Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2014-01-23T20:26:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_InfluenciasIdadeAmbiente.pdf: 35646132 bytes, checksum: 0e58f050b3a569f8927352c599ce214d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-01-24T14:19:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_InfluenciasIdadeAmbiente.pdf: 35646132 bytes, checksum: 0e58f050b3a569f8927352c599ce214d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-24T14:19:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_InfluenciasIdadeAmbiente.pdf: 35646132 bytes, checksum: 0e58f050b3a569f8927352c599ce214d (MD5) Previous issue date: 2014 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Por conta de que o ambiente enriquecido (AE) aumenta a atividade de células T e contribuí para imunopatogênese durante as infecções heterólogas do vírus da dengue (VDEN), nós hipotetizamos que animais que crescem em AE em comparação com animais que crescem em ambiente padrão (AP), ao serem infectados pelo vírus da dengue, desenvolveriam formas mais graves da doença. Além disso, como os animais velhos apresentam menor declínio funcional em células T de imunidade adaptativa, testamos a hipótese de que camundongos AE velhos ao serem infectados pelo vírus da dengue apresentariam maior taxa de mortalidade do que animais AP pareados por idade, e isso estaria associado à maior hiperplasia dos linfócitos T. Para testar essas hipóteses implantamos regime de inoculações múltiplas em animais adultos de 9 e 18 meses de idade. Dois regimes de inoculação foram testados: inoculações múltiplas de homogeneizado cerebral infectado por um único sorotipo (IUS) ou inoculações alternadas daquele homogeneizado e de anticorpo heterólogo (ICAH). Em ambos os casos foram feitas inoculações múltiplas intraperitoneais encontrando-se diferenças significativas no curso temporal da doença nos animais submetidos a um ou outro regime de inoculação. Comparado ao grupo ICAH para o qual detectou-se diferenças significativas entre os grupos AE e AP (Kaplan-Meyer log-rank test, p = 0,0025), não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos experimentais AP e AE submetidos ao regime IUS (Kaplan-Meyer log-rank test, p = 0,089). As curvas de sobrevivência dos grupos AE e AP sob o regime ICAH foram estendidas após a injeção de glicocorticoides reduzindo-se os sintomas e o número de mortes e esse efeito foi maior no grupo AE do que no AP (Kaplan-Meyer log-rank test, p = 0,0162). No regime ICAH, o grupo AE mostrou sinais clínicos mais intensos do que o AP e isso incluiu dispneia, tremor, postura encurvada, imobilidade, paralisia pré-terminal, choque e eventual morte. Comparado ao grupo AP, o grupo AE independentemente da idade apresentou maior mortalidade e sinais clínicos mais intensos. Esses sinais clínicos mais intensos nos animais do ambiente enriquecido submetidos ao regime ICAH foram associados à maior hiperplasia de linfócitos T no baço e maior infiltração dessas células no fígado, pulmões e rins. Embora a hiperplasia linfocítica e a infiltração tenham se mostrado mais intensas nos animais velhos do que nos jovens, a imunomarcação para os antígenos virais nos mesmos órgãos foi maior nos jovens do que nos velhos. A presença do vírus nos diferentes órgãos alvo foi confirmada por PCR em tempo real. Tomados em conjunto os resultados sugerem que o ambiente enriquecido exacerba a resposta inflamatória subsequente à infecção por dengue acentuada por anticorpo heterólogo, e isso está associado à sintomas clínicos mais intensos, maior taxa de mortalidade e ao aumento da expansão de células T. Os ensaios comportamentais e histopatológicos do presente trabalho permitiram testar e validar novo modelo murino imunocompetente para estudos em dengue permitindo testar numerosas hipóteses oriundas de estudos epidemiológicos e in vitro. / Because the enriched environment (EE) increases the activity of T cells, contribute to the immunopathogenesis of dengue virus infections (VDEN) we hypothesized that animals maintained in an enriched environment (AE) compared with animals from impoverished environment of standard laboratory cages (IE), would develop more severe forms of the disease. Because older animals have less functional decline in adaptive immunity T cells, we tested the hypothesis that AE old mice would show higher number of deaths and more intense clinical signs than age-matched IE animals, and this would be associated with greater expansion of T lymphocytes. To test these hypotheses we established scheme of multiple inoculations in adult animals of 9 and 18 months of age. Two regimens of inoculation were tested: multiple injections of single serotype (VDEN3 genotype III) infected brain homogenate (SS) or alternatively multiple injections with that infected brain homogenate followed 24h later by inoculation of heterologous antibody (SSHA). In both cases multiple i.p. inoculations were done. It was found significant differences in the temporal progression of the disease in the animals submitted to one or another scheme of inoculation: SSHA group (Kaplan -Meier log-rank test, p = 0.0025); IUS (Kaplan -Meier log-rank test, p = 0.089). The survival curves of AE and AP under SSHA regime were extended after a single injection of glucocorticoids, reducing the symptoms and the number of deaths, and these effects were greater in the EE group than in the IE (Kaplan-Meier log-rank test, p = 0.0162). In SSHA scheme, EE group showed clinical signs more intense than the AP and those included dyspnea, tremor, hunched posture, immobility, pre-terminal paralysis, shock and eventual death. Compared to the IE group, the AE group regardless of age showed higher mortality and more severe clinical signs. These more severe clinical signs in EE animals under SSHA regime were associated with increased hyperplasia of T lymphocytes in the spleen and increased infiltration of these cells in the liver, lungs and kidneys. Although lymphocytic hyperplasia and infiltration have been more intense in older than in younger animals, immunostaining for viral antigens in target organs was higher in young than in the aged mice. The presence of the virus in various infected organs were confirmed by real time PCR. Taken together the results suggest that the enriched environment life style exacerbates the subsequent inflammatory response to infection, and that is associated with more severe clinical symptoms, higher mortality and increased T cell expansion. Behavioral and histopathological data validate a new immunocompetent murine model for studies on dengue disease allowing in vivo tests of a number of hypothesis raised by epidemiological and in vitro studies.

Introdução: Hanseníase, doença crônica, incapacitante, causada pelo M.leprae, que afeta a pele e os nervos periféricos. Manifesta-se como doença espectral, que exibe dois polos imunologicamente distintos, denominados hanseníase virchowiana (lepromatous - LL), caracterizada por uma resposta celular ineficiente; e hanseníase tuberculoide (Tuberculoid - TT), com resposta imune celular efetiva. A ativação de células T requer a sinalização através de moléculas coestimulatórias expressas em células apresentadoras de antígeno e seus ligantes nas células T. As células T regulatórias (Treg) exercem importante papel no mecanismo de falha do controle da disseminação antigênica nas formas graves das doenças crônicas granulomatosas, mas seu real papel na hanseníase ainda não foi elucidado. Métodos: Estudamos a expressão das moléculas coestimulatórias e células Treg na resposta imune de pacientes nos diferentes espectros da doença. A expressão de células Treg foi quantificada por citometria de fluxo (CD4+CD25+FoxP3+) nas células mononucleares do sangue periférico de pacientes e controles (16 eram virchowianos, 12 tuberculoides e 6 controles) estimulados in vitro com o antígeno do M. leprae e com o mitógeno phytohemaglutinina, bem como nas lesões de pele por imunohistoquímica. A expressão de moléculas coestimulatorias (CD80, CD86, CD28, CTLA-4, PD-1, ICOS) foi avaliada por citometria de fluxo in vitro, a partir do estimulo de células mononucleares provenientes de 14 pacientes virchowianos, 14 tuberculoides e 10 indivíduos saudáveis expostos ao bacilo. A resposta linfoproliferativa, a produção de citocinas (IL10 e IFN-?) in vitro e a expressão in situ de IL-10, TGF? e CTLA-4 também foram determinadas. Resultados: Nós demonstramos que pacientes virchowianos apresentam deficiência na expressão da molécula CD86 na superfície de monócitos, e isso contribui para uma apresentação antigênica ineficiente, favorecendo o estado de anergia observado nesse grupo de pacientes. Observamos ainda, que o bloqueio da expressão dessa molécula, mas não do CD80 inibe a resposta linfoproliferativa ao M.leprae. Ainda no polo virchowiano anérgico, observamos redução da expressão de moléculas coestimulatórias de sinalização positiva (CD28, CD86) na superfície dos linfócitos. Em contraste, nos pacientes tuberculoides notamos um aumento da expressão de moléculas de sinalização negativa (CTLA-4 e PD-1), que pode representar uma provável modulação da resposta imune exacerbada, regulando dessa forma os efeitos deletérios da hiperreatividade celular. Notavelmente, os contatos também expressão em menor intensidade CD86 e CD28, mas não se observou expressão exacerbada de CTLA-4 ou PD-1, sugerindo que eles provavelmente desenvolvem resposta imune balanceada sem que haja necessidade de sinalização imunossupressora. Observamos ainda, que o antígeno do M.leprae induz uma significativa redução da resposta linfoproliferativa, mas um aumento significativo de células Treg no sangue e na pele dos pacientes virchowianos, quando comparado ao grupo tuberculoide. Em paralelo, notamos o aumento da expressão de moléculas anti-inflamatórias (IL-10 e CTLA-4) nas lesões cutâneas desses pacientes virchowianos. Conclusão: Nossos resultados sugerem que células Treg e moléculas coestimulatórias desempenham papel importante na patogênese da hanseníase, especialmente no polo virchowiano, em que favoreceria a anergia e a multiplicação bacilar / Introduction: Leprosy, caused by the bacillus Mycobacterium leprae, is a chronic, incapacitating disease that affects the peripheral nerves and skin. Leprosy manifests as a spectral disease, exhibiting two polar sides, namely, lepromatous leprosy (LL) characterised by impaired T-cell responses and tuberculoid leprosy in which T-cell responses are strong. Proper T-cell activation requires signalling through costimulatory molecules expressed by antigen presenting cells and their ligands on T-cells. T regulatory cells (Tregs) play an important role in the mechanism of host\'s failure to control pathogen dissemination in severe forms of different chronic granulomatous diseases, but their role in leprosy has not yet been elucidated. The objective of this study was to investigate the influence of costimulatory molecules and Tregs cels on the immune responses of subjects along the leprosy spectrum. Patients and Methods: Tregs were quantified by flow cytometry (CD4+ CD25+ Foxp3+) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients (16 lepromatous, 12 tuberculoids and controls (n = 6) stimulated in vitro with a M. leprae antigenic preparation and phytohemagglutinin as well as in skin lesions by immunohistochemistry. The expression of the costimulatory molecules (CD80, CD86, CD28, CTLA-4, PD-1, ICOS) was evaluated in in vitro-stimulated peripheral blood mononuclear cells isolated from 14 lepromatous and 14 tuberculoid patients, and 10 healthy individuals exposed to the bacillus. The lymphoproliferative (LPR), interleukin-10 (IL-10), and interferon-g (IFN-g) responses of the in vitro-stimulated peripheral blood mononuclear cells and the in situ expression of IL-10, transforming growth factor-b (TGF-b), and cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) were also determined. Results: We show that lepromatous patients have defective monocytes\' CD86 expression, likely contributing to the impairment of the antigen presentation process and to their anergy. Accordingly, anti-CD86 blocking monoclonal antibody, but not anti-CD80 antibody, inhibited the lymphoproliferative response to Mycobacterium leprae. Consistent with the lepromatous pole anergy, there was reduced T-cells\' expression of the positive signaling costimulatory molecules CD28 and CD86 in these patients. Tuberculoid patients, on the other hand, had increased expression of the negative signaling CTLA-4 and PD-1 molecules, probably representing a means of modulating exacerbated immune response and avoiding immunopathology. Interestingly, contacts exhibited proper CD86 and CD28 expression, but not exacerbated CD152 and PD-1 expression, suggesting that they tend to develop a balanced immunity without requiring immunosuppressive costimulatory signaling. We also observed that M. leprae antigens induced significantly lower lymphoproliferation but significantly higher Treg numbers in lepromatous than tuberculoid patients and contacts. Mitogen-induced lymphoproliferation and Treg frequencies were not significantly different between the three groups. Tregs were also more frequent in situ in multibacillary patients, and this was paralleled by increased expression of the anti-inflammatory molecules IL-10 and CTLA-4, but not TGF. Conclusion: Our results suggest that Tregs and costimuatory molecules play a major role in the pathogenesis of leprosy, especially the lepromatous pole, in which they would act to favor the anergy and the unrestricted multiplication of the bacilli

INTRODUÇÃO: Líquen plano (LP) é uma doença mucocutânea de natureza inflamatória crônica de etiologia ainda desconhecida. Alterações na resposta imune inata, como aos padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) e padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) podem levar à inflamação crônica e contribuir com a patogênese do LP. OBJETIVO: Avaliar o efeito da ativação via o DAMP S100A8 e o receptor Toll-like 4 (TLR-4) em células Natural killer (NK) e TCD8 citotóxicas e suas subpopulações de memória/efetoras em pacientes com LP. MÉTODOS: Foram selecionados 25 pacientes com LP (22 mulheres, 3 homens) com idade média de 43,46 anos ± 8,46 e um grupo controle com 25 indivíduos (22 mulheres, 3 homens) com idade média de 42 anos ± 5,5. A determinação transcricional e da expressão por imunohistoquimica dos DAMPs S100A8, HMGB-1 e de TLR-4 e RAGE foi realizada em biópsias de lesões cutâneas de indivíduos com LP, e os níveis séricos de S100A8, HMGB-1, MICA e MICB foram determinados por ELISA. As células mononucleares (CMNs) de sangue periférico foram avaliadas por citometria de fluxo quanto a frequência de TNF, IL-1beta e o marcador de desgranulação CD107a em células TCD8+ e células NK CD56+ e suas subpopulações. A avaliação da via de sinalização de TLR em células TCD8+ purificadas e ativadas com S100A8 foi analisada por PCR array e a determinação da expressão de mRNA dos componentes do inflamassoma em células TCD8+ ativadas com S100A8 por PCR em tempo real. RESULTADOS: Foi evidenciado nos indivíduos com LP elevada expressão da proteína S100A8 nas lesões cutâneas e de HMGB-1, TLR-4 e RAGE na derme, em paralelo ao aumento da expressão de mRNAs para S100A8 e S100A9 e diminuição de RAGE. Além disto, uma elevação dos níveis séricos do dímero S100A8/A9 foi detectada nos pacientes comparados aos controles, ao contrário do DAMP HMGB-1 que mostrou níveis similares em ambos os grupos. A influência do S100A8 em células TCD8+ e células NK, foi analisada em CMNs pela ativação com o lipopolissacáride e a proteína recombinante S100A8, ambos ligantes de TLR-4. Nos indivíduos com LP foi detectado aumento da resposta citotóxica de linfócitos TCD8+ e células NK CD56bright pela expressão do marcador de desgranulação CD107a por citometria de fluxo. A proteína S100A8 foi capaz de induzir a expressão de genes pró-inflamatórios como IL-1beta, TNF e IL-6 em células TCD8+ de pacientes com LP em contraste com os indivíduos saudáveis que mostraram expressão IL-10 e IFN tipo I. As células TCD8+ de indivíduos com LP ativadas ou não com S100A8 expressam transcritos de NLRP1, NLRP3 e AIM-2 e produzem IL-1beta em níveis similares a controles saudáveis. Além disso, células TCD8+ ativadas com S100A8 mostraram aumento de expressão TLR3, TLR5, TLR7 e TLR8 na doença comparada às biopsias de controles. O aumento da resposta TCD8+ citotóxica foi principalmente mediado pelo subtipo de memória efetora (TEM, CCR7- CD45RA-). Elevação basal da expressão do receptor ativador NKG2D e inibidor NKG2A foi observado em células NK CD56dim nos indivíduos com LP e um nível similar do ligante solúvel MICB em ambos os grupos. CONCLUSÃO: Estes resultados evidenciam que componentes da imunidade inata, como a proteína S100A8 pode contribuir na manutenção do perfil inflamatório do LP / BACKGROUND: Lichen planus (LP) is a mucocutaneous inflammatory chronic disease of unknown etiology. Alterations in the innate immune response such as the pathogen-associated molecular pattern (PAMPs) and damage-associated molecular pattern (DAMPs) can lead to chronic inflammation and contribute to the pathogenesis of LP. OBJECTIVE: Evaluate the effect of the activation trough the DAMP S100A8 and the Toll-like receptor 4 (TLR-4) on the Natural killer cells (NK) and cytotoxic TCD8 cells and their memory / effector subsets in LP disease. METHODS: We selected 25 patients with LP (22 women, 3 men) with a mean age of 43.46 years ± 8.46 and a control group of 25 subjects (22 women, 3 men) with a mean age of 42 ± 5, 5. The transcriptional determination and protein expression by immunohistochemistry of DAMPs, S100A8 and HMGB-1 as well as TLR-4 and RAGE was performed on biopsies of skin lesions from patients with LP, and serum levels of S100A8, HMGB-1, MICA and MICB were determined by ELISA. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were assessed by flow cytometry to evaluate the frequency of TNF, IL-1beta and the degranulation marker CD107a in CD8+ T cells and CD56 + NK cells and their subsets. The evaluation of the TLR signaling pathway in purified CD8 + T cells activated with S100A8 were analyzed by PCR array and the determination of mRNA expression of inflammasome components on CD8 + T cells activated by S100A8 was measured by real time PCR. RESULTS: It was shown in the LP individuals an increased expression of the S100A8 protein in the cutaneous lesions and HMGB-1, TLR-4 and RAGE in the dermis, in parallel to increased level of mRNAs for S100A8 and S100A9 and decreased expression of RAGE. Moerover, increased serum levels of the dimer S100A8 / A9 was detected in patients compared to controls, in contrast to DAMP HMGB1 that revealed similar levels in both groups. The influence of S100A8 in CD8 + T cells and NK cells, was analyzed in PBMC activating with lipopolysaccharide and recombinant protein S100A8, both ligands of TLR-4. It was detected in LP individuals, an increased cytotoxic response of CD8+ T lymphocytes and CD56bright NK cells trough CD107a degranulation marker expression. The S100A8 protein was able to induce the pro-inflammatory genes expressions such as IL-1beta, TNF and IL-6 in CD8 + T cells of LP patients in contrast to healthy subjects who promoted IL-10 expression and type I IFN. CD8 + T cells of LP individuals activated or not with S100A8 are able to express NLRP1, NLRP3 and AIM-2 and IL-1beta production at similar levels to healthy controls. Moreover, CD8 + T cells activated with S100A8 showed increased expression of TLR3, TLR5, TLR7 and TLR8 in LP compared to biopsies from healthy controls. The increased CD8 + T cells cytotoxic response was mediated by the subtype of effector memory (TEM CD45RA- CCR7). The increased baseline expression of activating receptor NKG2D and the inhibitory NKG2A in the NK CD56dim cells in LP individulas, and the similar level of MICB soluble in both groups. CONCLUSION: These results shows that innate immunity components, such as S100A8 protein may contribute to the maintenance of LP inflammatory profile

Em áreas endêmicas para leishmaniose visceral, a AIDS aumenta o risco de aparecimento desta doença de cem a mil vezes. Conhecem-se muitos estudos sobre leishmaniose visceral (LV) em HIV/AIDS no Mediterrâneo, mas, pouco sobre leishmaniose tegumentar (LT) em HIV/AIDS. No Brasil não se constatou, até o momento, um aumento de casos de co-infecção HIV-Leishmania, mas, isto pode ser conseqüente ao subdiagnóstico por várias causas incluindo o não conhecimento da apresentação clínica nesses casos. Pela prevalência maior da LT em relação à LV no Brasil, é de se supor que ocorram com freqüência casos de co-infecção com a forma tegumentar de leishmaniose no nosso meio. Como no Brasil não dispomos de estudos de descrição sistemática da apresentação clínica nos casos de co-infecção, um parâmetro importante visando o diagnóstico, realizou-se um estudo transversal e descritivo, durante um período de dois anos a partir de fevereiro de 2002, em dois centros de tratamento de doenças infecciosas em São Paulo. Partimos de uma população alvo de 113 pacientes com sorologia positiva para HIV, procedentes de área endêmica para leishmanioses, 69 com algum sintoma sugestivo de leishmaniose visceral ou tegumentar e 44 assintomáticos. Em dez pacientes foi diagnosticada leishmaniose por encontro de parasitos ou antígeno de Leishmania em tecidos, maioria (8/10) por busca ativa, sendo cinco casos de LV e cinco de LT. Baseados nesses casos, observamos que, o contato com área endêmica de leishmaniose mesmo por um período curto como duas semanas deva ser valorizado, principalmente se foi recente. Houve dificuldade no encontro de casos porque a leishmaniose não é considerado como diagnóstico diferencial de infecções intercorrentes nos casos de HIV/AIDS no nosso meio, houve presença concomitante de outras doenças oportunistas mais prevalentes e manifestações clínicas atípicas ou semelhantes a infecções oportunistas. xvi Os casos de LV apresentaram manifestações clássicas, enquanto que os casos de LT apresentaram lesões diversas, desde úlcera única até lesões múltiplas e polimórficas (placas infiltrativas, pápulas, nódulos, máculas), com tendência à disseminação atingindo mucosa e pele, incluindo área genital (em quatro dos cinco pacientes com LT). Em dois pacientes observaram-se aparecimento de lesões (num caso) e piora (noutro caso), após início da terapia antirretroviral altamente efetiva (HAART), com características sugestivas de síndrome inflamatória de recuperação imune. Quanto à classificação de HIV segundo CDC, oito pacientes eram C3 e dois B3 e todos apresentavam contagem de linfócitos T CD4+ menor que 200 células/?l. A sorologia para leishmaniose foi positiva em todos os casos de LV mas, positiva em três dos cinco casos de LT. O teste de Montenegro foi negativo nos dois casos de LV onde o teste foi realizado e positivo em todos os três pacientes de LT submetidos ao teste. No tratamento da leishmaniose, freqüentemente os pacientes apresentaram efeitos adversos aos medicamentos e obervou-se mortalidade alta (40%) e freqüência alta de recidiva nos pacientes sobreviventes (100% dos LT e 66% dos LV) / In endemic areas of visceral leishmaniasis (VL), AIDS increases the risk for VL in 100 to 1000 times. There are many studies on VL in HIV/AIDS patients from the Mediterranean basin but data on tegumentary leishmaniasis (TL) are scarce. In Brazil, no increase in the number of cases of HIV/Leishmania co-infection was reported so far, but it may be due to subdiagnosis owing to various reasons including ignorance on clinical features of the co-infected patients.. Since the prevalence of TL is greater than VL in Brazil, we presume that cutaneous or mucosal leishmaniasis would be frequent in cases of coinfection in our country. Since there are no studies on systematic description of clinical manifestations of HIV/Leishmania co-infection in Brazil, an important basis for diagnosis, study was done for a period of two years from February 2002 aiming description of clinical manifestations in a transversal study in two infectious disease reference centers in Sao Paulo city, Brazil. The target population was constituted by 113 HIV positive patients that reported some kind of contact with endemic area for leishmaniasis, 69 being with some symptoms suggestive of visceral or tegumentary leishmaniasis, and 44 asymptomatic. In ten patients diagnosis of leishmaniasis was established by the detection of amatigotes or Leishmania antigens in tissue samples, five presented VL and five TL. Eight of 10 were found by active search. Based in these cases, we noted that contact with endemic area, even for short time like two weeks has to be considered in the diagnosis, mainly if it occurred recently. The search for these cases were difficult because leishmaniasis is not considered within differential diagnosis ofopportunistic infections in HIV positive patients among physicians, and in addition more prevalent opportunistic infections were concomitantly present and the clinical features were atypical for leishmaniasis or similar to other opportunistic infections. Clinical manifestation of VL was classic, while that of TL was quite variable, ranging from single to multiple ulcers, with polimorphic xviii presentations (papules, nodules, infiltrative plaques, macules) that tended to disseminate to the other areas of skin and mucosa, including genital area (in four from five TL patients). In two patients appearance of lesions (in one case) and worsening of tegumentary manifestations (in another case) after introduction of highly active anti-retroviral therapy (HAART) were observed that were suggestive of the so called immune reconstitution inflammatory syndrome. Concerning CDC classification of HIV, eight patients were C3 and two B3, and all presented CD4+ T cell count lower than 200/?l. All the VL patients had anti-Leishmania antibody test positive, however in TL three of five cases of was positive. Leishmanin skin (Montenegro) test was negative in two cases of VL submitted to this test, and positive in all three TL patients evalued. Frequent toxicity and adverse events with treatments were observed, as well as high mortality (40%), and high frequency of relapses among survivors (100% of TL and 66% of VL cases)

O vírus Epstein-Barr infecta aproximadamente 95% da população mundial adulta, estabelecendo uma infecção latente e assintomática. Porém, é um vírus associado à neoplasias malignas, tais como carcinomas de nasofaringe, linfomas de Hodgkin, alguns casos de carcinomas gástrico, linfomas T e NK, dentre outras. O EBV também está implicado em doenças não neoplásicas como a leucoplasia pilosa. O fenômeno de imunotolerância está ligado ao potencial de infecção e oncogênico do EBV. Células dendríticas imaturas e linfócitos T reguladores são importantes nesse contexto. Em situações neoplásicas, esse mecanismo impede o reconhecimento e a destruição de células tumorais. O objetivo desse trabalho foi estudar em quatro diferentes situações de infecção pelo EBV, a saber, amigdalite crônica, linfomas de Hodgkin, leucoplasia pilosa e carcinomas de nasofaringe, a presença de células dendríticas imaturas e linfócitos T reguladores, e também o papel da citocina MIP3 no recrutamento dessas células. Foram utilizadas as técnicas de hibridização in situ para detecção do EBV e imunoistoquímica para detecção das células dendríticas, linfócitos T reg e para análise da expressão de MIP3. Em todos os casos de linfoma de Hodgkin, amigdalites e carcinomas de nasofaringe EBV+ observou-se uma forte concentração de células dendríticas imaturas e linfócitos T reg. A expressão de MIP3 mostrou-se intensa nas neoplasias EBV positivas e fraca nos casos de amigdalite crônica. Não foi observada expressão de MIP3 nos casos de leucoplasia pilosa. A concentração de células dendríticas imaturas e linfócitos T reg está intimamente ligada à presença de céulas EBV+ e pela expressão de MIP3 nos linfomas de Hodgkin associados ao EBV e carcinomas de nasofaringe, criando assim um micro-ambiente de imunossupressão nessas lesões. / The Epstein-Barr virus infects approximately 95% of adult world-wilde population, establishing a latent and asymptomatic infection. However it is related to malignant neoplasia, such as nasopharynx carcinomas, Hodgkin disease, some gastric carcinomas, T/NK lymphomas among others. EBV is also implicated in non-neoplasic disease such as hairy leukoplakia. This phenomenon is associated with the EBV infectious and oncogenic potential. Immature dendritic cells and T reg cells are important in this context. In neoplasic situations, this mechanism obstructs recognition and destruction of tumoral cells. The aim of this work was study, in four different situations of EBV infection, to knowledge, chronic tonsillitis, Hodgkins disease, hairy leukoplakia and nasopharynx carcinoma, the presence of immature dendritic cells and T reg cells, and also the role of cytokine MIP3 in the recruitment of these cells. In situ hybridization was performed for EBV detection and immunohistochemistry for dendritic cells and T reg cells detection and also for expression evaluation of MIP3 cytokine. In all the cases of Hodgkins disease, tonsillitis and nasopharynx carcinoma EBV+, a strong concentration of immature dendritic cells and T reg lymphocytes was observed. The MIP3 expression was more intense on EBV positive neoplasia and weak in cases of chronic tonsillitis. No MIP3 expression was observed in hairy leukoplakia. The concentration of immature dendritic cell and T reg lymphocyte is intimately connected with the presence of EBV positive-cells and MIP3 expression in Hodgkin disease associated to EBV and nasopharynx carcinoma, creating a microenvironment of immunosuppression in these neoplasias.

A predisposição de recém-nascidos às doenças infecciosas é atribuída, em parte, a falta da memória imunológica pré-existente. Em recém-nascidos pré-termo, é presumido que o sistema imune seja menos desenvolvido ao nascimento, mas pouco se sabe sobre o tamanho e as características das subpopulações de linfócitos. Células T reguladoras (Treg) possuem papel crucial no controle do desenvolvimento de um sistema imune saudável incluindo a manutenção da autotolerância e, sua ausência, é responsável pela gama de manifestações inflamatórias e autoimunes observadas em pacientes com IPEX (Immunodeficiency, Poliendocrinopathy and Enteropathy X-linked Syndrome). Essas células são fenotipicamente caracterizadas pela presença do fator de transcrição Foxp3 (forkhead box P3) e pela alta expressão da cadeia ? do receptor de IL-2 (CD25), já que esta citocina é essencial para a geração, manutenção e funcionamento das células Treg. Pouco se sabe sobre a frequência destas células em recém-nascidos, particularmente em recém-nascidos muito prematuros ou moderados e recém-nascidos prematuros tardios, estudados como grupos separados. Resultados preliminares do nosso grupo revelaram uma maior capacidade dos recém-nascidos de produzir resposta pró-inflamatória em comparação aos adultos, a qual foi ainda mais acentuada pela diminuição da produção de IL-10, o que sugere uma função reguladora reduzida. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi caracterizar fenotipicamente e quantificar a população de células Treg, por meio de citometria de fluxo, em sangue de cordão umbilical de 15 recém-nascidos pré-termo nascidos entre 30-336/7 semanas de gestação (Grupo 1), 19 recém-nascidos pré-termo nascidos entre 34-366/7 semanas de gestação (Grupo 2) e 20 recém-nascidos a termo nascidos entre 37-41 semanas de gestação (Grupo 3), todos clinicamente saudáveis e com peso adequado para a idade gestacional, em comparação com 26 adultos saudáveis. Os resultados demonstraram que existe uma correlação inversa entre a frequência de Treg e a idade gestacional, com frequências significativamente maiores de células Treg CD4+CD25hiCD127loFoxp3+ no Grupo 1 quando comparado aos Grupos 2 e 3 e no Grupo 2 comparado ao Grupo 3, assim como frequências e números de Treg mais elevados em todos os recém-nascidos comparados aos adultos. Todos os recém-nascidos exibiram maior frequência de células Treg com fenótipo naïve comparados aos adultos. A expressão de CTLA-4 nas células Treg naïve foi reduzida nos dois grupos de pré-termo comparados aos grupos de recém-nascidos a termo e adultos, assim como nas células Treg de memória do Grupo 1 comparado aos demais grupos. As frequências de Tregs alfa4beta7+ e alfa4beta1+ foram maiores em ambos os grupos de pré-termo, mas significativamente diferentes somente no Grupo 1, quando comparado aos recém-nascidos a termo e adultos. Em conclusão, foram observadas altas frequências de células Treg em recém-nascidos pré-termo e a termo, e essas frequências mostraram correlação inversa com a idade gestacional. Essas células exibiram um perfil naïve quando comparadas às dos adultos, com alta expressão de CD45RA e alfa4beta7+ e menor expressão de CTLA-4, sugerindo uma menor função, particularmente em recém-nascidos muito prematuros / The predisposition of newborn infants to infectious diseases is attributed, in part, to the lack of pre-existing immunological memory. In preterm newborns, it is assumed that the immune system is less developed at birth, but little is known about the size and characteristics of lymphocyte subpopulations. Regulatory T cells (Tregs) have a crucial role in controlling the development of a healthy immune system including the maintenance of self-tolerance and, their absence, is responsible for the range of inflammatory and autoimmune manifestations observed in patients with IPEX (Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X-linked Syndrome). These cells are phenotypically characterized by the presence of the transcription factor Foxp3 (forkhead box P3) and by the high expression of the ? chain of the IL-2 receptor (CD25), as this cytokine is essential for the generation, maintenance and function of Treg cells. Little is known about the frequency of these cells in neonates, particularly in very and moderate preterm newborns and late preterm newborns studied as separate groups. Preliminary results from our group revealed greater ability of newborns to produce proinflammatory response compared to adults, which was further accentuated by the decreased production of IL-10, which suggests a reduced regulatory function. Thus, the aim of this study was to phenotypically characterize and quantify the population of Treg cells, by flow cytometry, in the cord blood of 15 preterm newborns born at 30-336/7 gestation weeks (Group 1), 19 preterm newborns born at 34-366/7 gestation weeks (Group 2) and 20 term newborns born at 37-41 gestation weeks (Group 3), all clinically healthy and adequate-for-gestational-age, compared to 26 healthy adults. The results demonstrated that there is an inverse correlation of the Treg frequency and gestational age, with significantly higher frequencies of CD4+CD25hiCD127loFoxp3+ Treg cells in Group 1 compared to Groups 2 and 3 and in Group 2 compared to Group 3, as well as significantly higher Treg frequencies and numbers in all the neonates compared to the adults. All of the newborns exhibited increased Treg frequencies with a naive phenotype compared to the adults. CTLA-4 expression in the naive Tregs was decreased in both preterm groups compared with those from term newborns and adults, as well as in the memory Treg cells from Group 1 compared with the other groups. The frequencies of alfa4beta7+ and alfa4beta1+ Tregs were higher in both preterm groups, but significantly different only in Group 1, when compared with those from the term newborns and the adults. In conclusion, high frequencies of Tregs were observed in term and preterm newborns, and these frequencies showed an inverse correlation with gestational age. These cells exhibited a naive profile when compared with adults, with high expression of CD45RA and alfa4beta7+ and lower expression of CTLA-4, implying a decreased function, particularly in very preterm newborns

Os tumores carcinoides típicos broncopulmonares (TCTB) são considerados neoplasias bem diferenciadas e as menos agressivas dentro do espectro dos tumores neuroendócrinos. Entretanto, metástases linfonodais e hematogênicas tem sido encontradas em número considerável de casos e não existem, até o momento, estudos relacionados aos mecanismos de escape imune tumoral em TCTB. Alguns trabalhos tem relacionado a expressão da enzima indoleamine 2,3-dioxigenase (IDO) em células neoplásicas como fator responsável pela aquisição de tolerância tumoral. Além disso, os níveis de infiltração linfocitária intratumoral parecem estar associados com prognóstico e sobrevida nesses tumores. O principal objetivo deste estudo foi determinar os níveis de expressão intratumorais da IDO e sua possível aplicação como marcador biológico de metástases em TCTB. Além disso, também foi estabelecido o padrão de infiltração linfocitária intratumoral e analisada sua provável correlação com os níveis de expressão da IDO. Portanto, realizou-se uma coorte retrospectiva multicêntrica no qual 64 pacientes submetidos à cirurgia de ressecção de TCTB entre 1981 e 2003 foram selecionados. O período de seguimento pós-operatório foi de 5 anos e a ocorrência de metástases linfonodais (hilar ou mediastinal) e hematogênicas foi avaliada através de tomografia computadorizada. Os níveis da expressão da IDO e de infiltração linfocitária intratumoral foram avaliados através de estudo imunohistoquímico. Os resultados obtidos mostraram que dos 64 pacientes selecionados, 17 (26.5%) apresentaram qualquer tipo de metátases durante o estudo: linfonodal, hematogênica ou ambas. A expressão da IDO foi encontrada em níveis diferentes de intensidade em mais de 80% das células dos TBCT. Entretanto, a análise univariada não mostrou nenhuma diferença significante na expressão da IDO entre grupos com e sem metástase (p=0,9 e p=0,3 pela análise semi-quantitativa e quantitativa, respectivamente). A quantificação dos linfócitos em todos os grupos estudados demonstrou predominância de linfócitos T CD8+, quando comparado aos linfócitos T CD4+(p< 0.01). Nenhuma diferença na infiltração intratumoral de linfócitos T CD8+ foi encontrada entre grupos com e sem metástase (p=0,98). Entretanto, a quantificação de linfócitos T CD4+ foi nula nos grupos com qualquer tipo de metástase (p=0,01), e nos casos com metástase linfonodal (p=0,02). Nenhuma correlação entre os níveis da expressão da IDO e da infiltração linfocitária intratumoral foi identificada nos grupos analisados (r= -0.2 e p=0,1 para ambos os grupos). Conclui-se que, a expressão intratumoral da IDO não apresenta correlação com a ocorrência de metástase nos TBCT. Apesar de nenhuma diferença ter sido identificada na infiltração intratumoral de linfócitos T CD8+ nos grupos com e sem metástase, a ausência de infiltração de linfócitos T CD4+ está associado à ocorrência do evento estudado. Estes linfócitos parecem conferir um efeito protetor evitando o escape tumoral / Typical bronchopulmonary carcinoid tumors (TBCT) are considered the less aggressive neoplasm within the spectrum of neuroendocrine tumors. However, regional nodes and haematogenic metastasis occur in a considerable rate and no data regarding immune escape mechanisms in these tumors are available. Some studies have implicated indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) expression in malignant cells as the responsible for tumor tolerance. Also, levels of tumor infiltrating lymphocytes (TILs) seem to be related with prognosis and survival. Our aim in this study was to determine intratumoral IDO expression levels and the value of this variable as a predictive marker of TBCT metastasis. Thus, TILs pattern was determined and correlation with intratumoral IDO expression analyzed. For this purpose, a multicenter retrospective cohort study was performed and 64 patients operated on for TBCT between 1981 and 2003 were enrolled. Follow-up period was 5 years and regional or haematogenic metastasis was assessed by computerized tomography (CT) scan. Levels of IDO expression and TILs were assessed by immunohistochemical study. The results obtained showed that of all 64 patients, 17 (26,5%) presented with any metastasis during the study: regional nodes, haematogenic or both. IDO expression was found in different intensity levels in over 80% of TBCT cells. However, univariate analysis showed no significant difference in IDO expression between groups with and without metastasis (p=0,9 and p=0,3 for semi-quantitative and quantitative analysis respectively). TILs quantification in all studied groups demonstrated predominance of CD8+ TILs when compared to CD4+ TILs (p<0,01). No difference in CD8+ TILs was found between groups with and without metastasis (p=0,98). However CD4+ TILs quantification was null in the groups with any metastasis (p=0,01), and regional nodes metastasis (p=0,02). No correlation between IDO expression levels and TILs was identified in all analyzed groups(r= -0,2 and p=0,1 for both groups). In conclusion, these data shows that intratumoral IDO expression do not correlate with TBCT metastasis. Even though no difference in CD8+ TILs between groups with and without metastasis was found, absence of CD4+ TILs is associated with the studied event. These cells seem to confer a protective effect against tumoral immune escape

O Papilomavírus humano (HPV) é provavelmente o agente mais prevalente das doenças sexualmente transmissíveis do trato genital.Este estudo foi realizado para comparar as prevalências de HPV nos 144 raspados penianos de homens HIV positivos e negativos.Utilizou PCR PGMY09/11 e hidridização em pontos. A prevalência de HPV nos indivíduos HIV positivo foi de 59% e no HIV negativo de 67%.A lesão aceto-branca pela peniscopia não demonstrou significativa positividade para HPV.Pacientes HIV positivo mostraram múltiplos tipos de HPV e os tipos oncogênicos (16/18) foram os de maior freqüência. Os HPV tipo 6/11 foram os mais freqüentes nos dois grupos. Observou-se maior prevalência de HPV nos HIV positivos com linfócitos T CD4 menor que 200 células/mm3. A carga viral plasmática do HIV não foi um fator de positividade para HPV / Genital tract human papillomaviruses (HPV) are probably the most prevalent sexually transmitted pathogens. This study is to compare HPV DNA prevalence in 144 penile smears, obtained from HIV positive and negative men. It was used PCR employing the PGMY09/11 generic HPV primers and dot blot hybridization. HPV prevalence was 59% in HIV positive men and 67% in HIV negative. Acetic white lesions by peniscopy did not show significant positive of HPV in neither HIV positive and negative groups. HIV positive men had more often multiple and oncogenic HPV types (16/18). HPV types 6/11 were more frequent in both groups. The HIV positive group with lower 200 T CD4 cell counts load reported more HPV prevalence. HIV load was not a positive factor for HPV

Mosquitos são os mais importantes vetores de patógenos humanos, transmitindo um amplo espectro de doenças infecciosas emergentes e reemergentes. Nesse cenário, o mosquito Aedes aegypti está entre as espécies mais relevantes. No presente estudo investigamos as atividades do extrato de glândula salivar (EGS) desse mosquito vetor na biologia das células dendríticas e dos linfócitos T. Nossos dados revelam que o EGS não interfere na diferenciação, maturação e função de células dendríticas murinas. Entretanto, componentes salivares desse mosquito possuem um efeito direto sobre linfócitos. O mecanismo de ação do EGS envolveu a apoptose de células T naïve, enquanto células de memória foram mais resistentes a essa atividade. Uma molécula com peso molecular acima de 400 kDa é provavelmente a responsável por esse efeito. Em conjunto, os resultados gerados por esse trabalho contribuem com a elucidação dos efeitos biológicos da saliva de Ae. aegypti na imunidade de seus hospedeiros e, conseqüentemente, seu papel na transmissão de doenças. / Mosquitoes are the most important vectors of human pathogens, transmitting a wide range of emerging and re-emerging infectious diseases. In this scenario, Aedes aegypti is a relevant mosquito species. In the present study, we have investigated the activities of the salivary gland extract (SGE) of this mosquito vector on the dendritic cell and T lymphocyte biology. Our data reveals that the SGE does not interfere on the differentiation, maturation and function of murine dendritic cells. However, salivary components of these mosquitoes have a direct effect on lymphocytes. The mechanism of action of SGE involved apoptosis of naïve T cells, while memory cells were more resistant to this activity. A molecule with molecular weight above 400 kDa is likely responsible for this effect. .Taken together, the results generated by this work contribute to the understanding of the biological effects of Ae. aegypti saliva on the host and, consequently, its role on the transmission of diseases.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-09-30T14:49:37Z No. of bitstreams: 1 regina_p_carvalho_ipec_pesquisaclinicadi_0005_2010.pdf: 1759534 bytes, checksum: 3ba01da2b81179270af6897d913fd20c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-30T14:49:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 regina_p_carvalho_ipec_pesquisaclinicadi_0005_2010.pdf: 1759534 bytes, checksum: 3ba01da2b81179270af6897d913fd20c (MD5) Previous issue date: 2010 / Fiocruz / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Introdução: A imunidade mediada por células tem um papel importante na resposta imune do hospedeiro à Leishmania. Em pacientes com leishmaniose cutânea, a presença de células ativadas tem sido correlacionada positivamente com o tamanho das lesões. Já a atividade citolítica de células T CD8 + vem sendo associada ao dano tecidual e à gravidade da forma mucosa. No entanto, não se sabe o perfil fenotípico induzido nas células de indivíduos clinicamente curados quando estes reencontram os antígenos de Leishmania. Objetivo: Identificar perfis imunológicos associados à cura clínica na leishmaniose cutânea, com foco na análise das características fenotípicas e funcionais de linfócitos T específicos para a Leishmania. Materiais e Métodos: Foram estudados 26 indivíduos curados de leishmaniose cutânea (LCC) divididos em dois grupos de acordo com o tempo de cura: (i) menor que 2 anos (<2 anos, n=13) e (ii) 2 a 5 anos (2-5 anos, n=13). Como grupo controle, foram utilizados 12 indivíduos sadios (IS) sem histórico prévio de leishmaniose. As células mononucleares do sangue periférico foram analisadas ex vivo e após cultivo in vitro na presença de antígenos de Leishmania (Ag-Lb). Foi analisada a expressão de moléculas de superfície relacionadas ao fenótipo dos linfócitos (CD3, CD4 e CD8), ao fenótipo funcional dos linfócitos de memória central (TMC) ou de memória efetora (TME) - (CCR7 e CD45RO), à ativação (CD69 e CD25), à citotoxicidade (C1.7) e à migração linfocitária (CLA). Essas moléculas foram avaliadas dentro da subpopulação de células T CD4+ e T CD8+. Resultados: A média da razão TCD4+/TCD8+ nos pacientes LCC foi similar nas células ex vivo e nas células estimuladas por Ag-Lb. Nos LCC, houve um aumento significativo do percentual de células CD25+ e CD69+ em T CD4+ e em T CD8+ após o estímulo com Ag-Lb. Houve uma correlação negativa entre o tempo de cura e o percentual de células T ativadas pelo antígeno (CD25 + e CD69+). Nos pacientes LCC, o percentual de linfócitos TME em CD4+ e CD8+ aumentou após o estímulo com Ag-Lb, quando comparado com as células ex vivo. Já o percentual de células TMC não se modificou. O percentual de células C1.7+ dentro de T CD8+ e de células CLA+ em T CD4+ e T CD8+ foi similar na análise de células ex vivo e após estímulo com Ag-Lb, em pacientes LCC. Nos IS, não foi observado aumento do percentual de células T para nenhuma das moléculas avaliadas, quando comparadas às células ex vivo e estimuladas com Ag- Lb. Conclusão: À medida que aumenta o tempo de cura clínica, há uma redução de moléculas associadas à ativação tanto em linfócitos T CD4+ quanto em T CD8+. Esses indivíduos apresentam um aumento de células de ME que poderiam participar no controle dos parasitos caso ocorra uma reinfecção. Além disso, as células expandidas não apresentaram moléculas de superfície relacionadas à citotoxicidade ou migração para a pele. Considerando que os pacientes curados possuem um padrão de resposta imunoprotetor, tal padrão pode ser considerado um parâmetro importante para a seleção de antígenos candidatos para uma vacina. / Introduction: The cell-mediated immunity plays an important role in the immune response of the host to Leishmania. In cutaneous leishmaniasis patients, the presence of activated cells has been positively correlated with lesion size. The cytolytic activity of T CD8+ cells has been associated with tissue damage and the severity of mucosal form. However, the phenotypic profile induced in cells of clinical cured individuals, when they are exposed to Leishmania antigens again, is not known. Objective: Identify imunological profiles associated with clinical cure in cutaneous leishmaniasis, with emphasis on phenotypical and functional characteristics of Leishmania-specific T cells. Materials and Methods: In the study, 26 individuals cured from cutaneous leishmaniasis (CCL) were divided in two groups according to the time of cure: (i) less than 2 years (<2 years, n=13) and (ii) from 2 to 5 years (2-5 years, n=13). As the control group, 12 healthy subjects (HS) without previous history of leishmaniasis were used. Peripheral blood mononuclear cells were evaluated ex vivo and after in vitro culture in the presence of Leishmania antigens (Lb-Ag). It was analysed the expression of surface molecules related with lymphocytes phenotype (CD3, CD4 and CD8), functional phenotype of central memory (TCM) or effector memory lymphocytes (TEM) - (CCR7 and CD45RO), activation (CD69 and CD25), citotoxicity (C1.7) and lymphocyte migration (CLA). These molecules were evaluated within subpopulations of CD4 + and CD8+ T cells. Results: The mean ratio T CD4+/T CD8+ in CCL patients was similar in ex vivo cells and in Lb-Ag stimulated cells. In CCL, there was a significant increase in the percentual of CD25 + and CD69+ in CD4+ and in CD8+ T cells after Lb-Ag stimulus. There was a negative correlation between the time of cure and the percentual of T cells activated by the antigen (CD25+ and CD69+). In CCL patients, the percentual of TEM lymphocytes in CD4+ and in CD8+ increased after Lb-Ag stimulus, when compared to ex vivo cells. The percentual of TMC cells has not altered. The percentual of C1.7+ cells within CD8+ T cells and CLA+ in CD4+ and in CD8+ T cells was similar to the analysis of ex vivo cells and after Lb-Ag stimulus, in CCL patients. In the HS, it was not observed an increase in the percentual of T cells in any of the molecules analised, when comparing ex vivo to Lb-Ag stimulated cells. Conclusions: As the time of cure increases, there is a decrease of molecules related to activation in both CD4+ and CD8+ T cells. These individuals present an increase in EM cells that could take part in the parasite control in case of reinfection. Moreover, expanded cells have not presented surface molecules related to citotoxicity or migration to skin. Considering that cured patients have a imunoprotective response profile, such profile should be considered as an important parameter for selection of antigen candidates for the development of a vaccine.