BEZERRA, Maria Júlia Barbosa. Resolução da estrutura tridimensional da lectina de Dioclea violacea Mart para estudo da relação estrutura-função. 2011. 71 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-29T12:46:55Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_mjbbezerra.pdf: 3567822 bytes, checksum: 02df5a11f781364615e5b2190b539688 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:12:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_mjbbezerra.pdf: 3567822 bytes, checksum: 02df5a11f781364615e5b2190b539688 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:12:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_mjbbezerra.pdf: 3567822 bytes, checksum: 02df5a11f781364615e5b2190b539688 (MD5) Previous issue date: 2011 / Lectins from subtribe Diocleinae belong to the family from Leguminosae and are characterized by high homology among their amino acid sequences. Despite this high structural similarity the same is not true in the biological activities from this lectin family. Studies show that the modification of a few amino acids can cause large changes in biological activities of these lectins. Thus more detailed understanding of three dimensional structures of these proteins is essential for structure/function analyses. The Dioclea violacea lectin was purified by affinity chromatography on a column of Sephadex G-50. The protein was crystallized in the presence of the ligand X-Man and the crystals were obtained by the vapor diffusion method in hanging drop by sparse matrix. Crystallization kits “Crystal Screen I and II” from Hampton Research were used to obtain protein crystals and the better condition was 33 from kit I4 M sodium formate. The crystal was diffracted to 2.61Å with space group I222 with unit cell dimensions a = 61.34; b = 66.11; c = 106.69Å and α = β = γ = 90º. It was observed the presence of a monomer in asymmetric unit containing 42.04% of solvent in the crystal. The molecular replacement was made using Dioclea rostrata structure (PDB: 2ZBJ). The final refinement obtained Rfactorof 0.23 and Rfree of 0.27 in absence of any amino acid in regions not allowable in Ramachandran plot. The structure of X-Man was co-crystallized and observed perfectly placed in the carbohydrate recognition domain. Regarding the balance of the dimmer-tetramer associations of plant lectins, the lectin from Dioclea violacea has the amino acid HIS 131 and the position of HIS 51 is similar to the same amino acid in Dioclea grandiflora lectin, characterizing these lectins as a tetramer even at low pH. It was made comparisons between the differences in biological activities of other lectins from Diocleainae and the distances of the residues from carbohydrate site. It was observed that differences in biological activities in vasorelaxant effects on vascular smooth muscle are probably related to the distances between the residues that compose the carbohydrate domain. / As lectinas da subtribo Diocleinae pertencem à família de Leguminosas e são caracterizadas pela alta homologia entre suas sequências de aminoácidos. Apesar da alta similaridade estrutural o mesmo não acontece nas atividades biológicas das lectinas dessa família. Estudos mostram que a modificação de poucos aminoácidos em suas sequências é capaz de provocar grandes alterações nas atividades biológicas dessas lectinas, dessa forma o entendimento mais detalhado das estruturas tridimensionais dessas proteínas é essencial para a análise da relação entre estrutura e função. A lectina de Dioclea violacea foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de Sephadex G-50. A proteína foi cristalizada na presença do ligante X-Man e os cristais foram obtidos pelo método de difusão de vapor em matriz esparsa por gota suspensa. Foram utilizando os kit “cristal screen” I e II da Hampton Research e a condição que obteve melhor cristal foi a condição 33 do kit I composta por 4M Formato de sódio. O cristal foi difratado a 2,61Å e apresenta grupo espacial I222 com cela unitária com dimensões de a = 61,34, b = 66,11, c = 106,69Å e ângulos de α = β = γ = 90º. Foi observada a presença de um monômero na unidade assimétrica contendo 42,04% de solvente no cristal. A substituição molecular foi feita utilizando a estrutura da lectina de Dioclea rostrata (PDB: 2ZBJ). O refinamento final obteve Rfactor de 0,23 e Rfree de 0,27 com ausência aminoácidos em regiões não permitidas do gráfico de Ramachandran. O ligante X-Man foi co-cristalizado e sua estrutura foi observada perfeitamente encaixada no domínio de reconhecimento a carboidratos. Em relação ao equilíbrio dímero tetrâmero, a lectina de Dioclea violacea apresenta o aminoácido HIS 131 e a posição da HIS 51 é semelhante ao mesmo aminoácido da Dioclea grandiflora, caracterizando esta lectina como tetrâmero mesmo em pH baixo. Foram feitas comparações entre as atividades biológicas de outras lectinas do gênero Dioclea e as distâncias entre os resíduos do sítio de ligação a carboidrato. Essa analise mostrou que a variação nessas distâncias influi no efeito e eficácia da atividade vasorelaxante em aorta de ratos.

NOBRE, C. B. Caracterização físico-química e efeito sobre bactérias orais de uma lectina de sementes de Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff. 2012. 93 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-10-31T20:03:44Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_cbnobre.pdf: 1864484 bytes, checksum: 118f59fa7f9546d508dc8870d7c1b826 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-16T20:56:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_cbnobre.pdf: 1864484 bytes, checksum: 118f59fa7f9546d508dc8870d7c1b826 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-16T20:56:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_cbnobre.pdf: 1864484 bytes, checksum: 118f59fa7f9546d508dc8870d7c1b826 (MD5) Previous issue date: 2012 / Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff seeds, a species belonging to the Leguminosae family, Papilionoideae subfamily, Dalbergieae tribe, have a glucose/mannose specific lectin rabbit erythrocytes that agglutinate native or treated with proteolytic enzymes. The lectin from Andira surinamensis seeds was purified by affinity chromatography on Mannose-Sepharose matrix followed by ion exchange chromatography on DEAE-Sephacel matrix. This procedure resulted in a purified lectin, named ASL. ASL purification process was monitored by specific hemagglutinating activity and SDS-PAGE, where it was observed that this lectin is composed of six protein bands, a higher molecular weight of approximately 20 kDa and five other bands of lower apparent molecular weight between 15 and 12 kDa.The intact molecular mass of the purified lectin was determined by mass spectrometry with electrospray ionization (ESI). The analysis of the intact mass spectrum showed the presence of two majority ions of molecular mass 12.220+ 2 and 13.258 + 2 Da. ASL also had its primary structure partially sequenced by mass spectrometry sequence. This lectin is a glycoprotein and shows high stability, being able to maintain their hemagglutinating activity in a wide pH range and after exposure to temperatures up to 80 °C for 1 hour. After dialysis against the chelating agent EDTA, ASL had its hemagglutinating activity decreased, but recovered its activity after the addition of metals, being dependent on divalent metal cations. We also evaluate the effect of ASL on planktonic bacterial growth and biofilm formation and found that it interfered with the growth of two different planktonic gram-positive bacterial strains (Streptococcus mitis and Streptococcus salivarius) and biofilm formation by Stafilococcus aureus e Streptococcus salivarius. / As sementes de Andira surinamensis (Bondt) Splitg. ex Amshoff, uma espécie pertencente à família Leguminosae, subfamília Papilionoideae, tribo Dalbergieae, possuem uma lectina glicose/manose específica, que aglutina eritrócitos de coelhos nativos ou tratados com enzimas proteolíticas. A lectina de sementes de Andira surinamensis foi purificada através de cromatografia de afinidade em matriz de Sepharose-Manose seguida por cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-Sephacel. Esse procedimento resultou na lectina purificada, nomeada de ASL. O processo de purificação da ASL foi monitorado pela atividade hemaglutinate específica e SDS-PAGE, onde se observou que essa lectina é composta por seis bandas protéicas, uma de maior peso molecular aparente de aproximadamente 20 kDa e outras cinco bandas de menor peso molecular aparente entre 15 e 12 kDa. A massa molecular intacta da lectina purificada foi determinada através da técnica de espectrometria de massa com Ionização por Eletrospray (ESI). A análise do espectro de massa intacta mostrou a presença de dois íons majoritários de massa molecular de 12.220+ 2 e 13.258 + 2 Da. ASL também teve sua estrutura primária parcialmente sequenciada através de espectrometria de massa sequencial. Essa lectina é uma glicoproteína e demonstra elevada estabilidade, sendo capaz de manter sua atividade hemaglutinante em uma ampla faixa de pH e após exposição a temperaturas de até 80 ºC por 1hora. Após diálise contra o agente quelante EDTA, ASL teve sua atividade hemaglutinante diminuída, porém recuperou sua atividade após a adição de metais, mostrando-se dependente de cátions metálicos divalentes. Foi avaliado também o efeito da ASL no crescimento planctônico bacteriano e na formação de biofilmes e observou-se que ela interferiu no crescimento planctônico de duas diferentes cepas bacterianas gram-positivas (Streptococcus mitis e Streptococcus salivarius) e na formação de biofilme por Staphylococcus aureus e Streptococcus salivarius.

PEREIRA JÚNIOR, F. N. Caracterização estrutural parcial e biológica de uma lectina de sementes de Dioclea reflexa Hook F. 2014. 103 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-22T20:56:52Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_fnpereirajunior.pdf: 3977046 bytes, checksum: 1715360bf0e298000773e7aa5472e6a4 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-12T14:09:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_fnpereirajunior.pdf: 3977046 bytes, checksum: 1715360bf0e298000773e7aa5472e6a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-12T14:09:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_fnpereirajunior.pdf: 3977046 bytes, checksum: 1715360bf0e298000773e7aa5472e6a4 (MD5) Previous issue date: 2014 / Lectins are proteins that have at least one non-catalytic domain capable of reversibly bind to specific mono-or oligosaccharides. Lectins are widely distributed in many plants as well as animals and other organisms. In general, lectins are very abundant in plant seeds, especially in the Leguminosae family. Hundreds of lectins have been isolated and characterized from plants belonging to different families of this division. The legume lectin family is the group of this protein class further studied, in particular highlighted the subtribe Diocleinae. Lectins Diocleinae have a high degree of structural similarity, but the same was not true about the biological activities. This variability lies in details that can be analyzed in studies based structures. In this context, this paper describes the partial structural and biological characterization of a lectin present in seeds Dioclea reflexa Hook F. belonging to the family Leguminosae, subfamily Papilionoideae, tribe Phaseoleae, subtribe Diocleinae. The seed lectin Dioclea reflexa (DrfL) was purified in a single step by affinity chromatography on Sephadex G-50 column. The lectin strongly agglutinated rabbit erythrocytes and was inhibited by D-mannose and methyl-α-D-manoside. The hemagglutinating activity of the DrfL is optimum pH 5.0, 6.0 and 7.0, stable at a temperature of 50 ° C. Similar to other lectins of the subtribe Diocleinae, analysis by mass spectrometry indicated that the lectin D. reflex has three chains (α, β and γ) with masses of 25,562; 12,874 and 12,706 Da, respectively, and has no disulfide bonds or glycosylation. The primary sequence of DrfL shows great similarity with other lectins from species of the same genus. The protein was crystallized by vapor diffusion bonding method in the presence of X-man and was determined to a resolution of 1.76 Å. DrfL presented relaxing effect on smooth muscle and endothelial aortas rat and showed inflammatory activity in the rat paw edema model. The lectin D. reflexa exhibited low cytotoxicity against Artemia sp. / Lectinas são proteínas que possuem no mínimo um domínio não catalítico capaz de se ligar reversivelmente a mono ou oligossacarídeos específicos. As lectinas são amplamente distribuídas em muitas plantas, bem como em animais e outros organismos. Geralmente, as lectinas são muito abundantes em sementes de plantas, especialmente na família Leguminosae. Centenas de lectinas já foram isoladas e caracterizadas de plantas pertencentes a diferentes famílias dessa divisão. A família das lectinas de leguminosas representa o grupo desta classe proteica mais bem estudada, em especial destaque a subtribo Diocleinae. As lectinas de Diocleinae apresentam um alto grau de similaridade estrutural, porém o mesmo não se observa quanto às atividades biológicas. Esta variabilidade reside em detalhes que podem ser analisados em estudos baseados em estruturas. Neste contexto, o presente trabalho descreve a caracterização estrutural parcial e biológica de uma lectina presente em sementes de Dioclea reflexa Hook F., pertencente à família Leguminosae, subfamília Papilionoideae, tribo Phaseoleae, subtribo Diocleinae. A lectina de sementes de Dioclea reflexa (DrfL) foi purificada em uma única etapa através de cromatografia de afinidade em coluna Sephadex G-50. A lectina aglutinou fortemente eritrócitos de coelho e foi inibida por D-manose e α-metil-D-manosídeo. A atividade hemaglutinante da DrfL é ótima nos pH 5,0;6,0 e 7,0, e estável a uma temperatura de 50 °C. Semelhante a outras lectinas da subtribo Diocleinae, a análise por espectrometria de massas indicou que a lectina de D. reflexa possui possui três cadeias (α, β e γ) com massas de 25.562, 12.874 e 12.706 Da, respectivamente, e não possui ligações dissulfeto ou glicosilações. A sequência primária da DrfL apresenta grande similaridade com outras lectinas de espécies do mesmo gênero. A proteína foi cristalizada pelo método de difusão de vapor na presença do ligante X-man e foi resolvida a uma resolução de 1,76 Å. DrfL apresentou efeito relaxante em músculo liso de aortas endotelizadas de rato e apresentou atividade inflamatória no modelo de edema de pata de rato. A lectina de D. reflexa exibiu baixa citotoxicidade contra náuplios de Artemia sp.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Leguminosae is recognized by the large amount of isolated and characterized lectins, especially seeds. In this group stand out proteins extracted from species belonging to subtribe Diocleinae, the number of studies in different areas of knowledge. Lectins can be defined as proteins or glycoproteins which are not originated from a body's immune response and have the ability to recognize and bind reversibly to mono or oligosaccharides particular without, however, altering their chemical structures. Different works in our group are structurally haracterizing these proteins as well as elucidating some possible biotechnological applications for these molecules. In this sense, the objective of this study was to isolate and characterize lectins of different species of Leguminosae of Diocleinae subtribe and test them for toxicity to Artemia sp. naupilos, The effect on the smooth muscle of blood vessels and the detention lectin matrix agarose previously activated with cyanogenic bromide (CNBr). Were isolated and characterized the lectin Dioclea sclerocarpa, Dioclea lasiocarpa and Dioclea lasiophylla. Were also made circular dichroism studies on lectin Dioclea sclerocarpa and Dioclea lasiocarpa. The lectin Dioclea lasiophylla was tested against Artemia sp. order to assess their toxicity and was also immobilized on agarose matrix. We evaluated the effect of lectin Dioclea lasiocarpa in the smooth muscle of blood vessels. The knowledge gained from the three scientific articles published in this thesis is a major breakthrough in this promising field of study that has been continuously growing for biotechnological applications. / A famÃlia Leguminosae à reconhecida pela grande quantidade de lectinas isoladas e caracterizadas, especialmente de sementes. Neste grupo se destacam as proteÃnas extraÃdas de espÃcies pertencentes a subtribo Diocleinae, pela quantidade de estudos em diferentes Ãreas do conhecimento. Lectinas podem ser definidas como proteÃnas ou glicoproteÃnas que nÃo sÃo originadas a partir de uma resposta imunolÃgica do organismo e possuem a capacidade de reconhecer e se ligar reversivelmente a mono ou oligossacarÃdeos especÃficos sem, no entanto, alterar suas estruturas quÃmicas. Diferentes trabalhos no nosso grupo vÃm caracterizando estruturalmente essas proteÃnas, bem como elucidando algumas possÃveis aplicaÃÃes biotecnolÃgicas para essas molÃculas. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar lectinas de diferentes espÃcies de Leguminosae da subtribo Diocleinae e testa-las com relaÃÃo à toxicidade para naupilos de Artemia sp., o efeito na musculatura lisa de vasos sanguÃneos e a imobilizaÃÃo de lectina em matriz de agarose previamente ativada com brometo cianogÃnico (CNBr). Foram isoladas e caracterizadas as lectinas de Dioclea sclerocarpa, Dioclea lasiocarpa e Dioclea lasiophylla. TambÃm foram feitos estudos de dicroÃsmo circular na lectina de Dioclea sclerocarpa e Dioclea lasiocarpa. A lectina de Dioclea lasiophylla foi testada contra Artemia sp.de forma a avaliar sua toxicidade e tambÃm foi imobilizada em matriz de agarose. Foi avaliado o efeito da lectina de Dioclea lasiocarpa na musculatura lisa de vasos sanguineos. O conhecimento acumulado a partir dos trÃs artigos cientÃficos publicados nesta tese constitui um grande avanÃo no neste campo promissor de estudo que vem em contÃnuo crescimento para aplicaÃÃo biotecnolÃgica.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-05T16:39:15Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2011-Tese-MoacyrRêgol.pdf: 2001004 bytes, checksum: 1fa7b5e19c232f34bd9c8735fac6c753 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-05T16:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2011-Tese-MoacyrRêgol.pdf: 2001004 bytes, checksum: 1fa7b5e19c232f34bd9c8735fac6c753 (MD5) Previous issue date: 2011-08-26 / Este trabalho objetivou analisar a expressão de Galectina=1(Gal=1), Galectina=3 (Gal=3) e ligantes de lectinas em ambientes hipóxicos e/ou privados de nutrientes em célula de câncer de mama e em biópsias tumorais. Para modelar o evento in vitro a linhagem celular de câncer de mama T47D foi submetida à hipóxia em câmara de hipóxia durante 24, 48 e 72h com ou sem privação de nutrientes. Os grupos controles (normóxia com ou sem nutrientes) foram mantidos em estufa de CO2. As biópsias tumorais de carcinoma ductal invasivo (CDI) foram divididas em dois grupos: um positivo e outro negativo para o marcador de hipóxia (CA IX) assim como as biópsias de carcinoma ductal in situ (CDIS) foram divididas em comedônicas/hipóxas e não=comedônicas/controle, para posterior comparação quanto aos parâmetros clínicos, histopatológicos e glicobiológicos. Os experimentos com T47D mostraram que a expressão de Gal=3 aumenta progressivamente quando submetida à hipóxia e privação de nutrientes durante 24, 48, 72h. As biopsias de CDI positivas para CA IX apresentaram uma marcação nuclear mais intensa que o grupo negativo e características tumorais mais agressivas como invasão linfonodal e ausência de Receptor de estrógeno. Gal=1 não foi expressa pelas células neoplásicas no modelo in vitro bem como nas biópsias, onde foi possível detectar positividade nas células do estroma associadas ao tumor. Quanto ao papel da Gal=3 na proteção a morte celular, utilizando=se citômetria de fluxo, observou=se que não houve correlação entre a inibição do domínio de reconhecimento a carboidratos da proteína e o aumento de morte celular. Entretanto, foi observada indução a morte para o anticorpo monoclonal M338, específico para o N=terminal de Gal=3, sendo esta marcação aumentada em até três vezes durante o aumento de morte celular em 48h e 72h de hipóxia e privação de nutrientes. A histoquímica com lectinas foi utilizada em amostras de CDIS com Con A, WGA e UEA=I e de CDI com L=PHA e SNA. Nos casos de CDIS as lectinas utilizadas reconheceram mais casos do grupo comedônico (hipóxico) que o não=comedônico. Ao passo que nas biópsias de CDI foi observado um aumento na sialilação assim como nas células T47D (in vitro) onde se pode avaliar que esta glicosilação não é de responsabilidade exclusiva de ST6GALNac. Nossos resultados indicam que ocorre uma glicosilação aberrante no ambiente hipóxico in vitro e in vivo associada a um fenótipo tumoral mais agressivo bem como sugere que Gal=3 participa da proteção contra morte celular e informativa para diagnóstico e prognóstico. / This study aimed to analyze the expression of Galectin=1, Galectin=3 and lectin ligands in hypoxic environments starved or not of nutrients in breast cancer cells and in tumour biopsies. In vitro experiments in T47D breast cancer cells were subjected to hypoxia in hypoxia chamber for 24, 48 and 72h with or without nutrients; control groups (in normoxia and nutrients supplied) were kept in CO2 incubator. Invasive ductal carcinoma (IDC) biopsies were divided into two groups: one positive and one negative for hypoxia marker Carbonic Anhydrase (CA IX); and Ductal Carcinoma in situ (DCIS) samples were divided in comedonecrosis/hypoxic or non=comedonecrosis/control groups, and then they were compared to clinical, histopathological and glycobiology aspects. Confocal microscopy, real=time PCR and western blotting showed that Galectin=3 expression was predominantly nuclear and increased progressively when subjected to hypoxia for 24, 48, 72h and nutrient starvation. CDI samples positive for hypoxia marker CA IX presented an intense nuclear staining in comparison to control group besides more aggressive tumour features as node positivines and absence of ER staining. Gal=1 was not expressed by neoplastic cells in cell model and biopsies, where it was possible to detect positivity in tumour=associated stroma. The evaluation of Gal=3 role in cell death protection using flow cytometry showed that there was no correlation between inhibition of Gal=3 carbohydrate recognition domain and the increase in cell death rate. However, it was observed that monoclonal antibody M338, specific to Gal=3 N=terminal, positivity increased with the increasing of dead cells after 48h and 72h under hypoxia and starvation. Lectin histochemistry for Gal=3 ligands or Gal=3=ligant complex preventing carbohydrates were investigated using Con A, WGA, PNA and UEA=I for DCIS and L=PHA, SNA and VVA for CDI. Results indicated that in CDIS the lectins used recognized more intensely the comedogenic/hypoxic group while in CDI samples were observed an increase in sialylation as well as in T47D cells indicating that ST6GALNac is not the only responsible for this event. Our results indicate that aberrant glycosylation occurs in hypoxic environments associated with a high aggressive tumour phenotype providing information of diagnostic and prognostic value. Results also suggest that Gal=3 participates in the protection of cell death by N=terminal and that sialylation in hypoxic environment is not mainly caused by N=glycosylation.

Orientador: Paulo Roberto Bueno / Coorientador: Maria Del Pilar Taboada Sotomayor / Banca: Hideko Yamanaka / Banca: Emanuel Carrilho / Banca: Marcelo Mulato / Banca Mauro Bertotti / Resumo: A técnica de espectroscopia de capacitância eletroquímica foi recentemente utilizada com sucesso para detecção de biomarcadores de interesse clínico, como o caso da proteína C-reativa (CRP), que está relacionada com doenças cardíacas e processos inflamatórios. Nesta tese, esta técnica foi utilizada para desenvolver dispositivos eletroanalíticos com possíveis aplicações para a detecção de trombose, utilizando a proteína biomarcadora D-dímero; câncer de próstata, por meio da detecção da enzima fosfatase ácida prostática (PAP), e glicoproteína HRP, para possível detecção de células tumorais e como modelo para o estudo da interação lectina-glicoproteína. Além, no último caso, utilizaram-se também as funções de imitância como sinal transdutor como possível aplicação em glycoarray. Para a construção da superfície receptora sobre eletrodo de ouro, foram utilizadas duas moléculas diferentes de tiol (R-SH, sendo R uma cadeia carbônica genérica). A primeira, que contém em sua estrutura o grupo terminal carboxílico, foi utilizada com o objetivo de imobilizar o material biológico para reconhecimento do analito (i.e., anticorpos ou lectina) via protocolo EDC/NHS. A segunda, com o grupo redox terminal (11-ferrocenil-undecanotiol, 11Fc), foi utilizada com o intuito de fornecer o sinal transdutor. As monocamadas bifuncionais obtidas pela adsorção conjunta de ambas as moléculas apresentam densidade molecular superficial na ordem de 5 x 10-10 mol/cm2. A imobilização do anticorp... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The electrochemical capacitance spectroscopy technique has been recently applied to detect biomarkers of clinical interest, such as C-reactive protein (CRP) which is related to heart disease and inflammatory processes. Herein, this technique was used to develop electroanalytical approaches with potential applications for thrombosis diagnosis by detecting D-dimer biomarker protein; prostatic cancer, using prostatic acid phosphatase (PAP) enzyme as target; and glycoprotein assay, for possible detection of tumor cells and as a model for studying lectin-glycoprotein interaction (using ArtinM lectin and HRP glycoprotein). In addition, in the latter case, immittance functions were used as transducer signals as possible application for glycoarray. For the construction of the receptor surface on gold electrodes, two different thiol molecules (R-SH, being R a generic carbonic chain) were used. The first, which contains the carboxylic terminal group, was applied to immobilize the biological material for target recognition (i.e., either antibodies or lectin) via EDC/NHS protocol. The second molecule contains a terminal redox group (11-ferrocenyl-undecanethiol, 11Fc) in order to provide the transducer signal. The bifunctional monolayers obtained herein present high surface coverage, ≈ 5 x 10-10 mol/cm2. The immobilization of the antibody to PAP detection (anti-PAP) was investigated by QCM, and it was verified that saturation occurs in approximately 1 h, yielding a surface coverage of ≈ 3.7 mg/m2, suggesting "end on" orientation. Using the electrochemical capacitance signal, it was possible to develop an approach for PAP detection with limit of detection (LD) and quantification (LQ) of 9 pmol/L and 28 pmol/L, respectively, applied to a PAP clinically useful concentration range of 50-1000 pmol/L in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4). The relative standard deviation obtained was 9.5%, and showed specif... / Doutor

Lectinas estão situadas dentro de um grupo estruturalmente diverso de proteínas que se ligam a carboidratos e glicoconjugados com grande especificidade. Encontradas em diversos organismos, elas são moléculas extremamente úteis na caracterização de sacarídeos, como agentes mediadores de endereçamento de fármacos ou até mesmo como marcadores de superfície celular. A pulchellina é uma glicoproteína heterodimérica ligante de D-Galactose oriunda de sementes de Abrus pulchellus e classificada como proteína inativadora de ribossomo do tipo 2 (“type 2 ribosome-inactivating protein" - type 2 RIP). A cadeia B recombinante da pulchellina (rPBC) foi previamente produzida em E. coli BL21(DE3). Neste presente trabalho, a rPBC é analisada quanto a sua atividade, interação com células de mamíferos “in vitro" e estabilidade estrutural. Os resultados indicam que a rPBC possui seletividade quanto a tipos celulares alvo e é endocitada ativamente, provavelmente compartilhando a via de endocitose descrita para outras RIPs. Além disto, a rPBC foi unida à cadeia catalítica e o heterodímero resultante demonstrou toxicidade similar à da holotoxina nativa, confirmando a atividade da rPBC e atribuindo-lhe papel essencial no mecanismo de intoxicação. Uma segunda parte deste trabalho tratou de outra lectina, extraída de sementes de Camptosema ellipticum. Recentemente, experimentos com extratos aquosos obtidos a partir de sementes de Camptosema ellipticum demonstraram possuir atividade hemaglutinante frente a hemácias humanas. Tal atividade foi atribuída a um dado componente protéico que foi então purificado através de cromatografias de troca iônica e exclusão molecular. A proteína, então chamada camptosemina, demonstrou ocorrer na forma de um tetrâmero e cujo estado de oligomerização pode ser controlado pelo pH do meio. Informações sobre a seqüência primária na porção amino-terminal, obtidas por seqüenciamento de aminoácidos, permitiram o desenho de oligonucleotídeos degenerados para a amplificação e clonagem de seu cDNA. As seqüências dos clones obtidos foram submetidas a diversas rotinas de procura de dados do NCBI. Entre os resultados retornados encontraram-se a concanavalina e a aglutinina de amendoim, dois representantes da chamada família de lectinas de leguminosas. Representantes deste grupo compartilham com a camptosemina o tamanho de seus monômeros e a forma de controle de seus graus de oligomerização. O presente trabalho traz a caracterização preliminar da camptosemina quanto a sua seqüência primária e oligomerização através de técnicas de clonagem e de espectroscopia. Foi possível a clonagem de duas variantes para o cDNA da camptosemina cujas seqüências prevêem um peptídeo sinal N-terminal ausente na proteína madura. As seqüências primárias deduzidas são muito semelhantes entre si e em comparação com outros membros da família de lectinas de leguminosas. A camptosemina se demonstrou extremamente resistente a mudanças de temperatura, exibindo sua dissociação em monômeros somente sob pHs extremamente ácidos ou alcalinos. / Lectins have been placed in a structurally diverse group of proteins that bind carbohydrates and glycoconjugates with high specificity. Found in several organisms, they are extremely useful molecules in the characterization of saccharides, as drug delivery mediators, and even as cellular surface markers. Pulchellin is a D-Galactose-binding heterodimeric glycoprotein from Abrus pulchellus seeds and classified as a type-2 ribosome-inactivating protein (type-2 RIP). The recombinant pulchellin B (rPBC) was previously produced in E. coli BL21 (DE3). In the present work, rPBC is analyzed with respect to its interaction with mammal cells “in vitro" and structural stability. Results show that rPBC has selectivity for targeted cell types and that it is actively endocytosed, probably by the same route described for other RIPs. Furthermore, rPBC was bond to the catalytic chain and the resulting heterodimer has shown toxicity degree very similar to the native holotoxin, confirming rPBC activity and attributing it a essential role in the intoxication mechanism. A second part of this work has dealed with another lectin extracted from the seeds of Camptosema ellipticum. Recently, experiments with water-soluble extracts obtained from the seed of Camptosema ellipticum have shown to have hemagglutinative properties when assayed with human erythrocytes. Such biological activity was attributed to a certain proteic component that was purified by ion-exchange and size-exclusion chromatographies. The protein, so called camptosemin, has shown to occur as a tetramer and which oligomerization’s state could be driven by the environmental pH. Primary sequence information from the amino-terminal portion, obtained by aminoacid sequencing, allowed the design of degenerated oligonucleotides for the amplification and cloning of its cDNA. The obtained clones’ sequences were submitted to several NCBI data bank search scripts. Among the retrieved results were found concanavalin and peanut agglutinin, two representatives of the called legume lectins family. Members of this group share with camptosemin their monomer sizes and the way their oligomerization state can be driven. This present work characterizes camptosemin with respect to its sequence and oligomerization using cloning and spectroscopy techniques. It was possible the cloning of two cDNA variants for camptosemin which sequences deduce an N-terminal signal peptide absent in the mature protein. Deduced primary sequences are very similar to each other and to other legume lectin members. Camptosemin has shown being extremely temperature resistant, only dissociating in monomeric subunits under extremely acid or alkaline pHs.

A família das galectinas compreende um grupo de lectinas cujos domínios de reconhecimento de carboidratos (CRDs) possuem afinidade específica para ß-galactosídeos. Estas se encontram amplamente distribuídas em células normais e neoplásicas de diferentes organismos e estão envolvidas em uma grande diversidade de mecanismos celulares. As galectinas têm sido foco de estudos recentes, principalmente pelo seu envolvimento em processos inflamatórios e neoplásicos, entretanto, muitas perguntas sobre as interações com diferentes carboidratos, a especificidade destas interações e o papel específico das galectinas em inflamação, adesão celular, progressão tumoral e metástase permanecem ainda sem resposta. O presente projeto focou os estudos estruturais dos domínios de reconhecimento de carboidratos (CRDs) da galectina-4 humana (HGal-4). Nosso trabalho envolveu a clonagem, expressão, purificação dos domínios de reconhecimento de carboidratos (CRD-I e CRD-II) de forma independente. O domínio CRD-I da HGal-4 foi cristalizado e sua estrutura determinada por técnicas de cristalografia de raios-X a 2 Å de resolução. A estrutura cristalográfica do domínio CRD-I da galectina-4 humana possue duas folhas- compostas de seis fitas (S1- S6) e cinco fitas (F1-F6) enoveladas na forma de um -sanduiche. Uma comparação estrutural entre membros da classe das galectinas mostra que este enovelamento global dos CRDs é conservado e que e a diferença em especificidade pelos carboidratos observado pelas diferentes galectinas é consequência de mutações pontuais de aminoácidos. Os resultados obtidos no desenvolvimento do presente projeto serão utilizados como uma ferramenta importante para o entendimento de processos celulares que envolvem a galectina-4 humana, como inflamação, progressão celular e metástase, e conseqüentemente, contribuir para o planejamento de novas estratégias de diagnóstico e tratamento de neoplasias. / The galectin family comprises a group of lectins where the carbohydrate-recognition domains (CRDs) display specific affinity for ß-galactosides. They are widely distributed in normal and neoplasic cells of different organisms and are involved in a great diversity of cellular mechanisms. The galectins have been focus of recent studies, mainly for their involvement in inflammatory and neoplasic processes, however, many questions about the interactions with different carbohydrates, the specificity of these interactions and the specific role of the galectins in inflammation, cell adhesion, tumor progression and metastasis remain unanswered.The present project focused the strctural studies of human galectin-4 (HGal-4) carbohydrate-recognition domains (CRDs). Our work involved the independent cloning, heterologous expression and purification of both carbohydrate-recognition domains (CRD-I and CRD-II). The HGal-4 CRD-I domain has been successfully crystallized and its structure solved by X-ray crystallography techniques at 2 Å resolution. The crystallographic structure of HGal-4 CRD-I domain comprises two -sheets containing six (S1- S6) and five strands (F1-F6) each packed as a -sandwich domain. A structural comparison among members of galectin class of proteins shows that this folding is highly conserved and that the difference in specificity for carbohydrate molecules is consequence of punctual aminoacid mutations. Our results will be used as an important tool towards a better understanding of cellular processes such as inflammation, cell progression and metastasis, and consequently, contribute for the development of new strategies for diagnosis and treatment of neoplasies.

A lectina ArtinM, extraída de sementes de Artocarpus heterophyllus e caracterizada como um homotetrâmero constituído de subunidades de 16 kDa, tem alta afinidade de ligação a manotriose Man? 1-3 [Man? 1-6] Man, que constitui o core de N-glicanas. ArtinM é dotada de interessantes propriedades biológicas: (1) ativa neutrófilos a partir do reconhecimento de N-glicanas dos receptores CXCR2 e TLR2; (2) induz a desgranulação de mastócitos por interagir com N-glicanas de Fc?R ou com N-glicanas de IgE ligadas a Fc?R; (3) estimula a produção de IL-12, por reconhecer N-glicanas contidas no ectodomínio de TLR2 da superfície de células apresentadoras de antígeno (APCs); (4) exerce atividade imunomoduladora, que direciona o padrão de resposta para o perfil Th1; (5) confere resistência a infecções por patógenos intracelulares, como Paracoccidioides brasiliensis, Leishmania amazonensis e Leishmania major, Neospora caninum e Candida albicans Células T CD4+ participam de funções essenciais do sistema imune; durante o estabelecimento de uma resposta imune, podem ser desenvolvidas subpopulações de células T CD4+ adequadas para gerar respostas eficientes de combate a patógenos, manutenção da tolerância e regulação da imunidade. A ativação das células T CD4+ depende de um primeiro sinal, desencadeado pelo complexo TCR/CD3, e de um segundo sinal, oriundo de moléculas coestimulatórias como CD28. A ativação e expansão de células T CD4+ são limitadas pela ação de moléculas inibitórias, principalmente por CTLA-4. Lectinas podem ativar as células T, sendo a fitohemaglutinina (PHA) e a Concanavalin A (ConA) os exemplos mais conhecidos. Além disso, está bem caracterizado que o alvo de reconhecimento de ConA localiza-se no complexo TCR/CD3. No presente estudo buscou-se caracterizar os efeitos da lectina ArtinM sobre células T CD4+ murinas e investigar os possíveis mecanismos responsáveis pelos efeitos exercidos. Foram avaliados, inicialmente, os efeitos diretos de ArtinM sobre as células T CD4+, no que se refere à produção de citocinas, expressão de moléculas coestimulatórias e inibitórias e indução de diferenciação celular. Passou-se então à identificação de possíveis receptores de superfície reconhecidos por ArtinM e responsáveis pelo desencadeamento da ativação celular. Finalmente, buscou-se apontar moléculas sinalizadoras envolvidas nos efeitos diretos de ArtinM. A primeira evidência da interação direta de ArtinM com células T CD4+ foi proporcionada por aglutinação celular. Uma curva dose-resposta revelou que 5µg/ml foi a melhor concentração para adquirir significativa produção de citocinas Th1 (IL-2 e IFN-?) e Th17 (IL-6 e IL-17A) pelas células T CD4+. O estímulo com a concentração ótima de ArtinM mostrou que após 12 horas de incubação houve um significativo aumento nos níveis de IL-2, IFN-?, IL-6 e IL-17A no sobrenadante celular; persistindo no curso de 48 horas de observação. A secreção concomitante de IFN-? e IL-17A motivou a avaliação, por citometria de fluxo, da ocorrência de dupla marcação intracelular dessas citocinas. O estímulo, por 24 horas, com ArtinM, levou a importante aumento da frequência de células duplo-positivas para IFN-? e IL-17. Uma vez comprovado pelo padrão de citocinas secretadas que ArtinM promove a ativação das células T CD4+, investigou-se a expressão das moléculas CD25 e CTLA-4. ArtinM aumentou a expressão de ambas as moléculas, de maneira dose-dependente. Curiosamente, a detecção tanto de CD28, como de CTLA-4, foi precoce e persistente, diferindo do padrão temporal de expressão proporcionado por outros ativadores de células T CD4+. Com vistas a determinar o mecanismo através do qual ArtinM atua nas células T CD4+, alvos potenciais de reconhecimento foram ensaiados: CD3?, CD3??, CD28, CD45 e CD4. Esses receptores foram selecionados com base em predição de potenciais sítios Nglicosilados. Dessa forma, anticorpos específicos para essas moléculas foram utilizados para analisar a sua capacidade de inibir a atividade de ArtinM de induzir as células T CD4+ a produzir citocinas, como IL-2, IFN-?, IL-6 e IL-17A. Apenas o anticorpo anti-CD3?? foi capaz de impedir a secreção das citocinas induzidas por ArtinM. Além disso, esse anticorpo inibiu a marcação de células T CD4+ por ArtinM biotinilada. Esses dados indicam que ArtinM exerce sua atividade sobre células T CD4+ através do reconhecimento de glicanas na cadeia ? do receptor CD3, não excluindo-se, entretanto, a ocorrência da interação de ArtinM com outras glicoproteínas na superfície de linfócitos T CD4+. Também foi verificado que ArtinM possui alta especificidade por glicanas na superfície dessas células, pois foram necessárias elevadas concentrações de manotriose para inibir em 50% a ligação de ArtinM à superfície das células T CD4+. Através do uso de inibidores específicos para moléculas sinalizadoras, constatou-se que PI3K, PTK, p42/44MAPK, p38MAPK, JNK e PKC estão implicadas na sinalização para a produção das citocinas de perfis Th1 e Th17, induzida por ArtinM. Esse conjunto de resultados indica que ArtinM é um potente e rápido ativador de células T CD4+. A ativação celular induzida por ArtinM está relacionada com a ligação à cadeia ? do receptor CD3 e se associa à alta expressão de moléculas coestimuladoras e inibitórias. Ademais, demonstrou-se que ArtinM promove a diferenciação das células T CD4+ naive em células Th1 e Th17, utilizando moléculas sinalizadoras que são conhecidas como críticas para a indução de citocinas que caracterizam essas subpopulações celulares. / The lectin ArtinM, extracted from seeds of Artocarpus heterophyllus and characterized as a homotetramer consisted of 16 kDa subunits, has high binding affinity to the manotriose Man? 1-3 [Man? 1-6] Man, which is the core of N-glycans. ArtinM is endowed with interesting biological properties: (1) it activates neutrophils through the recognition of Nglycans attached to CXCR2 and TLR2 receptors; (2) induces degranulation of mast cells by interacting with N-glycans of Fc?R or to N-glycans of IgE bound to Fc?R; (3) stimulates the production of IL-12 through the recognition of N-glycans of the TLR2 ectodomain, expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs); (4) exerts immunomodulatory activity, which accounts for Th1 immunity (5) confers resistance to intracellular pathogens, such as P. brasiliensis, Leishmania amazonensis and Leishmania major, Neospora caninum e Candida albicans. CD4+ T cells participate in essential functions of the immune system. During the development of an immune response, CD4+ T cells are activated and give origin to subpopulations of cells that are suitable for establishing effective responses to combat pathogens, for tolerance maintenance, and for adequate immuneregulation. The activation of CD4+ T cells depends on a first signal, triggered by the TCR/CD3 complex, and a second signal, provided by costimulatory molecules. The activation and expansion of CD4+ T cells is limited by the action of inhibitory molecules. Lectins may activate T cells, and Phytohemagglutinin (PHA) and Concanavalin A (ConA) are the best know examples. Furthermore, it is well characterized that the target for ConA recognition is localized in the TCR/CD3 complex. The present study was delineated to characterize the effects of the lectin ArtinM on murine CD4+ T cells and to investigate the possible mechanisms accounting for the observed effects. It was investigated the ArtinM direct effects on CD4+ T cells, concerning its ability to induce the production of cytokines, the expression of costimulatory and inhibitory molecules and cell differentiation. In addition, the possible surface receptors recognized by ArtinM and responsible for triggering cell activation were also assessed. Finally, signaling molecules involved in the direct effects of ArtinM were approached. The first evidence of direct interaction of ArtinM with CD4+ T cells was provided by cell agglutination. A dose-response curve has revealed that 5µg/ml was the best ArtinM concentration to achieve significant production of Th1 (IL-2 and IFN-?) and Th17 (IL-6 and IL-17A) cytokines by TCD4+ cells. Stimulus with the optimum ArtinM concentration has showed that after 12 hours incubation there was a significant augmentation of IL-2, IFN-?, IL- 6 and IL-17A levels in the cell supernatant; which has persisted in the course of 48 hours observation. The concomitant secretion of IFN-? and IL-17A led us to evaluate, by flow cytometry, the intracellular expression of these cytokines. After 24 hours stimulation with ArtinM, there was a significant increase in the frequency of cells IFN-?+IL-17+. Once the cytokines detection indicated that CD4+ T cells have been activated by ArtinM, the expression of CD25 and CTLA-4 molecules was assessed. ArtinM increased the expression of both molecules, in a dose-dependent manner. Interestingly, both cell surface molecules, CD25 and CTLA-4, were early and persistently detected a temporal pattern that is distinct from the provided by other inducers of CD4+ T cell activation. In order to determine the mechanism by which ArtinM acts on CD4+ T cells, potential targets of recognition were assessed: CD3??, CD3?, CD28, CD45 and CD4. These receptors were selected on the basis of prediction of N-glycosylation sites. Specific antibodies for these molecules were assayed regarding their ability to inhibit the ArtinM of inducing TCD4+ cells to produce cytokines, such as IL-2, IFN-?, IL-6 and IL-17A. Only anti-CD3 antibody was able to prevent the cytokines secretion induced by ArtinM. In addition, anti-CD3 antibody has inhibited the T CD4+ cell labeling by biotynil-ArtinM. These data indicate that ArtinM exerts its biological activity on T CD4+ cells through recognition of CD3 receptor ? chain glycans, without excluding the occurrence of ArtinM interactions with other glycoproteins on the surface of T CD4+ lymphocytes. The interaction of ArtinM with glycans at the surface of these cells was found to occur with great specificity, since high concentrations of the manotriose - Man? 1-3 [Man? 1-6] Man - were required to inhibit the binding. By using specific inhibitors of signaling molecules, we have found that PI3K, PTK and p42/44MAPK are relevant cytokine production profiles of Th1 and Th17 cells after stimulation with ArtinM. All toghether, these results indicate that ArtinM is a potent and rapid activator of CD4+ T cells. The activation induced by ArtinM is triggered by its binding to the CD3 receptor ? chain, which induces high expression of costimulator and inhibitory molecules. Moreover, it was demonstrated that ArtinM promotes the differentiation of naive CD4+ T cells into Th1 and Th17 cells by committing signaling molecules that are known as critical for the induction of cytokines that characterize these subpopulations of cells.

A lectina ArtinM, extraída de sementes de Artocarpus heterophyllus e caracterizada como um homotetrâmero constituído de subunidades de 16 kDa, tem alta afinidade de ligação a manotriose Man? 1-3 [Man? 1-6] Man, que constitui o core de N-glicanas. ArtinM é dotada de interessantes propriedades biológicas: (1) ativa neutrófilos a partir do reconhecimento de N-glicanas dos receptores CXCR2 e TLR2; (2) induz a desgranulação de mastócitos por interagir com N-glicanas de Fc?R ou com N-glicanas de IgE ligadas a Fc?R; (3) estimula a produção de IL-12, por reconhecer N-glicanas contidas no ectodomínio de TLR2 da superfície de células apresentadoras de antígeno (APCs); (4) exerce atividade imunomoduladora, que direciona o padrão de resposta para o perfil Th1; (5) confere resistência a infecções por patógenos intracelulares, como Paracoccidioides brasiliensis, Leishmania amazonensis e Leishmania major, Neospora caninum e Candida albicans Células T CD4+ participam de funções essenciais do sistema imune; durante o estabelecimento de uma resposta imune, podem ser desenvolvidas subpopulações de células T CD4+ adequadas para gerar respostas eficientes de combate a patógenos, manutenção da tolerância e regulação da imunidade. A ativação das células T CD4+ depende de um primeiro sinal, desencadeado pelo complexo TCR/CD3, e de um segundo sinal, oriundo de moléculas coestimulatórias como CD28. A ativação e expansão de células T CD4+ são limitadas pela ação de moléculas inibitórias, principalmente por CTLA-4. Lectinas podem ativar as células T, sendo a fitohemaglutinina (PHA) e a Concanavalin A (ConA) os exemplos mais conhecidos. Além disso, está bem caracterizado que o alvo de reconhecimento de ConA localiza-se no complexo TCR/CD3. No presente estudo buscou-se caracterizar os efeitos da lectina ArtinM sobre células T CD4+ murinas e investigar os possíveis mecanismos responsáveis pelos efeitos exercidos. Foram avaliados, inicialmente, os efeitos diretos de ArtinM sobre as células T CD4+, no que se refere à produção de citocinas, expressão de moléculas coestimulatórias e inibitórias e indução de diferenciação celular. Passou-se então à identificação de possíveis receptores de superfície reconhecidos por ArtinM e responsáveis pelo desencadeamento da ativação celular. Finalmente, buscou-se apontar moléculas sinalizadoras envolvidas nos efeitos diretos de ArtinM. A primeira evidência da interação direta de ArtinM com células T CD4+ foi proporcionada por aglutinação celular. Uma curva dose-resposta revelou que 5µg/ml foi a melhor concentração para adquirir significativa produção de citocinas Th1 (IL-2 e IFN-?) e Th17 (IL-6 e IL-17A) pelas células T CD4+. O estímulo com a concentração ótima de ArtinM mostrou que após 12 horas de incubação houve um significativo aumento nos níveis de IL-2, IFN-?, IL-6 e IL-17A no sobrenadante celular; persistindo no curso de 48 horas de observação. A secreção concomitante de IFN-? e IL-17A motivou a avaliação, por citometria de fluxo, da ocorrência de dupla marcação intracelular dessas citocinas. O estímulo, por 24 horas, com ArtinM, levou a importante aumento da frequência de células duplo-positivas para IFN-? e IL-17. Uma vez comprovado pelo padrão de citocinas secretadas que ArtinM promove a ativação das células T CD4+, investigou-se a expressão das moléculas CD25 e CTLA-4. ArtinM aumentou a expressão de ambas as moléculas, de maneira dose-dependente. Curiosamente, a detecção tanto de CD28, como de CTLA-4, foi precoce e persistente, diferindo do padrão temporal de expressão proporcionado por outros ativadores de células T CD4+. Com vistas a determinar o mecanismo através do qual ArtinM atua nas células T CD4+, alvos potenciais de reconhecimento foram ensaiados: CD3?, CD3??, CD28, CD45 e CD4. Esses receptores foram selecionados com base em predição de potenciais sítios Nglicosilados. Dessa forma, anticorpos específicos para essas moléculas foram utilizados para analisar a sua capacidade de inibir a atividade de ArtinM de induzir as células T CD4+ a produzir citocinas, como IL-2, IFN-?, IL-6 e IL-17A. Apenas o anticorpo anti-CD3?? foi capaz de impedir a secreção das citocinas induzidas por ArtinM. Além disso, esse anticorpo inibiu a marcação de células T CD4+ por ArtinM biotinilada. Esses dados indicam que ArtinM exerce sua atividade sobre células T CD4+ através do reconhecimento de glicanas na cadeia ? do receptor CD3, não excluindo-se, entretanto, a ocorrência da interação de ArtinM com outras glicoproteínas na superfície de linfócitos T CD4+. Também foi verificado que ArtinM possui alta especificidade por glicanas na superfície dessas células, pois foram necessárias elevadas concentrações de manotriose para inibir em 50% a ligação de ArtinM à superfície das células T CD4+. Através do uso de inibidores específicos para moléculas sinalizadoras, constatou-se que PI3K, PTK, p42/44MAPK, p38MAPK, JNK e PKC estão implicadas na sinalização para a produção das citocinas de perfis Th1 e Th17, induzida por ArtinM. Esse conjunto de resultados indica que ArtinM é um potente e rápido ativador de células T CD4+. A ativação celular induzida por ArtinM está relacionada com a ligação à cadeia ? do receptor CD3 e se associa à alta expressão de moléculas coestimuladoras e inibitórias. Ademais, demonstrou-se que ArtinM promove a diferenciação das células T CD4+ naive em células Th1 e Th17, utilizando moléculas sinalizadoras que são conhecidas como críticas para a indução de citocinas que caracterizam essas subpopulações celulares. / The lectin ArtinM, extracted from seeds of Artocarpus heterophyllus and characterized as a homotetramer consisted of 16 kDa subunits, has high binding affinity to the manotriose Man? 1-3 [Man? 1-6] Man, which is the core of N-glycans. ArtinM is endowed with interesting biological properties: (1) it activates neutrophils through the recognition of Nglycans attached to CXCR2 and TLR2 receptors; (2) induces degranulation of mast cells by interacting with N-glycans of Fc?R or to N-glycans of IgE bound to Fc?R; (3) stimulates the production of IL-12 through the recognition of N-glycans of the TLR2 ectodomain, expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs); (4) exerts immunomodulatory activity, which accounts for Th1 immunity (5) confers resistance to intracellular pathogens, such as P. brasiliensis, Leishmania amazonensis and Leishmania major, Neospora caninum e Candida albicans. CD4+ T cells participate in essential functions of the immune system. During the development of an immune response, CD4+ T cells are activated and give origin to subpopulations of cells that are suitable for establishing effective responses to combat pathogens, for tolerance maintenance, and for adequate immuneregulation. The activation of CD4+ T cells depends on a first signal, triggered by the TCR/CD3 complex, and a second signal, provided by costimulatory molecules. The activation and expansion of CD4+ T cells is limited by the action of inhibitory molecules. Lectins may activate T cells, and Phytohemagglutinin (PHA) and Concanavalin A (ConA) are the best know examples. Furthermore, it is well characterized that the target for ConA recognition is localized in the TCR/CD3 complex. The present study was delineated to characterize the effects of the lectin ArtinM on murine CD4+ T cells and to investigate the possible mechanisms accounting for the observed effects. It was investigated the ArtinM direct effects on CD4+ T cells, concerning its ability to induce the production of cytokines, the expression of costimulatory and inhibitory molecules and cell differentiation. In addition, the possible surface receptors recognized by ArtinM and responsible for triggering cell activation were also assessed. Finally, signaling molecules involved in the direct effects of ArtinM were approached. The first evidence of direct interaction of ArtinM with CD4+ T cells was provided by cell agglutination. A dose-response curve has revealed that 5µg/ml was the best ArtinM concentration to achieve significant production of Th1 (IL-2 and IFN-?) and Th17 (IL-6 and IL-17A) cytokines by TCD4+ cells. Stimulus with the optimum ArtinM concentration has showed that after 12 hours incubation there was a significant augmentation of IL-2, IFN-?, IL- 6 and IL-17A levels in the cell supernatant; which has persisted in the course of 48 hours observation. The concomitant secretion of IFN-? and IL-17A led us to evaluate, by flow cytometry, the intracellular expression of these cytokines. After 24 hours stimulation with ArtinM, there was a significant increase in the frequency of cells IFN-?+IL-17+. Once the cytokines detection indicated that CD4+ T cells have been activated by ArtinM, the expression of CD25 and CTLA-4 molecules was assessed. ArtinM increased the expression of both molecules, in a dose-dependent manner. Interestingly, both cell surface molecules, CD25 and CTLA-4, were early and persistently detected a temporal pattern that is distinct from the provided by other inducers of CD4+ T cell activation. In order to determine the mechanism by which ArtinM acts on CD4+ T cells, potential targets of recognition were assessed: CD3??, CD3?, CD28, CD45 and CD4. These receptors were selected on the basis of prediction of N-glycosylation sites. Specific antibodies for these molecules were assayed regarding their ability to inhibit the ArtinM of inducing TCD4+ cells to produce cytokines, such as IL-2, IFN-?, IL-6 and IL-17A. Only anti-CD3 antibody was able to prevent the cytokines secretion induced by ArtinM. In addition, anti-CD3 antibody has inhibited the T CD4+ cell labeling by biotynil-ArtinM. These data indicate that ArtinM exerts its biological activity on T CD4+ cells through recognition of CD3 receptor ? chain glycans, without excluding the occurrence of ArtinM interactions with other glycoproteins on the surface of T CD4+ lymphocytes. The interaction of ArtinM with glycans at the surface of these cells was found to occur with great specificity, since high concentrations of the manotriose - Man? 1-3 [Man? 1-6] Man - were required to inhibit the binding. By using specific inhibitors of signaling molecules, we have found that PI3K, PTK and p42/44MAPK are relevant cytokine production profiles of Th1 and Th17 cells after stimulation with ArtinM. All toghether, these results indicate that ArtinM is a potent and rapid activator of CD4+ T cells. The activation induced by ArtinM is triggered by its binding to the CD3 receptor ? chain, which induces high expression of costimulator and inhibitory molecules. Moreover, it was demonstrated that ArtinM promotes the differentiation of naive CD4+ T cells into Th1 and Th17 cells by committing signaling molecules that are known as critical for the induction of cytokines that characterize these subpopulations of cells.