocktail) and VACV infection induced profound down-regulation of all TLRs. These findings will have important implications for the rational design of VACV-vectored vaccines.