BARRETO, F. K. A. Atividade antihiperglicêmica e antioxidante da lectina de Bryothamnion seaforthii em ratos com diabetes induzido por estreptozotocina. 2016. 70 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-04-25T16:04:49Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_fkabarreto.pdf: 1766441 bytes, checksum: 26c5c0aaab11f4ece9ec0cc03086f172 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-04-25T16:05:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_fkabarreto.pdf: 1766441 bytes, checksum: 26c5c0aaab11f4ece9ec0cc03086f172 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-25T16:05:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_fkabarreto.pdf: 1766441 bytes, checksum: 26c5c0aaab11f4ece9ec0cc03086f172 (MD5) Previous issue date: 2016-03-17 / Diabetes mellitus (DM) is a chronic disease characterized by metabolic disorder of multiple etiologies, which occurs when the pancreas does not produce enough insulin or when the organism cannot effectively use the insulin produced, causing systemic hyperglycemia. The cause of diabetes is associated with a combination of dysfunction of pancreatic β-cells and insulin resistance, because the insulin produced is not capable of providing adequate peripheral glucose uptake. Approximately 7% of the world population lives with the disease and 90% of the cases are type 2 diabetes. Diabetes associated with hyperlipidemia may occur and generate increased production of free radicals, causing oxidative stress, which in turn causes endothelial dysfunction. Since the complexity of the DM, more studies are needed to provide alternative therapies for their treatment. Lectins have the peculiar property of binding to carbohydrates and display intrinsic role in cell communication, featuring a variety of biological effects, such as anti-inflammatory, pro-healing, anti-cancer, antiviral and antioxidant activities. This study aimed to evaluate the antihyperglycemic, antilipidemic and antioxidant activities of the lectin isolated from Bryothamnion seaforthii (BSL) thorough an in vivo study. For this evaluation, diabetes mellitus type 2 was induced in Wistar rats using streptozotocin and nicotinamide. The effectiveness and efficiency of the treatment were evaluated from serum collections at 0, 30, 60, 90 and 120 days after confirmation of hyperglycemia with serum assessment of fasting glucose, total cholesterol, triglycerides, evaluation of the enzymes glutathione peroxidase, catalase, superoxide dismutase, and determination of the insulin resistance by HOMA-IR (homeostasis model assessment for insulin resistance) and HOMA β (homeostasis model assessment e-cell function). In the study, it was observed that the groups treated with BSL were significantly reduced regarding the amount of fasting glucose, total cholesterol and triglycerides, as well as significantly increased the glutathione peroxidase activity. Superoxide dismutase difference was not observed with regard to catalase. Finally, regarding the assessments of HOMA-IR and HOMA-β levels, it was observed that BSL administration decreased insulin resistance and hypersecretion. In conclusion, these data suggest that BSL promotes hypoglycemic and hypolipidemic effect, and reduce insulin resistance as well as improve the function of β cells, also working improving the enzymatic activity in the oxidative stress caused by DM2. / Diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica, caracterizada por uma desordem metabólica de múltiplas etiologias, que ocorre quando o pâncreas não produz insulina suficiente ou quando o organismo não pode usar de maneira eficaz a que é produzida, ocasionando uma hiperglicemia sistêmica. A causa do diabetes está associada a uma combinação de disfunção das células β-pancreáticas e insulino-resistência, pois a insulina produzida não é capaz de promover adequada captação periférica de glicose. Aproximadamente 7% da população mundial vive com essa doença e 90% destes casos são diabetes tipo 2. O diabetes pode ocorrer associado à hiperlipidemias que podem gerar aumento dos radicais livres produzidos, provocando um estresse oxidativo, que por sua vez provoca uma disfunção endotelial, gerando as complicações conhecidas do diabetes. Visto a complexidade do DM, são necessários mais estudos para fornecer terapias alternativas para seu tratamento. As lectinas possuem a propriedade peculiar de ligação a carboidratos e papel intrínseco na comunicação celular, apresentando uma variedade de efeitos biológicos, tais como antiinflamatórios, pró-cicatrizantes, anticâncer, antiviral e atividade antioxidante. O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade antihiperglicêmica e antioxidante da lectina de Bryothamnion seaforthii (BSL) in vivo, assim também, como seu efeito na redução de lipídios. Para esta avaliação, foi induzido diabetes mellitus tipo 2 em ratos Wistar, utilizando estreptozotocina e nicotinamida. A eficácia e eficiência do tratamento foram avaliadas a partir de coletas aos períodos de 0, 30, 60, 90 e 120 dias após confirmação da hiperglicemia, com avaliação sérica de glicose de jejum, colesterol total, triglicérides, avaliação das enzimas glutationa peroxidase, catalase, superóxido dismutase, e determinação da resistência à insulina por meio do HOMA-IR (modelo de avaliação da homeostase na resistência à insulina) e HOMA β (modelo de avaliação da homeostase na disfunção das células β). No estudo, observou-se que os grupos tratados com BSL nas suas três concentrações obtiveram redução significativa da quantidade de glicose de jejum, colesterol total e triglicérides, assim também, como aumentaram significativamente a atividade enzimática de glutationa peroxidase e superóxido dismutase, não sendo observada nenhuma diferença em relação à enzima catalase. Por fim, com as avaliações dos índices HOMA-IR e HOMA-β, observou-se que a administração de BSL diminuiu significantemente a resistência à insulina e a hipersecreção da mesma, pelas células β. Em conclusão, estes dados propõem que BSL promove eficaz efeito hipoglicemiante e hipolipídico, além de diminuir a resistência à insulina e melhorar a função das células β, atuando também, na melhoria da atividade enzimática no estresse oxidativo causado pelo DM2.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2012-10-26T10:00:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 310349.pdf: 10727909 bytes, checksum: c93e4065cf21f11b20ff92c38ec6e1ff (MD5) / A tuberculose é uma doença causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis que mata anualmente cerca de 2 milhões de pessoas no mundo. Dado um alto impacto na saúde pública causado pelo M. tuberculosis, a ausência de uma vacina preventiva eficaz e o surgimento de cepas resistentes ao tratamento convencional, existe uma clara necessidade de um melhor entendimento dos mecanismos de imunopatogênese da tuberculose e, sobretudo, a identificação de fatores determinantes do bacilo envolvidos nesse processo. Nesse contexto, as informações geradas pelo projeto genoma de seqüenciamento do M. tuberculosis apresentam um grande potencial a ser explorado, principalmente no que diz respeito a moléculas de superfície/secretadas que possam ser identificadas e avaliadas quanto ao seu envolvimento nos eventos iniciais de infecção e imunogenicidade. No presente estudo, nós identificamos uma nova lectina secretada de M. tuberculosis por uma abordagem bioinformática que é reconhecida durante a fase ativa da tuberculose em humanos tanto em termos de indução de IFN-. em células mononucleares do sangue periférico quanto na produção de anticorpos IgG anti-sMTL-13. Essa produção de anticorpos diminui logo após 1-2 meses de tratamento e permanece em níveis basais até os pacientes atingirem cura clínica, sugerindo que anticorpos anti-sMTL-13 poderiam ser utilizados como um biomarcador de sucesso terapêutico. Em adição, estudos de deleção gênica revelaram que o gene Rv1419 não é essencial para o crescimento in vitro do M. Tuberculosis em meio de cultura, mas que o mesmo parece afetar o crescimento intracelular do bacilo e modula a produção de TNF-a em macrófagos da linhagem RAW 264.7. Em conjunto, os nossos achados demonstram a existência de um novo antígeno de M. tuberculosis com potencial de uso em diagnóstico e de gerar informações relevantes sobre a biologia da interação do patógeno com o hospedeiro. / Tuberculosis remains a major public health problem throughout the world and one-third of the world population carries an asymptomatic infection, which results in eight million new cases of tuberculosis and two million deaths every year. In general, infection by Mycobacterium tuberculosis leads to a latent state in which the host is able to control the pathogen growth. While effective cellular immune responses are suggested as critical to control M. tuberculosis growth inside macrophages, it has been demonstrated that mycobacteria-associated factors play an important role in tuberculose immunopathogenesis. In this study, we have identified a secreted 13 kDa lectin from M. tuberculosis by homology search of a non-redundant lectin database. Bioinformatic analysis revealed that sMTL-13 belongs to the ricin-type b-trefoil family of proteins containing a Sec-type signal peptide present in M. tuberculosis complex species, but not in nontuberculous mycobacteria. Following heterologous expression of sMTL-13 and generation of an mAb (clone 276.B7/IgG1k), we confirmed that this lectin is present in culture filtrate proteins from M. tuberculosis H37Rv, but not in non-tuberculous mycobacteria-derived culture filtrate proteins. In addition, sMTL-13 leads to an increased IFN-g production by PBMC from active tuberculosis patients. Furthermore, sera from tuberculosis patients displayed high titers of IgG Ab against sMTL-13, a response found to be decreased following successful antituberculosis therapy. We also investigated the role of Rv1419 gene of M. tuberculosis during in vitro infection. Our work shows that bacterial replication kinetics of Rv1419 mutant and wild type bacterium were comparable in liquid culture under static conditions. Moreover, the Rv1419 mutant was not impaired in its ability to growth upon macrophage infection. However, its ability to stimulate key cytokine such as TNF-á was reduced, which is in line with CFU counts at earlier time points post-infection (24h) Together, our findings reveal a secreted 13 kDa ricin-like lectin from M. tuberculosis, which is immunologically recognized during active tuberculosis and could serve as a biomarker of disease treatment. We believe that sMTL-13 is an important component of the bacterial-host interplay.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2012-10-26T12:23:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 300018.pdf: 2976063 bytes, checksum: c622e4a3ff5691ca0487f735af172b47 (MD5) / A parte aérea da mandioca (Manihot Esculenta Crantz), planta cultivada no Brasil, é pouco utilizada e muitas vezes descartada como resíduo. Em sua composição encontram-se lectinas e polifenois, compostos cuja estrutura química está relacionada a fenômenos de aglomeração, podendo, portanto, serem aproveitados em diversos campos tecnológicos. No presente trabalho, extratos aquosos e etanólicos de folhas e caule de mandioca foram aplicados ao tratamento de efluentes em escala de laboratório. Os extratos foram inicialmente avaliados quanto aos teores protéico e fenólicos, obtendo-se concentrações de proteína maiores nas folhas (0,44 mg?mL-1 de extrato). Os conteúdos de fenólicos também foram determinados, evidenciando uma alta percentagem de taninos condensados (90-100% do total de taninos). Quanto aos agentes extratores (água e etanol 70%), o etanol apresentou melhor rendimento tanto nas folhas (59%) como no caule (37%), porém com inconvenientes no seu uso no caso das folhas, pela extração de pigmentos indesejáveis. Foi avaliada a atividade hemaglutinante dos extratos em vários tipos de eritrócitos, detectando aglutinação em alguns deles (humano, bovino e de frango) com distintas intensidades, o que sugere a presença de uma lectina de caráter específico. Utilizando testes de significância e análise de variância, foram estabelecidas as condições de extração (25°C e 60 min) e armazenamento (10°C) sob as quais o fenômeno de aglutinação é maior. Posteriormente, os extratos foram testados na descoloração de soluções aquosas de azul de metileno, achando-se uma maior remoção de cor quando a fase aquosa proveniente da concentração do extrato etanólico do caule da mandioca era utilizada. Escolhido o extrato, foram conduzidos testes de coagulação para remover o corante e, usando um planejamento fatorial fracionário, foram avaliadas diferentes variáveis com objetivo de atingir a máxima remoção (0,10 mg corante?ml de extrato-1). O pH e a dosagem de extrato foram os fatores mais influentes. Posteriormente, testaram-se outros dois corantes catiônicos (Azul Maxilon GRL e Verde de Malaquita) atingido remoções máximas de 0,19 e 0,14 mg corante?ml de extrato-1respectivamente. pHs neutros e básicos, concentrações de corante baixas, dosagens de extrato em torno de 40 ml?L-1, ausência de NaCl e tempos de agitação de 5 e 30 min para as etapas de mistura rápida e lenta, favoreceram o processo de descoloração. Adicionalmente foi testada a adição de um alcalinizante o que permitiu aumentar a remoção até 90%. Finalmente foram avaliadas a demanda química de oxigênio e a toxicidade das soluções tratadas com o extrato. Houve um aumento da DQO e uma diminuição da toxicidade das amostras tratadas em 80%. A concentração letal do extrato em fase aquosa foi de 80 ml?L-1. Como as dosagens medidas nos testes de descoloração foram menores à dosagem letal determinada, os mesmos foram considerados inócuos

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências / Made available in DSpace on 2013-03-04T19:12:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 305008.pdf: 1294464 bytes, checksum: 1c308bc869ef17da3ff0b5b2d4ed979c (MD5) / A tuberculose, causada principalmente pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), é uma doença responsável por aproximadamente 1,4 milhão de mortes anuais no mundo. Dado seu grande impacto na saúde pública, aliado à ausência de um modelo vacinal eficaz e ao surgimento de cepas resistentes, existe uma clara necessidade na busca por novos imunógenos, bem como novas estratégias de prevenção, diagnóstico e tratamento da TB. Nosso grupo caracterizou um possível antígeno vacinal, a lectina de 13 kDa secretada pelo Mtb (sMTL-13), que apresentou alto potencial antigênico na indução de respostas imunes celulares (IFN-?/PBMC) e humorais (IgG/soro) em pacientes com tuberculose ativa. A natureza ubíqua das lectinas reflete o seu envolvimento em diversos mecanismos celulares, tornando significante o estudo da sua interação em processos biológicos. Visando obter informações acerca da imunogenicidade da sMTL-13, este trabalho demonstrou que, além de secretada, esta proteína possui capacidade de ficar ancorada na parece celular do Mtb, provavelmente pela sua sequência conhecida como peptídeo sinal, tendo uma possível função na interação inicial do bacilo com células apresentadoras de antígeno (APCs), pois a incubação do Mtb com a D-Galactose, carboidrato que possui afinidade pela sMTL-13, e não L-Galactose, foi capaz de impedir essa interação. Esta lectina também foi capaz de induzir produção de citocinas pró-inflamatórias por APCs e essas foram capazes de levar a uma proliferação celular de linfócitos T CD4+ antígenos-específicos, indicando que a sMTL-13 possui atividade imunogênica. Estes dados demonstram que há uma importante regulação na interação de proteínas ligantes de carboidratos com o APCs e que a sMTL-13 pode atuar como padrão molecular associado a patógenos (PAMP) do Mtb, porém há a necessidade de mais estudos envolvendo a interação dessa lectina com células do sistema imune.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318837.pdf: 5744333 bytes, checksum: 7e7d4317f183327253ac9a1d2dfc21d0 (MD5) Previous issue date: 2013 / O objetivo principal deste trabalho é a preparação, caracterização e estudos catalítico e de detecção de lectinas por nanopartículas de prata (AgNPs) tendo compostos a base de açúcares como estabilizantes. Para atingir esse objetivo duas estratégias foram utilizadas, uma usando o polissacarídeo dextrana como estabilizante e outra usando compostos anfifílicos baseados em oligossacarídeos (maltose, lactose, maltoheptaose e xiloglucano). Em ambas estratégias, a otimização da preparação das AgNPs foi realizada utilizando-se análise multivariada baseada nas informações coletadas a partir da banda de ressonância de Plasmon de superfície (SPR) das AgNPs. Todas as AgNPs estáveis foram caracterizadas pelas técnicas de UV-Vis, TEM, SAXS e DLS. A atividade catalítica das AgNPs foram determinadas frente a reação de redução do p-nitrofenol (Nip) por NaBH4, como agente redutor, em água e misturas de água/etanol.Dois tipos diferentes de anfifílicos foram sintetizados, um com grupo alquino na junção do bloco de açucar com o bloco hidrofóbico e outro tipo com um grupo ácido carboxílico no final da parte hidrofóbica. Os anfifílicos foram caracterizados por 1H e 13C NMR e espectrometria de massas.A reação de redução do Nip por NaBH4 teve a melhor atividade catalítica com as nanopartículas AgNPs-dextran e Ag-Mal7NAcC12, com constante de velocidade normalizada para a área superfícial das NPs por unidade de volume de 1,41 e 1,11 s-1 m-2 L, repectivamente. Estes valores estão entre os maiores descritos na literatura. O efeito do solvente nesta reação foi avaliado por misturas de água e etanol. Aplicando uma reação superfícial pseudo-monomolecular como um artifício experimental, os dados cinéticos obtidos foram tratados de acordo com o modelo de Langmuir, que combinados com observações de tensão superfícial de misturas de água/etanol, revelaram que a adição de etanol inibe a reação, provavelmente pela competição com os íons BH4- pela superfície da nanopartícula, com a formação de uma monocamada de solvente. Finalmente, três sistemas diferentes (Ag-Mal7NAcC12, Ag-XGONAcC12 e Ag-LacNAcC12) foram testados como sensores para detecção de lectinas e somente Ag-Mal7NAcC12 mostrou interação específica com a Concanavalina A. <br> / The main goal of this work is the preparation, characterization and catalytic and lectins detection studies of silver nanoparticles (AgNPs) having sugar-based compounds as stabilizers. To achieve this goal two strategies were used, one using the polysaccharide dextran as stabilizer and other using amphiphile compounds based on oligosaccharides (maltose, lactose, maltoheptaose and xyloglucan). In both strategies the optimization of AgNPs preparation was realized using a multivariate analysis based in informations collected from the surface Plasmon resonance band (SPR) of AgNPs. All stable AgNPs were characterized by ultraviolet-visible spectroscopy (UV-vis), transmission electron microscopy (TEM), small angle X-ray scattering (SAXS) and dynamic light scattering (DLS) techniques. The catalytic activities of AgNPs were determined over the p-nitrophenol reduction reaction by NaBH4, as reducing agent, in water or water-ethanol mixtures. Two different types of amphiphiles were synthesized, one with an alkyne group in the junction of a sugar block with a hydrophobic block and the other with a carboxylic acid group in the end of hydrophobic part. The amphiphiles were characterized by 1H and 13C NMR and mass spectrometry.The Nip reduction reaction with NaBH4 showed the best catalytic activity with AgNPs-dextran and Ag-Mal7NAcC12 nanoparticles with the rate constant normalized to the surface area of the NPs per unit volume of 1.41 and 1.11 s-1 m-2 L, respectively. These values are among the highest ones found in literature. The solvent effect in this reaction was evaluated by mixtures of water and ethanol. Applying a pseudo-monomolecular surface reaction as an experimental artifice, the obtained kinetic data were treated according to the Langmuir model, which combined with water/ethanol surface tension observations revealed that addition of ethanol inhibit the reaction, most probably by competing with BH4- ions for the nanoparticles surface, with the formation of a solvent monolayer.Finally, three different systems (Ag-Mal7NAcC12, Ag-XGONAcC12 and Ag-LacNAcC12) were tested as sensor for lectin detection and Ag-Mal7NAcC12 nanoparticles showed specific interaction with the Concanavalin A.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-05-08Bitstream added on 2014-06-13T18:29:02Z : No. of bitstreams: 1 santos_a_me_araiq.pdf: 1458862 bytes, checksum: f7fe58d688854cba187d0f1e30f22ce7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As proteínas de micronema TgMIC1 e TgMIC4 (TgMICs) da Toxoplasma gondii fazem parte de um complexo proteico localizado na superfície do parasita responsável pelo processo de adesão e invasão celular. Os objetivos desse trabalho foram estudar dispositivos piezelétricos contendo em cada um, uma das MICs recombinantes (rTgMIC1 ou rTgMIC4) e utilizá‐los na determinação das constantes de afinidade entre elas com a fetuína e asialofetuína, empregando o modelo da Isoterma de Langmuir. Os dispositivos foram desenvolvidos por meio a abordagem de monocamadas automontadas (SAM) mista de tióis, utilizando solução etanólica contendo 2,5 mM de ácido 11‐mercaptoundecanóico (11‐MUA) e 7,5 mM de 6‐mercapto‐1‐hexanol (C6OH). A formação da SAM, realizada em temperatura ambiente por 12 h, foi monitorada pela técnica de Microbalança a Cristal de Quartzo com Fator Dissipativo (QCM‐D) e voltametria cíclica utilizando o par redox [FeII(CN)6]4‐/ FeIII(CN)6]3‐. Os resultados obtidos por ambas as técnicas evidenciaram a formação de SAM rígida e de elevado grau de cobertura superficial após cinética lenta em que processos de adsorção e organização dos tióis ocorreram simultaneamente. Para a imobilização das rTgMICs, solução aquosa contendo 10 mM de EDC (N‐etil‐N‐(dimetilaminopropil) carbodiimida) e 20 mM de NHS (N‐hidroxisuccinimida) foi utilizada para a ativação dos grupos carboxílicos presentes na SAM por 2 h, e o processo acompanhado por QCM‐D apresentou resultados compatíveis com aqueles encontrados na literatura. Pela mesma técnica, foi possível verificar que ambas as rTgMICs se imobilizam sobre o cristal de quartzo após sua incubação com solução 0,15 mg/mL de cada rTgMIC em tampão Tris‐HCl contendo 200 mM de NaCl... / The Toxoplasma gondii micronemal proteins TgMIC1 and TgMIC4 (TgMICs) are part of a protein complex located on the surface of the parasite responsible for the process of cellular adhesion and invasion. The goal of the present work was to study a piezoelectric device containing the recombinant MICs (rTgMIC1 or rTgMIC4) and use it in determining the affinity constants between the MICs with fetuin and asialofetuin, employing the Langmuir isotherm model. The devices were developed using the approach of self‐assembled monolayer (SAM) in ethanolic solution containing 2.5 mM of 11‐mercaptoundecanoic acid (11‐MUA) and 7.5 mM of 6‐mercaptohexanol (C6OH). The SAM formation, held at room temperature for 12 h, was monitored by the Quartz Crystal Microbalance technique with Dissipative Factor (QCM‐D) and cyclic voltammetry using the redox couple [FeII(CN)6]4‐/FeIII(CN) 6]3‐. The results obtained from both techniques showed the formation of a rigid and high surface degree coverage SAM after a slow kinetic process in which adsorption and organization of the thiols occur simultaneously. For the immobilization of rTgMICs, aqueous solution containing 10 mM EDC N‐ethyl‐N‐(dimethylaminopropyl) carbodiimide and 20 mM NHS (N‐hydroxysuccinimide) was used for 2 h, and the process followed by QCM‐D was consistent with those found in the literature. By the same technique it was found that both rTgMICs are immobilized on the quartz crystal after incubation whit solution 0.15 mg/mL of each rTgMIC in Tris‐HCl containing 200 mM NaCl (pH 8.0) for 2 h. Unlike the functionalization of the quartz crystal rTgMIC4, remaining adsorption sites were observed in the process using the rTgMIC1, wherein the blocking step using 0.1% gelatin solution for 2 h was required. Throughout the QCM‐D technique it was possible... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-10-10T13:01:33Z No. of bitstreams: 1 DissNCPA.pdf: 2788446 bytes, checksum: b200bad70c866c03e825d7800753371b (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-13T20:10:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissNCPA.pdf: 2788446 bytes, checksum: b200bad70c866c03e825d7800753371b (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-13T20:10:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissNCPA.pdf: 2788446 bytes, checksum: b200bad70c866c03e825d7800753371b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-13T20:10:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissNCPA.pdf: 2788446 bytes, checksum: b200bad70c866c03e825d7800753371b (MD5) Previous issue date: 2016-02-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Freshwater green microalgae are a group which present great complexity for classical morphological taxonomy. For groups like Selenastraceae family, the morphological characteristics are ambiguous at genus level and do not reflect the phylogenetic relationships. Taxonomic polyphasic approaches have been emerged to assist the classical taxonomy in the classification of such groups. Taking into account the specific relation lectin-carbohydrate and the great diversity in monomer composition of extracellular polysaccharides from microalgae, we aim to understand if some microalgae taxa have specific terminal monosaccharides set, which could be used as chemotaxonomic feature within a polyphasic taxonomic approach. Thus, we performed an optimization of methods so far used in taxonomy, and analyzed the terminal monosaccharides and lectins behavior against ten species from different genera to the following families: Selenastraceae and Scenedesmaceae (Chlorophyceae), Botryococcaceae and Oocystaceae (Trebouphyceae), and Fragilariaceae, Stephanodiscaceae (Bacillariphyceae), all of them in crops. We noticed that is possible, using this technique, to separate strains from the same species isolated different from places. Furthermore, we found some indicator monosaccharides the microalgae of some taxa. In this work we use six types of lectins and eleven anti synthetic lectins to recognize the terminal monosaccharides and lectins. / As microalgas verdes de água doce compõem um dos grupos de grande complexidade para taxonomia morfológica clássica. Para grupos como a família Selenastraceae, as características morfológicas são ambíguas em nível de gênero e não refletem as relações filogenéticas. As abordagens taxonômicas polifásicas têm emergido como uma maneira de tentar ajudar a taxonomia clássica a resolver a classificação desses grupos. Considerando-se a relativa especificidade lectina/carboidrato e a grande diversidade na composição monomérica dos polissacarídeos extracelulares de microalgas, buscamos conhecer se alguns táxons de microalgas apresentam um conjunto de lectinas e monossacarídeos terminais específico o que poderia ser utilizado como característica quimiotaxonômica em uma abordagem taxonômica polifásica. Para tanto fizemos uma otimização dos métodos até hoje utilizados para taxonomia e analisamos o comportamento dos monossacarídeos terminais e das lectinas para dez espécies de diferentes gêneros das famílias Selenastraceae e Scenedesmaceae (Chlorophyceae), Botryococcaceae e Oocystaceae (Trebouphyceae), e Fragilariaceae, Stephanodiscaceae (Bacillariphyceae) em cultivos. Observamos que é possível por meio desta técnica separar cepas de mesma espécie de locais diferentes, além de encontrar monossacarídeos indicadores em regiões específicas para determinado táxons. Neste trabalho utilizamos seis tipos de lectinas e onze antilectinas sintéticas para reconhecer os monossacarídeos terminais e as lectinas.

Orientador: Paulo Roberto Bueno / Banca: Emanuel Carrilho / Banca: Maria Cristina Roque Antunes Barreira / Resumo: As proteínas de micronema TgMIC1 e TgMIC4 (TgMICs) da Toxoplasma gondii fazem parte de um complexo proteico localizado na superfície do parasita responsável pelo processo de adesão e invasão celular. Os objetivos desse trabalho foram estudar dispositivos piezelétricos contendo em cada um, uma das MICs recombinantes (rTgMIC1 ou rTgMIC4) e utilizá‐los na determinação das constantes de afinidade entre elas com a fetuína e asialofetuína, empregando o modelo da Isoterma de Langmuir. Os dispositivos foram desenvolvidos por meio a abordagem de monocamadas automontadas (SAM) mista de tióis, utilizando solução etanólica contendo 2,5 mM de ácido 11‐mercaptoundecanóico (11‐MUA) e 7,5 mM de 6‐mercapto‐1‐hexanol (C6OH). A formação da SAM, realizada em temperatura ambiente por 12 h, foi monitorada pela técnica de Microbalança a Cristal de Quartzo com Fator Dissipativo (QCM‐D) e voltametria cíclica utilizando o par redox [FeII(CN)6]4‐/ FeIII(CN)6]3‐. Os resultados obtidos por ambas as técnicas evidenciaram a formação de SAM rígida e de elevado grau de cobertura superficial após cinética lenta em que processos de adsorção e organização dos tióis ocorreram simultaneamente. Para a imobilização das rTgMICs, solução aquosa contendo 10 mM de EDC (N‐etil‐N‐(dimetilaminopropil) carbodiimida) e 20 mM de NHS (N‐hidroxisuccinimida) foi utilizada para a ativação dos grupos carboxílicos presentes na SAM por 2 h, e o processo acompanhado por QCM‐D apresentou resultados compatíveis com aqueles encontrados na literatura. Pela mesma técnica, foi possível verificar que ambas as rTgMICs se imobilizam sobre o cristal de quartzo após sua incubação com solução 0,15 mg/mL de cada rTgMIC em tampão Tris‐HCl contendo 200 mM de NaCl... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Toxoplasma gondii micronemal proteins TgMIC1 and TgMIC4 (TgMICs) are part of a protein complex located on the surface of the parasite responsible for the process of cellular adhesion and invasion. The goal of the present work was to study a piezoelectric device containing the recombinant MICs (rTgMIC1 or rTgMIC4) and use it in determining the affinity constants between the MICs with fetuin and asialofetuin, employing the Langmuir isotherm model. The devices were developed using the approach of self‐assembled monolayer (SAM) in ethanolic solution containing 2.5 mM of 11‐mercaptoundecanoic acid (11‐MUA) and 7.5 mM of 6‐mercaptohexanol (C6OH). The SAM formation, held at room temperature for 12 h, was monitored by the Quartz Crystal Microbalance technique with Dissipative Factor (QCM‐D) and cyclic voltammetry using the redox couple [FeII(CN)6]4‐/FeIII(CN) 6]3‐. The results obtained from both techniques showed the formation of a rigid and high surface degree coverage SAM after a slow kinetic process in which adsorption and organization of the thiols occur simultaneously. For the immobilization of rTgMICs, aqueous solution containing 10 mM EDC N‐ethyl‐N‐(dimethylaminopropyl) carbodiimide and 20 mM NHS (N‐hydroxysuccinimide) was used for 2 h, and the process followed by QCM‐D was consistent with those found in the literature. By the same technique it was found that both rTgMICs are immobilized on the quartz crystal after incubation whit solution 0.15 mg/mL of each rTgMIC in Tris‐HCl containing 200 mM NaCl (pH 8.0) for 2 h. Unlike the functionalization of the quartz crystal rTgMIC4, remaining adsorption sites were observed in the process using the rTgMIC1, wherein the blocking step using 0.1% gelatin solution for 2 h was required. Throughout the QCM‐D technique it was possible... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

nÃo hà / Lectins are a group of proteins present in various living organisms, particularly in plants and especially in Leguminosae seeds. Among this family, a species that stands out for having large amount of lectin in the seed is the Canavalia brasiliensis. One approach for the investigation of lectins on biological systems is the detection there of by techniques involving antibody. Such techniques may include from classical immunochemical assays (immunodiffusion, immunoelectrophoresis and rocketimunoeletroforese) to ELISA experiments and advanced microscopy techniques. In this sense, antibodies become biotechnological tools invaluable since they are capable of specifically recognizing epitopes of the target molecules. Immunoglobulins (Igs) are proteins present in high concentration in the blood plasma of mammals. They are vectors of humoral immunity, with the primary function to join the foreign antigens to the individual so as to neutralize them. In the case of poultry the main immunoglobulin class (IgYs) can be found not only in blood, but also in egg yolk. This fact enables fast and efficient purification of these molecules facilitating its use as biotechnological inputs. Thus, this study aimed to produce antibodies against the lectin extracted from Canavalia brasiliensis seed (ConBr) (Fabaceae) in laying hens, implementing production methodology of new biotechnological inputs for the study of lectins. For this laying hens were immunized with 200 or 400&#956;g of lectin Canavalia brasiliensis (ConBr) for 15 weeks at 10-day intervals. Collected eggs from vaccinated birds had their isolated and precipitated yolk in 0-30% fraction with ammonium sulfate for partial purificaÃÃoo of IgYs. Confirmation of the presence of antibodies was made by immunodiffusion assays agarose gel. The fraction showed 0-30%, from the first week after the immunization, capable of recognizing ConBr IgYs. This profile appeared in all groups over the 15-week experiment. The production of specific IgYs against the lectin from Canavalia brasiliensis (ConBr) proved feasible and remained throughout the experiment, possibly in reasonable quantities. In this sense, IgYs produced in this work provide a powerful biotechnological tool to be made available for future studies. / As lectinas constituem um grupo de proteÃnas presentes em diversos organismos vivos, sobretudo em vegetais e especialmente em sementes de Leguminosae. Dentre essa famÃlia, uma espÃcie que se destaca por possuir grande quantidade de lectina na semente à a Canavalia brasiliensis. Uma das possÃveis abordagens para a investigaÃÃo de lectinas em sistemas biolÃgicos à a detecÃÃo das mesmas atravÃs de tÃcnicas que envolvam anticorpos. Tais tÃcnicas podem incluir desde ensaios clÃssicos de imunoquÃmica (imunodifusÃo, imunoeletroforese e rocketimunoeletroforese), atà experimentos de ELISA e tÃcnicas avanÃadas de microscopia. Neste sentido, os anticopos tornam-se ferramentas biotecnolÃgicas de grande valia uma vez que sÃo capazes de reconhecer especificamente epÃtopos das molÃculas alvo. As imunoglobulinas (Igs) sa&#771;o protei&#769;nas presentes em grande concentrac&#807;a&#771;o no plasma sanguÃneo de mamÃferos. Sa&#771;o os vetores da imunidade humoral, tendo como func&#807;a&#771;o principal unir-se aos anti&#769;genos estranhos ao indivÃduo, de modo a neutraliza&#769;-los. No caso das aves a principal classe de imunoglobulinas (IgYs) pode ser encontrada nÃo somente no sangue mas tambÃm nas gemas dos ovos. Esse fato permite purificaÃÃo rÃpida e eficiente dessas molÃculas facilitando seu uso como insumos biotecnolÃgicos. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo produzir anticorpos contra a lectina extraÃda da semente de Canavalia brasiliensis (ConBr) (Leguminosae) em galinhas poedeiras, implementando metodologia de produÃÃo de novos insumos biotecnolÃgicos para o estudo de lectinas. Para tanto galinhas poedeiras foram imunizadas com 200 ou 400&#956;g da lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) por 15 semanas em intervalos de 10 dias. Ovos coletados das aves imunizadas tiveram suas gemas isoladas e precipitadas na fraÃÃo 0-30% com sulfato de amÃnio para a purificaÃÃo parcial das IgYs. A confirmaÃÃo da presenÃa dos anticorpos foi feita por ensaios de imunodifusÃo em gel de agarose. A fraÃÃo 0-30% apresentou, a partir da primeira semana apÃs a imunizaÃÃo, as IgYs capazes de reconhecer ConBr. Esse perfil se apresentou em todos os grupos ao longo das 15 semanas de experimento. A produÃÃo das IgYs especÃficas contra a lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) se mostrou viÃvel e permaneceu durante todo experimento, possivelmente em quantidades razoÃveis. Neste sentido, as IgYs produzidas nesse trabalho constituem uma potente ferramenta biotecnolÃgica a ser disponibilizada para estudos futuros.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As lectinas consitem em uma classe diversificada de proteÃnas, capazes de reconhecer estruturas glicÃdicas de forma reversÃvel e com alta especificidade, no entanto sem alterar suas estruturas quÃmicas, participando de vÃrios processos celulares importantes. Dentre as diferentes famÃlias de lectinas, as isoladas a partir de leguminosas sÃo as mais extensivamente estudadas, havendo sido relatada a influÃncias dessas molÃculas sobre diversos processos patolÃgicos, incluindo a carcinogÃnese. NotÃveis propriedades antitumorais tÃm sido detectadas para algumas lectinas de leguminosas, resultantes da sua habilidade em induzir a morte celular ou a autofagia em cÃlulas cancerÃgenas, o que atraÃdo atenÃÃo para suas possiveis aplicaÃÃes biomÃdicas. AlÃm disso, algumas lectinas desse grupo especificas para galactose/N-acetil-D-galactosamina (Gal/GalNAc) tÃm se mostrado Ãteis como marcadores histoquÃmicos na pesquisa do cÃncer e a caracterizaÃÃo estrutural dessas lectinas em complexo com diferentes epÃtopos cancerÃgenos vem sendo realizada com sucesso. A lectina isolada a partir das sementes da leguminosa Vatairea macrocarpa (VML) à uma lectina bem caracterizada especÃfica para Gal/GalNAc capaz de reconhecer especificamente o antÃgeno Tn (GalNAc-&#945;-O-Ser), naturalmente encontrado em O-mucinas presentes em diferentes tipos de cÃncer. As estruturas cristalogrÃficas para a VML em complexo com o antÃgeno Tn e GalNAc foram determinadas com resoluÃÃes de 1.4 e 1.7 Ã, respectivamente. A maioria das lectinas obtidas a partir de fontes naturais consiste em misturas de diferentes isoformas, uma caracterÃstica indesejada para aplicaÃÃes biomÃdicas. Com base nisso, uma construÃÃo recombinante para VML (rVML) foi expressa em Escherichia coli, sendo obtida de forma solÃvel em com alto rendimento. A estrutura cristalina para a rVML, bem como para seus complexos com o antÃgeno Tn, GalNAc e &#945;-Lactose foram determinadas com resoluÃÃes de 1.7, 2.7, 2 e 1.8 Ã, respectivamente, apresentando a mesma estrutura geral e padrÃes de interaÃÃo que a lectina silvestre. Com o intuito de gerar um perfil comparativo entre a VML e outras lectinas de leguminosas capazes de reconhecer o antÃgeno Tn, foram realizadas anÃlises de docking molecular utilizando fragmentos de O-mucinas diferentemente decorados com o antÃgeno Tn. Esse perfil ressalta como alteraÃÃes sutis no elenco ou disposiÃÃo dos aminoÃcidos constituintes do sÃtio de ligaÃÃo a carboidrato, que talvez nÃo influenciem a capacidade de ligaÃÃo a monossacarÃdeo, podem impactar diretamente a habilidade dessas lectinas em reconhecer antÃgenos em condiÃÃes naturais. Adicionalmente aos jà caracterizados efeitos biolÃgicos relatados para VML, a similaridade entre sua estrutura e perfis de interaÃÃes quando comparadas a outras lectinas comumente utilizadas como marcadores histoquÃmicos (e.g., VVLB4 e SBA), sugerem fortemente a possÃvel utilizaÃÃo da VML como uma nova ferramenta na pesquisa do cÃncer. Esse trabalho consiste no primeiro relato de estruturas cristalogrÃficas para uma lectina de leguminosa especÃfica para Gal/GalNAc da tribo Dalbergieae. / Lectins are a very diverse class of proteins able to bind specific sugar structures reversibly and with high specificity, but without enzymatically modifying them, triggering several important cellular processes. Among the different lectin families, legume lectins are the most thoroughly studied and have been widely reported to exhibit a number of links to many pathological processes, including carcinogenesis. The remarkable anti-tumor properties of some legume lectins, resulting from their ability to induce programmed cell death and/or autophagocytosis in cancer cells have attracted much attention for biomedical applications. Moreover, a few galactose/N-acetylgalactosamine (Gal/GalNAc)-binding lectins from this group have proven to be useful markers for cancer histochemistry, and the structural characterization of these lectins bound to specific cancer epitopes has been carried out successfully. The seed lectin isolated from the legume tree Vatairea macrocarpa (VML) is a well characterized Gal/GalNAc-binding protein able to specifically recognize naturally occurring O-mucins presenting the carcinoma epitope Tn antigen (GalNAc-&#945;-O-Ser). The crystal structures of VML in complex with Tn antigen and GalNAc have been determined at the resolution of 1.4 and 1.7 Ã, respectively. Unfortunately, most of lectins obtained from natural sources consist in a mixture of forms, which is an undesired feature for biomedical applications. Thus, the recombinant form of VML (rVML) was expressed in Escherichia coli, being obtained soluble and wih high yielding. The crystal structure for rVML, as well as for the complex with Tn antigen, GalNAc and &#945;-Lactose have been determined at resolutions of 1.7, 2.7, 2 and 1.8 Ã, respectively, presenting the same overall structure and binding patterns as the wild lectin. Molecular docking analysis of this new structure and other Tn-binding legume lectins to O-mucin fragments differently decorated with this antigen provides a comparative binding profile among these proteins, stressing that subtle alterations that may not influence monosaccharide binding can, nonetheless, directly impact the ability of these lectins to recognize naturally occurring antigens. In addition to the specific biological effects of VML, the structural and binding similarities between it and other lectins commonly used as histological markers (e.g., VVLB4 and SBA) strongly suggest that VML can be used as a new tool for cancer research. This is the first report of crystal structures of a Gal/GalNAc-binding legume lectin from the Dalbergieae tribe.