Resumo: Visando à contribuição ao estudo da oncologia e ao aumento da sobrevida de cadelas com neoplasias mamárias, o objetivo deste trabalho é investigar as possíveis alterações no gene supressor de tumor p53 em tumores de mama relacionando-as com a idade, raça, tipo histológico, número e localização da neoplasia, tempo de progressão e característica macroscópica do tumor (tamanho e presença de úlcera). Foram avaliadas 30 amostras de neoplasias de mama de cadelas. Este material foi distribuído em cinco grupos, de acordo com a classificação histopatológica do tumor (adenoma, tumor misto benigno, carcinoma, tumor misto maligno e sarcoma). O Grupo Controle compreendeu cinco amostras de tecido mamário sem alterações patológicas. As possíveis mutações existentes nos exons 5 a 8 do gene p53 foi analisado por meio da técnica de PCR (reação em cadeia de polimerase) e seqüenciamento. Foram observadas cinco mutações em neoplasias malignas e uma mutação em neoplasia benigna. Dessas mutações, todas eram "missense" e três delas eram do tipo "frameshift". Comparando as mutações com os outros parâmetros clínicos, concluiu-se que alterações em p53 devem ser originadas em um estágio inicial na carcinogênese mamária canina e mutações em p53 podem estar relacionadas com a malignidade do tumor. / Abstract: Aiming at the contribution for oncology's study and the improvement of survival time of bitches with mammary neoplasm, the purpose of this research is investigate the possible alterations in tumor suppressor gene p53 in mammary neoplasm, relating then with age, breed, tumor histologic classification, neoplasm location (which mammary gland and if they are unique or multiples), progression time and neoplasm macroscopic characteristic (size and ulceration presence). Thirty canine mammary neoplasm patterns were evaluated. This material was distributed in five groups according to histologic classification of the tumor (adenoma, benign mixed tumor, carcinoma, malignant mixed tumor and sarcoma). The Control Group included five mammary tissue patterns with no pathological alterations. Possible mutations at 5 to 8 exons within p53 gene was analyzed by the PCR technique ("Polymerase Chain Reaction") and sequencing. Five mutations were observed in malignant mammary neoplasm and one mutation in benign neoplasm. About these mutations, all were missense and three of them were frameshift. Comparing the mutations with the other clinical parameters, it was concluded that p53 alterations must be started in an initial stage in canine mammary carcinogenesis and p53 mutations can be related with the tumor malignancy. / Orientador: Carlos Roberto Daleck / Coorientadora: Janete Apparecida Desidério Sena / Banca: Renata Afonso Sobral / Banca: José Jurandir Fagliari / Mestre

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Les cellules Natural Killer (NK), actrices majeures de la vigilance anti-tumorale, sont modulées par des facteurs nutritionnels et métaboliques. L'inhibition de leur activité favorise le développement tumoral. Un régime alimentaire hypercalorique induisant l'obésité est un facteur de risque de développer un cancer du sein. Au niveau du micro-environnement tumoral mammaire, la biodisponibilité en certaines molécules contrôle non seulement les cellules néoplasiques mais, également les cellules immunes infiltrées. Ainsi, la leptine, sécrétée à forte concentration par les adipocytes mammaires, pourrait favoriser la croissance tumorale et altérer les cellules NK. L'arginine fortement consommée par les cellules tumorales et les cellules suppresseurs dérivées des myéloïdes pourrait faire défaut aux cellules NK. L'objectif de cette thèse est de caractériser les activités fonctionnelles et métaboliques des cellules NK en situation de stress nutritionnel. Dans un premier temps, nous avons exploré, in vivo, l'impact d'un régime hypercalorique sur l'activité des cellules NK et sur le développement tumoral mammaire. Ensuite, nous avons cherché à identifier les potentielles altérations fonctionnelles des cellules NK en mimant, in vitro, les conditions retrouvées au niveau du micro-environnement tumoral telles que la présence de concentration élevée en leptine et la déplétion en arginine. Des souris Balb-c "nude" femelles ont été soumises à un régime hypercalorique (HC) versus une diète normo-calorique (NC) pendant 6 mois. Au bout de 5 mois, des cellules tumorales mammaires (MCF-7 ; groupes NCT et HCT) ou le véhicule (groupes NC et HC) ont été implantés au niveau de la quatrième paire de glandes mammaires. Sous régime HC, le développement tumoral s'accompagne d'une perte de masse grasse, de masse maigre et de poids corporel avec un volume et un poids de tumeur augmentés. Cette diète induit au niveau tumoral une sur-expression des ARNm d'enzymes impliquées dans la glycolyse et une sous-expression des acteurs du cycle de Krebs. Sous régime HC, l'expression de la caspase 3 clivée et des récepteurs des oestrogènes β et de la progestérone est réduite alors que celle du Ki67 est accrue. Les cellules NK des souris HC ont une cytotoxicité diminuée. Bien que la présence de tumeur stimule l'activité lytique des cellules NK, la cytotoxicité de ces cellules reste inférieure dans le groupe HCT comparativement à celle du groupe NCT. La leptine stimule, in vitro, de façon dose-dépendante l'activité métabolique des cellules NK. A fortes concentrations, elle active leur cytotoxicité vis-à-vis des cellules cibles MDA-MB-231. Cet effet passe par une stimulation de l'expression de TRAIL et de l'IFN-γ par les cellules NK. En revanche, vis-à-vis des cellules cibles MCF7, les cellules NK présentent une activité lytique réduite en présence de fortes concentrations de leptine, probablement en lien avec une réduction de l'expression de la perforine. En réponse à une déplétion en arginine dans le milieu de culture, la prolifération et la cytotoxicité des cellules NK sont abaissées. L'altération de la reconnaissance des cellules cibles par les récepteurs NKp46 et NKp30, la moindre transmission du signal activateur par la chaine ζ et la faible production d'IFN-γ peuvent expliquer l'inhibition de la cytotoxicité des cellules NK. Ainsi, un apport énergétique élevé favorise le développement tumoral mammaire notamment eninhibant la cytotoxicité des cellules NK. De plus, la leptine à fortes concentrations stimule ou réduit, in vitro, la cytotoxicité des cellules NK selon la nature des cellules cancéreuses mammaires cibles. Une déplétion en arginine, in vitro, quant à elle, inhibe la prolifération et la cytotoxicité des cellules NK. Ces travaux contribuent à mieux comprendre l'impact du micro-environnement sur la réponse antitumorale des cellules NK. / Natural killer (NK) cells are critical mediators of anti-tumor immunity. A high-calorie diet inducing obesity is associated with breast cancer development. NK cells are modulated by dietary and metabolic factors and a decrease in their lytic activity promotes mammary tumor development. In the breast microenvironment, high concentration of leptin can be secreted by mammary adipocytes and thereby could stimulate tumor growth and control immune cells. Arginine, strongly consumed by tumor and myeloid-derived suppressor cells, could be lacking to NK cells. The aim of this work is to characterize the functional and metabolic activities of NK cells in response to nutritional stress. Initially, we explored in vivo the impact of a high-calorie diet on NK cells activity and mammary tumor development. Then, we identified potential functional alterations in NK cells by mimicking the conditions found in the tumor microenvironment such as the presence of high leptin concentration and arginine depletion. Female Balb-c nude mice were fed a high-caloric diet (HC) versus a standard caloric diet (SC) for 6 months. After five months, mammary tumor cells (MCF-7, SCT, HCT) or MatrigelTM (SC, HC) were implanted into the fourth mammary fat pads. The tumor development in HC diet-fed mice was associated with a decrease in body weight, body fat and lean mass and an increase in volume and weight of tumors. This diet induced tumor over-expression, at the transcriptional level, of enzymes involved in glycolysis and a down-expression of citrate cycle actors. Protein tumor levels of cleaved caspase 3, estrogen β and progesterone receptors were reduced while Ki67 was increased in the HC diet-fed mice. NK cell cytotoxicity of HC diet-fed mice was reduced. Although the presence of tumor stimulated NK cell lytic activity, this later was lower in the HCT group compared to the one of SCT mice. In vitro, leptin stimulated, in dose-dependent manner, the metabolic activity of NK cells. High leptin concentrations enhanced NK cell cytotoxicity against the MDA-MB-231 target cells. This phenomenon involved the increase of expression of TRAIL and IFN-γ in NK cells. However, against the MCF-7 target cells, NK cell lytic activity was reduced in the presence of high concentrations of leptin, probably in link to the decreased perforin expression. NK cell proliferation and cytotoxicity were impaired in response to arginine depletion. This inhibition of NK cell cytotoxicity could be linked to a low target cells recognition by NKp46 and NKp30, a reduced activating signal transmission by ζ chain and a low production of IFN-γ. Thus, high energy intake promotes mammary tumor development in particular by inhibiting NK cell cytotoxicity. In vitro, high leptin concentrations stimulate or reduce NK cell cytotoxicity according to the breast cancer cell targets. Furthermore, arginine depletion inhibits NK cell proliferation and cytotoxicity in vitro. These findings provide insight into the microenvironment impacts on NK cell antitumor response in tumor development.

An 53 Hündinnen aus dem Patientengut der Klinik für Kleintiere der Universität Leipzig, die mit Umfangsvermehrungen der Mamma vorgestellt und anschließend in der Klinik für Kleintiere operiert wurden, wurde präoperativ eine sonographische Untersuchung der Mamma durchgeführt. Darüber hinaus wurden die Mammarkomplexe von acht tragenden und einer laktierenden Hündin mit dieser Technik untersucht. Ziel war es, Kriterien zur Einschätzung der Dignität der Tumoren mit Hilfe dieser nichtinvasiven Methode zu erarbeiten. Es sollten die Fragen geklärt werden, ob mit Hilfe der hochauflösenden Sonographie eine Aussage über Gut- oder Bösartigkeit eines Herdes möglich ist und ob dabei dieselben Kriterien entscheidend sind, die in der Humanmedizin eine zuverlässige Differenzierung erlauben. Außerdem sollte überprüft werden, welchen Beitrag die farbkodierte Duplexsonographie oder Resistance- und Pulsatilitätsindex zur Charakterisierung von Mammatumoren der Hündin leisten. Die Gesamtzahl der in die Studie eingehenden Komplexe beträgt 114. Die sonographischen Untersuchungen erfolgten mit einem 14 MHz Matrix-Linearschallkopf. Bei 70 der 114 untersuchten Lokalisationen erfolgte zusätzlich zur B-Mode-Untersuchung eine Untersuchung mit der farbkodierten Duplexsonographie. Konnten mit Hilfe dieser Methode Gefäße in der Umfangsvermehrung nachgewiesen werden, wurde in 47 von 70 Fäl-len zusätzlich der PW-Doppler eingesetzt, um Flussspektren aus den dargestellten Gefäßen abzuleiten. Aus diesen wurden Resistance-Index und Pulsatilitätsindex bestimmt. Bei der retrospektiven Auswertung der Grauwertbilder aus der B-Mode-Untersuchung wurde für jeden Komplex die Ausprägung von 12 Parametern beurteilt. Die Bilder aus der farbkodierten Duplexsonographie lieferten zusätzlich Informationen zu Gefäßzahl, Gefäßdurchmesser und Gefäßverteilung innerhalb eines Tumors. Die Exstirpate wurden pathohistologisch untersucht. Die aus der Gewebetypisierung entsprechend der WHO-Klassifikation resultierenden Gruppen sind so klein, dass nur eine deskriptive statistische Auswertung möglich war. Es erfolgte die Zusammenfassung unterschiedlicher Gewebetypen zu den Gruppen der „malignen“ bzw. „benignen“ Tumoren. Für Malignität sprechen eine unregelmäßige Randkontur (32 von 61 malignen, 4 von 48 benignen Lokalisationen), eine Schallverstärkung (36/61 malignen, 9/48 benignen Lokalisationen) oder –auslöschung (8/61 malignen, 0 /48 benignen Lokalisationen) hinter dem Tumor, Verkalkungen (20/61 malignen, 6/48 benignen Lokalisationen) sowie ein unregelmäßiger Durchmesser der Tumorgefäße (25/61 malignen, 12/48 benignen Lokalisationen). Meist gutartig sind Umfangsvermehrungen der Mamma, denen sonographisch eine klare Abgrenzung zum umgebenden Gewebe fehlt (15/61 malignen, 36/48 benignen Lokalisationen). Außerdem solche mit indifferentem retroläsionalem Schallverhalten (17/61 malignen, 39/48 benignen Lokalisationen). Kombiniert man mehrere der Parameter miteinander, ist die resultierende Teilmenge der betreffenden Läsionen kleiner, die Aussagekraft höher. Für Bösartigkeit spricht beispielsweise eine Kombination von Verkalkung und unregelmäßiger Randkontur (13 von 61 malignen, 1 von 48 benignen Lokalisationen), Verkalkung und echodichtem Randsaum („deutlich“ oder „fraglich“; 9/61 malignen, 0/48 benignen Lokalisationen) sowie mittlerer Echodichte und retroläsionaler Schallverstärkung (21/61 malignen, 6/48 benignen Lokalisationen). Für Gutartigkeit sprechen mittlere Echodichte des Tumorzentrums in Kombination mit indifferentem Schallverhalten (13/61 malignen, 33/48 benignen Lokalisationen) sowie regelmäßiger Gefäßdurchmesser bei diffuser Gefäßverteilung (3/36 malignen, 14/29 benignen Lokalisationen). Es konnte dargestellt werden, dass sich mit Hilfe der hochauflösenden B-Mode-Sonographie Kriterien aufzeigen lassen, die tendenziell für Gut- oder Bösartigkeit eines Mammatumors sprechen. Dabei ist es zweckmäßig, mehrere Parameter in die Beurteilung einfließen zu lassen. Auch die farbkodierte Duplexsonographie kann dabei einen Beitrag leisten. Die Ermittlung von Resistance- und Pulsatilitätsindex hingegen erweist sich als nicht sinnvoll. Ein Parameter, welcher in der Humanmedizin eine entscheidende Rolle zur Unterscheidung bösartiger von gutartigen Tumoren der Mamma spielt ist die Randkontur eines Tumors. Dies ist das einzige Kriterium, das auch bei Mammatumoren der Hündin einen diagnostischen Nutzen aufweist. Anhand einzelner sonographischer Parameter ist es nicht möglich, die Dignität eines Tumors vorherzusagen. Die sonographische Untersuchung kann jedoch in einigen Fällen beim Abschätzen der Prognose helfen. / In 53 bitches that underwent surgery because of tumors of the mammary gland at the Department of small animal medicine of the University of Leipzig we carried out a preoperative ultrasonographic examination of the mammary gland. Furthermore eight pregnant and one lactating bitch were examined the same way. We aimed to find out, whether high-resolution ultrasound helps differentiate benign from malignant tumors. Also we wanted to evaluate criteria established for that purpose in human medicine. Use of colour-coded duplex sonography, resistance index and pulsatility index for this question are reassessed too. The total number of mammary complexes examined for this study is 114. A GE Logiq™ 9 with a 14 MHz linear array transducer was used for all examinations. Seventy of the 114 sites of mammary tissue underwent a colour-coded duplex sonography after the B scan. Blood vessels were detectet in 70 of the tumors. In 47 of these sites the PW-Doppler was used to gain flow patterns to achieve resistance- and pulsatility-index. The images were analysed retrospectively. In B scan images lesions were judged by 12 parameters. Additional information about number, diameter and distribution of vessels within a tumor was taken from the images of colour-coded duplex sonography. The excised complexes were evaluated pathohistologically. Only descriptive statistical analysis was possible because the resulting groups were very small after being sorted according to WHO-classification. Therefore the complexes of mammary glands were subsumpted into two groups – „malignant“ and „benign“ tumours. An irregular contour of the tumor (32 of 61 malignant, 4 of 48 benign tumors), signal enhancement (36/61 malignant, 9/48 benign tumors) or total shadowing (8/61 malignant, 0/48 benign tumors) behind the tumor, calcification (20/61 malignant, 6/48 benign tumors) and irregular vessel diameters (25/61 malignant, 12/48 benign tumors) are signs of malignancy. Tumors that miss a clearly detactable borderline (15/61 malignant, 36/48 benign tumors) and tumors with no signal alteration behind the tumor (17/61 malignant, 39/48 benign tumors) are benign more often. The combination of parameters reduces the number of adequate tumors and rises significance. A tumor showing an irregular contour and calcification (13/61 malignant, 1/48 benign tumors) is more likely to be malignant as well as a tumor of medium echodensity showing signal enhancement (21/61 malignant, 6/48 benign tumors). Tumors of medium echodensity without signal alteration behind the lesion (13/61 malignant, 33/48 benign tumors) and tumors with diffusely distributed vessels of regular diameter (3/36 malignant, 14/29 benign tumors) are more likely to be benign. It could be shown that high-resolution B scan parameters can help differentiate between malignant and benign tumors of the mammary gland, especially if they are used in combination with each other. Parameters from colour-coded duplex sonography can increase predicting value of B scan examinations too but there is no use of analysing resistance index or pulsatility index. One of the criteria established in human medicine ist the contour of a tumor. This parameter is of diagnostic use in mammary tumours of the bitch too. It is not possible to clearly predict the character of a tumor of the mammary gland of a bitch by only a few parameters based on a sonogram but sonographic examination can be helpful for assessing prognosis sometimes.

L'inflammasome est une plateforme moléculaire composée d'un récepteur de l'immunité innée tels que NLRP3 ou NLRP1b, de la protéine adaptatrice ASC et de la caspase-1. Il joue un rôle essentiel dans le déclenchement de la réponse inflammatoire via l'activation de la caspase-1 qui mène à la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telle que l'IL-1ß. Dans un premier axe de recherche, nous avons mis en évidence que les macrophages de souris déficientes pour ASC traités avec l'activateur de l'inflammasome NLRP1b, la toxine létale de bacillus anthracis, étaient capables de sécréter la forme mature de l'IL-1ß en absence de clivage de la caspase-1 pourtant décrit comme un événement indispensable à son activité. En reconstituant des macrophages caspase-1 KO avec une forme mutante non-clivable de la caspase-1, nous avons démontré que la forme entière de la caspase-1 est capable d'induire la sécrétion d'IL-1ß en réponse à la toxine létale alors qu'elle n'est pas fonctionnelle au sein de l'inflammasome NLRP3.Dans un second axe de recherche, mon travail de thèse s'est intéressé à comprendre le rôle de l'inflammasome au cours de la progression tumorale. En effet, l'IL-1ß est une cytokine fréquemment retrouvée dans le microenvironnement tumorale mammaire suggérant donc l'activation de l'inflammasome au sein des tumeurs. Au moyen d'un modèle de tumeurs in vivo, nous avons montré que l'absence de la caspase-1 et de ASC dans les cellules immunitaires chez la souris conduit à une réduction de la croissance tumorale. De plus, l'absence de ces deux protéines provoque également un plus fort recrutement et une meilleure activité des cellules NK au sein des tumeurs.En plus d'identifier un nouveau mécanisme d'activation de la caspase-1, mon travail de thèse a permis de mettre en évidence le rôle de l'inflammasome dans l'altération des cellules NK au cours de la progression tumorale mammaire. Ces données permettent d'envisager l'inflammasome comme une cible thérapeutique dans le cancer / The inflammasome is a molecular platform composed of an innate immune receptor such as NLRP3 or NLRP1b, of the adaptor protein ASC and of the caspase-1. It plays an essential role in triggering inflammatory response through the activation of caspase-1 that leads to the secretion of pro-inflammatory cytokines such as IL-1ß.In a first research axis, we showed that ASC deficient mice macrophages treated with an NLRP1b inflammasome activator, the lethal toxin of Bacillus anthracis, were able to secrete the mature form of IL-1ß in absence of any cleavage of caspase-1 previously described as an essential event for its function. By reconstituting caspase-1 KO macrophages with an uncleavable mutant form of caspase-1, we showed that the entire form of the protein is able to induce IL-1ß secretion upon lethal toxin treatment but is nonfunctional upon NLRP3 inflammasome activation.In a second research axis, my PhD work focused on underlying the inflammasome role during tumor progression. Indeed, IL-1ß is frequently found within breast tumor microenvironment suggesting that inflammasome is activated in tumors. Using in vivo tumor model, we showed that the absence of caspase-1 of ASC in immune cells lead to a delay tumor growth. In addition, the absence of these two proteins also causes a stronger recruitment and an enchanced activity of NK cells within mammary tumors

Canine Mammatumoren (CMT) sind eine der häufigsten Todesursachen bei Hündinnen (SIMON et al. 2001). Durch ihre periphere Lage sind zumeist nicht die Primärtumoren, sondern ihre Metastasen lebensbedrohlich, da diese häufig wichtige Organe wie Lunge Herz und Gehirn befallen (CLEMENTE et al. 2010). Aktuell angewandte Untersuchungsmethoden zur Erkennung von Metastasierung können entweder das invasive Wachstum beschreiben oder bereits bestehende Metastasen detektieren, jedoch fehlen bislang molekulare Marker, die frühzeitig und zuverlässig das metastatische Potential eines CMT anzeigen bevor Metastasen aufgetreten sind. Das Peptidhormon Relaxin ist in zahlreichen physiologischen und pathologischen Situationen beim Menschen als ein Induktor von Matrixmetalloproteinasen (MMP) bekannt (TOO et al. 1984; UNEMORI und AMENTO 1990; PALEJWALA et al. 2001; BINDER et al. 2002; KLONISCH et al. 2007; HENNEMAN et al. 2008). MMP sind Schlüsselenzyme des Bindegewebsabbaus, der jeder Metastasierung vorausgehen muss (WOODHOUSE et al. 1997). Bei der Frau ist im Blut messbares Relaxin ein Marker für metastatischen Brustkrebs (BINDER et al. 2004), für die Hündin scheint dagegen der Relaxinblutspiegel nicht aussagekräftig zu sein (SCHWEIZER 2010). Möglicherweise wird aber Relaxin lokal im caninen Mammagewebe exprimiert wie von GOLDSMITH et al. (1994) und SILVERTOWN et al. (2003) postuliert, so dass es wie in humanen Tumoren auto- oder parakrin Invasivität und Metastasierung (KLONISCH et al. 2007) fördern könnte. Daher sollte in der vorliegenden Arbeit die intratumorale Expression des Relaxins und seiner Rezeptoren sowie bekannter Faktoren des Bindegewebsabbaus untersucht und auf ihre prognostische Eignung überprüft werden. In zwei Studienabschnitten (LAMP et al. 2009; LAMP et al. 2011) wurden CMT-Gewebeproben von n=31 (LAMP et al. 2009) respektive n=59 Hündinnen (LAMP et al. 2011) mittels quantitativer Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) auf ihre Expression von Relaxin, seinen Rezeptoren, RXFP1 und RXFP2, sowie den Matrixmetalloproteinasen MMP-1, -2, -3, -9 und MMP-13, den Östradiolrezeptoren, ERα und ERβ, und dem Progesteronrezeptor (PR) analysiert. In beiden Studienabschnitten wurden die Plasmakonzentrationen der Hormone Relaxin, Östradiol und Progesteron auf mögliche Zusammenhänge mit der lokalen Genexpression überprüft. Im zweiten Studienabschnitt (LAMP et al. 2011) wurde darüber hinaus die Expression von Relaxin und RXFP1 auch immunhistologisch an n=9 CMT-Proben untersucht und in einer Multivarianzanalyse die prognostische Eignung aller untersuchten Parameter getestet. Die Expressionsanalyse konnte zeigen, dass CMT sowohl ein bisher unbekannter Ort der Relaxinexpression beim Hund sind als auch den Hauptrezeptor des Relaxins, RXFP1, exprimieren. Diese Ergebnisse der mRNA-Untersuchung ließen sich immunhistologisch bestätigen. Darüber hinaus ergab die immunhistologische Untersuchung, dass Relaxin vorwiegend im myoepithelialen Anteil der untersuchten CMT exprimiert wird. In den epithelialen CMT-Zellen fand sich die stärkste RXFP1-Reaktivität, so dass RXFP1 mit der von anderen Autoren beschriebenen MMP-2- und MMP-9-Expression in epithelialen Zellen kolokalisiert ist (PAPPARELLA et al. 1997; HIRAYAMA et al. 2002; PAPPARELLA et al. 2002). Die quantitativen Expressionsanalysen zeigten Korrelationen der Expressionsintensitäten von Relaxin, RXFP1 und MMP-2 auf. Die RXFP1 Expression war in dieser Studie sogar ein unabhängiger Marker für Metastasierung mit einem 15-fach höheren Risiko für Metastasierung für Patienten mit einer Expression oberhalb des studienspezifischen Cut-Offs. Alle untersuchten lokalen Genexpressionen waren von den systemischen Plasmakonzentrationen von Relaxin, Östradiol und Progesteron unabhängig. Die Resultate legen eine Bedeutung des intratumoral exprimierten Relaxins für eine auto- oder parakrine Steuerung der MMP-Expression, die für Invasivität und Metastasierung wichtig ist, nahe. Aufgrund des mRNA-Nachweises, der Kolokalisation der Proteine von RXFP1 und MMP-2 und -9 sowie der Korrelation der Genexpression von Ligand (Relaxin), Rezeptor (RXFP1) und Effektormolekül (MMP-2) ist es wahrscheinlich, dass CMT über das Relaxin eine autonome Steuerung ihrer Invasivität vornehmen können. RXFP1 scheint dabei eine Regulationsfunktion in der Relaxinsensibilität der CMT-Zelle zuzukommen, die in Zukunft durch die Messung der RXFP1-Expressionsintensität prognostisch nutzbar sein könnte. Zudem ist RXFP1 im CMT damit auch ein möglicher Ansatzpunkt für eine neue, auf Relaxinanaloga basierende, antimetastatische Therapie, die bereits an humanen Tumorzellen und in Mausmodellen erprobt wird (FENG et al. 2007; HOSSAIN et al. 2010). Durch den Nachweis von Relaxin und RXFP1 im CMT und ihre wahrscheinliche Relevanz für die Metastasierung ergeben sich somit neue Möglichkeiten für eine exaktere Prognose und verbesserte antimetastatische Therapie von CMT sowie die Chance, den Hund als Modell für die Erforschung Relaxin basierter Therapien des humanen Brustkrebses zu nutzen. / Canine mammary tumours (CMT) are one of the main reasons of death in female dogs (SIMON et al. 2001). Due to its peripheral location, it is normally not the primary tumour, but its metastases, which are life-threatening as they often impair the function of vital organs, such as lung, heart or brain (CLEMENTE et al. 2010). Currently used techniques for the detection of metastasis can either barely describe invasive growth patterns or detect already existing metastases. Molecular markers to determine the metastatic potential early and reliably, before metastatic spreading has occurred, are still lacking. The peptide hormone relaxin is well known as an inductor of matrix metalloproteinases (MMP) in numerous physiological as well as pathological situations in humans (TOO et al. 1984; UNEMORI und AMENTO 1990; PALEJWALA et al. 2001; BINDER et al. 2002; KLONISCH et al. 2007; HENNEMAN et al. 2008). MMP are key-enzymes of connective tissue remodelling which is a prerequisite for metastasis (WOODHOUSE et al. 1997). In women, the plasma relaxin concentration is a marker for metastatic breast cancer (BINDER et al. 2004). However, in dogs, the concentration of circulating relaxin seems to have no diagnostic value (SCHWEIZER 2010). But, possibly relaxin is expressed locally in the canine mammary tissue as postulated by GOLDSMITH et al. (1994) and SILVERTOWN et al. (2003) and it could therefore act as a pro-invasive and pro-metastatic factor in an auto- or paracrine manner as it does in various human tumours (KLONISCH et al. 2007). Thus, the present study should examine the intratumoural expression of relaxin and its receptors as well as factors of connective tissue remodelling and evaluate their prognostic abilities. In two sections of the study (LAMP et al. 2009; LAMP et al. 2011), CMT-tissue samples from n=31 bitches (LAMP et al. 2009) and n=59 bitches (LAMP et al. 2011), respectively, were analysed for their expression of relaxin, its receptors RXFP1 and RXFP2, MMP-1, -2, -3, -9 and MMP-13 as well as the oestradiol receptors ERα and ERβ and the progesterone receptor (PR) using quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR). Additionally, the plasma concentrations of the hormones relaxin, oestradiol and progesterone were tested for possible connections with the local gene expression. In the second section of the study, the expression of relaxin and RXFP1 was also examined immunohistologically in n=9 CMT tissue samples (LAMP et al. 2011) and the prognostic value of all parameters examined was assessed by a multivariate analysis. The expression analysis showed that CMTs are a novel site of expression of relaxin and its main receptor RXFP1 in the dog. These results were confirmed by the immunohistological examination. Moreover, the immunohistological analysis demonstrated that relaxin seems to be expressed mainly in myoepithelial cells. However, the strongest signals for RXFP1 were located in epithelial cells of the CMT, thus RXFP1 is colocalised with the expression of MMP-2 and MMP-9 reported in epithelial CMT-cells (PAPPARELLA et al. 1997; HIRAYAMA et al. 2002; PAPPARELLA et al. 2002). The quantitative expression analysis revealed correlations of expression intensities for relaxin, RXFP1 and MMP-2. The expression of RXFP1 presented as an independent marker for metastasis with a 15-fold risk increase for patients with an expression intensity above the study-specific cut-off. All local gene expressions examined where independent from systemic plasma concentrations of relaxin, oestradiol and progesterone. The results propose an important role for intratumourally expressed relaxin as an auto- or paracrine modulator of MMP expression, which is important for invasiveness and metastasis. Due to the mRNA detection, the protein colocalisation of RXFP1 with MMP-2 and MMP-9 as well as the correlation of gene expressions of the ligand (relaxin), the receptor (RXFP1) and the effector (MMP-2) it is highly probable that CMT can autonomously regulate their invasiveness via locally expressed relaxin. RXFP1 seems to have a regulatory function in the relaxin responsiveness of CMT cells, which may be of prognostical use in the future. In addition, RXFP1 is also a possible target for a novel antimetastatic therapy based on relaxin analoga which has been tested in human tumour cells and mice (FENG et al. 2007; HOSSAIN et al. 2010). The detection of relaxin and RXFP1 in the CMT and their probable relevance for metastasis could be a basis for a more precise prognosis of CMT, improved anti-metastatic therapies in the dog and the use of the dog as a model for relaxin-based therapies of human breast cancer.

An 53 Hündinnen aus dem Patientengut der Klinik für Kleintiere der Universität Leipzig, die mit Umfangsvermehrungen der Mamma vorgestellt und anschließend in der Klinik für Kleintiere operiert wurden, wurde präoperativ eine sonographische Untersuchung der Mamma durchgeführt. Darüber hinaus wurden die Mammarkomplexe von acht tragenden und einer laktierenden Hündin mit dieser Technik untersucht. Ziel war es, Kriterien zur Einschätzung der Dignität der Tumoren mit Hilfe dieser nichtinvasiven Methode zu erarbeiten. Es sollten die Fragen geklärt werden, ob mit Hilfe der hochauflösenden Sonographie eine Aussage über Gut- oder Bösartigkeit eines Herdes möglich ist und ob dabei dieselben Kriterien entscheidend sind, die in der Humanmedizin eine zuverlässige Differenzierung erlauben. Außerdem sollte überprüft werden, welchen Beitrag die farbkodierte Duplexsonographie oder Resistance- und Pulsatilitätsindex zur Charakterisierung von Mammatumoren der Hündin leisten. Die Gesamtzahl der in die Studie eingehenden Komplexe beträgt 114. Die sonographischen Untersuchungen erfolgten mit einem 14 MHz Matrix-Linearschallkopf. Bei 70 der 114 untersuchten Lokalisationen erfolgte zusätzlich zur B-Mode-Untersuchung eine Untersuchung mit der farbkodierten Duplexsonographie. Konnten mit Hilfe dieser Methode Gefäße in der Umfangsvermehrung nachgewiesen werden, wurde in 47 von 70 Fäl-len zusätzlich der PW-Doppler eingesetzt, um Flussspektren aus den dargestellten Gefäßen abzuleiten. Aus diesen wurden Resistance-Index und Pulsatilitätsindex bestimmt. Bei der retrospektiven Auswertung der Grauwertbilder aus der B-Mode-Untersuchung wurde für jeden Komplex die Ausprägung von 12 Parametern beurteilt. Die Bilder aus der farbkodierten Duplexsonographie lieferten zusätzlich Informationen zu Gefäßzahl, Gefäßdurchmesser und Gefäßverteilung innerhalb eines Tumors. Die Exstirpate wurden pathohistologisch untersucht. Die aus der Gewebetypisierung entsprechend der WHO-Klassifikation resultierenden Gruppen sind so klein, dass nur eine deskriptive statistische Auswertung möglich war. Es erfolgte die Zusammenfassung unterschiedlicher Gewebetypen zu den Gruppen der „malignen“ bzw. „benignen“ Tumoren. Für Malignität sprechen eine unregelmäßige Randkontur (32 von 61 malignen, 4 von 48 benignen Lokalisationen), eine Schallverstärkung (36/61 malignen, 9/48 benignen Lokalisationen) oder –auslöschung (8/61 malignen, 0 /48 benignen Lokalisationen) hinter dem Tumor, Verkalkungen (20/61 malignen, 6/48 benignen Lokalisationen) sowie ein unregelmäßiger Durchmesser der Tumorgefäße (25/61 malignen, 12/48 benignen Lokalisationen). Meist gutartig sind Umfangsvermehrungen der Mamma, denen sonographisch eine klare Abgrenzung zum umgebenden Gewebe fehlt (15/61 malignen, 36/48 benignen Lokalisationen). Außerdem solche mit indifferentem retroläsionalem Schallverhalten (17/61 malignen, 39/48 benignen Lokalisationen). Kombiniert man mehrere der Parameter miteinander, ist die resultierende Teilmenge der betreffenden Läsionen kleiner, die Aussagekraft höher. Für Bösartigkeit spricht beispielsweise eine Kombination von Verkalkung und unregelmäßiger Randkontur (13 von 61 malignen, 1 von 48 benignen Lokalisationen), Verkalkung und echodichtem Randsaum („deutlich“ oder „fraglich“; 9/61 malignen, 0/48 benignen Lokalisationen) sowie mittlerer Echodichte und retroläsionaler Schallverstärkung (21/61 malignen, 6/48 benignen Lokalisationen). Für Gutartigkeit sprechen mittlere Echodichte des Tumorzentrums in Kombination mit indifferentem Schallverhalten (13/61 malignen, 33/48 benignen Lokalisationen) sowie regelmäßiger Gefäßdurchmesser bei diffuser Gefäßverteilung (3/36 malignen, 14/29 benignen Lokalisationen). Es konnte dargestellt werden, dass sich mit Hilfe der hochauflösenden B-Mode-Sonographie Kriterien aufzeigen lassen, die tendenziell für Gut- oder Bösartigkeit eines Mammatumors sprechen. Dabei ist es zweckmäßig, mehrere Parameter in die Beurteilung einfließen zu lassen. Auch die farbkodierte Duplexsonographie kann dabei einen Beitrag leisten. Die Ermittlung von Resistance- und Pulsatilitätsindex hingegen erweist sich als nicht sinnvoll. Ein Parameter, welcher in der Humanmedizin eine entscheidende Rolle zur Unterscheidung bösartiger von gutartigen Tumoren der Mamma spielt ist die Randkontur eines Tumors. Dies ist das einzige Kriterium, das auch bei Mammatumoren der Hündin einen diagnostischen Nutzen aufweist. Anhand einzelner sonographischer Parameter ist es nicht möglich, die Dignität eines Tumors vorherzusagen. Die sonographische Untersuchung kann jedoch in einigen Fällen beim Abschätzen der Prognose helfen. / In 53 bitches that underwent surgery because of tumors of the mammary gland at the Department of small animal medicine of the University of Leipzig we carried out a preoperative ultrasonographic examination of the mammary gland. Furthermore eight pregnant and one lactating bitch were examined the same way. We aimed to find out, whether high-resolution ultrasound helps differentiate benign from malignant tumors. Also we wanted to evaluate criteria established for that purpose in human medicine. Use of colour-coded duplex sonography, resistance index and pulsatility index for this question are reassessed too. The total number of mammary complexes examined for this study is 114. A GE Logiq™ 9 with a 14 MHz linear array transducer was used for all examinations. Seventy of the 114 sites of mammary tissue underwent a colour-coded duplex sonography after the B scan. Blood vessels were detectet in 70 of the tumors. In 47 of these sites the PW-Doppler was used to gain flow patterns to achieve resistance- and pulsatility-index. The images were analysed retrospectively. In B scan images lesions were judged by 12 parameters. Additional information about number, diameter and distribution of vessels within a tumor was taken from the images of colour-coded duplex sonography. The excised complexes were evaluated pathohistologically. Only descriptive statistical analysis was possible because the resulting groups were very small after being sorted according to WHO-classification. Therefore the complexes of mammary glands were subsumpted into two groups – „malignant“ and „benign“ tumours. An irregular contour of the tumor (32 of 61 malignant, 4 of 48 benign tumors), signal enhancement (36/61 malignant, 9/48 benign tumors) or total shadowing (8/61 malignant, 0/48 benign tumors) behind the tumor, calcification (20/61 malignant, 6/48 benign tumors) and irregular vessel diameters (25/61 malignant, 12/48 benign tumors) are signs of malignancy. Tumors that miss a clearly detactable borderline (15/61 malignant, 36/48 benign tumors) and tumors with no signal alteration behind the tumor (17/61 malignant, 39/48 benign tumors) are benign more often. The combination of parameters reduces the number of adequate tumors and rises significance. A tumor showing an irregular contour and calcification (13/61 malignant, 1/48 benign tumors) is more likely to be malignant as well as a tumor of medium echodensity showing signal enhancement (21/61 malignant, 6/48 benign tumors). Tumors of medium echodensity without signal alteration behind the lesion (13/61 malignant, 33/48 benign tumors) and tumors with diffusely distributed vessels of regular diameter (3/36 malignant, 14/29 benign tumors) are more likely to be benign. It could be shown that high-resolution B scan parameters can help differentiate between malignant and benign tumors of the mammary gland, especially if they are used in combination with each other. Parameters from colour-coded duplex sonography can increase predicting value of B scan examinations too but there is no use of analysing resistance index or pulsatility index. One of the criteria established in human medicine ist the contour of a tumor. This parameter is of diagnostic use in mammary tumours of the bitch too. It is not possible to clearly predict the character of a tumor of the mammary gland of a bitch by only a few parameters based on a sonogram but sonographic examination can be helpful for assessing prognosis sometimes.

Animal models have been recognized for the valuable roles they serve in both animal and human medicine. Dogs share many of the same naturally occurring tumors as humans including osteosarcoma, lymphoma, and mammary tumors. In addition, dogs share the same environment as humans, have a shorter lifespan, and often have a quicker progression of disease, making them an attractive model of human disease. Platelets are small anucleate cell fragments that have essential roles in hemostasis, angiogenesis, and wound healing, and, more recently recognized, roles in development, survival, growth, and metastasis of various cancers. Their roles in angiogenesis has proven to be both directly and indirectly linked to tumor growth due to the angiogenic roles they play in the development of tumor blood supply. Being able to study the interactions and mechanisms between platelets and tumor cells at the protein level, through proteomics, would allow great insight into the effects of platelets on tumor cell behavior as well as potential biomarker identification and therapeutic development. The objective of this research is to integrate the roles of canine platelet proteins into a better understanding of the effects and interactions that platelets have with different tumor cells while utilizing the canine model of neoplasms commonly affecting their human counterparts. The first study in this research describes an efficient technique developed for the purification of canine platelets from clinically relevant volumes of whole blood with high platelet recovery and minimal contamination from other blood cells. The second study describes a non-electrophoretic detergent fractionation technique used for the digestion of canine platelet samples for proteomic analysis as well as description of the proteomic findings for the normal canine platelet. Lastly, the third study describes the proteomic analysis of proteins differentially expressed by canine osteosarcoma and mammary tumor cells following incubation with canine platelet lysate in vitro. Overall, findings of this research support the canine model of human cancers and provide comprehensive information regarding canine platelet proteomics as well as novel efficient techniques that aid the future of canine platelet-tumor cell interaction research

In recent years mammary cancer has been increasingly recognized in pet rabbits. In addition to uterine carcinomas—the most common tumor of female rabbits—mammary cancer can also markedly reduce the life expectancy of pet rabbits. The aim of this review is to raise awareness for these tumors and to report recent progress in related research. Their detailed characterization will likely improve medical care for affected rabbits. Moreover, study results will contribute to comparative pathology and may reveal if the rabbit is a suitable model for certain types of breast cancer in humans. Available information suggests that most invasive cancer cases develop through stepwise progression from non-invasive forms. Thus, early recognition will likely improve a complete cancer cure. So far, the only treatment option is surgical excision and prognostic factors are unknown. Recent investigations have identified tumor features with likely prognostic value. They have also revealed differences and similarities to mammary tumors in other species and breast cancer in women. Despite these initial data, continued research is necessary to gain more insights into the development of these tumors and their molecular features.