Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2016-11-21T15:56:00Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Keila Patrícia Almeida de Carvalho - 2016.pdf: 1984915 bytes, checksum: 0d6b814fa8ededd81b851b12fb3ff2f8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-11-21T20:25:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Keila Patrícia Almeida de Carvalho - 2016.pdf: 1984915 bytes, checksum: 0d6b814fa8ededd81b851b12fb3ff2f8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-21T20:25:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Keila Patrícia Almeida de Carvalho - 2016.pdf: 1984915 bytes, checksum: 0d6b814fa8ededd81b851b12fb3ff2f8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-10-14 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Introduction. Squamous cell carcinoma is the most common type of cervical cancer, followed by endocervical adenocarcinoma. Tumor staging is important to evaluate prognosis. Cervical infection by one of the oncogenic types of HPV, especially HPV 16 and 18 is a pre-requisite for developing invasive cancer. Epigenetics alterations, as DNA methylation, are well-known carcinogenic mechanisms. WIF1 is a tumor suppressor gene which silencing by methylation helps in neoplastic progression. Objective. The goal of this study was to evaluate staging, HPV genotypes and WIF1 methylation in cervical cancer and to test association between these variables with age, prognosis and survival. Methods. It was included 95 cases obtained in Araujo Jorge Hospital (Goiânia/ GO): 73 of invasive squamous cell carcinoma and 22 of invasive endocervical adenocarcinoma. DNA was extracted from paraffin-embedded biopsies using phenol-chloroform. HPV detection and genotyping were conducted using the kit INNO- LiPA HPV GENOTYPING EXTRA® (Innogenetics™). Methylation of WIF1 gene was evaluated by methylation-specific PCR (MSP). Odds Ratio was used to calculate statistical association. The calculation of survival used the Kaplan-Meier method and the log-hank test was used to compare means of survival and prognostic factors. A value of p<0.05 was considered statically significant. Results. There was significant association between tumor stages III and IV and worse prognosis (OR = 7.32). The 5-year overall survival was 79.1% and it was significant higher in cases with tumor stages I and II (p = 0.001). Women between 50 and 60 years had more chances having tumors in stages III and IV (OR = 0.15). Although, considering mean and median ages of women included, those over 51 years were more likely having tumor stages III and IV (OR = 5.92). No association was found between worse prognosis or lower survival and histological type, HPV infection and WIF1 methylation. Conclusion. Worse prognosis and lower survival was determined by tumor stages III and IV. / Introdução. O tipo histológico mais comum do câncer do colo do útero é o carcinoma de células escamosas, seguido pelos adenocarcinomas endocervicais. O estadiamento tumoral é importante para avaliar o prognóstico. A infecção da cérvice por um dos genótipos oncogênicos de HPV, especialmente os HPV 16 e 18, é pré-requisito para o desenvolvimento do câncer invasor. Alterações epigenéticas, como a metilação do DNA, são mecanismos conhecidos de carcinogênese. O gene WIF1 é supressor tumoral e seu silenciamento por metilação auxilia na progressão neoplásica. Objetivo. O objetivo desse estudo foi avaliar o estadiamento, genótipos de HPV e a metilação do gene WIF1 e testar a associação entre estas variáveis e a idade, o prognóstico e a sobrevida de mulheres com câncer do colo do útero. Métodos. Foram incluídos 95 casos obtidos no Hospital Araújo Jorge (Goiânia/GO) sendo 73 de carcinomas escamosos invasores e 22 de adenocarcinomas endocervicais invasores. O DNA foi extraído com fenol-clorofórmio dos materiais de biópsia incluídos em parafina e a detecção e genotipagem de HPV foram realizadas utilizando-se o kit INNO- LiPA HPV GENOTYPING EXTRA® (Innogenetics™). A análise de metilação do gene WIF1 foi realizada através da técnica PCR específica para metilação (MSP). As associações estatísticas foram feitas com cálculo de Odds Ratio e a sobrevida foi calculada pelo método de Kaplan-Meier, sendo a comparação das médias de sobrevida e os fatores prognósticos analisada pelo teste log-rank. Um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Resultados. Houve associação estatisticamente significante entre neoplasias diagnosticadas nos estágios III e IV e pior prognóstico (OR = 7,32). A sobrevida global em cinco anos foi de 79,1% e foi significativamente maior nos casos com estágios I e II (p = 0,001). Mulheres na faixa etária entre 50 e 60 anos idade mostraram-se com maior chance de serem portadoras de câncer do colo do útero em estágios I e II (OR = 0,15). Contudo, considerando a média e mediana da idade das mulheres incluídas, aquelas com idade acima dos 51 anos tiveram mais chance de serem diagnosticadas com câncer em estágios III e IV (OR = 5,92). Não houve associação significante entre tipo histológico, infecção por HPV ou metilação do gene WIF1 e pior prognóstico ou menor sobrevida. Conclusão. Pior prognóstico e menor sobrevida das mulheres foram determinados pelo estadiamento tumoral em III e IV.

Introdução: O câncer de pulmão (CP) é o tipo de câncer que mais mata no mundo e o cigarro ainda é sua causa mais importante. Além disso, a alimentação tem sido associada ao CP, por ser fonte de vitaminas e aminoácidos que fazem parte do metabolismo do carbono (MC). O MC é considerado mecanismo chave na manutenção da integridade do DNA e na regulação da expressão gênica, que, dessa forma, deve estar relacionado à carcinogênese. A ativação da imunidade está associada ao envelhecimento em indivíduos saudáveis, assim como a uma série de patologias, incluindo o câncer. Objetivo: Estudar como o MC, a ativação da imunidade e o tabaco estão relacionados ao risco de CP em um estudo caso-controle aninhado à coorte do EPIC (European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition). Métodos: Para avaliar se os níveis plasmáticos de cotinina são um bom biomarcador da exposição ao tabaco, foram utilizados modelos lineares generalizados. Para avaliar os efeitos do tabaco, do MC e da ativação da imunidade no risco de CP, foram aplicados modelos de equações estruturais (MEE) de duas maneiras diferentes (com e sem variáveis latentes). Resultados: Com base nas respostas aos questionários de qualidade de vida, com relação às questões sobre fumo ativo e passivo, a cotinina se mostrou um bom biomarcador de exposição recente ao tabaco (tanto o aumento da exposição passiva quanto ativa foram significativas, P<0,001 e P<0,001 respectivamente). Em um MEE com variáveis observadas, incluindo o MC e a via de ativação da imunidade, a metionina e o folato como causas proximais apresentaram uma forte e inversa associação com o risco de CP. O aumento em um desvio-padrão nos níveis séricos de metionina e de folato significou uma redução no risco de 19 por cento (P<0,01) e 12 por cento (P=0,03) respectivamente. Em um MEE com variáveis latentes (cada uma representando o conjunto de vitaminas e aminoácidos importantes para promover: metilação de DNA, síntese de núcletídeos e imune ativação), foram encontrados efeitos protetores diretos da metilação do DNA (P=0,018) e da imune ativação (P=0,037); por outro lado, a síntese de nucletídeos não apresentou efeito no risco do câncer (P=0,098). Nas duas abordagens de MEE o cigarro permaneceu como a causa de maior impacto. Conclusões: A cotinina mostrou-se um bom biomarcador da exposição ao tabaco (ativa e passivamente). Confirmou-se que a via de metilação é um fator de proteção contra o CP. A ativação da imunidade apresentou um efeito direto de proteção contra o CP no modelo com variáveis latentes, equanto que, a síntese de nucletídeos não apresentou relação com o CP. O tabaco continua sendo o fator de maior impacto no risco de CP / Background: Lung cancer (LC) continues to be the most common cancer death in the world. Tobacco exposure continues to be the most important cause. In addition, micronutrient intake has been linked to LC, because they are the main source of vitamins and amino acids involved in the one-carbon metabolism (OCM) which is considered key in maintaining DNA integrity, regulating gene expression, and may thus affect carcinogenesis. Immune activation is involved in the aging process in normal healthy individuals as well as in a number of pathologies, including cancer. Objectives: To investigate how OCM, immune activation and tobacco are related to LC incidence in a nested case-control study from the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC) cohort. Methods: To validate plasma cotinine levels as a good biomarker for tobacco exposure, a generalized linear model was applied. To evaluate the effects of tobacco, OCM and immune activation in LC, structural equation models (SEM) were applied in two different ways. Results: Based on questions about smoking, passive smoking and number of cigarettes smoked, it was shown that cotinine is a good biomarker for tobacco exposure (passive and active exposure with significant relation, p<0.001 and P<0.001, respectively). In a SEM model with only observed variables, including OCM and immune activation, methionine and folate as proximal causes presented a strong and inverse relation with LC risk. An increase in one standard deviation of serum levels of methionine and folate meant a 19 per cent (P<0.01) and 12 per cent (P<0.01) reduction in LC risk, respectively. In a SEM including latent variables (each one including vitamins and amino acids important to promote DNA methylation, nucleotide synthesis and immune activity), a direct and protective effect for DNA methylation (p=0.018) and immune activation was found (p=0.037), whereas nucleotide synthesis did not present a significant total effect. In both approaches of SEM, tobacco exposure remains with the highest impact on LC risk. Conclusions: It was found that cotinine is a good biomarker of tobacco exposure (active and passive). It was confirmed that methylation protects against LC. Immune activation presented a direct protective effect in the latent model, while nucleotide synthesis was not confirmed to be related to LC risk. Tobacco effect remains as the factor with highest impact in lung cancer

O imprinting genômico é um processo epigenético essencial para o desenvolvimento normal de mamíferos com placenta e refere-se à expressão gênica alelo-específica, de acordo com a origem parental. A expressão dos genes marcados por imprinting é controlada por regiões diferencialmente metiladas (DMRs), situadas em regiões controladoras de imprinting (ICRs). O cromossomo 29 de Bos taurus possui dois domínios cromossômicos semelhantes à região 11p15.5 de humanos, que são denominados KvDMR1 (na ICR2) e H19DMR (na ICR1). Essas ICRs controlam um cluster de genes importantes para o crescimento e desenvolvimento, sendo a KvDMR1 metilada no alelo materno e a e H19DMR metilada no alelo paterno. No presente trabalho, foi verificado o padrão de metilação da KvDMR1 e da H19DMR em oócitos não maturados (Vg) e maturados in vitro (MII) e nos blastocistos inicial (Bi) e expandido (Bx) bovinos e em placentas bovinas e humanas de primeiro trimestre. Foram coletados oócitos e embriões pré-implantação no estágio de blastocisto produzidos pela técnica de Fertilização in vitro. Também foram coletados o tecido placentário e de um feto bovino de 49 dias e de uma placenta humana, com idade gestacional de 12 semanas. O DNA genômico foi extraído e modificado com bissulfito de sódio. O padrão de metilação das regiões KvDMR1 e H19DMR foi verificado por meio de clonagem e seqüenciamento do DNA modificado com bissulfito de sódio. Para as análises de expressão gênica nos oócitos e blastocistos, foi realizada a extração do RNA e em seguida o cDNA foi produzido para a quantificação relativa da expressão gênica por meio da técnica de PCR em tempo real. Os resultados de metilação para a amostra controle de espermatozóide apresentaram um perfil hipometilado para a KvDMR1 e hipermetilado para a H19DMR. Os oócitos Vg e MII mostraram um perfil hipermetilado para a KvDMR1 e nos Bi e Bx foi observado um perfil hipermetilado e hipometilado, respectivamente. Para a H19DMR, foi observado um perfil hipermetilado para as amostras Vg e MII, sendo que para os Bi foi observado um perfil hipometilado e, para os Bx, um perfil monoalélico de expressão. A expressão dos genes LIT1 e IGF2 foi relativamente baixa nas amostras analisadas, sendo que o gene LIT1 foi expresso nos mesmos níveis para todas as amostras e o IGF2 não foi expresso nos Bi e Bx. Os oócitos MII apresentaram altos níveis de expressão do IGF2 quando comparados com os oócitos Vg. Nas placentas precoces de bovinos, a porcentagem de metilação para a KvDMR1 variou entre os cotilédones de 39,6%. e 88,9%. A porcentagem de metilação para a H19DMR nos cotilédones variou entre 35,0% e 57,0% , sendo que apenas uma amostra apresentava-se completamente demetilada para esta ICR. Nas análises das vilosidades humanas, foi observado um perfil hipermetilado em todas as amostras analisadas, em que as porcentagens de metilação para a KvDMR1 e H19DMR variaram entre 84,4% e 97,9%. Os resultados mostram um perfil alterado de metilação nos oóctios MII para as duas regiões analisadas, e uma alteração nas amostras de oócitos Vg para a H19DMR. Para os blastocistos, o esperado seria um perfil monoalélico para as duas regiões, no entanto, esse resultado só foi encontrado para os Bx na H19DMR. Em bovinos, as DMRs apresentaram um funcionamento antagônico, enquanto a KvDMR1 tende a uma hipermetilação a H19DMR tende a uma hipometilação. O resultado das análises comparativas das placentas bovina e humana não sugerem uma relação do padrão de metilação dessas regiões entre essas duas espécies, no entanto, servem de base para o conhecimento do imprinting na placenta. Os estudos nos oócitos e blastocistos realizados representam um passo inicial na investigação da influencia das tecnologias de reprodução assistida no desenvolvimento embrionário, sendo o primeiro relato do funcionamento dessas DMRs nas amostras de oócitos e embriões pré-implantação bovinos. / Genomic imprinting is an epigenetic process that plays an essential role in the development of placental mammals with a parent-of-origin-specific manner of gene expression, in which only one allele is expressed. The imprinted gene expression is controlled by differentially methylated regions (DMRs), located in imprinting control regions (ICRs). In Bos Taurus, chromosome 29 presents two imprinted domains similar to human 11p15.5 region which are named KDMR1 (in the ICR2) and H19DMR (in the ICR1). Several genes that play an essential role in growth and development are under the control of the ICRs, in which the KvDMR1 is methylated on the maternal allele and the H19DMR is methylated on the paternal allele. In this study, the DNA methylation status of the KvDMR1 and H19DMR was verified in bovine non-matured germinative vesicle (GV) in vitro matured (MII) oocytes, as well in early (EA) and expanded (EX) blastocysts, and in bovine and human early placenta. The oocytes and blastocysts were collected after in vitro fertilization (IVF) techniques. Tissues from bovine placenta and fetus with 49 days of gestational age and human placenta with 12 weeks of gestational age were also collected. The DNA was extracted and modified by sodium bisulfite. The methylation pattern of KvDMR1 e H19DMR was verified by cloning and bisulfite sequencing. RNA extraction and cDNA synthesis for the relative quantification of gene expression by real time PCR were performed for oocytes and blastocysts. The methylation profile for the control sample of sperm was hypomethylated for KvDMR1 and hypermethylated for H19DMR. The GV and MII oocytes showed a hypermethylated pattern for KvDMR1 and in the EA and EX was hypermethylated and hypomethylated, respectively. The H19DMR displayed a hypermethylated pattern for GV and MII oocytes. For EA was observed a hypomethylated profile and EX presented a monoallelic expression. The LIT1 and IGF2 gene expression were low for all samples, however the LIT1 had the same level of expression in all samples while the IGF2 was not expressed in EA and EX. The MII oocytes showed high levels of IGF2 gene expression when compared with GV oocytes. The methylation levels for KvDMR1 in bovine early placenta varied between the cotyledons (39,6% and 88,9%). The percentage of methylation for H19DMR in cotyledons varied between 57.0% to 35.0%. Only one sample was not methylated for this ICR1. In human villous, a hypermethylated profile was observed for all samples, and the percentage of methylation for KvDMR1 and H19DMR varied between 84.4% e 97.9%. The results show an altered methylation profile in MII oocytes for two analysed regions and an alteration of H19DMR in GV oocytes. The expected for blastocysts was a monoallelic profile for KvDMR1 and H19DMR, however these results were observed only in EX for H19DMR. In bovine, the methylation levels of KvDMR1 and H19DMR seems to work antagonistically. While the KvDMR1 tended to hypermethylation, the ICR1 tended to a hypomethylation. The comparative analysis of bovine and human early placentas does not suggest a relationship between the methylation patterns of these regions in these two species. However, these studies provide the basis for the understanding of imprinting in the placenta. The study in oocytes and blastocysts represent an initial investigation in understanding how the assisted reproductive technologies affect the embryo growth and development, and this is the first report on the methylation patterns of KvDMR1 and H19DMR in bovine oocytes and blastocysts.

A doença de Alzheimer (DA) é a causa mais comum de demência na população, sendo responsável por cerca de 50 a 60% dos casos. Embora o diagnóstico clínico da doença na maioria das vezes seja acurado, a confirmação da DA só é feita post mortem através principalmente da caracterização dos dois tipos principais de lesões neurais: depósitos extracelulares de placas de &beta; amiloide e emaranhados de proteína tau hiperfosforilada. Até o momento, o envolvimento de apenas quatro genes foi confirmado na etiologia da DA, três deles (APP, PSEN1 e PSEN2) associados à forma familial de herança mendeliana, que corresponde a um tipo raro e grave. No entanto, apesar de inúmeros trabalhos de associação genômica, (Genome wide association studies- GWAS) sugerirem uma possível participação de vários outros genes na suscetibilidade à manifestação da forma multifatorial da DA, o gene APOE, ainda é o único consistente e reproduzivelmente associado à doença. As descobertas derivadas dos GWAS investigando o papel de SNPs coletivamente explicam somente uma pequena porcentagem da variação herdada que contribui para o risco de desenvolver a DA. Atualmente, há novas abordagens para investigar a base genética do restante da variabilidade fenotípica herdada e que pode influenciar a suscetibilidade ao desenvolvimento de doenças complexas. O papel da variação do número de cópias de segmentos de DNA (Copy Number Variation - CNV) na genética de doenças complexas foi demonstrado por diversos estudos nos últimos anos e evidencia que desequilíbrios genômicos também podem contribuir significantemente para a resistência ou susceptibilidade a várias patologias. Outro aspecto que vem assumindo crescente importância é a análise de modificações epigenéticas que podem constituir um mecanismo molecular básico e contribuir diretamente para a patogênese da DA. Logo, este trabalho teve como objetivo principal investigar dois aspectos relacionados à DA: (1) a identificação de CNVs que podem estar contribuindo para o desenvolvimento da forma multifatorial da DA, usando a técnica de array-CGH, e (2) a análise de alterações do padrão global de metilação do DNA no córtex frontal de indivíduos com a forma multifatorial da DA, usando um microarranjo que interroga o status de metilação de 450.000 sítios CpGs. Em nossa investigação sobre desequilíbrios genômicos na DA, identificamos 6 CNVs raras com conteúdo gênico relevante para o fenótipo investigado. Dois indivíduos distintos do grupo DA apresentam microduplicações em genes que codificam diferentes subunidades do mesmo tipo de canal de Ca2+ dependente de voltagem, o tipo L. Além disso, dos outros genes selecionados como especialmente interessantes, 4 estão envolvidos em diferentes processos inflamatórios e 1 é responsável por codificar a enzima nicotinamida fosforibosiltransferase, participante importante da via de biossíntese da molécula nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD). A implicação de um possível envolvimento de mediadores da sinalização celular do Ca2+ e da via de biossíntese da NAD na etiologia da DA também foi reforçada pelos nossos resultados sobre o padrão de metilação do DNA na DA. Dois genes importantes para a homeostasia intracelular do Ca2+ e via de biossíntese da NAD apresentaram sítios CpGs diferenciamente metilados nos sujeitos com DA / Alzheimer\'s disease (AD) is the most common form of dementia in the population, corresponding to 50-60% of all cases. Although clinical diagnosis seems to be accurate, the definitive diagnosis of the disease can only be made by a post mortem neuropathological exam that certifies the presence of the two hallmarks of AD: the accumulation of extracellular senile plaques containing &beta;-amyloid (A&beta;) and the intracellular neurofibrillary tangles containing hyperphosphorylated tau protein. Four genes are known to be involved in the etiology of AD, three of them (APP, PSEN1 and PSEN2) are associated to the familial form of the disease, which show autosomal dominant inheritance and correspond to the more severe and rare type of AD. Despite many genome wide association studies (GWAS), APOE still remains the only unequivocal genetic risk factor associated to the multifactorial form of AD. The discoveries from GWAS using SNPs collectively explain only a small percentage of heritable variation that may contribute in AD risk. Currently, new approaches have been used to investigate the genetic basis of the phenotypical variability inheritance that can influence the susceptibility of complex diseases. The important role of DNA copy number variation (CNV) has been demonstrated by several studies over the last years and shows that genomic imbalances may also significantly contribute to resistance or susceptibility to various complex diseases. Additionally, there is now increasing interest in exploring how epigenetic modifications, in particular DNA methylation, could influence complex diseases etiology. Thus, the major aim of this work were to investigate two aspects related to the multifactorial form of AD: (1) identification of rare CNVs, using array-CGH, that could contribute to the development of the disease, and (2) analysis of the DNA methylation pattern in frontal cortex of individuals with AD. In our study, we identified 6 rare CNVs with relevant gene content to the investigated phenotype. Two distinct subjects with AD from our casuistic presented microduplications in genes that encode different subunits of the same type of Ca2+ voltage channel, the L-type. Furthermore, among the other selected genes, four are involved in different inflammatory process and one encodes the nicotinamide phosphoribosyltransferase enzyme, important mediator of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) biosynthesis. The implication of a possible involvement of Ca2+ intracellular signaling mediators and NAD biosynthesis pathway in the etiology of AD was also reinforced by our analysis of DNA methylation pattern. Interestingly, two important genes, one to intracellular Ca2+ homeostasis and the other to NAD biosynthesis pathway presented CpGs sites differently methylated in the AD subjects

Os tumores malignos hepáticos são raros nas crianças, sendo o tumor embrionário hepatoblastoma a neoplasia hepática mais comum em crianças abaixo dos 5 anos e, ainda assim, responsável por apenas 1% dos tumores incidentes nessa faixa etária. Devido, entre outros fatores, à sua baixa incidência, o hepatoblastoma é um tumor ainda pouco caracterizado a nível molecular. O presente trabalho contemplou três frentes de análises moleculares em hepatoblastomas: análise de alterações em número de cópias (através da técnica array-CGH), investigação de mutações somáticas em regiões codificadoras (sequenciamento de exoma por next-generation) e delineamento de perfil global de metilação de DNA (beadarrays). Encontramos um baixo número de alterações em número de cópias, na maioria ganhos de grande extensão cromossômica, evidenciando uma baixa instabilidade cromossômica em comparação ao encontrado em outros tumores sólidos de adultos. Uma região em 2q24 previamente associada a um pior prognóstico em hepatoblastomas foi encontrada como ganho de alta amplitude (amplicon). A análise de expressão gênica na área destacou 5 dos 48 genes como super-expressos em nossas amostras de hepatoblastomas (DAPL1, ERMN, GALNT5, SCN1A e SCN3A). Foi observada também uma baixa ocorrência de mutações somáticas não-sinônimas, quando comparada à magnitude de variações encontradas em outros tumores sólidos de adultos. Descrevemos uma nova mutação não-sinônima danosa no exon 3 do gene CTNNB1 (beta-catenina), marcador molecular de destaque em hepatoblastomas, que provavelmente desenvolve um papel importante na tumorigênese deste tipo de neoplasia. Dentre a lista de alterações somáticas encontradas, cabe destacar o enriquecimento da via Wnt, via da beta-catenina, já bem estudada em hepatoblastomas e que apresenta correlação tanto com desenvolvimento embrionário como com o processo de carcinogênese. Destacamos uma lista de mutações somáticas não-sinônimas presentes com boa cobertura em nossos experimentos, e ausentes ou presentes em baixa frequência (< 1%) na população. O presente estudo é o pioneiro na análise de alterações globais no padrão de metilação de citosinas em hepatoblastomas, e revelou um padrão incomum de hipometilação global nos tumores, não associado à metilação de regiões repetitivas LINE-1; especificamente, hepatobastomas apresentam um nível intermediário entre o encontrado para os fígados maduros e aquele encontrado para os fígados fetais. Tal achado dá suporte ao modelo no qual a tumorigênese do hepatoblastoma recapitularia fases do desenvolvimento fetal do fígado. Foram destacados 11 genes que apresentaram padrão de metilação de DNA diferencial em seus promotores. Em suma, nossos achados revelam que o tumor embrionário hepatoblastoma apresenta relativa estabilidade genética, com uma frequência menor de alterações (alterações em número de cópias e mutações somáticas em regiões codificadoras) que tumores sólidos de adultos. Simultaneamente, foi detectado um padrão marcante de hipometilação global de DNA associado ao tumor, evidenciando a importância de aspectos epigenéticos em sua tumorigênese / Hepatic malignant tumors are rare in children, the embryonal tumor hepatoblastoma is the most common liver cancer in children under 5 years old but, in spite of that, accounts for only 1% of incident tumors in this age group. Due to its low incidence, among other factors, hepatoblastoma is a tumor poorly characterized at molecular level. This study included three approaches of molecular analyzes in hepatoblastomas: examination of copy number alterations (through array-CGH technique), investigation of somatic mutations in coding regions (next-generation exome sequencing) and determination of the global DNA methylation profile (bead arrays). We found a low frequency of copy number alterations, mostly consisting of large extent chromosomal gains, reflecting lower chromosomal instability than other solid adult tumors. A region at 2q24, previously associated with worse prognosis in hepatoblastomas, was found amplified in high amplitude (amplicon). Gene expression analysis of the 48 genes comprised in the amplicon segment highlighted five genes as overexpressed (DAPL1, ERMN, GALNT5, SCN1A and SCN3A). We also observed a low frequency of non-synonymous somatic mutations in our hepatoblastomas samples compared to the amount of variation found in other adult solid tumors. We described a predicted harmful non-synonymous mutation in exon 3 of CTNNB1 gene (beta-catenin), the best characterized molecular marker in hepatoblastomas. The list of somatic alterations points to a remarkable enrichment of genes from the Wnt pathway, which is well-studied in hepatoblastomas and is associated both with embryonic development and with the process of carcinogenesis. We highlighted a list of non-synonymous somatic mutations that presented high coverage in our experiments, and were absent or present at low frequency (<1%) in the general population. This study is the first to analyze global changes in cytosine methylation in hepatoblastomas, and revealed an unusual pattern of global hypomethylation in these tumors, not associated with LINE-1 repetitive regions; specifically, hepatobastomas exhibited an intermediate level of methylation, in between the patterns of mature and fetal livers. This finding supports the model in which the oncogenesis of hepatoblastoma recapitulates stages of fetal liver development. We highlighted 11 genes that showed differential pattern of DNA methylation in their promoters compared to differentiated liver. In summary, our findings show that the embryonal tumor hepatoblastoma are relatively genetically stable with lower frequency of alterations (changes in copy number and somatic mutations in coding regions) than most solid adult tumors. Simultaneously, a clear pattern of global hypomethylation of non-repetitive DNA was associated with the tumor, indicating the importance of epigenetic aspects in its tumorigenesis

A esquizofrenia é uma desordem altamente incapacitante que atinge cerca de 1% da população, envolvendo desequilíbrio da neurotransmissão dopaminérgica e uma hipofunção glutamatérgica. Portadores dessa doença apresentam deficiência do processamento de informações caracterizada por prejuízo no teste de inibição pré-pulso (prepulse inhibition - PPI). Essa condição pode ser reproduzida em modelos experimentais, pelo tratamento com psicoestimulantes, como a anfetamina (ANF) e atenuado/revertido pelo tratamento com antipsicóticos. O canabidiol (CBD) é o principal componente não psicotomimético da Cannabis sativa. Estudos clínicos e pré-clínicos sugerem que o CBD apresenta perfil antipsicótico, com baixa indução de efeitos adversos. Contudo, até o momento poucos estudos foram realizados com o objetivo de investigar os mecanismos farmacológicos e/ou moleculares envolvidos nesse perfil. Os prováveis mecanismos envolvidos com as propriedades antipsicóticas do CBD parecem envolver a ativação de receptores TRPV1 e o aumento da sinalização do endocanabinoide anandamida. No presente estudo, demonstramos que os receptores TRPV1 e o aumento da disponibilidade de anandamida parecem participar do perfil antipsicótico do CBD. Nessas investigações, não observamos participação dos receptores 5-HT1A. A microinjeção de CBD no córtex pré-frontal (CPF), estrutura envolvida com a fisiopatologia da esquizofrenia e um provável sítio para ação de antipsicóticos, não atenuou o prejuízo induzido por ANF no PPI. Recentemente, mecanismos epigenéticos, como a metilação do DNA, têm sido associados à fisiopatologia da esquizofrenia. Nesse sentido, avaliamos o envolvimento da metilação do DNA em estruturas envolvidas com a neurobiologia da esquizofrenia regulada por CBD, sobre as respostas comportamentais induzidas por drogas psicotomiméticas. Verificamos que a ANF causa um aumento da metilação global no estriado ventral, efeito bloqueado pelo pré-tratamento com CBD e de forma semelhante com o antipsicótico clozapina (CLZ). Não observamos alterações na metilação global no CPF. O tratamento com MK-801 não alterou a metilação global nas duas estruturas anteriormente citadas. Protocolo experimental semelhante foi utilizado em mais duas abordagens: (i) a expressão do fator neurotrófico do cérebro (BDNF), relacionado com a manutenção, crescimento e diferenciação dos neurônios está aumentada no hipocampo dos animais tratados com a associação CBD e ANF, padrão semelhante foi observado com a associação CLZ e ANF. (ii) a expressão de fosfo-histona acetilada, um marcador que indica alterações na cromatina, intimamente ligada com as alterações da expressão gênica está aumentada no núcleo acumbens e CPF dos animais tratados com a associação CBD e ANF. Os dados aqui apresentados sugerem que os receptores TRPV1 e o endocanabinoide anandamida parecem estar envolvidos com o perfil antipsicótico do CBD. Pela primeira vez foi demonstrado que tanto o pré-tratamento com CBD ou CLZ podem alterar o aumento da metilação global de DNA induzido por ANF. Além disso, a expressão de BDNF no hipocampo e a expressão de fosfo-histona acetilada podem ser outros mecanismos que merecem atenção em relação ao perfil antipsicótico do CBD. / Schizophrenia is a highly disabling disorder that affects about 1% of the population and involves impaired dopaminergic neurotransmission and glutamatergic hypofunction. Patients with this disorder have a deficiency in information processing characterized by disruption in the prepulse inhibition (PPI) test. This condition can be reproduced in experimental models by treatment with psychostimulants such as amphetamine and attenuated / reversed by treatment with antipsychotics. Cannabidiol (CBD) is the main non-psychotomimetic component of Cannabis sativa. Clinical and preclinical studies suggest that CBD has an antipsychotic profile, with low induction of adverse effects. However, to date, few studies have been carried out to investigate the pharmacological and / or molecular mechanisms involved in this outcome. The likely mechanisms involved with the antipsychotic properties of CBD appear to involve activation of TRPV1 receptors and increased endocannabinoid anandamide signaling. In the present study, we demonstrated that TRPV1 receptors and the increased availability of anandamide appear to participate in the CBD antipsychotic profile. In these investigations, we did not observe participation of 5-HT1A receptors. Microinjection of CBD in the prefrontal cortex, structure involved in the pathophysiology of schizophrenia and a probable site of antipsychotic action, did not attenuate the amphetamine-induced disruption in PPI. Recently, epigenetic mechanisms, such as DNA methylation, have been associated with the pathophysiology of schizophrenia. In this sense, we also evaluated the involvement of DNA methylation in structures involved with the neurobiology of CBD-regulated schizophrenia on behavioral responses induced by psychotomimetic drugs. We found that amphetamine causes increased global methylation in the ventral striatum, an effect blocked by pre-treatment with CBD and similarly with the antipsychotic clozapine. We did not observe changes in the global methylation in prefrontal cortex. Treatment with MK-801 did not alter the global methylation in the two aforementioned structures. Similar experimental protocol was used in two other approaches: (i) brain neurotrophic factor (BDNF) expression, related to the maintenance, growth and differentiation of neurons is increased in the hippocampus of animals treated with CBD and amphetamine; a similar pattern was observed with the association clozapine and amphetamine. (ii) the expression of acetylated phospho-histone, a marker indicating changes in chromatin, closely linked to changes in gene expression is increased in the nucleus acumbens and CPF in animals treated with the CBD and amphetamine combination. The data presented here suggest TRPV1 receptors and the endocannabinoid anandamide seem to be involved with the antipsychotic profile of CBD. For the first time it has been shown that both pre-treatment with CBD or clozapine may alter the increase in overall DNA methylation induced by amphetamine. In addition, the expression of BDNF in the hippocampus and the expression of acetylated phospho-histone may be different mechanisms that deserve attention in relation to the antipsychotic profile of CBD.

O câncer configura uma das maiores causas de mortalidade no mundo, caracterizando-se como uma doença complexa orquestrada por alterações genômicas e epigenômicas capazes de alterar a expressão gênica e a identidade celular. Nova evidência obtida por meio de um estudo genômico em larga escala e cujos dados encontram-se disponíveis no banco público do TCGA sugere que um em cada dez pacientes portadores de câncer pode ser classificado com maior eficácia tendo como base a taxonomia molecular quando comparada à histologia. Dessa maneira, nós hipotetizamos que o estabelecimento de mapas genômicos exibindo a localização de sítios de ligação de fatores de transcrição combinada à identificação de regiões diferencialmente metiladas e perfis alterados de expressão gênica possa nos auxiliar a caracterizar e explorar, ao nível molecular, fenótipos associados ao câncer. Avanços tecnológicos e bancos de dados públicos a exemplo do The Cancer Genome Atlas (TCGA), The Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) e o NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium (Roadmap) têm proporcionado um recurso inestimável para interrogar o (epi)genoma de linhagens de células tumorais em cultura, bem como de tecidos normais e tumorais em alta resolução. Todavia, a informação biológica encontra-se armazenada em diferentes formatos e não há ferramentas computacionais para integrar esses dados, evidenciando um cenário atual que requer, com urgência, o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática e softwares capazes de direcionar a solução deste obstáculo. Nesse contexto, o objetivo principal deste estudo consiste em implementar o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática, na linguagem de programação R que, ao final do estudo, será submetido à comunidade científica do projeto Bioconductor sob a licença de código aberto GNU GPL versão 3. Além disso, ajudaremos nossos colaboradores com o aperfeiçoamento do ELMER, um pacote R/Bioconductor que identifica elementos reguladores usando dados de expressão gênica, de metilação do DNA e análise de motivo. Nossa expectativa é que essas ferramentas possam automatizar com acurácia a pesquisa, o download e a análise dos dados (epi)genômicos que se encontram atualmente disponíveis nas bases de dados públicas dos consórcios internacionais TCGA, ENCODE e Roadmap, além de integrá-los facilmente aos dados genômicos e epigenômicos gerados por pesquisadores por meio de experimentos em larga escala. Além disso, realizaremos também o processamento e a análise manual dos dados que serão automatizados pelas ferramentas, visando validar sua capacidade em descobrir assinaturas epigenômicas que possam redefinir subtipos de câncer. Por xi fim, as usaremos para investigar as diferenças moleculares entre dois subgrupos de gliomas recentemente descobertos por nosso laboratório. / Cancer, which is one of the major causes of mortality worldwide, is a complex disease orchestrated by aberrant genomic and epigenomic changes that can modify gene regulatory circuits and cellular identity. Emerging evidence obtained through high-throughput genomic data deposited within the public TCGA international consortium suggests that one in ten cancer patients would be more accurately classified by molecular taxonomy versus histology. Therefore, we have hypothesized that the establishment of genome-wide maps of the de novo DNA binding motifs localization coupled with differentially methylated regions and gene expression changes might help to characterize and exploit cancer phenotypes at the molecular level. Technological advances and public databases like The Cancer Genome Atlas (TCGA), The Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE), and The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium (roadmap) have provided unprecedented opportunities to interrogate the epigenome of cultured cancer cell lines as well as normal and tumor tissues with high resolution. Markedly however, biological information is stored in different formats and there is no current tool to integrate the data, highlighting an urgent need to develop bioinformatic tools and/or computational softwares to overcome this challenge. In this context, the main purpose of this study is the development of bioinformatics tools in R programming language that will be submitted to the larger open-source Bioconductor community project under the GNU GPL3 (General Public License version 3). Also, we will help our collaborators improve of the R/Bioconductor ELMER package that identifies regulatory enhancers using gene expression, DNA methylation data and motif analysis. Our expectation is that these tools can effectively automate search, retrieve, and analyze the vast (epi)genomic data currently available from TCGA, ENCODE, and Roadmap, and integrate genomics and epigenomics features with researchers own high-throughput data. Furthermore, we will also navigate through these data manually in order to validate the capacity of these tools in discovering epigenomic signatures able to redefine subtypes of cancer. Finally, we will use them to investigate the molecular differences between two subgroups of gliomas, one of the most aggressive primary brain cancer, recently discovered by our laboratory.

Os genes de receptores olfatórios (OR) pertencem a uma família de proteínas de membrana formada por cerca de 1000 genes no genoma de camundongo. Os genes OR são expressos de forma monogênica e monoalélica nos neurônios olfatórios (OSNs). No entanto, ainda não está claro o mecanismo que permite essa forma de expressão peculiar, sobretudo, qual o papel da metilação de DNA nesse processo. Nosso estudo determinou o padrão de metilação de DNA da região promotora e codificadora do gene Olfr17. Em células de epitélio olfatório (MOE) de camundongos adultos, observamos na região codificadora (CDS) do gene uma frequência de metilação em dinucleotídeos CpG 58%, enquanto que na sua região promotora ela foi bem mais baixa. Os níveis de metilação do Olfr17 em MOE de embrião (E15.5) e fígado foram similares aos observados em MOE de animais adultos. Em seguida, analisamos se a metilação de DNA pode regular a expressão gênica do Olfr17. Utilizando animais transgênicos onde os neurônios olfatórios que expressam Olfr17 também expressam GFP, pudemos selecionar neurônios olfatórios GFP+ e analisar a metilação do gene Olfr17, que está ativo nestas células. Verificamos que o padrão geral de metilação do Olfr17, tanto na região CDS como na região promotora, não se altera quando este gene está ativo. Este resultado indica que alterações na metilação do gene Olfr17 não são necessárias para que este receptor seja expresso. Finalmente, verificamos que a região promotora do gene Olfr17, de duas linhagens de camundongos diferentes, a C57BL/6 e a 129, possuem dois polimorfismos de base única (SNPs) que alteram o conteúdo CpG. Devido a estes SNPs, a linhagem 129 apresenta dois sítios CpG adicionais, inexistentes na linhagem C57BL/6. Nossas análises mostraram que estes CpGs são frequentemente metilados, o que torna o promotor do Olfr17 de 129 significativamente mais metilado que o promotor de C57BL/6. Em seguida, nós analisamos o nível de expressão no MOE dos dois alelos de Olfr17, o 129 e o C57BL/6, utilizando ensaios de RT-qPCR. Estes experimentos demonstraram que o nível de expressão do alelo 129, que possui 3 CpGs metiladas em seu promotor, é menor que o do alelo C57BL/6, que apresenta apenas uma CpG que é pouco metilada em seu promotor. Nossos resultados sugerem que as alterações na região promotora influenciam a probabilidade com que o gene OR é escolhido para ser expresso no MOE. / Olfactory receptor (OR) genes belong to a large family of membrane proteins composed of 1000 genes in the mouse genome. The OR genes are expressed in the olfactory sensory neurons (OSNs) in a monogenic and monoallelic fashion. However, the mechanisms that govern OR gene expression are unclear. Here we asked whether DNA methylation plays a role in the regulation of OR gene expression. We first determined the DNA methylation pattern in the coding (CDS) and promoter regions of the odorant receptor gene Olfr17. In olfactory epithelium (MOE) cells, the CpG methylation level in the CDS is 58% but is much lower in the promoter region of the gene. In embryonic MOE (E15.5) and liver, the levels of Olfr17 DNA methylation are similar to the ones shown in adult MOE. We next analyzed whether DNA methylation is involved in Olfr17 regulation. We isolated GFP+ neurons from transgenic mice that coexpress GFP with Olfr17, and analyzed the DNA methylation pattern of the Olfr17, which is active in these cells. We found that the general methylation pattern, both, in the coding and promoter regions is not altered in the active gene. These results indicate that changes in DNA methylation are not required for the activation of Olfr17. Finally, we found that the Olfr17 promoter region from two different mouse strains, C57BL/6 and 129, has two single-nucleotide polymorphisms (SNPs) that alter the CpG content. The SNPs lead to the existence of two additional CpGs in the 129 allele, which are absent in the C57BL/6 allele. These CpGs are frequently methylated, making the 129 Olfr17 promoter significantly more methylated than the Olfr17 promoter from C57BL/6. We next performed RT-qPCR experiments to analyze the expression levels of the 129 and C57BL/6 Olfr17 alleles in the MOE. These experiments showed that the expression level of the 129 Olfr17 allele, which contains three methylated CpGs in its promoter region, is lower than the one from C57BL/6, which contains only one, undermethylated CpG, in its promoter. Our results suggest that these promoter modifications regulate the probability of the OR gene choice.

Introdução: Apesar da identificação de fatores prognósticos clínicos e patológicos, muitos pacientes portadores de carcinoma de células renais (CCR) apresentam metástases ao diagnóstico e outros irão desenvolver recorrência local ou à distância durante o seguimento. Novos fatores prognósticos e de origem molecular têm sido avaliados no CCR, destacando-se o PTEN como um dos principais genes envolvidos na carcinogênese renal. Objetivos: Avaliar os fatores clínicos e anatomopatológicos mais significativos nas taxas de sobrevida, identificar a frequência de hipermetilação do gene PTEN através da técnica do pirosequenciamento, o impacto da hipermetilação do gene nas taxas de sobrevida global (SG) e livre de doença (SLD), como também, a associação da presença de hipermetilação com os principais fatores prognóticos. Material e métodos: Foram avaliados 137 pacientes portadores de CCR submetidos a tratamento cirúrgico do tumor primário entre 1997 e 2009. Foram considerados os dados epidemiológicos, clínicos, anatomopatológicos, de estadiamento (TNM 2004) e os obtidos da reação de pirosequenciamento. Resultados: O tempo de seguimento médio foi de 32,3 meses e mediana de 28,8 meses. Considerando o estadimento clínico, foram fatores independentes para a SG: idade (p<0,01), ASA (p=0,02), margens cirúrgicas (p=0,04), grau de Fuhrman (p=0,01), estádio clínico (p<0,001) e subtipo histológico (p<0,01). No modelo múltiplo a SLD foi influenciada únicamente pelo estádio clínico (p<0,001). Dos 137 casos analisados, hipermetilação do gene foi detectada em cinco casos (3,6%). Devido a baixa freqüência detectada optou-se por não realizar a associação da metilação do PTEN com os fatores prognósticos. Em relação às taxas de SG e SLD, de acordo com o perfil de hipermetilação do PTEN, não houve a ocorrência de nenhum evento, ou seja, morte, morte por CCR ou recorrência da doença para os cinco casos que apresentavam hipermetilação. Conclusões: A hipermetilação do xv PTEN foi detectada com baixa frequência, sugerindo a participação de outros genes ou mecanismos moleculares diferentes da metilação na inativação deste gene frequentemente envolvido na carcinogênese renal. As taxas de sobrevida não foram influenciadas pelo perfil de hipermetilação do PTEN, permanecendo o estadiamento clínico do TNM como a principal variável determinante da evolução e do risco de recidiva pelo CCR / Introduction: Despite the identification of clinical and pathological prognostic factors, many patients with renal cell carcinoma (RCC) have metastases at diagnosis and others will develop local or distant recurrence during follow-up. New prognostic factors and of molecular origin have been evaluated in RCC, highlighting PTEN, one of the main genes involved in renal carcinogenesis. Objetives: To assess the most significant clinical and pathological factors in survival rates, and identify the frequency of hypermethylation of the PTEN gene by the pyrosequencing technique, the impact of gene hypermethylation on overall survival (OS) rates and disease free interval (DFS), as well as associating presence of hypermethylation with main prognostic factors. Methods: We evaluated 137 patients with RCC that underwent surgical treatment of primary tumor between 1997 and 2009. We considered the epidemiological, clinical, pathological, staging (TNM 2004) data and those obtained from pyrosequencing. Results: Mean follow-up was of 32.3 months and the median of 28.8 months. Considering the clinical TNM stage, the OS was influenced in the multiple model by age (p < 0.01), ASA (p = 0.02), surgical margins (p = 0.04), Fuhrman´s grade (p = 0,01), clinical stage (p <0.001) and cell subtype (p < 0.01). DFS were influenced in multivariate analysis only by presence of clinical stage (p <0.001). Of the 137 cases examined, gene hypermethylation was detected in five cases (3,6%). Because of this low frequency perceived, we elected not to carry out the association of PTEN methylation with prognostic factors. Regarding OS and DFS rates, according to the hypermethylation of PTEN profile, no event occurred, that is to say death, death from RCC or disease recurrence in the five cases with hypermethylation. Conclusions: Hypermethylation of PTEN was detected with low frequency suggesting involvement of other genes or different molecular mechanisms of methylation upon inactivation of this gene, frequently involved in renal xvii carcinogenesis. Survival rates were not influenced by the hypermethylation of PTEN profile, with clinical TNM staging remaining as the main determinant for development and risk of RCC recurrence

Um grande número de proteínas está envolvido no processamento de rRNA, e cada uma delas desempenha uma ação específica, seja como um fator estrutural, regulatório ou catalítico. Apesar da biogênese dos ribossomos ter sido intensamente estudada, ainda não se tem conhecimento claro da função de muitas proteínas envolvidas neste mecanismo. Dentre os snoRNPs, o grupo denominado box C/D é responsável pela metilação e clivagens no pré-rRNA. Através da análise de interação proteína-proteína do sistema do duplo híbrido a proteína aqui denominada Nop17p foi isolada interagindo com a proteína Rrp43p, uma subunidade do exossomo. Estudos de microarray mostraram que o mutante nulo &#916;nop17 tem o mesmo fenótipo que mutantes de genes envolvidos em tradução. No presente trabalho apresentamos uma análise detalhada da função da Nop17p e a importância da sua interação com a proteína Nop58p, componente do snoRNP de box C/D. Observamos também um defeito na função da Nop58p na ausência da Nop17p e outro dado importante apresentado aqui é que a localização sub-celular de componentes de snoRNPs de box C/D não é correta na ausência de Nop17p. Estes resultados evidenciam um envolvimento direto entre Nop17p e snoRNPs de box C/D, com um papel de regulação da função e/ou na montagem desses complexos. Apresentamos também dados com a proteína homóloga de humanos (hNop17p), que foi expressada na cepa &#916;nop17 de levedura e que conseguiu suprimir parcialmente o fenótipo termo-sensível dessa cepa, demonstrando uma possível conservação da função de Nop17p ao longo da evolução. / In eukaryotes, pre-rRNA processing depends on cis-acting elements and on a large number of non-ribosomal trans-acting factors, including endonucleases and exonucleases, RNA helicases, rRNA modifying enzymes and components of snoRNPs. The exosome is a conserved eukaryotic protein complex containing multiple 3\'-5\' exonucleases, which has been implicated in pre-rRNA, snoRNA and snRNA processing, as well as in mRNA degradation. In order to identify new proteins involved in rRNA processing, we have screened a yeast two-hybrid cONA library, to isolate proteins interacting with the exosome subunit Rrp43p. In this screen, a novel nucleolar protein, Nop17p, was identified which also interacts with the box C/D snoRNP protein Nop58p. The NOP17 gene is not essential for cell viability but its deletion causes a temperature-sensitive phenotype. Pre-rRNA processing analyses revealed that rRNA formation is affected in the &#916;nop17 strain subjected to the non-permissive temperature, although it is not blocked completely. In addition, primer extension analyses of RNA isolated from Nop17p-depleted cells subjected to the non-permissive temperature indicates that the pre-rRNA is undergoing different modification or degradation processes in these cells as compared to the parental strain. Nop17p was recently described in the same complex as Nop58p and, interestingly, its depletion leads to mislocalization of Nop1p, Nop56p, Nop58p and Snu13p, which are the core proteins of the box C/D ribonucleoprotein (snoRNP), indicating that Nop17p function is required either for nucleolar retention or for the proper assembly ofthe box C/D snoRNP.