Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5264_1.pdf: 2886740 bytes, checksum: 56c736feadc9b36ed9bc882bab5177fe (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Moringa oleifera é uma planta tropical com grande importância econômica e de usos industriais e medicinais. Diferentes partes da planta são aplicadas e o extrato de sementes é comumente usado na purificação de água para consumo humano. Ácidos húmicos constituem uma significante fração de matéria orgânica natural que ocorre em rios e constituem o maior problema nas estações de tratamento de água, porque reagem com o cloro formando subprodutos indesejáveis. O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade hemaglutinante (AH) em tecidos de M. oleifera, purificar uma lectina de sementes solúvel em salina (SSMoL), avaliar a atividade coagulante de preparações lectínicas e SSMoL na água tratada com caolin e em solução de ácido húmico, caracterizar a afinidade de SSMoL com ácido húmico e investigar a atividade antioxidante em tecidos desta planta. A lectina foi isolada após extração da farinha em NaCl 0,15 M e cromatografia em gel de guar. Ensaios de AH foram realizados na presença de carboidratos, glicoproteínas, ácido húmico e compostos orgânicos halogenados. Experimentos de difusão com o ácido húmico e preparações lectínicas foram efetuados em gel de agarose. Atividade antioxidante foi investigada em extratos etanólicos (E1) e salinos (E2) de M. oleifera a partir de flores, raques da inflorescência e da folha, sementes, tecidos de folhas e tecido fundamental do tronco. A capacidade de capturar radical livre (RSC) de extratos e padrões antioxidantes foi determinada com dot-blots em placa de cromatografia em camada fina corada com solução do radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) 0,4 mM. Ensaios espectrofotométricos foram realizados (515 nm); extratos foram analisados com vários reagentes para classe de compostos associados com atividade antioxidante. Atividade lectínica foi detectada em extratos salinos a partir de flores, raque da inflorescência, sementes, tecido de folha e tecido fundamental do tronco. SSMoL aglutinou eritrócitos de coelho e humanos e foi ativa na faixa de pH 4,0 a 9,0. Também, AH de extratos de tecidos e SSMoL foram inibidas por carboidratos e glicoproteínas; azocaseína e asialofetuína aboliram a AH de SSMoL. AH do extrato, fração e SSMoL diminuiu significantemente na presença do ácido húmico. Nenhum efeito foi observado na presença dos ácidos tricloroacético e dicloroacético ou clorofórmio. Bandas de precipitação foram observadas através de difusão em gel entre ácido húmico, preparações e SSMoL. A lectina básica foi termoestável a 100 °C durante 7horas. SDS-PAGE, em condições redutoras, revelou duas bandas. Preparações de sementes e SSMoL apresentaram atividade coagulante similar ao controle positivo, sulfato de alumínio. Componentes antioxidantes foram detectados em todos E1 e E2 de flores, raque da inflorescência e tecido de folha por redução do DPPH após 30 min. Extrato de folha mostrou melhor RSC; antioxidantes presentes em E2 reagiram mais lentamente com o radical DPPH. Flavonóides foram detectados em E1 e E2; esteróides e triterpenóides foram detectados em E1. O cromatograma revelado com solução metanólica difenilborinato-2- etilamina (p/v) mostrou que flores, raques da inflorescência e da folha, bem como tecido de folha de E1 continham pelo menos três flavonóides com os mesmos valores de Rf (0,18, 0,38 e 0,44, respectivamente). Flor e folha de E2 mostraram pelo menos dois flavonóides (Rf 0,35, 0,63 e 0,16, 0,34, respectivamente). Quando DPPH foi usado para revelar o cromatograma, a presença de componentes antioxidantes foi confirmada em todos os extratos. Em conclusão, extratos de tecidos distintos de M. oleifera mostraram AH. Uma lectina foi purificada usando um método simples, após definido o protocolo. Extrato, fração e SSMoL mostraram propriedades coagulantes na água tratada com caolin e em solução de ácido húmico. Resultados similares foram encontrados com o sulfato de alumínio, o mais comum coagulante sintético usado no tratamento da água em todo mundo. Contudo, preparações de sementes de M. oleifera e SSMoL podem ser aplicadas no tratamento da água para remover ácidos húmicos. Extratos etanólicos e salinos de tecidos de M. oleifera possuem componentes antioxidantes

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-03-14T12:26:00Z No. of bitstreams: 1 Jacqueline Ellen Camelo Batista Albuquerque.pdf: 1563098 bytes, checksum: 993e6d21852ba5b6790a3c951b311ae4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-14T12:26:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jacqueline Ellen Camelo Batista Albuquerque.pdf: 1563098 bytes, checksum: 993e6d21852ba5b6790a3c951b311ae4 (MD5) Previous issue date: 2017-03-14 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Plant lectins represent a class of proteins that perform various biological activities, including an immunomodulatory actions. In particular, lectins ConBr (Canavalia brasiliensis) and CFL (Cratylia argentea) have demonstrated an ability to modulate cytokines of the proinflammatory cascade as well as the production of nitric oxide in the murine model of Salmonella infection. Immunomodulatory molecules represent a promising alternative in the prevention and treatment of infections and can enhance immunological and adaptive mechanisms of the host improving the efficacy of antibiotics and vaccines against pathogens. This study evaluated the biotechnological potential of the ConBr and CFL as therapeutic and vaccine adjuvants against the antigen Vi from S. typhi, which has been used with limited success for immunization against typhoid fever. Initially, cytotoxicity assays with lectins were performed with cultured murine peritoneal macrophages to define non-toxic proteins concentrations for assays. Then, macrophages were treated with lectins and infected with a virulent strain of Salmonella Typhimurium. For this purpose, macrophages were incubated with ConBr and CFL lectins (1 and 10 μg / mL) before (preventive treatment) or after (curative treatment) the onset of infection. The following analyses were conducted: macrophage cell viability, intracellular bacterial quantification, iNOS plus pro-and anti-inflammatory cytokines and Toll-like receptor´s (TLR2, TLR4 and TLR9) gene expression. Both preventive and curative treatments significantly reduced the intracellular bacterial load and increased cell viability of infected macrophages. In the preventive treatment with CFL there was an increase in the level of transcripts for IL-6 and TNF-α, whereas ConBr induced an increase of IL-12 (p40). In the curative treatment, CFL induced significant expression of IL-12 (p40), whereas ConBr increased gene expression of IL-1β and TNF-α. In addition, the curative treatment with CFL increased approximately 130 fold the expression of TLR-4 and 24 fold expression of TLR2. In view of the importance of the TLR2 and TLR4 for the control of Salmonella infection, we evaluated the participation of these receptors in the immunomodulatory action of the CFL. Thus, bone marrow-derived macrophages (BMDM) knockout for TLR2/TLR4 were treated with the lectin and gene expression for IL-1β, TNF-α and IL-6 cytokines was evaluated. Naïve BMDM demonstrated high levels of gene expression, increasing 258-fold the number of transcripts for IL-1β, 233-fold for IL-6, and 25-fold for TNF-α. Conversely, double knockout BMDM for TLR2/TLR4 produced low levels of transcripts. Finally, ConBr and CFL were tested as vaccine adjuvants in Swiss mice immunized with the purified Vi antigen through evaluation of anti-Vi IgG antibodies. The results showed that as CFL and ConBr lectins were not able to induce an increase of specific IgG anti-Vi antibodies. Although the lectins did not demonstrate a potential as vaccine adjuvant against the Vi antigen, they showed therapeutic properties beneficial to the control of Salmonella-infected macrophages and were capable to interact with Toll-like receptors, which play a key role on activation of innate immune response and development of adaptive immune response. Such results represent a promising prospect for the development of new drugs against Salmonella. / Lectinas vegetais representam uma classe de proteínas que desempenham diversas atividades biológicas, incluindo a ação imunomoduladora. Recentemente, as lectinas ConBr (Canavalia brasiliensis) e CFL (Cratylia argentea) demonstraram a capacidade de modular a cascata pró-inflamatória de citocinas, bem como a produção de óxido nítrico em modelo murino de infecção por Salmonella. Moléculas imunomoduladoras representam uma alternativa promissora na prevenção e no tratamento de infecções, podendo atuar nos mecanismos imunológicos naturais e adaptativos do hospedeiro, aprimorando a eficácia de antibióticos e vacinas contra patógenos. Diante disso, este estudo avaliou o potencial biotecnológico das lectinas, ConBr e CFL, como adjuvantes terapêuticos, frente ao antígeno vacinal Vi de S. Typhi, que tem sido usado com sucesso limitado para imunização contra a febre tifoide. Inicialmente, foram realizados ensaios de citotoxicidade das lectinas em cultura de macrófagos peritoneais murinos para definir as concentrações proteicas não tóxicas de uso nos ensaios. A seguir, os macrófagos foram tratados com as lectinas e infectados por uma cepa virulenta de Salmonella Typhimurium. Para tanto, os macrófagos foram incubados com as lectinas ConBr e CFL (1 e 10 μg/mL) antes (tratamento preventivo) ou após (tratamento curativo) infecção experimental com Salmonella. Foram realizadas análises de viabilidade celular dos macrófagos, quantificação intracelular bacteriana e expressão gênica de iNOS, citocinas pró- e anti-inflamatórias e receptores Toll-like (TLR2, TLR4 e TLR9). Ambos os tratamentos preventivo e curativo reduziram significativamente a quantificação bacteriana intracelular de Salmonella e aumentaram a viabilidade celular dos macrófagos. Os tratamentos preventivos com CFL aumentaram os níveis de transcritos para IL-6 e TNF-α, já ConBr induziu o aumento de IL-12 (p40). No tratamento curativo, CFL induziu expressão significativa de IL-12 (p40), enquanto ConBr aumentou a expressão gênica de IL-1β e TNF-α. Além disso, o tratamento curativo com CFL foi capaz de aumentar cerca de 130 vezes a expressão de TLR-4 e 24 vezes a expressão de TLR2. Considerando a importância dos receptores TLR2 e TLR4 para o controle da infecção por Salmonella, este trabalho avaliou a participação desses receptores na ação imunomoduladora da lectina CFL. Para tanto, macrófagos derivados da medula óssea (BMDM) e duplo nocautes para TLR2/TLR4 foram tratados com a lectina e a expressão gênica das citocinas IL-1β, TNF-α e IL-6 foi avaliada. Os BMDM demonstraram elevados níveis de expressão gênica, induzindo o aumento de cerca de 258 vezes para IL-1β, 233 vezes para IL-6 e 25 vezes para TNF-α. No entanto, BMDM duplo nocautes para TLR2/TLR4, produziram níveis significativamente mais baixos de transcritos. Por fim, ConBr e CFL foram testados como adjuvante vacinais em camundongos Swiss imunizados com antígeno Vi purificado, através da avaliação de anticorpos IgG anti-Vi. Os resultados mostraram que as lectinas CFL e ConBr não foram capazes de induzir o aumento no título de anticorpos específicos IgG anti-Vi. Apesar das lectinas não terem demonstrado potencial adjuvante vacinal frente ao antígeno Vi, tais proteínas apresentaram propriedades terapêuticas benéficas no controle de células infectadas por Salmonella, além de serem capazes de interagir com receptores do tipo Toll, essenciais na ativação da resposta imune inata e desenvolvimento da resposta adaptativa. Assim, tais resultados representam uma perspectiva promissora para o desenvolvimento de novos fármacos contra Salmonella.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectinas de origem vegetal inibem quimiotaxia neutrofÃlica, provavelmente por aÃÃo competitiva com selectinas endÃgenas por um sÃtio glicosÃdico na membrana de cÃlulas endoteliais, leucÃcitos ou em componentes da matrix extracelular. Exploramos os efeitos de lectina isolada de sementes de Dioclea violacea (Dviol) na artrite induzida por zymosan (Azy). Ratos Wistar (180 a 220g) receberam injeÃÃo intra-articular (i.a.) de zymosan (Zy) (1mg) no joelho direito. A hiperalgesia foi avaliada pelo teste de incapacitaÃÃo articular, medido pelo tempo de suspensÃo da pata (TSP) em s/min. O influxo celular (IC) foi medido no lavado articular, obtido 6 h apÃs a injeÃÃo do Zy, por lavagem e aspiraÃÃo da articulaÃÃo. Grupos foram prÃ-tratados (30 min) antes do Zy com Dviol (1 - 30 Âg; i.a. ou 1 - 10mg/kg; e.v.), sendo comparados ao grupo nÃo-tratado (NT), que recebeu apenas Zy e o veÃculo. Outros grupos receberam apenas Dviol (0,3- 30 Âg) i.a. e o grupo Naive, apenas salina i.a. A administraÃÃo de Dviol (6mg/kg; e.v.), reduziu significantemente (p<0,01) a hiperalgesia (TSP= 14,08  1,4) quando comparado ao NT (TSP= 36,06  3,3). A injeÃÃo endovenosa de Dviol inibiu o IC (18.266,7  1.890,1; 14.633,3  3.207,2; 2.790  503,3 e 120  37,4 cÃlulas/mm3 para 1, 3, 6 e 10mg de Dviol, respectivamente) quando comparados ao NT (37.583,3  6.007,2 cÃlulas/mm3). A administraÃÃo i.a. de apenas Dviol (30 Âg) aumentou significativamente o TSP (15,5  0,9), em relaÃÃo ao NV. Dviol i.a. isolada (0,3 a 30; Âg), aumentou significantemente o IC (3.600  676; 4.958,3  1037,2 e 8.350  1.511,5 cÃlulas/mm3 para lectina 0,3; 3 e 30, respectivamente), comparado ao NV (858,3  389,5 cÃlulas/mm3). Dviol (10 Âg; i.a.), 30 min antes da injeÃÃo do Zy, inibiu significantemente a hiperalgesia (TSP = 20,15  2,2) (p<0,01), em relaÃÃo ao NT (TSP= 35,9  2,7). Dviol i.a. (1, 10 e 30&#956;g) reduziu significantemente o IC (18.266,7  1.890,1; 11.366,7  2.883,7 e 19.866,7  1.783,4 cÃlulas/mm3, respectivamente), comparado ao NT. A administraÃÃo e.v. de Dviol (6 mg/kg) + manose (0,1M), reverteu a inibiÃÃo da Dviol na hiperalgesia (TSP= 38,4  4,4) (P<0,01) e no IC (15200  1829,7 cÃlulas/mm3) da AZy, em relaÃÃo a Dviol (6mg/kg;e.v.) (TSP= 14,08  1,4 e IC= 2.790  503,3 cÃlulas/mm3). Os resultados demonstram, de maneira inÃdita, que a lectina de semente de Dviol tem aÃÃo antiinflamatÃria em artrite experimental. Esse efeito parece ser prioritariamente associado à ligaÃÃo da Dviol a sÃtios de polissacarÃdeos intra-articulares, embora nÃo possamos descartar que a ligaÃÃo a domÃnios protÃicos possa estar envolvida nessa aÃÃo / Plant-derived lectins inhibit neutrophil chemotaxis, probably through a competitive mechanism with endogenous selectins for a glycosidic residue in the membrane of endothelial cells, leukocytes or in components of the extracellular matrix. We investigated the effects of a lectin isolated from Dioclea violacea (Dviol) seeds in the zymosan-induced arthritis (Azy). Wistar rats (180 a 220g) received an intraarticular (i.a.) injection of 1 mg zymosan (Zy) into the right knee. The hyperalgesia was evaluated with the test for articular incapacitation, measured as the paw elevation time (PET) in s/1min. Cell influx (IC) was assessed in the joint exudate, obtained 6 h after injection of the Zy, through washing and aspiration of the joint. Groups were pretreated 30min before the Zy with Dviol (1 - 30 Âg; i.a. ou 1 - 10mg/kg; e.v.), and were compared to non-treated groups (NT), that received the Zy and the vehicle. Others groups received only Dviol (0,3 - 30Âg; i.a. and the naÃve animals (NV) received just saline i.a. The i.v. administration of Dviol (6mg/kg) significantly reduced the hyperalgesia (p<0.01) (PET= 14,08  1,4) as compared to NT (PET= 36,06  3,3). The i.v. injection of Dviol inhibited IC (18.266,7  1.890,1; 14.633,3  3.207,2; 2.790  503,3 e 120  37,4 cells/mm3 for the 1, 3, 6, and 10mg doses of Dviol, respectively). Dviol given i.a. isolated (30Âg) increased PET (15,5  0,9) significantly, as compared to NV. Dviol i.a. isolated (0,3 - 30 Âg) significantly increased IC (3.600  676; 4.958,3  1037,2 e 8.350  1.511,5 cells/mm3 for 0,3, 3 e 30 Âg, respectively), as compared to NV (858,3  389,5 cells/mm3). Dviol (10 Âg i.a.) given 30min before the Zy significantly inhibited the hyperalgesia (PET = 20,15  2,2) (p<0.01), as compared to NT (TSP= 9,9 Â1,2). Dviol i.a. (1, 10, and 30&#956;g) significantly reduced IC (18.266,7  1.890,1; 11.366,7  2.883,7 e 19.866,7  1.783,4 cells/mm3, respectively), as compared to NT. The i.v. administration of Dviol (6 mg/kg) + manose reversed the inhibitory action of Dviol in the hyperalgesia (PET= 38,4  4,4) (P<0.01) and in the IC (15200  1829,7 cells/mm3) of the AZy, as compared to Dviol (6mg/kg; i.v.) (TEP= 14,08  1,4 and IC= 2.790  503,3 cells/mm3). The results demonstrate, for the first time, that the lectin isolated from Dviol has anti-inflammatory effect in an experimental arthritis model. This effect appears to be prominently due to the coupling of Dviol to intrarticular polysaccharide residues. However, we can not exclude that coupling to protein residues may be also involved in this mechanism

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / IntroduÃÃo: A transformaÃÃo neoplÃsica està associada a alteraÃÃes na composiÃÃo dos carboidratos celulares, que determinam caracterÃsticas especiais à cÃlula, tais como comportamento, crescimento, diferenciaÃÃo e adesividade. Lectinas sÃo proteÃnas que apresentam afinidade por carboidratos especÃficos e por isso tÃm sido usadas em muitas Ãreas de investigaÃÃo diagnÃstica e prognostica do cÃncer e das metÃstases. O Linfoma de Hodgkin (LH) à uma neoplasia heterogÃnea em relaÃÃo a aspectos clÃnicos, biolÃgicos e de resposta ao tratamento. Existe atualmente uma intensa procura de novos marcadores que possam ter valor prÃtico na previsÃo de comportamento e prognÃstico do LH. Este estudo investiga em casos de LH forma clÃssica (LHc) a expressÃo de glicoconjugados especÃficos para Artocarpus incisa L (frutalina), uma lectina vegetal aD-Galactose ligante, nas cÃlulas de Reed-Sternberg (RS) e suas variantes. Material e MÃtodos: O estudo foi feito em 54 blocos de parafina de linfonodos com diagnÃstico morfolÃgico e imunohistoquÃmico de LHc, 31 do tipo Esclerose Nodular (LHEN), 18 do tipo Celularidade Mista (LHCM), 3 do tipo Interfolicular (LHIN) e 2 do tipo Rico em LinfÃcitos (LHRL). Foram realizados cortes histolÃgicos na espessura de 3 micrÃmetros (mm), fixados em lÃminas silanizadas e processados pela tÃcnica da estrepto-avidinaâbiotinaâperoxidase (estrepto ABC) utilizando a frutalina biotilinada (Fb) como sonda. Como controles positivos, casos de carcinoma papilÃfero de tireÃide e, negativos, os cortes do estudo com a exclusÃo da Fb. Dados clÃnicos foram obtidos por revisÃo de prontuÃrios. Resultados: Foram detectados trÃs padrÃes de positividade: citoplasmÃtica (Fbc), membranar (Fbm) e golgiana (Fbg) (coloraÃÃo puntiforme paranuclear), que tambÃm foram classificadas segundo a intensidade: fraca (+) e forte (++/+++). A positividade global para Fb nas cÃlulas RS e suas variantes foi de 85,2% (46/54), freqÃÃncia igual a da positividade global da amostra para o CD15. O padrÃo de marcaÃÃo Fbg foi o mais freqÃente aparecendo em 91,3% (42/46) dos casos positivos (p=0,008). NÃo foi observada associaÃÃo estatisticamente significante entre a marcaÃÃo pela frutalina e os dados clÃnicos e de estadiamento; resposta inicial ao tratamento; subtipo histolÃgico e fenÃtipo do LHc. ConclusÃo: A Fb pode ser utilizada como marcador para cÃlulas RS e variantes. O seu uso, associado ao estudo morfolÃgico, pode ser Ãtil para o diagnÃstico de LHc. Com este nÃmero de casos ainda nÃo foram observadas correlaÃÃes do padrÃo de marcaÃÃo com apresentaÃÃo clÃnica ou fatores oncobiolÃgicos tidos como indicadores de prognÃstico do LHc. Palavras-chave: DoenÃa de Hodgkin, Frutalina, Lectina, HistoquÃmica. / Introduction: Neoplasic transformation is associated with alterations in the composition of cellular carbohydrates, which determine special cellular characteristics, such as behavior, growth, differentiation and adhesivity. Lectins are proteins which have affinity with specific carbohydrates, so they serve as tools in several fields of diagnostic and prognostic investigations on cancer and on metastases. Hodgkinâs Lymphoma (HL) is an heterogenous neoplasia in clinical, biological, and responsive aspects concerning treatment. There is currently an intense search for new markers which can have practical value in predicting HL behavior and prognosis. This study investigates, in cases of HL classical form (CHL) the expression of specific glyconjugates for Artocarpus incisa L (frutalin), a vegetable aD-galactose-binding lectin, in Reed-Sternberg cells (RS) and their variations. Materials and Methods: The study assessed 54 paraffin blocks containing lymphonodes with morphological and immunohistochemical diagnosis for CHL; 31 of the Nodular Esclerosis type (HLNE); 18 of the Mixed Cellularity type (HLMC); 3 of the Inter-folicular type (HLIN); and 2 of the Lymphocyte-rich type (HLLR). Then 3-mm histological cuts were made and fixed to sylated slides and processed through the strep-avidin-biotin-peroxidase technique (strep ABC), using the biotilinated frutalin (Fb) as probe. Cases of thyroidâs papillary carcinoma were considered positive controls; studyâs cutoffs excluding Bf were considered negative ones. Clinical data were obtained through records review. Results: Three positivity patterns have been detected: cytoplasmic (Fbc), membranous (Fbm) and golgian (Fbg) (paranuclear punctiform coloration), which were also classified according to intensity: weak (+) and strong (++/+++). Global positivity for Fb in RS cells was 85.2% (46/54), same frequency as global positivity of CD15 sample. The Fbg marking pattern was the most frequent one, present in 91.3% (42/46) of positive cases (p=0.008). No statistically significant association was observed between frutalin markers, and clinical and stadiament data; initial response to treatment; CHL histological and phenotype subtype. Conclusion: Fb can be used as marker for RS cells and their variations. This use, associated with the morphological study, can be an useful tool for CHL diagnosis. With this number of cases, no correlation between marking pattern and clinical presentation or oncobiological factors that could be considered a prognosis indicator for CHL has been observed so far.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Dioclea megacarpa Rolfe is the correct synonym for D. relexa var. grandiflora. This species belongs to Fabaceae, the legume family. Previous studies, realized in our research group, showed the presence of active proteins for several phytopathogenic fungi in the seeds of this species, among of them Aspergillus niger. Thus, the present work was proposed with the objective of determining the bioactivity of protein(s) from D.megacarpa seeds against fungi, leading to its/their purification and partial characterization and further investigation of its/their action mechanism. Another approach of this work it was analyze the insecticidal potential of glucose/mannose-specific lectin, isolated from D.megacarpa seeds (Moreira et al., 1983), against the cowpea bruchid Callosobruchus maculatus. For this, seed flour was placed in contact with 0.15 M NaCl (1:5, w/w), followed by stirring for 3 h, filtration through a nylon cloth, re-extraction for 1 h, centrifugation at 11,500 x g, for 30 min, at 4 oC. The supernatant obtained, named total extract, showed antifungal activity against A. niger and presented several bioactive proteins, including lectin (129.27 UH/mgP, using trypsinized rabbit erythrocytes), trypsin inhibitor (18.91 mg de tripsina inibida/gF), urease (47.50 U/gF), toxin (LD50 119.60 mgP/Kg mice body weight ), chitinase (1.66 nKat/mgP) e &#946;-1,3-glucanase (0.55 nKat/mgP). On the other hand, peroxidasic and proteolytic activities were not detected. For purification of antifungal principle, several chromatographies were performed on Sephadex G-50, Chitin and Resource Q, this last connected to an FPLC system. The purified antifungal protein, named Dm-PAF, with apparent molecular mass of 67-68 kDa (SDS-PAGE), did not show any haemagglutinating or chitinolytic activity and presented its NH2-terminal sequence blocked. Dm-PAF, at a very low concentration (0.015 ÂgP/ÂL), it was able to inhibit the growth of Saccharomyces cerevisiae and Candida tropicalis yeasts. The investigation of the antifungal action mechanism excluded the possibility of interaction between Dm-PAF and H+-ATPase pumps. In addition, the glucose/mannose-specific lectin, obtained from Sephadex G-50 column, exhibited a potent insecticidal activity against C. maculatus, interfering in important parameters related to life cycle of this insect. These data show to be the D. megacarpa seeds a rich source of biologically interesting proteins, possibly involved in the defense mechanism of plants / Dioclea megacarpa Rolfe à usada como sinonÃmia de D. relexa var. grandiflora, uma espÃcie pertencente à famÃlia Fabaceae (Leguminosae). Estudos prÃvios, realizados por nosso grupo de pesquisa, demonstraram a presenÃa em suas sementes de proteÃnas ativas contra fungos fitopatogÃnicos, dentre esses Aspergillus niger. Assim, o presente trabalho foi proposto no intuito de avaliar a bioatividade de proteÃnas de sementes de D. megacarpa contra fungos, conduzindo à sua purificaÃÃo e caracterizaÃÃo parcial, bem como à investigaÃÃo de seu mecanismo de aÃÃo. Outro objetivo deste trabalho foi examinar o potencial inseticida da lectina com especificidade por glucose-manose, isolada de sementes de D. megacarpa (Moreira et al., 1983), contra o bruquÃdeo do feijÃo-caupi Callosobruchus maculatus. Para tanto, farinha de sementes foi posta em contato com NaCl 0,15 M (1:5, p/v), seguida de agitaÃÃo contÃnua por 3 h, filtraÃÃo em pano de trama fina, re-extraÃÃo por 1 h e centrifugaÃÃo a 11.500 x g, 30 min, 4 oC. O sobrenadante obtido, denominado de extrato total, se mostrou ativo contra A. niger e apresentou vÃrias proteÃnas bioativas, compreendendo lectina (129,27 UH/mgP, com eritrÃcitos tripsinizados de coelho), inibidor de tripsina (18,91 mg de tripsina inibida/gF), urease (47,50 U/gF), toxina (DL50 119,60 mgP/Kg de peso corpÃreo de camundongo), quitinase (1,66 nKat/mgP) e &#946;-1,3-glucanase (0,55 nKat/mgP). Por outro lado, atividades peroxidÃsica e proteolÃtica nÃo foram detectadas. Para purificaÃÃo da proteÃna antifÃngica, foram realizadas cromatografias em matrizes de Sephadex G-50, Quitina e Resource-Q, essa Ãltima acoplada ao sistema de FPLC. A proteÃna antifÃngica purificada de sementes de D. megacarpa, denominada de Dm-PAF, com massa molecular aparente de 67-68 kDa (PAGE-SDS), nÃo mostrou atividades hemaglutinante e quitinÃsica e apresentou sua seqÃÃncia NH2-terminal bloqueada. Dm-PAF, em concentraÃÃo baixÃssima (0,015 ÂgP/ÂL), se mostrou capaz de inibir o crescimento das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida tropicalis, cuja investigaÃÃo do mecanismo de aÃÃo nÃo revelou envolvimento dessa proteÃna com bombas de H+-ATPase. Em adiÃÃo, a lectina ligante a glucose-manose, obtida na cromatografia em Sephadex G-50, mostrou potente atividade inseticida contra C. maculatus, interferindo em parÃmetros importantes relacionados ao ciclo de vida do inseto. Os dados apresentados mostram as sementes de D. megacarpa como uma rica fonte de proteÃnas interessantes, possivelmente envolvidas no mecanismo de defesa das plantas

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectinas de plantas sÃo proteÃnas de origem nÃo-imune contendo pelo menos um domÃnio nÃo-catalÃtico, capaz de se ligar especÃfica e reversivelmente a mono ou oligossacarÃdeos, podendo ou nÃo apresentar sÃtios catalÃticos. As lectinas de planta sÃo o grupo mais estudado dessas proteÃnas. Apesar da alta similaridade dos membros da subtribo Diocleinae, apresentam diferenÃas na especificidade a carboidratos e atividades biolÃgicas variadas. A lectina de sementes de Canavalia boliviana foi purificada utilizando cromatografia de afinidade em matriz de Sephadex G-50 e cristalizada por difusÃo de vapor a 293 K. ApÃs otimizaÃÃes bons cristais foram obtidos utilizando a condiÃÃo de 0,1M de HEPES pH 7,5 com 3,0 M de formato de sÃdio. Os cristais apresentavam o grupo espacial monoclÃnico C2, com parÃmetros de cela de a = 126,70 Ã, b = 66,64 Ã, c = 64,99 à e Ãngulos de &#945; = 90,0 &#946; = 120,8 &#947; = 90,0Â. Observando a presenÃa de um dÃmero na unidade assimÃtrica foi estimada uma concentraÃÃo de 46% de solvente no cristal. A estrutura foi resolvida a 1,6 à usando substituiÃÃo molecular para resolver o problema das fases e as coordenadas da CGL foram utilizadas como modelo. O refinamento foi satisfatÃrio com Rfator e Rfree 17,89 e 20,71 respectivamente e todos os resÃduos de aminoÃcidos se mostraram em regiÃes permitidas no grÃfico de Ramachandran. A estrutura primaria apresentou identidade de 98% com a ConA e outras lectinas do tipo ConA. A estrutura tridimensional se mostrou semelhante com outras estruturas jà descritas, mas algumas diferenÃas foram observadas principalmente em regiÃes de âloopâ. Essas diferenÃas podem ser responsÃveis pelas diferenÃas nas atividades biolÃgicas dessas proteÃnas / Lectins are proteins of non immune origin with non-catalytic site that bind reversibly and specific carbohydrates, containing or not a catalytic-site. Plant lectins are the most studied group of carbohydrate binding proteins. Despite the high similarity between the members of the Diocleinae sub tribe (Leguminosae) group, they present different biological activities. Canavalia boliviana lectin (Cbol) was purified using a Sephadex G-50 column and crystallized in the presence of X-Man by hanging-drop vapor diffusion at 293K. After optimizations crystals suitable for diffraction were obtained under the condition 0.1 M HEPES pH 7.5 and 3.0 M sodium formate. The crystal belongs to the monoclinic space group C2, with unit-cell parameters a = 126.70 Ã, b = 66.64 Ã, c = 64.99 à and the angles &#945; = 90.0 &#946; = 120.8 &#947; = 90.0Â. A complete data set was collected at 1.5 à resolution. Assuming the presence of a dimmer in the asymmetric unit, the solvent content was estimated to be about 46%. The structure was solved at 1.6 à using molecular replacement to solve the phase problem and CGL coordinates was used as model. The refinement was satisfactory Rfactor and Rfree were respectively 17.98 and 20.71 and all amino acids residues were found in allowed regions. The primary structure showed 98% of identity to ConA and others ConA like lectins. The tridimensional structure observed showed high similarity to others already described structures, but some differences could be observed mainly on loop regions. These differences could be responsible for the distinct biological effects of these proteins

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Sementes de Platypodium elegans Vogel, pertencente à FamÃlia Fabaceae, subfamÃlia Papilionoideae, Tribo Dalbergiae possui uma lectina Manose/Glicose ligante. Na purificaÃÃo da lectina em estudo, o extrato total de sementes de P. elegans preparado em NaCl 0,15M teve sua fraÃÃo hemaglutinante isolada por cromatografia de afinidade em quitina, trocas iÃnica em DEAE-Sephacel e em HiTrap SP, essa Ãltima acoplada a HPLC. As fraÃÃes ativas para atividade hemaglutinante obtidas sequencialmente nesses procedimentos foram avaliados quanto à sua atividade especÃfica e homogeneidade em SDS-PAGE. A lectina em seu Ãltimo passo de purificaÃÃo apresentou massa molecular aparente de 55 kDa. A fraÃÃo prÃ-purificada ativa obtida em DEAE-Sephacel foi caracterizada quanto ao seu potencial termiticida e fungicida. A atividade termiticida contra operÃrios e soldados de Nasutitermes corniger, induzindo 100% de mortalidade em ambas as classes, foram melhor visualizadas com as concentraÃÃes 1,0 e 0,8mg/mL, entre 8 e 9 dias para operÃrios e 7 e 8 dias para soldados, onde ainda nÃo se havia registrado menos que 50% de mortalidade no controle negativo. A fraÃÃo testada nÃo apresentou efeito repelente. Em relaÃÃo à atividade fungicida, 20 ug da fraÃÃo chegou a inibir consideravelmente Fusarium lateritium (33%), F. oxysporum (19,4%) e F. solani (14,3%). F. decemcellulare teve uma inibiÃÃo de 4,8% e F. moniliforme, 3,3%. Essas duas atividades reforÃam a participaÃÃo dessa lectina na defesa vegetal, fazendo-a uma potente ferramenta biotecnolÃgica a ser mais profundamente investigada e estudada em relaÃÃo a seu papel na defesa vegetal e na potencial utilizaÃÃo na resistÃncia de madeiras susceptÃveis a cupins. / Seeds of Platypodium elegans Vogel, belonging to the Fabaceae family, Papilionoideae sub-family, Dalbergiae Tribe, posses a specific mannose/glucose lectin. In the purification of the lectin in study, the total extract of seeds of P. elegans prepared in NaCl 0,15M had its active fraction isolated for affinity chromatography in chitin and exchange ionic chromatography in DEAE-Sephacel and HiTrap SP, this last one connected to the HPLC.The active fractions for hemmagutinant activity gotten in these procedures had been sequentially about its specific activity and homogeneity in SDS-PAGE. The lectin in the last step of purification presented apparent molecular mass of 55 kDa. The active fraction from DEAE-Sephacel was characterized about its termiticidal and fungicidal potential. The termiticidal activity against laborers and soldiers of Nasutitermes corniger, inducing 100% of mortality in both the classrooms, was better visualized with the concentrations of 1,0 and 0,8mg/mL, between 8 and 9 days for laborers and 7 and 8 days for soldiers, where it had not been registered mortality less than 50% in the negative control. The tested fraction did not present repellent effect. In relation to the fungicidal activity, 20 ug of the fraction arrived to inhibit considerably Fusarium lateritium (33%), F. oxysporum (19.4%) and F. solani (14.3%). F. decemcellulare had a inhibition of 4,8% and F. moniliforme, 3.3%. These two activities strengthen the participation of this lectin in the vegetal defense, making it a powerful biotechnological tool to be more deeply investigated and studied about its paper in the vegetal defense and the potential use in the resistance of susceptible wood to termites.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os caprinos sÃo considerados importantes fontes de carne, leite e pele, e, portanto, desempenham importante papel econÃmico especialmente na regiÃo nordeste do Brasil Diante disso, o desenvolvimento de sistemas de cultivo de folÃculos ovarianos pode otimizar potencial reprodutivo desta espÃcie. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da lectin PHA de Phaseolus vulgaris sobre o desenvolvimento de folÃculos ovarianos caprino cultivados in vitro. FolÃculos secundÃrios (~ 0,2mm) foram isolados de cÃrtex ovariano e individualmente cultivados por seis dias em &#945;-MEM+ suplementado com 0, 1, 10, 50, 100 o 200Âg/mL da lectina PHA. Ao final do perÃodo de cultivo, os nÃveis de RNAm para FSH-R PCNA e NOS1 nestes folÃculos foram quantificados por qRT-PCR . Os resultados mostraram que, apÃs o cultivo, todos os tratamentos foram capazes de manter a sobrevivÃncia folicula AlÃm disso, nÃo foram observadas diferenÃas significativas entre os tratamentos e o control no aumento do diÃmetro folicular durante o cultivo. Entretanto, a PHA na concentraÃÃo de 10Âg/mL promove uma maior taxa de formaÃÃo de antro em relaÃÃo ao controle (&#945;-MEM+ Nessa concentraÃÃo houve maior expressÃo dos nÃveis de RNAm para FSH-R e PCNA. Em conclusÃo, a PHA na concentraÃÃo de 10Âg/mL mostrou aÃÃo biolÃgica na formaÃÃo antro estimulou um aumento nos nÃveis de expressÃo de RNAm para FSH-R e PCNA em folÃculo secundÃrios caprinos cultivados in vitro por 6 dias. / Goats are considered important sources of meat, milk and skin, and therefore play an important economic role, especially in northeastern Brazil. Thus, the development of culture systems can optimize the reproductive potential of this species. This study aimed to evaluate the effect of lectin PHA of Phaseolus vulgaris on the development of caprine secondary follicles cultured in vitro. Secondary follicles (~0,2mm) were isolated from the cortex of caprine ovaries and individually cultured for six days in &#945;-MEM+ supplemented with PHA at concentrations of 0, 1, 10, 50, 100 or 200Âg/mL. The levels of mRNA for R-FSH, PCNA and NOS1 in these follicles were also evaluated. The results showed that, after culture, all treatments were capable of maintaining the follicular survival. Moreover, there was no significant difference among all treatments regarding follicular growth. However, PHA at concentrations of 10Âg/mL increased the antrum formation rate when compared with control. In this concentration, there was a higher expression of mRNA for R-FSH and PCNA. In conclusion, PHA at concentration 10Âg/mL showed a biological action in antro formation and stimulated an increase of levels of expression of RNAm in caprine ovarian follicles cultured for six days.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Lectinas de plantas podem ser definidas como proteÃnas de origem nÃo imune que possuem pelo menos um domÃnio nÃo catalÃtico que se liga reversivelmente de maneira especÃfica a um mono- ou oligossacarÃdeo. A famÃlia das lectinas de leguminosas representa o grupo destas proteÃnas mais bem estudadas, em especial destaque a subtribo Diocleinae, que possui o representante mais bem caracterizado, a ConA. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porÃm o mesmo nÃo ocorre quanto Ãs atividades biolÃgicas e especificidade a carboidratos variados, o que torna importante a investigaÃÃo em nÃveis estruturais e biolÃgicos dos seus diversos membros, dentre eles a Canavalia grandiflora Benth. A lectina de sementes de Canavalia grandiflora (ConGr) foi purificada de acordo com Ceccato (2001) e foi cristalizada pelo mÃtodo de difusÃo de vapor a 293 K. Cristais foram obtidos em uma condiÃÃo contendo 0,5 M de sulfato de cÃdmio hidratado, 0,1 M de HEPES pH 7.5 e 1,0 M de acetato de sÃdio triidratado. Os cristais apresentam o grupo espacial ortorrÃmbico I222, a cela unitÃria tem como dimensÃes a=67,70 Ã, b=55,90à e c=107,46 à e Ãngulos ?=?=?=90Â, sendo observado um monÃmero na unidade assimÃtrica e um conteÃdo de 42,53% de solvente no cristal. A estrutura foi resolvida a 2,19à e o problema de fase foi solucionado pelo mÃtodo de substituiÃÃo molecular utilizando as coordenadas da Canavalia gladiata como modelo (PDB: 2D7F). O refinamento satisfatÃrio apresentou âRfactorâ e âRfreeâ com 22,6 e 27,4 respectivamente e apenas um resÃduo de aminoÃcido em regiÃo nÃo permitida do Ramachandran. Apesar da alta similaridade estrutural, pequenas mudanÃas na orientaÃÃo de aminoÃcidos chaves, podem ser responsÃveis pela diversidade nos resultado de aplicaÃÃes biolÃgicas como os resÃduos do sÃtio de ligaÃÃo a carboidrato, que apesar de conservados possuem modificaÃÃes na orientaÃÃo espacial. A seqÃÃncia primÃria da lectina de C. grandiflora apresenta grande similaridade com lectinas do mesmo gÃnero, porÃm ela concentra o maior nÃmero de mutaÃÃes representativas do gÃnero Dioclea, caracterizando-o como o subgÃnero de Canavalia mais prÃximo de Dioclea, e dentre as canavalias à a mais primitiva. A ConGr apresentou atividade edamatogÃnica em modelo de edema de pata (s.c.) e efeito relaxante em mÃsculo liso de aortas de ratos endotelizadas, porÃm os efeitos mostram-se fracos frente a outras lectinas de Diocleinae. / Plant Lectins can be defined as non-immune origin proteins having at least one non-catalytic domain that binds reversibly in a specific fashion to a mono-or oligosaccharide. The legume lectin family group represents the best studied of these proteins, in particular highlighted the subtribe Diocleinae, which has the best characterized representative, ConA. Lectins Diocleinae show a high degree of structural similarity, but the same does not regarding biological activities and specificity to different carbohydrates, which makes it important to research in structural and biological levels of its various members, among them the Canavalia grandiflora Benth. The lectin from Canavalia grandiflora (Congr) was purified according to Ceccato (2001) and was crystallized by vapor diffusion method at 293 K. Crystals were obtained in a state containing 0.5 M of cadmium sulfate hydrate, 0.1 M HEPES pH 7.5 and 1.0 M sodium acetate trihydrate. The crystals have the orthorhombic space group I222, the unit cell has the dimensions a = 67.70 Ã, b = 55.90 à and c = 107.46 à and angles? =? =? = 90 Â, giving a monomer in the asymmetric unit and a content of 42.53% solvent in the crystal. The structure was solved to 2.19 à and phase problem was solved by the method of molecular replacement using the coordinates of Canavalia gladiata as a template (PDB: 2D7F). The refinement showed satisfactory "rfactor" and "Rfree" with 22.6 and 27.4 respectively and only one amino acid residue in a region of the Ramachandran disallowed. Despite the high structural similarity, small changes in the direction of key amino acids may be responsible for the diversity in the biological applications as a result of the residues of the carbohydrate binding site which are retained despite changes in spatial orientation. The primary sequence of the lectin from C. grandiflora has great similarity with lectins of the same genus, but it has the largest number of mutations representative of the genus Dioclea, characterizing it as the subgenus Canavalia nearest Dioclea and canavalias is among the most primitive. The Congregation edamatogÃnica showed activity in a model of paw edema (sc) and relaxing effect on smooth muscle of rat aorta endothelial, but the effects appear to be weak compared to other lectins Diocleinae.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / As sementes de Bauhinia bauhinioides Mart, uma espÃcie pertencente à FamÃlia Leguminosae, SubfamÃlia Caesalpinoideae, Tribo Cercideae, possuem uma lectina Galactose/Lactose especÃfica, que aglutina eritrÃcitos de coelho e humanos nativos ou tratados com enzimas proteolÃticas. A lectina de sementes de B. bauhinioides foi purificada por precipitaÃÃo com sulfato de amÃnio seguida por cromatografias de trocas iÃnica em DEAE-Sephacel e em HiTrap SP, essa Ãltima acoplada a HPLC. Esse procedimento resultou na lectina purificada, nomeada BBL. O processo de purificaÃÃo da BBL foi monitorado por SDS-PAGE e observou-se que a lectina purificada à caracterizada por um perfil eletroforÃtico composto por uma banda Ãnica, com massa molecular aparente de aproximadamente 31 kDa, tanto na presenÃa quanto na ausÃncia de um agente redutor. A anÃlise por espectrometria de massas indicou que BBL possui massa molecular de 28310 Da e, por cromatografia de exclusÃo molecular, observou-se que a lectina, na sua forma nativa, parece assumir uma estrutura tetramÃrica. A lectina de sementes de B. bauhinioides nÃo à uma glicoproteÃna e demonstra elevada estabilidade, sendo capaz de manter sua atividade hemaglutinante em uma ampla faixa de pH, apÃs exposiÃÃo a temperaturas de atà 60 C por 1 hora e apÃs diÃlise contra EDTA. BBL foi testada quanto a atividade prÃ-inflamatÃria utilizando o modelo de edema de pata em ratos, tendo sido observada uma induÃÃo significativa de edema nos animais tratados com BBL na dose de 1,0 mg/kg sendo esta atividade prÃ-inflamatÃria inibida pela incubaÃÃo prÃvia da lectina com 0,1 M de D-galactose. Foi avaliado tambÃm o efeito prÃ-inflamatÃrio da BBL em presenÃa de bloqueadores farmacolÃgicos de dois importantes mediadores inflamatÃrios e observou-se que o L-NAME, um inibidor nÃo-seletivo da enzima Ãxido NÃtrico Sintase, inibiu significativamente o edema causado pela lectina, sugerindo que a atividade prÃ-inflamatÃria causada por BBL envolve a participaÃÃo do oxido nÃtrico. Esses resultados reforÃam a idÃia da utilizaÃÃo de lectinas vegetais como ferramentas biotecnolÃgicas em estudos sobre os mecanismos implicados na resposta inflamatÃria. / A new galactose-specific lectin, named BBL, was purified from seeds of the Caesalpinoideae plant, Bauhinia bauhinioides, by precipitation with solid ammonium sulfate followed by two steps of ion exchange chromatography, and its pro-inflammatory activity was evaluated. The lectin haemagglutinated rabbit and humans erythrocytes (native and treated with proteolytic enzymes), which occurred independent on presence of divalent cations, was stable at 60 ÂC for 60 min, had an optimum pH between pH 8.0 and 9.0 and was inhibited after incubation with D-galactose and its derivatives, especially &#945;-methyl-D-galactopyranoside. The pure protein was found to have a molecular mass of 31 kDa by SDSâPAGE and 28,305 Da by electrospray ionization mass spectrometry. The s.c. injection of BBL induced dose-dependent paw edema at all doses tested, an effect that occurred via carbohydrate site interaction and that was significantly reduced by L-NAME, indicating the important participation of nitric oxide in the late phase of the edema induced by BBL. These findings indicate that this lectin can be used as a tool to better understand the mechanisms involved in inflammatory responses.