A Lectina Ligadora de Manose (MBL) é uma proteína que reconhece carboidratos na superfície microbiana levando à ativação do sistema complemento. Este processo é mediado por Serino Proteases tal como a MASP-2. O complexo MBL/MASP-2 é responsável pela formação da C3 convertase C4bC2b. Os níveis séricos de MBL e a MASP-2 (genes MBL2 e MASP-2, respectivamente) são geneticamente determinados, e podem ser influenciados pela presença de polimorfismos em um único nucleotídeo SNPs em genes codificadores destas proteínas. OBJETIVO: Determinar os níveis séricos e polimorfismos gênicos da MBL e MASP-2 em uma amostra da população brasileira. MÉTODOS: 294 amostras de doadores de sangue [mediana = 36,51 ± 10,56; 18-63 anos; 91/294 (30,95%) sexo feminino, 203/294 (69,05%) sexo masculino] foram genotipadas para os SNPs do éxon 1 (MBL2): SNPs localizados nos códons 52 (ArgCys), 54 (GlyAsp) e 57 (GlyGlu) e SNP Asp371Tyr (D371Y, A>C ) do gene da MASP-2 (éxon 9). Foi utilizado o ensaio de temperatura de dissociação para éxon 1 (MBL2) e sequenciamento direto dos promoters (H/L, X/Y e P/Q, nas posições -550, -221 e +4, respectivamente). A combinação das variantes do éxon 1 MBL2 foram agrupadas e denominadas alelo O e o genótipo selvagem foi denominado A. O éxon 9 da MASP-2 foi genotipado através da plataforma TaqMan. RESULTADOS: MBL2: 58,5% A/A, 36,39% A/O e 5,1% O/O; promoters: 13% H/H, 39% H/L, 48% L/L; 2% X/X, 26% X/Y, 72% Y/Y; 52% P/P, 37% P/Q, 11% Q/Q; haplótipos encontrados: 15% LXPA, 28% HYPA, 8% LYQO, 12% LYPO, 11% LYPA, 22% LYQA e 4% HYPO. Quanto à produção, 56,12% produziram altos níveis de MBL, 30,61% níveis médios e 13,27% níveis baixos ou insuficientes de MBL. Para MASP-2: 38,78% A/A, 44,56% A/C e 16,67% C/C. CONCLUSÃO: A prevalência (5,1%) SNP O/O do éxon 1 (MBL2) está de acordo com a literatura brasileira, é semelhante à européia (4%) e japonesa (5%), menor que a africana (10-14%). Níveis séricos de MBL corresponderam aos genótipos determinados. Esta é a primeira avaliação da frequência do SNP D371Y do gene MASP-2 em uma população brasileira. Os resultados deste trabalho fornecem subsídios para estudos sobre repercussão de MBL e MASP-2 em situações clínicas / BACKGROUND: Mannose-binding lectin (MBL) is a protein that recognizes carbohydrates on microbial surface leading to complement activation. This process is mediated by MBL-associated serine proteases, such as MASP-2. MBL/MASP-2 complex is responsible for generating the C3 convertase C4bC2b. Both MBL and MASP-2 levels are genetically determined, and can be influenced by the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genes encoding for these proteins (namely MBL2 and MASP-2). OBJTECTIVE: to determine MBL and MASP-2 serum levels and the frequencies of MBL2 and MASP-2 gene polymorphisms in a Brazilian population sample. METHODS: 294 blood donor samples [median age = 36.51 ± 10.56 years, range 18-63, 91/294 (31%) females and 203/294 (69%) males] were genotyped for MBL2 exon 1 SNPs: single point mutation in codon 52 (ArgCys), 54 (GlyAsp) and 57 (GlyGlu), and MASP-2 polymorphism Asp371Tyr (D371Y, A>C) (exon 9). A melting temperature assay was used to perform the genotyping of MBL2 SNPs. The combination of variants of MBL2 were grouped together as allele O, wild types were indicated as A. Exon 1 promoters were evaluated by direct genotype sequencing- alleles H/L, X/Y and P/Q (positions -550, -221 and +4, respectively). MASP-2 exon 9 genotyping was performed by using TaqMan pre-developed assay. RESULTS: MBL2: 58.5% A/A, 36.39% A/O, 5.1% O/O; promoters: 13% H/H, 39% H/L, 48% L/L; 2% X/X, 26% X/Y, 72% Y/Y; 52% P/P, 37% P/Q, 11% Q/Q; haplotypes: 15% LXPA, 28% HYPA, 8% LYQO, 12% LYPO, 11% LYPA, 22% LYQA and 4% HYPO. MASP-2: 38.78% A/A, 44.56% A/C and 16.67% C/C. CONCLUSION: The prevalence (5.1%) of O/O genotype of MBL2 exon 1 SNPs in our population is in accordance with Brazilian reports, similar to European (4%) and Japanese (5%); lower than Africans (10-14%). There is a correlation between MBL serum levels and genotyping. Moreover, this is the first report of D371Y MASP-2 polymorphism frequency in a Brazilian population. Our data may contribute to new insights on the role of MBL and MASP-2 in clinical conditions

Diante da importância das lectinas no sistema imunológico avaliamos o papel da Nattectina, lectina tipo C identificada no veneno de Thalassophryne nattereri, no desenvolvimento das respostas imunes inata e específica. A Nattectina induziu peritonite em camundongos, caracterizada pelo influxo de neutrófilos e macrófagos, acompanhada da liberação de PGE2, LTB4, IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-6, KC, MCP-1, IL-10 e IL-12p70. A resposta imune específica induzida pela Nattectina foi caracterizada pela produção de anticorpos específicos IgG, IgG1 e principalmente IgG2a com síntese de IL-10 e IFN-<font face=\"symbol\">g pelas células esplênicas re-estimuladas in vitro. A incubação de células dendríticas imaturas com a Nattectina gerou maturação destas células com aumento da expressão de moléculas MHC classe II, CD40, CD80, CD86 e expressão de MMP-2 e MMP-9 distribuídas no núcleo e no citoplasma celular, produção das citocinas IL-10 e IL-12p70 e eficiente apresentação antigênica. Concluímos que a Nattectina é capaz de induzir inflamação e resposta imune específica do tipo Th1 mediante a ativação de células dendríticas. / Due to the importance of the lectins in the immunological system we evaluated the role of Nattectin a C-type lectin identified in the venom of Thalassophryne nattereri on development of the innate and specific immune responses. Nattectin induced a significant cellular recruitment into peritoneal cavity of mice, mainly by influx of neutrophils, followed by macrophages, with synthesis of PGE2, LTB4, IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-6, KC, MCP-1, IL-10, and IL-12p70. The specific immune response induced by Nattectin was characterized by the production of specific antibodies IgG, IgG1 and mainly IgG2a with IL-10 and IFN-<font face=\"symbol\">g synthesis by splenic cells. Incubation of immature dendritic cells with Nattectin resulted in maturation with up-regulation of MHC class II, CD40, CD80, CD86, and expression of MMP-2 e MMP-9 distributed in nucleus and cytoplasm. Mature dendritic cells produced and release IL-10 and IL-12p70 and present the antigen efficiently. We concluded that Nattectin is able to induce inflammation and Th1 specific immune response through the activation of dendritic cells.

A implantação embrionária e a placentação em cobaios são caracterizadas pela presença trofoblastos que se destacam da placenta principal, semelhantes ao trofoblasto extra-viloso de humanos. Nestes animais ultrapassam os limites, e podem ser encontrados infiltrados no profundamente no endométrio e no em ambiente externo ultrapassando aos limites da parede uterina. A cobaia desenvolve uma importante estrutura fisiológica de troca materno-embrionária, denominada de placenta vitelina invertida, definidas como membrana fetal destituída parcial ou totalmente do revestimento trofoblástico que permite a exposição do endoderma extra-embrionário em contato direto com o tecido materno. Tais características denotam um mecanismo de controle da resposta imune materna distinta dos paradigmas estabelecidos na reprodução humana e de roedores, assim como ratos e camundongos. Sendo a mais intrigante, a destituição do trofoblasto como célula da interface-materno-fetal que controla a tolerância imune-materna.No presente trabalho, procurou-se estabelecer a organização da placenta vitelina de cobaios a partir da identificação das células que compõe esta membrana extra-embrionária e identificar em que momento ocorre à remoção das células trofoblásticas, e a subseqüente forma de interação das células da placenta vitelina na interface com o tecido materno. Para tanto foram utilizados cobaias fêmeas com idade gestacional conhecida, sacrificadas para coleta de segmentos uterinos nos períodos iniciais da gestação e destinados ao processamento histotógico de embebição em parafina. Na ausência de marcadores celulares específicos conhecidos para cobaios, foram realizados testes prospectivos com reações: citoquímicas de PAS e azul de toluidina (AT; um painel de lectinas biotinadas com afinidade específica para diferentes açúcares; e imunocitoquímica para citoqueratina. As reações realizadas com PAS e AT não identificaram populações celulares com marcação seletiva. Contudo dentre as lectinas tetadas, a Erytrina cristagali lectin (ECL) apresentou reação altamente seletiva para a população de trofoblasto mural (TM) que se origina do trofectoderma, mantendo esta reatividade ao longo da gestação. Esta marcação permitiu avaliar temporal e espacialmente o destino destas células que ao longo da gestação eram mantidas como monocamada de TM revestindo externamente a placenta vitelina e, portanto, não expondo as células do endoderma parietal ou visceral ao ecido materno. Pelo acompanhamento do desenvolvimento embrionário nos cortes seriados, foi constatada no interior do blastocisto a organização de duas massas celulares internas em pólos opostos desde a fase de pré-eclosão. Uma das massas celulares constituída de embrioblastos que dará origem aos os folhetos embrionários nas fases subseqüentes, enquanto a outra formada as células tronco trofoblásticas precursora do cone ectoplacentário (CE). A cavidade da blastocele que separa estas duas massas celulares tem a sua parede revestida pelo endoderma parietal em fase tardia, após a formação da cavidade amniótica. Estes achados demonstram a pecularidade da embriogênese no cobaio, diferente daquelas descritas para humanos e outros roedores, não permitem analogias diretas, o que pode ter contribuído para o equívoco na descrição clássica da organização e constituição da placenta vitelina invertida de constituição córion-amniótica. Isto é, o trofoblasto participa da organização da placenta vitelina inicial e permanece na membrana âmnion-córion-vitelina perfazendo todo o limite do embrião ao longo da gestação. Portanto a hipótese da placenta vitelina parcial ou totalmente invertida baseada na descrição clássica em cobaios é decorrente da interpretação equivocada da embriogênese destes animais. / The guinea pig embryo implantation and placentation is characterized by trophoblast cells detaching from the main placenta in a similar way of human extra-villous trophobasts that deeply intrude inside the endometrium and sometimes also found outside the uterine wall. Furthermore, this animal also develops inverted yolk sac placenta defined as fetal membrane partially or fully devoided of trophoblast sheet that allows extra-embryonic endoderma direct exposition to the maternal environment. These characteristics denote a distinct control mechanism of maternal immune response from the established paradigm for human and rodents (rat and mouse) reproduction, being most intriguing the depriving of trophoblast as cells of maternal-fetal interface regulating the maternal immune tolerance. The present work aimed to establish the organization of guinea pig yolk sac based on identification of cell populations composing this membrane and identification if, or, when the trophoblast cells are removed from and subsequent interaction way of yolk sac cell in interface with maternal tissue. It was used pregnant guinea pig sacrificed on established gestational day to collect uterine fragments on early pregnancy stage and processed by conventional paraffin embedding. Due to absence of known specific cell markers for guinea pig, was performed the prospective evaluation using PAS and toluidine blue (TB) cytochemistry and a screening using a panel of biotinylated lectin specific for different sugars and, anti-cytokeratin. The PAS and TB staining did not identify any specific cell population, however, among the lectins used, Erytrina cristagali lectin (ECL) showed high selective labeling to the trophoblast cells originated from the trophectoderm that was kept through the gestational period. This reaction pattern was useful to evaluate chronologically and topologically the fate of this cell and confirmed the constancy of these cells layering the yolk sac placenta in contact with maternal tissue and therefore, endodermal cells were not exposed to maternal environment. Evaluation of embryo development step by step in the serial sections showed the presence of two inner cell mass in opposite sites inside the pre-hatched blastocyst. One of this, was formed with embryoblast that latter will originate the embryonic sheets and the other formed with trophoblast stem cells (ST) will originate the ectoplacental-cone. The wall of blastocele cavity separate these two inner cell mass was initially covered by a single ECL positive mural trophoblast and only later after the amniotic cavity is formed the extraembyonic endodermal cells migrate from the embryonic sheets to cover internally the blastocele cavity to organize the yolk sac placenta. These findings show the peculiarity of guinea pig embryogenesis, quite different from those described for human and rodents and therefore, does not allow direct analogy and seems to contribute in the misunderstanding of classic description of inverted yolk sac placenta and its cellular organization. It means, the trophoblast cell participates in the early organization of yolk sac placenta and remains in chorioamniotic yolk sac fetal membrane constantly limiting the embryo surface in contact with maternal environment. Therefore, the hypothesis of complete or partially inverted yolk sac placenta seems to be a miss understanding of guinea pig embryogenesis.

Pulchellina é uma proteína inativadora de ribossomo (RIP) isolada de sementes de Abrus pulchellus fragmento que codifica a cadeia A da pulchellina (PAC) foi clonado e inserido no vetor pGEX-5X para expressar a cadeia A recombinante (rPAC) como uma proteína de fusão em Escherichia coli. A análise da seqüência de aminoácidos mostrou que a rPAC apresenta uma alta identidade seqüencial (&#62 86%) com a cadeia A da abrina-c. A habilidade que a rPAC possui para depurinar rRNA em ribossomos de levedura também foi demonstrada em testes in vitro. Objetivando verificar a atividade tóxica do produto heterólogo, nós promovemos a associação in vitro da rPAC com a cadeia B recombinante da pulchellina (rPBC). Ambas as cadeias foram incubadas na presença de um sistema de redução/oxidação, originando um heterodímero ativo (rPAB). O rPAB apresentou uma massa molecular aparente de aproximadamente 60 kDa, similar a pulchellina nativa. As atividades tóxicas do rPAB e da pulchellina nativa foram comparadas através da injeção intraperitonial em camundongos, usando diferentes diluições de cada proteína. O rPAB foi capaz de matar 50% dos animais testados com doses de 45&#956g.kg-1. Nossos resultados mostraram que o heterodímero recombinante apresenta tanto toxicidade quanto um padrão conformacional similar a pulchellina nativa. Estudos usando cultura de tecidos também foram realizados com o objetivo de investigar a presença da pulchellina em calos obtidos a partir de sementes de A. pulchellus. Segmentos de cotilédones de sementes imaturas foram inoculados em meio MS suplementado com diferentes concentrações de auxina, citocinina e sacarose para promover a indução dos calos. A expressão da pulchellina nos calos foi monitorada através de RT-PCR e testes de atividade biológica. Os calos obtidos após 35 dias foram congelados, macerados e submetidos a extração de RNA total e proteínas. Um fragmento específico de DNA que codifica a cadeia A da pulchellina foi amplificado a partir do RNA total sugerindo a síntese da proteína nos calos. Isto foi confirmado no extrato bruto de calos, que mostrou atividade hemaglutinante contra sangue de coelho e uma alta toxicidade quando injetado via intraperitoneal em camundongos.O extrato bruto também foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose-4B. A fração retida na coluna apresentou duas bandas protéicas quando analisadas em gel de poliacrinamida, sob condições desnaturantes, apresentando um padrão similar ao obtido com a pulchellina de semente. / Pulchellin is a type 2 ribosome-inactivating protein (RIP) isolated from seeds of the Abrus pulchellus tenuiflorus plant. The DNA fiagment encoding Pulchellin A-chain (PAC) was cloned and inserted in pGEX-5X to express the recombinant pulchellin Achain (rPAC) as a fusion protein in Escherichin coli. The deduced amino acid sequence analyses of the rPAC presented a high sequential identity (&#62 86%) with the A-chain of abrin-c. The ability of the rPAC to depurinate rRNA in yeast ribosome was also demonstrated in vitro. Intending to validate the toxic activity we promoted the in vitro association of the rPAC with the recombinant pulchellin binding chain (rPBC). Both chains were incubated in the presence of a reducedloxidized system, yielding an active heterodimer (rPAB). The rPAB showed an apparent molecular mass of about 60 D a similar to the native pulchellin. The toxic activities of the rPAB and native pulchellin were compared by intraperitoneal injection in mice using different dilutions. The rPAB was able to kill 50% of the tested mice with doses of 45&#956g.kg-1. Our results indicated that the recombinant heterodimer presented toxic activity and a conformational pattern similar to pulchellin. Studies using tissue cultures were also performed to investigate the presence of the pulchellin in callus established from seed explants of A. pulchellus. Cotyledon segments of immature seeds were inoculated in basal medium MS supplemented with different concentrations of auxin, citokinin and sucrose in order to determine the best callus induction. The pulchellin expression was monitored in callus cultures by RT-PCR and biological activity. The calli obtained aRer 35 days were freeze dried, macerated and submitted to extraction of total RNA and proteins. A specific DNA fragment codifying the A-chain pulchellin was amplified from callus RNA suggesting the synthesis of the protein. This was confirmed in the calli crude extract that showed haemagglutinating activity against rabbit blood cells and a high intraperitoneal toxicity to mice. The crude extract was also submitted to affinity chromatography on a Sepharose-4B column. The retained protein, showed to be composed by two main bands in polyacrylamide gel electrophoresis, in denaturating conditions, with a similar pattern to the results obtained with seeds pulchellin.

De la reconnaissance protéine-glucides. Une activité lectine avec une spécificité mannose/glucose a été détectée dans les graines de Platypodium elegans, une légumineuse de la sous-tribu Dalbergiae. Le gène de la lectine PELa a été cloné. Son produit est une protéine de 261 acides aminés appartenant à la famille des lectines de légumineuses et présentant des similarités avec l'agglutinine de Pterocarpus angolensis (PAL). La lectine recombinante a été exprimée dans E. coli et renaturée à partir des corps d'inclusion. L'analyse de la spécificité par Glycan Array montre une préférence très rare pour des N-glycanes de type complexe avec des branches disymmétriques. Une branche courte composée d'un résidu de mannose est préférée sur le bras 1-6 des N-glycanes, tandis que l'extension par les résidus GlcNAc et Gal et favorable sur le bras 1-3. Les affinités ont été mesurées par microcalorimétrie de titration en utilisant des heptasaccharides liés à une asparagine et obtenus par une méthode semi-enzymatique. Une très forte affinité de 5 uM a été obtenue pour deux ligands symétriques et disymmétriques. Les structures cristallographiques de PELa complexé avec le trimannose branché et l'heptasaccharide-Asn symétrique de type complexe ont été résolues respectivement à 2,1 et 1,65 Å de résolution. La lectine adopte l'organisation dimérique canonique des lectines de légumineuses. Le trimannose ponte les sites de liaison de deux dimères voisins, résultant en la formation de chaînes infinies dans le cristal. L'heptasaccharide-Asn se lie par le mannose du bras 1-6 dans le site principal de liaison et de nombreux contacts supplémentaires sont établis avec les autres résidus glucidiques. Le GlcNAc du bras 1-3 interagit avec la surface de la protéine dans une conformation contrainte qui peut expliquer la plus grande affinité que l'on observe sur les puces pour les oligosaccharides avec des bras 1-3 courts qui ne contiennent pas ce monosaccharide. / Lectin activity with specificity for mannose and glucose has been detected in the seed of Platypodium elegans, a legume from the Dalbergiae tribe. The gene of the lectin PELa has been cloned and the resulting 261 amino acid protein belongs to the legume lectin family with similarity with Pterocarpus angolensis agglutinin (PAL) from the same tribe. The recombinant lectin has been expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. Analysis of specificity by Glycan Array evidenced a very unusual preference for complex type N-glycans with asymmetrical branches. A short branch consisting of one mannose residue is preferred on the 6- arm of the N-glycan, while extension by GlcNAc, Gal and NeuAc are favorable on the 3-arm. Affinities have been obtained by microcalorimetry using symmetrical and asymmetrical Asn- linked heptasaccharide prepared by semi-enzymatic method. Strong affinity of 5 µM was obtained for both ligands. Crystal structures of PELa complexed with branched trimannose and symmetrical complex type Asn-linked heptasaccharide have been solved at 2.1 and 1.65 Å resolution respectively. The lectin adopts the canonical dimeric organization of legume lectins. The trimannose bridges the binding sites of two neighbouring dimers, resulting in the formation of infinite chains in the crystal. The Asn-linked heptasaccharide binds with the 6-arm in the primary binding site and extensive additional contacts on both arms. The GlcNAc on the 3-arm is bound in a constrained conformation that may rationalize the higher affinity that is observed on chips for oligosaccharide with shorter 3-arm that do not present this monosaccharide.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Lectinas podem ser definidas como proteÃnas/glicoporteÃnas que reconhecem carboidratos de maneira especÃfica, mas nÃo participam do metabolismo dos mesmos e nÃo pertencem a nenhuma das principais classes de imunoglobulinas. As lectinas sÃo proteÃnas ubÃquas, estando presente em todos os organismos conhecidos. Em cÃlulas animais, lectinas tÃm sido encontradas no citoplasma, no nÃcleo e associadas a membranas das mais diversas organelas e nos mais variados tipos celulares. Tais lectinas animais podem ser classificadas em famÃlias distintas com base em suas caracterÃsticas fÃsico quÃmicas, funÃÃo e especialmente em sua identidade de estrutura primÃria e terciÃria. O objetivo deste trabalho foi purificar duas novas lectinas da esponja marinha Haliclona (Soestella) caerulea e caracterizar estruturalmente uma delas. EspÃcimes de H.caerulea foram coletados na praia do paracuru, CearÃ. Duas lectinas (H-1 e H-3) foram isoladas por tÃcnicas clÃssicas de quÃmica de proteÃnas. A estrutura primÃria de uma delas foi determinada por espectrometria de massas e RACE. A atividade tÃxica das lectinas foi avaliada frente à nÃuplios de Artemia e cepas das bactÃrias Escherichia coli e Staphylococus aureus. H-1 e H-3 apresentaram caracterÃsticas distinhas da lectina previamente isolada de H. caerulea. H-1 à uma proteÃna monomÃrica de aporoximadamente 40 kDa enquanto que H-3 à uma proteÃna trimÃrica com cadeias com massa aproximada de 9, 16 e 18 kDa. H-3 aglutina eritrÃcitos humanos do tipo A e B e foi inibida GalNAc e PSM, H-1 aglutina diversos grupos sanguineos e nÃo pÃde ser inibida por nenhum aÃÃcar testado. H-1 foi tÃxica a naÃplios de Artemia (LC50=6,4 &#956;g.mL-1) e H-3 foi considerada nÃo tÃxica (LC50=414,2 &#956;g.mL-1). H-3 à uma proteÃna azul, pois interage com um cromÃforo de 597 Da com absorÃÃo mÃxima a 620 nm. A estrutura primÃria de H-3 foi determinada e revelou-se Ãnica, nÃo sendo conhecida nenhuma lectina com estrutura similar. H-3 apresenta um glicano hÃbrido composto por Hex7NAcHex7DeoxiHex2. A cadeia &#945; de H-3 sofre um processamento proteolÃtico complexo que ainda nÃo foi completamente elucidado. AlÃm disso, H-3 foi cristalizada, mas nÃo foi possÃvel a obtenÃÃo de um padraÃo de difraÃÃo que permita a resoluÃÃo da estrutura. Em suma, duas novas lectinas foram isoladas e fora observado pela primeira vez a interaÃÃo entre uma lectina e um cromÃforo natural. Pela primeira vez tambÃm, fora determinada a composiÃÃo glicÃdica de uma lectina de esponja. / Lectins are proteins/glycoproteins that recognize carbohydrate of a specific way, but not participate in the metabolism of the same and do not belong to any of major classes of immunoglobulins. Lectins are ubiquitous proteins, present in all known organisms. In animal cells, lectins have been found in the cytoplasm, in the nucleous and as membrane-associated proteins, in diverse organelles and cells. Animal lectins can be classified into distinct families based on their physicochemical characteristics, especially in their function and identity of primary and tertiary structure. The aim of this study was to purify, characterize structural and biologically new lectins from the marine sponge Haliclona (Soestella) caerulea. H. caerulea specimens were collected in Paracuru beach, CearÃ. Two lectins (H-1 and H-3) were isolated by classical techniques of protein chemistry. The primary structure of H-3 was determined by mass spectrometry and RACE. The toxic activity of lectins was evaluated against Artemia nauplii and Escherichia coli and Staphylococcus aureus strains. H-1 and H-3 showed distinct characteristics of the lectin previously isolated from H. caerulea. H-1 is a monomeric protein of 40 kDa whereas H-3 is a heterogeneus protein with chains of 9, 16 and 18 kDa. H-3 binds human erythrocytes of A and B type and was inhibited by GalNAc and PSM, H-1 binds different blood groups and could not be inhibited by any sugar tested. H-1 was toxic to Artemia nauplii (LC50 = 6.4 &#956;g.mL-1) and H-3 was not considered toxic (LC50 = 414.2 &#956;g.mL-1). H-3 is a blue protein that interacts with a chromophore of 597 Da of maximum absorbance at 620 nm. The primary structure of H-3 revealed a unique amino acid sequence no similar to any animal lectins known. H-3 has a hybrid glycan comprising by Hex7NAcHex7DeoxiHex2. The &#945;-chain of H-3 undergoes complex proteolytic processing that not been fully elucidated. Moreover, H-3 was crystallized, but was not possible to obtain a diffraction pattern that permits solving the structure. In short, two new lectins were isolated and out first observed the interaction between a lectin and natural chromophore. Furthermore, for the first time given the composition glicidic out of a sponge lectin.

De la reconnaissance protéine-glucides. Une activité lectine avec une spécificité mannose/glucose a été détectée dans les graines de Platypodium elegans, une légumineuse de la sous-tribu Dalbergiae. Le gène de la lectine PELa a été cloné. Son produit est une protéine de 261 acides aminés appartenant à la famille des lectines de légumineuses et présentant des similarités avec l'agglutinine de Pterocarpus angolensis (PAL). La lectine recombinante a été exprimée dans E. coli et renaturée à partir des corps d'inclusion. L'analyse de la spécificité par Glycan Array montre une préférence très rare pour des N-glycanes de type complexe avec des branches disymmétriques. Une branche courte composée d'un résidu de mannose est préférée sur le bras 1-6 des N-glycanes, tandis que l'extension par les résidus GlcNAc et Gal et favorable sur le bras 1-3. Les affinités ont été mesurées par microcalorimétrie de titration en utilisant des heptasaccharides liés à une asparagine et obtenus par une méthode semi-enzymatique. Une très forte affinité de 5 uM a été obtenue pour deux ligands symétriques et disymmétriques. Les structures cristallographiques de PELa complexé avec le trimannose branché et l'heptasaccharide-Asn symétrique de type complexe ont été résolues respectivement à 2,1 et 1,65 Å de résolution. La lectine adopte l'organisation dimérique canonique des lectines de légumineuses. Le trimannose ponte les sites de liaison de deux dimères voisins, résultant en la formation de chaînes infinies dans le cristal. L'heptasaccharide-Asn se lie par le mannose du bras 1-6 dans le site principal de liaison et de nombreux contacts supplémentaires sont établis avec les autres résidus glucidiques. Le GlcNAc du bras 1-3 interagit avec la surface de la protéine dans une conformation contrainte qui peut expliquer la plus grande affinité que l'on observe sur les puces pour les oligosaccharides avec des bras 1-3 courts qui ne contiennent pas ce monosaccharide.

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune caracterizada pela produção de múltiplos auto-anticorpos, com componentes celulares nucleares como principal alvo. De etiologia desconhecida, envolve fatores genéticos, imunológicos, hormonais e ambientais. A deficiência na lectina ligadora da manose (MBL), um dos componentes do sistema de complemento, pode produzir uma apresentação anormal de antígenos para o sistema imunológico. Os polimorfismos genéticos na região promotora e codificante do gene MBL2 estão fortemente correlacionados com os níveis séricos da proteína MBL, tendo um possível impacto no mecanismo de tolerância imunológica. A influência do tabagismo ainda não foi avaliada em pacientes que apresentam estas variações alélicas. Nosso objetivo foi investigar o papel dos haplótipos associados à produção de MBL e tabagista sobre os índices de atividade, cronicidade e dano em pacientes com LES. Investigamos a frequência haplótipica da MBL em 327 pacientes com LES, classificados em Euro e Afro-descendentes. O hábito tabagista, dados clínicos e laboratoriais foram retirados dos prontuários e protocolos de pesquisa. A genotipagem do promotor e das variantes do exon 1 da MBL2 foram feitas por PCR-SSP e PCR-RFLP, respectivamente. Os índices SLICC e SLEDAI foram analisados comparando tabagismo, maços/ano (MA) e haplótipos através do teste Kruskal-Wallis e quiquadrado com Bonferroni para as outras análises. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do HCPA. Quando comparados fumantes e não-fumantes, não encontramos associação entre SLEDAI e SLICC com tabagismo, MA e os haplótipos da MBL. Em uma subanálise, manifestações como serosite (p = 0.025), pericardite (p = 0.015), convulsões (p = 0.011) e presença de anticorpos anti-Sm (p = 0.016) apresentaram uma maior frequência em não-fumantes. Entre fumantes, foi observado uma associação significativa entre alterações imunológicas (p = 0.032) e anti-RNP (p = 0,013) em pacientes que fumam de 4-24.7 MA, em comparação com quem fuma menos de 4 ou mais de 24.7 MA. Quando estratificados por etnia e os haplótipos da MBL, Euro-descendentes com haplótipos para deficiência de MBL apresentaram uma maior frequência de anticoagulante lúpico em fumantes (p = 0.016) e pleurite (p = 0.001) entre os que nunca fumaram. Nos haplótipos associados à baixa MBL, encontramos uma associação positiva entre pericardite em não-fumantes (p= 0.027). Entre os haplótipos para alta MBL, vimos uma menor frequência de distúrbios neurológicos (p = 0.05) e imunológicos (p = 0.027) e presença de anticorpos anti-Sm (p = 0.035) em não-fumantes. Em relação aos Afro-descendentes com haplótipos para baixa MBL, observou-se uma associação significativa entre o anti-RNP (p = 0.017) e não-fumantes. Aqueles indivíduos com haplótipo para alta MBL tiveram uma pequena associação entre o VDRL em não-fumantes (p = 0.048). Contudo, quando ajustado o p-valor para a correção de Bonferroni, todas essas associações perderam significância. Os resultados não apresentaram evidências de que o tabagismo possa atuar como um modulador dos índices de atividade, cronicidade e dano em pacientes com LES relacionado aos haplótipos da MBL. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease characterized by multiple autoantibody production, with cellular nuclear components as the most notable targets. With an unknown etiology, it involves genetic, immunological, hormonal and environmental factors. Deficiencies in the mannose-binding lectin (MBL), a component of the complement system, can produce an abnormal presentation of antigens to the immune system. Genetic polymorphisms in the promoter and coding regions of the MBL2 gene are strongly correlated to serum levels of the MBL protein, with possible impact in the immunological tolerance mechanism. The influence of smoking has not been evaluated in patients who present these allelic variants. Our aim was to investigate the role of MBL haplotypes (divided as deficient, low and high serum level-associated haplotypes) and smoking habit on disease activity and damage indexes in SLE patients. We investigated the frequencies of haplotype variants in 327 European and African-descendants SLE patients. Smoking habits, clinical and laboratory data were revised from clinical charts and genotyping of the promoter and exon 1 variants of MBL2 were performed by PCR-SSP and PCR-RFLP, respectively. SLICC and SLEDAI score were analyzed comparing the haplotype, smoking habits and pack-years (PY) of smoking using Kruskal-Wallis test for quantitative variables and chi-square test with Bonferroni for other analysis. The study was approved by the local ethical committee. When comparing ever smokers vs. never smokers, we found a lack of association between SLICC and SLEDAI among smoking habit, PY and MBL haplotypes. Further subanalysis on SLE manifestations showed a higher frequency of serositis (p=0.025), pericarditis (p=0.015), convulsion (p=0,011) and presence of anti-Sm (p=0.016) on never smokers. Among ever smokers, a significant association was observed between immunologic disorders (p=0.032) and anti-RNP (p=0.013) in patients who smoke 4 – 24.7 PY, compared with less than 4 or more than 24.7 PY. When stratified by ethnicity and MBL haplotypes, European-descendants with deficient MBL haplotype showed a higher frequency of lupus anticoagulant in smokers (p=0.001) and pleuritis (p= 0.016) among never smokers. On low MBL haplotype, we found a positive association between pericarditis and never smokers (p= 0.027). Among high MBL haplotype we identified a smaller frequency of neurologic (p=0.05) and immunologic disorders (p= 0.027) and presence of anti-Sm (p= 0.035) in never smokers. In relation to African-descendants with low MBL haplotype, a significant association between anti-RNP (p=0.017) and never smokers was observed. Those with high MBL haplotype had small association between false positive VDRL and never smokers (p=0.048). However, by adjusting the p-value for Bonferroni correction, all these associations lost significance. Our findings presented no evidence that smoking may act as a modulator of disease activity and damage indexes on SLE patients associated to serum MBL haplotypes.

ABREU, Ticiana Monteiro. Efeitos da Lectina da Alga Marinha Vermelha Solieria filiformis (Kützing) P.W. Gabrielson na Nocicepção e Inflamação em Animais. 2012. 112 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-13T14:06:13Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_tmabreu.pdf: 2823964 bytes, checksum: 547d578a7f85a4ed5fc8d14497be0364 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-14T22:50:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_tmabreu.pdf: 2823964 bytes, checksum: 547d578a7f85a4ed5fc8d14497be0364 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-14T22:50:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_tmabreu.pdf: 2823964 bytes, checksum: 547d578a7f85a4ed5fc8d14497be0364 (MD5) Previous issue date: 2012 / The seaweeds are a source of bioactive compounds, which gained importance in pharmacological applications. Among these, there are the lectins, which are (glyco)proteins that bind to specific mono or oligosaccharides. The aim of this study was to isolate the lectin from the red seaweed Solieria filifmoris (LSf), investigate its properties in acute nociception and inflammation, and their possible signs of toxicity in animals. Initially, the LSf was purified by extraction with Tris-HCl buffer 25 mM (pH 7,5), precipitation with ammonium sulfate (70%) and chromatographies in DEAE-cellulose and Sephadex G-100 columns. In the evaluation of the biological activities, animals groups (n=6) were submitted to pretreatment with LSf (1, 3 or 9 mg/kg; i.v.), 30 min before of the nociceptive or inflammatory stimulus. The antinociceptive activity was evaluated in male mice Swiss using the abdominal writhing test induced by acetic acid 0,8%, the formalin test to 2% and the hot plate test. Morphine and indomethacin (5 mg/kg; s.c.) were used as controls. The anti-inflamatory activity in male rats Wistar was assayed through of the peritonitis induced by carrageenan - Cg (700 µg/cav) and of the paw edemas Cg- (700 µg/paw), dextran- (500 µg/paw) or LSf-induced (9 mg/kg) models. Dexamethasone (1 mg/kg; s.c.) was used as control. The LSf edematogenic action (1, 3 or 9 mg/kg) was evaluated by the application of this lectin in the rat paws and by the pharmacological modulation of the edema formed. The toxicity study of LSf (9 mg/kg; i.v.) was carried out through of its application in mice (7 days) and of the analysis of the physical, biochemical and histological parameters. LSf significantly reduced the number of abdominal writhing and the paw licking time in the second phase of formalin test, but didn’t prolong the reaction time in hot plate test. The LSf also inhibited the cell migration in peritonitis induced by Cg and the paw edemas induced by Cg, dextran and LSf. Moreover, LSf showed edematogenic activity, which was inhibited by indomethacin and dexamethasone. Additionally, the LSf administration for 7 days presented no signs of systemic damages, except for the reduced level of alkaline phosphatase and splenomegaly. Concluding, the LSf has antinociceptive, anti-inflammatory (i.v.) and edematogenic (i.pl.) properties and could represent a potential therapeutic agent and a possible tool for the inflammation study. / As algas marinhas são fontes de compostos bioativos, os quais vêm despertando interesse em aplicações farmacológicas. Dentre esses, destacam-se as lectinas, que são (glico)proteínas que se ligam a mono ou oligossacarídeos específicos. O objetivo desse trabalho foi isolar a lectina da alga marinha vermelha Solieria filiformis (LSf), investigar as suas propriedades na nocicepção e na inflamação aguda e seus possíveis sinais de toxicidade em animais. Inicialmente, a LSf foi purificada por extração com tampão Tris-HCl 25mM, pH 7,5, precipitação com sulfato de amônio (70%) e cromatografias em colunas de DEAE-celulose e Sephadex G-100. Na avaliação das atividades biológicas, grupos de animais (n=6) foram submetidos ao pré-tratamento com a LSf (1, 3 ou 9 mg/kg; i.v.), 30 min antes do estímulo nociceptivo ou inflamatório. A atividade antinociceptiva foi avaliada em camundongos Swiss machos através dos ensaios de contorções abdominais induzidas por ácido acético 0,8%, teste da formalina a 2% e da placa quente. Morfina e indometacina (5 mg/kg; s.c.) foram utilizadas como controles. A atividade anti-inflamatória em ratos Wistar machos foi avaliada através dos ensaios de peritonite induzida por carragenana - Cg (700 µg/cav) e de edema de pata induzidos por Cg (700 µg/pata); dextrano (500 µg/pata); ou pela própria LSf (9 mg/kg). Dexametasona (1 mg/kg; s.c.) foi utilizada como controle. A ação edematogênica da LSf (1, 3 ou 9 mg/kg) foi avaliada através da sua aplicação na pata de ratos e da modulação farmacológica do edema formado. O estudo da toxicidade da LSf (9 mg/kg;i.v.) foi realizado através da sua aplicação em camundogos (7 dias) e da análise dos parâmetros físicos, bioquímicos e histológicos. A LSf reduziu significativamente o número de contorções abdominais e o tempo de lambedura da pata na segunda fase do teste da formalina, porém não prolongou o tempo de reação na placa quente. A LSf também inibiu a migração celular na peritonite induzida por Cg e os edemas de pata induzidos por Cg, dextrano e LSf. Ademais, LSf apresentou atividade edematogênica, que foi inibida por indometacina e dexametasona. Adicionalmente, a administração da LSf por 7 dias não apresentou sinais de danos sistêmicos, exceto pela redução no nível de fosfatase alcalina e esplenomegalia. Concluindo, a LSf possui propriedades antinociceptiva, anti-inflamatória (i.v.) e edematogênica (i.pl.), podendo representar um potencial agente terapêutico e uma possível ferramenta para o estudo da inflamação.

FONTENELLE, Thais Pontes Carvalho. Caracterização estrutural e atividade anti-inflamatória da lectina da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum. 2012. 78 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-13T12:40:50Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_tpcfontenelle.pdf: 798007 bytes, checksum: b4ac36b1e082f93f1df77fffe44bd8f3 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-14T23:02:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_tpcfontenelle.pdf: 798007 bytes, checksum: b4ac36b1e082f93f1df77fffe44bd8f3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-14T23:02:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_tpcfontenelle.pdf: 798007 bytes, checksum: b4ac36b1e082f93f1df77fffe44bd8f3 (MD5) Previous issue date: 2012 / The great biodiversity of seaweeds and their occurrence in almost all environments on the planet demonstrate the importance of such beings to ecosystems. One example is the extraction of potentially active biomolecules such as lectins, which are proteins that have been subject of research worldwide. This is due to its impressive ability to bind specifically to carbohydrates or substances containing them, providing an immense field of biological application. This work purpose was to produce lectin from the red seaweed Bryothamnion triquetrum (Lec), evaluate its secondary structure using spectroscopic techniques, and investigate their anti-inflammatory properties in mice. Initially, the lectin was purified by precipitation with ammonium sulfate (0-60) and ion exchange chromatography, and obtained the first peak (PI). This peak was selected by hemagglutination activity thus obtaining pure lectin from Bryothamnion triquetrum, verified by SDS-PAGE. The secondary structure of lectin was analyzed by circular dichroism spectroscopic techniques, against to pH extremes (4.0 to 11.0), and compared to the spectrum of its native structure, and fluorescence against different temperatures, ranging from 25° to 75°, each 10° interval. In biological activities assessment, groups of animals were subjected to pretreatment with the lectin (1.5 and 10mg/kg, ip) and indomethacin (10mg/kg) 30 min before the inflammatory stimulus. The anti-inflammatory activity in mice was evaluated through the assays of peritonitis induced by carrageenan - Cg (500 μg / cav) and paw edema induced by Cg (500 μg / paw), and dextran (500 μg / paw). Extremes of pH (4.0 and 11.0) did not alter the protein secondary structure. Fluorescence data (280nm and 295nm) also showed stability, and aromatic amino acids presence in their structure. Lectin inhibited cell migration in the induced peritonitis by Cg and induced paw edema by Cg and dextran. Thus, it is concluded that the lectin obtained from the Bryothamnion triquetrum DEAE PI shows stable structure related to pH and temperature variation. Regarding biological properties tested, the lectin showed anti-inflammatory effects in models used, and it can be considered a molecule with potential for further studies of inflammation. / A grande diversidade biológica das algas marinhas e sua ocorrência em praticamente todos os ambientes do planeta demonstram a importância desses seres para os ecossistemas. Um deles é a extração de biomoléculas potencialmente ativa como as lectinas, que são proteínas que têm sido alvo de pesquisas no mundo inteiro. Isso se deve à sua impressionante capacidade de ligar-se especificamente a carboidratos ou a substâncias que os contêm, propiciando um imenso campo de aplicação biológica. O objetivo deste trabalho foi produzir a lectina da alga marinha vermelha Bryothamnion triquetrum (Lec), avaliar sua estrutura secundária a partir de técnicas espectroscópicas e investigar as suas propriedades anti-inflamatórias em camundongos. Primeiramente a lectina foi purificada por precipitação com sulfato de amônio (0-60) e cromatografia de troca – iônica, sendo recolhido o primeiro pico (PI). Este pico foi selecionado através da atividade de hemaglutinação obtendo assim a lectina pura a partir de Bryothamnion triquetrum, verificada por SDS-PAGE. A lectina foi analisada quanto a sua estrutura secundária por técnicas espectroscópicas de dicroísmo circular, frente a extremos de pH (4,0 – 11,0) e comparada ao espectro da sua estrutura nativa, e fluorescência frente a diferentes temperaturas que variaram de 25° a 75° em intervalo de 10°. Na avaliação das atividades biológicas, grupos de animais foram submetidos ao pré-tratamento com a Lectina (1,5 e10mg/kg; i.p.) e indometacina (10mg/kg), 30 min antes do estímulo inflamatório. A atividade anti-inflamatória em camundongos foi avaliada através dos ensaios de peritonite induzida por carragenina - Cg (500 μg/cav) e de edema de pata induzidos por Cg (500 μg/pata); dextrano (500 μg/pata). Extremos do pH (4,0 e 11,0) não alterou a estrutura secundária da proteína. Os dados de fluorescência (280nm e 295nm), mostraram também uma estabilidade, além da presença de aminoácidos aromáticos na sua estrutura. A Lectina inibiu a migração celular na peritonite induzida por Cg e os edemas de pata induzidos por Cg e dextrano. Deste modo, conclui-se que a Lectina obtida do PI da DEAE de Bryothamnion triquetrum apresentou estrutura estável em relação a variação de pH e temperatura. Em relação às propriedades biológicas testadas, a Lectina apresentou efeitos anti-inflamatórios nos modelos empregados, podendo ser considerada uma molécula com potencial para estudos mais aprofundados de inflamação.