Η αναγέννηση, με τον τρόπο που αυτή επιτελείται στο ήπαρ, δηλαδή με πολλαπλασιασμό των ώριμων κυττάρων όλων των κυτταρικών ομάδων του οργάνου, είναι μία μοναδική ιδιότητα. Πιθανώς η ιδιότητα αυτή να είναι γνωστή από αρχαιοτάτων χρόνων, όπως συμβολίζεται στον μύθο του Προμηθέα. Απόλυτα δικαιολογημένο, εκ τούτου, είναι το μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον απέναντι στη μοναδική αυτή διεργασία. Το συνηθέστερο μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της αναγέννησης είναι η χειρουργική ηπατεκτομή σε μικρά τρωκτικά (κατά κύριο λόγο στον επίμυ). Μετά τη διενέργεια της επέμβασης παρατηρείται συγχρονισμένη είσοδος των ηπατοκυττάρων –αρχικά- και των λοιπών κυτταρικών ομάδων -στη συνέχεια- στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και σε προετοιμασία πολλαπλασιασμού. Στην πρώτη αυτή φάση τα ηπατοκύτταρα γίνονται δεκτικά στη δράση μίας πλειάδας αυξητικών παραγόντων. Αυτή είναι η εναρκτήρια φάση της αναγέννησης (priming phase). Ακολουθεί η φάση πολλαπλασιασμού ή μεταβολική φάση, όπου λόγω των μεγάλων ενεργειακών αναγκών των διαιρούμενων κυττάρων, επισυμβαίνουν χαρακτηριστικά μεταβολικά γεγονότα (παροδική υπογλυκαιμία, συστηματική λιπόλυση και παροδική ηπατοκυτταρική στεάτωση), για να καλύψουν τις ανάγκες αυτές. Στο διάστημα του πολλαπλασιασμού εμφανίζονται τα παρακρινικά και τα αυτοκρινικά σήματα μεταξύ των διαφορετικών κυτταρικών ομάδων του ήπατος. Στα τρωκτικά η φάση αυτή ολοκληρώνεται 4 ημέρες μετά την ηπατεκτομή και ακολουθεί η τρίτη και τελευταία φάση του τερματισμού της αναγέννησης. Τότε συμβαίνει η πολυπαραγοντική ρύθμιση της λήξης του πολλαπλασιασμού. Με εκπληκτική ακρίβεια ρυθμίζεται το βάρος του ήπατος σε συνάρτηση με τη συνολικό βάρος του ζώου, με χρήση και ενός κύματος απόπτωσης, ενώ ακολουθεί αποκατάσταση της φυσιολογικής σύστασης της εξωκυττάριας ουσίας και της ιστολογικής δομής του ηπατικού ιστού. Σε ένα αντικείμενο τόσο διεξοδικά μελετημένο, εντοπίστηκε ένα νέο πεδίο έρευνας που υιοθετήθηκε στην παρούσα διατριβή: ο πιθανός ρυθμιστικός ρόλος των microRNAs στην αναγέννηση του ήπατος. Τα microRNAs είναι μικρά μόρια μη κωδικοποιητικού RNA (μήκους 22 περίπου νουκλεοτιδίων), που ανακαλύφθηκαν σχετικά πρόσφατα. Ωστόσο, με γοργούς ρυθμούς αποκαλύπτεται ο μείζονος σημασίας ρυθμιστικός ρόλος τους στην έκφραση των γονιδίων και άρα στη ρύθμιση πολλαπλών κυτταρικών λειτουργιών. Κατά την έναρξη της παρούσας διατριβής υπήρχαν στοιχεία που ενέπλεκαν τα microRNAs στην αναγέννηση των πτερυγίων του είδους ψαριών zebrafish, τη αναγέννηση των σκωλήκων Planaria spp. και στην επούλωση του τραύματος. Διατυπώθηκε η υπόθεση ότι μπορεί να έχουν ρυθμιστικό ρόλο και στην ηπατική αναγέννηση και μεγάλο μέρος της μελέτης αφιερώθηκε στη διαλεύκανση του ρόλου αυτού. Πρώτο μέλημα των ερευνητών ήταν η βελτιστοποίηση και τυποποίηση της αναισθησιολογικής και εγχειρητικής διεργασίας, που για τον μυ δεν ήταν τόσο διαδεδομένες όσο ήταν για τον επίμυ, λόγω της δυσκολίας που παρουσιάζει η διενέργεια χειρουργικής επέμβασης σε ένα ζώο βάρους 20 γραμμαρίων. Έγιναν πολλαπλές τροποποιήσεις στις παλαιότερες τεχνικές, με αποτέλεσμα την τυποποίηση μίας διαδικασίας που εγγυάται την ταχύτατη διενέργεια της επέμβασης (12-15 λεπτά) με άριστη (95-100%) επιβίωση των πειραματόζωων. Με χρήση της προαναφερθείσας χειρουργικής μεθόδου διενεργήθηκε η πρώτη εγχειρητική πειραματική διαδικασία: Χρησιμοποιήθηκαν 56 πειραματόζωα, τα μισά εκ των οποίων υποβλήθηκαν σε 2/3 μερική ηπατεκτομή και τα υπόλοιπα μισά σε επέμβαση Sham. Λήφθηκαν τα δείγματα ηπατικού ιστού, στον χρόνο 0 και για τα χρονικά σημεία μετά αναγέννηση 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 ωρών, από 4 πειραματόζωα για κάθε χρονικό σημείο. Η πρώτη χρήση των δειγμάτων ιστού από το πρώτο πείραμα έγινε η επιβεβαίωση της συγκρισιμότητας των αποτελεσμάτων του νέου χειρουργικού μοντέλου με αυτά της διεθνούς βιβλιογραφίας. Έγινε ανοσοϊστοχημική χρώση για ανάδειξη της πρωτεΐνης Ki-67 και άρα της χρονικής αλληλουχίας του ρυθμού πολλαπλασιασμού των ηπατοκυττάρων. Αναδείχθηκε, όπως αναμενόταν, η 36η ώρα μετά την ηπατεκτομή ως το χρονικό σημείο που ο μέγιστος αριθμός ηπατοκυττάρων βρίσκεται σε φάση πολλαπλασιασμού στον μυ. Για περαιτέρω επιβεβαίωση του χειρουργικού μοντέλου, στη συνέχεια έγινε ημιποσοτική εκτίμηση της χρονικής εξέλιξης της παροδικής ηπατοκυτταρικής στεάτωσης μετά από χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης. Από την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων προκύπτει ότι η μέγιστη συσσώρευση λίπους ανευρίσκεται, όπως αναμενόταν, στα χρονικά σημεία 12 και 24 ωρών (+++). Η μελέτη, στη συνέχεια, στράφηκε στην κατεύθυνση αξιολόγησης του ρόλου των microRNAs. Για τον σκοπό αυτό ακολούθησε η δεύτερη εγχειρητική πειραματική διαδικασία. Χρησιμοποιήθηκαν 20 πειραματόζωα εκ των οποίων τα μισά υποβλήθηκαν σε 2/3 μερική ηπατεκτομή ενώ τα υπόλοιπα σε επέμβαση Sham. Μετά από αναγέννηση 12 ωρών λήφθηκαν οι ηπατικοί ιστοί για μελέτη του προφίλ έκφρασης των microRNAs. Η επιλογή των 12 ωρών έγινε ως ένα χρονικό σημείο κατά τη φάση έναρξης της αναγέννησης, αλλά όχι στα πολύ αρχικά της στάδια, με γνώμονα την αναζήτηση του τυχόν ρυθμιστικού ρόλου των microRNAs. Το προφίλ έκφρασης των microRNAs μελετήθηκε με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών. Ελέγχθηκαν τα 598 microRNAs που ήταν γνωστά κατά τον καιρό της μελέτης. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν ότι εμφανίζεται διαφορική έκφραση σε 8 microRNAs κατά την αναγέννηση. Αναλυτικότερα, τα mmu-miR-21 και mmu-miR-30b εμφάνισαν μεγαλύτερη έκφραση, ενώ τα υπόλοιπα 6 miRNAs (mmu-miR-34c, mmu-miR-144, mmu-miR-207, mmu-miR-451, mmu-miR-582-3p, mmu-miR-290-5p) εμφάνισαν μικρότερη έκφραση κατά την αναγέννηση. Τα δείγματα ιστών του δεύτερου πειράματος χρησιμοποιήθηκαν εκ νέου για επιβεβαίωση των ανωτέρω αποτελεσμάτων με τη μέθοδο RT-qPCR. Η qPCR επιβεβαίωσε το προφίλ έκφρασης των διαφορικά εκφρασμένων miRs, όπως είχαν δείξει τα δεδομένα από τα microarrays. Προέκυψε επίσης ότι το πιο σημαντικά διαφοροποιημένο mmu-miR μεταξύ αυτών που μελετήθηκαν, ήταν το mmu-miR-21. Για να συνδεθούν τα διαφοροποιημένα microRNAs με τις κυτταρικές λειτουργίες στις οποίες εμπλέκονται και πιθανώς ρυθμίζουν, εκτελέστηκε Gene Ontology ανάλυση με τη βοήθεια του TergetScan. Προέκυψε πλειάδα δυνητικών στόχων για τα εν λόγω microRNAs, με σαφή σχέση των γονιδίων-στόχων με τη διεργασία του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Από τα ως τότε αποτελέσματα, τράβηξε την προσοχή η μεγάλη μεταβολή στην έκφραση του mmu-miR-21. Αυτό, σε συνδυασμό με την γνωστή από άλλες μελέτες, εμπλοκή του mmu-miR-21 στο αναπαραγωγικό δυναμικό καρκινικών κυττάρων, αποφασίστηκε να αναζητηθεί η χρονική αλληλουχία έκφρασής του, με χρήση των δειγμάτων ηπατικού ιστού από το πρώτο πείραμα. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της RT-qPCR, που ανέδειξε σαφή υπεροχή της έκφρασης του mmu-miR-21 στις 12 ώρες μετά από τη μερική ηπατεκτομή με διατήρηση σχετικά υψηλής συγκέντρωσης ως και τις 24 ώρες. Ακολούθησε επιτυχής επιβεβαίωση του ανωτέρω αποτελέσματος με τη χρήση της μεθόδου του in situ υβριδισμού. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη πέτυχε να υποδείξει μία πολύ αποτελεσματική μέθοδο 2/3 ηπατεκτομής στον μυ. Το χειρουργικό αυτό μοντέλο αποδείχθηκε ότι έχει πλήρως συγκρίσιμα αποτελέσματα με αυτά της διεθνούς βιβλιογραφίας. Στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε η υπόθεση διαφορικής έκφρασης των microRNAs κατά τη διαδικασία της αναγέννησης. Το γεγονός αυτό, υπονοεί ότι ίσως να εμπλέκονται με κάποιο ρυθμιστικό ρόλο στη διαδικασία αυτή. Το mmu-miR-21 αναδεικνύεται ως το μάλλον σημαντικότερο από αυτά. Τα δεδομένα από την παρούσα μελέτη συμπληρώνουν τις έως τώρα γνώσεις για το φαινόμενο της ηπατικής αναγέννησης, αλλά και ανοίγουν δρόμους για νέο προσανατολισμό στην έρευνα, όπως την παραπέρα διαλεύκανση του τρόπου δράσης αυτών των microRNAs που εντοπίστηκαν ή τον τυχόν ρόλο τους και στις φάσεις πολλαπλασιασμού ή τερματισμού της αναγέννησης. / Liver regeneration is a unique ability, because of the way it proceeds, i.e. the proliferation of all categories of all mature liver cell types. It is highly possible that this ability is known to human kind since the ancient times, as pictured in Prometheus’ myth. The great scientific interest towards deciphering this complex process is, of course, highly justified. The most common model for the study of the process of regeneration is the surgical model of the 2/3 partial hepatectomy (PHx) in small rodents, predominantly the rat. 2/3 partial hepatectomy leads to a highly synchronized hepatocyte cell-cycle entry and progres¬sion. The first phase, known as the ‘priming phase’, occurs in the first hours after PH and poises the hepatocytes to enter the G1 phase and to become receptive to growth factors. The second phase corresponds to an increased metabolic demand imposed on the remnant liver. During this phase, among other metabolic changes, transient hypoglycemia is suggested to induce systemic lipolysis followed by a lipid droplets accumulation in the hepa¬tocytes. During this phase, am major role is played by the autocrine intercellular network. In rodents, this phase is completed in 4 days post-PHx and is followed by the termination phase. Ending the regenerative process is an equally complex, multiparameter process. The weight of the liver is regulated proportionally to the animal’s body weight with remarkable accuracy, sometimes employing an apoptotic wave. The termination phase of the regenerative process ends with normal hepatic histological structure restoration and matrix remodeling. Liver regeneration is a phenomenon that has been thoroughly studied in the past. Nevertheless, a point of emerging research interest has been adopted in the present study: the possible regulatory role of microRNAs in liver regeneration. MicroRNAs are small non-coding RNA molecules (approx. 22 nts long), which have been discovered quite recently but through research they are quickly emerging as cornerstone regulatory means in a large number of cellular functions. In the beginning of this study, data existed implicating microRNAs in the regeneration of zebrafish fins, regeneration in planarian worms and wound healing. The hypothesis that they may have a role in liver regeneration was made and a large part of this study is concerned with investigating the existence of such a role. The researchers began with revising and standardizing the method for anesthesia and surgical procedure, which, at the time (2007), were not satisfactory enough in the case of mice (as opposed to the widely used rats), possibly because of the difficulty of operating on a 20 gram animal. Many alterations were made upon the previous techniques. As a result, a procedure was standardized, as described herein, that guarantees a fast procedure (12-15 minutes) accompanied by excellent animal survival (95-100%). Using the above described technique, the first surgical experiment in this study was conducted: 56 animals (wild-type mice) were used, half of which were subjected to 2/3 PHx and the other half were sham operated. Liver samples were collected at time 0 and at several time points during regeneration (1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 hours), with a number of 4 animals per time point. These samples were used in order to confirm the comparability of the new surgical technique to bibliography models. An immunohistochemical dye for the protein Ki-67 was performed, thus revealing the number of hepatic cells undergoing proliferation at each time point. The 36th hour post-PHx emerged as the point of climax of the proliferative process in the mouse, as expected by previous studies. For further confirmation, the same samples were used to produce simple histological H-E slides, in order to evaluate the evolvement of lipid droplet accumulation in hepatic cells associated with liver regeneration. A semi-quantitative evaluation was conducted, that revealed that maximum lipid accumulation occurs at the time points of 12 and 24 hours (+++) in mouse, again as expected by previous studies. Then the study proceeded with investigating the potential role of microRNAs in liver regeneration. For this, a second surgical experiment was conducted: This time 20 animals (wild-type mice) were used, half of which were subjected to 2/3 PHx and the other half were sham operated. After regenerating for 12 hours, liver samples were harvested from all animals. The choice of the 12-hour interval was made as a time point at the beginning phase of liver regeneration, but not at the very early beginning, with a view to reveal the possible regulatory role of microRNAs at the first stage of the regenerative process. MicroRNA profiling was conducted using specific microarrays, examining the presence of the 598 microRNAs known at the time of this procedure. The results pointed out 8 differentially expressed microRNAs during regeneration: 2 that were up-regulated (-miR-21 and mmu-miR-30b) and 6 that were down-regulated (mmu-miR-34c, mmu-miR-144, mmu-miR-207, mmu-miR-451, mmu-miR-582-3p, mmu-miR-290-5p). Tissue samples from the second experiment were used again in order to confirm the aforementioned results utilizing the RT-qPCR method. This indeed confirmed the microarrays’ results and highlighted mmu-miR-21 as the most differentially expressed miR, indicating a possibly major regulatory role in liver regeneration. In order to link these differentially expressed microRNAs to their cellular and molecular functions, Gene Ontology Analysis was conducted, using TargetScan. Many putative gene-targets for each microRNA emerged, many of which are involved in the process of cellular proliferation. Following the emergence of the major differentiation of mmu-miR-21 within the results of qPCR evaluation and with previous research linking it with cancer cell proliferation regulation, it was decided to further assess the time kinetics of the expression of mmu-miR-21, utilizing tissue samples from the first experiment. Through an RT-qPCR evaluation, it was shown that up-regulation of mmu-miR-21 reaches its zenith at 12 hours post-PHx and remains quite highly expressed until 24 hours. This was further confirmed by in situ hybridization. In conclusion, we were able to standardize a very successful version of the 2/3 hepatectomy procedure adapted for mice. Using this model, the hypothesis of the altered expression of microRNAs during liver regeneration is confirmed, setting suspicion about some kind of regulatory role. Mmu-miR-21 emerges as the most differentially expressed one and possibly having the most important role. The data from the present study supplement preexisting knowledge on the phenomenon of liver regeneration, but also show the way for future research in further clarifying the paths leading to microRNAs’ regulatory role or investigating their potential role in the phases of proliferation or termination of liver regeneration.

Le rétrovirus HTLV-1 (Human T-cell Leukemia virus type 1) est l'agent étiologique de la leucémie T de l'adulte (ATLL) et de maladies inflammatoires. Il infecte principalement les lymphocytes T-CD4+ et T-CD8+, et se réplique essentiellement via l'expansion clonale de sa cellule hôte selon deux mécanismes distincts : HTLV-1 induit une résistance à l'apoptose des cellules T-CD8+ alors qu'il favorise la prolifération des cellules T-CD4+. Au stade chronique de l'infection, en comparaison à leur contreparties T-CD8+, les cellules T-CD4+ infectées non transformées présentent des caractéristiques pré-leucémiques telles que des anormalités génomiques et des défauts d'activation de la télomérase, ce qui explique vraisemblablement pourquoi les cellules d'ATLL sont régulièrement de phénotype T-CD4+. L'infection par HTLV-1 s'accompagne de reprogrammations drastiques du transcriptome cellulaire. Parmi elles, les modifications d'expression de micro-ARN (miARN). Les miARN sont de petits ARN non-codants qui contrôlent négativement la traduction des ARNm, et qui ont été récemment mis en évidence dans les cellules transformées par le virus, et semblent participer au maintien du phénotype tumoral. Ces données posent la question de l'origine de ces perturbations et de leurs implications dans les processus d'expansion clonale et d'initiation de la transformation des cellules infectées. Pour adresser cette question, nous avons réalisé une étude intégrée de l'expression des miARN et des ARNm de cellules T, issues de patients infectés sans malignité / Human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) is associated with adult T-cell leukemia / lymphoma (ATLL) hat regularly occurs after a prolonged period of viral latency. In vivo, HTLV-1 replication relies on the clonal expansion of its host CD4+ and CD8+ T-cells, yet the virus causes adult T-cell leukemia / lymphoma (ATLL) that is regularly of the CD4+ phenotype. Infected cells express Tax and HBZ viral oncoproteins. Tax is mainly expressed in untransformed cells, where it promotes cell proliferation, genetic instability, and miRNA dysregulation, whereas HBZ is expressed in both untransformed and malignant T-cells where it contributes to promote cell proliferation and to silence virus expression. Here, we show that an HBZ / miRNA axis promotes cell proliferation and genetic instability. MicroRNAs (miRNAs) are evolutionarily conserved, small (~21 nucleotides), noncoding RNAs that are encoded within the genomes of almost all eukaryotes from plants to mammals. In general, miRNAs, especially in animals, post-transcriptionally regulate protein synthesis by base pairing to partially complementary sequences in the 3’ untranslated regions (UTRs) of target mRNAs. Furthermore, whereas human lymphocyte subsets are known to possess specific miRNA signatures involved in T-cell differentiation and activation, little is known about the role of miRNA dysregulation in the clonal expansion of untransformed, infected CD4+ and CD8+ T-cells in vivo, including its role, if any, in viral persistence, inflammation, genetic instability, and early leukemogenesis. To our knowledge, no study to date has assessed the effects of HBZ on the biogenesis and activity of miRNAs. In order to assess the effect of HTLV-1 infection on the miRNA expression profiles of host cells in vivo, we performed an integrated analysis of miRNA- and mRNA-expression profiles of cloned CD4+ and CD8+ T-cells derived from infected individuals without malignancy

L’aldostérone et le Récepteur Minéralocorticoïde (MR) participent au contrôle de la balance hydrosodée et de la pression artérielle. Les altérations de l’expression du MR ou de la signalisation minéralocorticoïde sont associées à de nombreuses pathologies chez l’Homme. Dans ce travail, nous avons démontré, le rôle majeur de protéines de liaison à l’ARN, Tis11b et HuR, dans le contrôle post-transcriptionnel de l’expression du MR en réponse aux variations de tonicité extracellulaire dans un modèle de cellules principales rénales et chez la souris. L’hypertonicité (500 mOsmol/L) induit l’expression de la protéine Tis11b, qui lie la région 3’-non traduite du transcrit MR afin d’accélérer sa dégradation, diminuant ainsi l’expression rénale de la protéine MR et de la signalisation minéralocorticoïde. A l’opposé, l’hypotonicité (150 mOsmol/L) stimule la translocation nucléo-cytoplasmique de HuR, qui stabilise le transcrit MR, augmentant ainsi l’expression du MR et la sensibilité rénale à l’aldostérone. De plus, HuR est responsable de l’édition d’un nouveau variant d’épissage du MR, le variant MR Δ6, obtenu par l’exclusion de l’exon 6.Ce variant d’épissage exerce un effet dominant négatif sur la signalisation minéralocorticoïde. Enfin, l’identification de microARN modulés par l’hypertonicité suggère leur rôle potentiel dans le contrôle de la signalisation minéralocorticoïde rénale. La caractérisation de ces mécanismes inédits modulant l’action du MR améliore notre compréhension de la physiopathologie de la signalisation minéralocorticoïde, et pourrait aboutir, à terme, à de nouvelles stratégies thérapeutiques. / Aldosterone and the Mineralocorticoid Receptor (MR) participate to the control of salt and water balance and the arterial pressure. Alteration of renal MR expression or mineralocorticoid signaling pathway contributes to the development of numerous human disorders. In this work, we have demonstrated the major role played by the RNA-Binding Proteins, Tis11b and HuR, in the control of MR expression in response to variations of extracellular tonicity in a model of principal tubular cells and in vivo. Hypertonicity (500 mOsmol/L) increases the expression ofTis11b, which binds the 3’-untranslated region of MR transcript and accelerates the degradation of MR transcript, leading to the reduction of the mineralocorticoid signaling. Conversely, hypotonicity (150 mOsmol/L) stimulates nuclear-cytoplasmic shuttling of HuR protein, which stabilizes MR transcript increasing its expression and renal sensitivity to aldosterone action. Furthermore, HuR participates to the editing of the novel MR Δ6 splice variant, which lacks exon 6, and exerts a dominant negative effect on mineralocorticoid signaling. Finally, we have provided evidence that hypertonicity modulates expression of microRNA, which may control mineralocorticoid signaling pathway. Characterization of these original mechanisms modulating MR action is pivotal for a better understanding of mineralocorticoid-related pathophysiology, and should ultimately lead to the development of new therapeutic strategies.

No description available.

The structure, function and accessibility of epidermal skin provide aunique opportunity to study the DNA damage response (DDR) of a normaltissue. The in vivo response can be examined in detail, at a molecularlevel, and further associated to the structural changes, observed at atissue level. We collected an extensive skin biopsy material frompatients undergoing fractionated radiotherapy for 5 to 7 weeks. Several end-points inthe DDR pathways were examined before, during and after the treatment. Quantification of DNA double strand break (DSB) signalling focirevealed a hypersensitivity to doses below 0.3Gy. Furthermore, aconsiderable amount of foci persisted between fractions. The low dosehypersensitivity was observed throughout the treatment and was alsoobserved for several key parameters further downstream in the DDR-pathway, such as p21-associated checkpoint activation, apoptosisinduction and reduction in basal keratinocyte density (BKD).Furthermore, for dose fractions above 1.0 Gy, a distinct acceleration inDDR was observed half way into treatment. This was manifested as anaccelerated loss of basal keratinocytes, mirrored by a simultaneousincrease in DSBs and p21 expression. Quantifications of mitotic events revealed a pronounced suppression ofmitosis throughout the treatment which was clearly low dosehypersensitive. Thus, no evidence of accelerated repopulation could beobserved for fraction doses ranging from 0.05 to 2Gy. Our results suggest that the keratinocyte response primarily isdetermined by checkpoints, which leads to pre-mitotic cell elimination by permanent growth arrest and apoptosis. A comparison between the epidermal and dermal sub-compartments revealsa consistent up-regulation of the DDR response during treatment. Adifference was however observed in the recovery phase after treatment,where miR-34a and p21 remain up-regulated in dermis more persistentlythan in epidermis. Our observations suggest that the recovery phaseafter treatment can provide important clues to understand clinicalobservations such as the early and late effects observed in normaltissues during fractionated radiotherapy.

No description available.

La rétinopathie du prématuré, modélisée par les modèles de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR), est l’une des principales causes de cécité dans l’enfance. Elle est constituée d’une première phase de vaso-oblitération rétinienne et choroïdienne suivie d’une phase de néovascularisation post-ischmémique rétinienne. La phase de dégénérescence vasculaire est entre autres liée d’une part à une baisse de l’expression des facteurs pro-angiogéniques et d’autre part à une inflammation rétinienne excessive. Toutefois, les mécanismes post-transcriptionnels à l’origine de ces phénomènes demeurent peu connus. La dérégulation des microARNs (miRs), des ARNs non codants régulant négativement l'expression des gènes, est impliquée dans la modulation de multiples processus physiologiques et pathologiques dont l’angiogenèse et l'inflammation. Cependant, le rôle des miRs dans l’angiogenèse et l’inflammation au cours de l’OIR reste à explorer. Basé sur l’établissement préalable d’un profil de modulation de l’expression des miRs au cours de l’OIR, nous avons sélectionné et caractérisé dans cette thèse le rôle d’un miR sur la fonction angiogénique puis d’un miR sur la fonction inflammatoire dans l’OIR. Nous avons caractérisé dans un premier temps, le miR-96. L’expression du miR-96 était significativement diminuée in vivo dans la rétine et la choroïde lors de la phase de vaso-oblitération du modèle murin de l’OIR. In vitro, le miR-96 était régulé négativement par l’hyperoxie dans les cellules endothéliales rétiniennes. La supplémentation en miR-96 avait un effet pro-angiogénique sur les cellules endothéliales rétiniennes soumises à l’hyperoxie par la préservation de la signalisation de facteurs angiogéniques, tels que VEGF et Ang2, leur permettant de maintenir leur capacité de migration et de tubulogenèse. In vivo, la supplémentation intravitréenne en miR-96 exerçait également ces fonctions vaso-protectives et permettait de préserver la microvascularisation rétinienne et choroïdienne par le maintien du niveau d’expression physiologique de VEGF et Ang2. Dans un second temps, nous avons caractérisé le miR-125a. L’expression du miR-125a était significativement diminuée in vivo dans la rétine lors de la phase de vaso-oblitération du modèle murin de l’OIR, mais également in vitro dans les cellules microgliales soumises à l’inflammation par hyperoxie ou LPS, ce qui était inversement corrélé à une augmentation de cytokines pro-inflammatoires telles que TNF-a, IL-6 et IL-16. Le miR-125a a été caractérisé comme anti-inflammatoire et sa supplémentation dans les cellules microgliales activées diminuait significativement l’expression de ces marqueurs pro-inflammatoires. La modification du sécrétome des cellules microgliales permettait une récupération des capacités angiogéniques des cellules endothéliales rétiniennes avec amélioration de leur prolifération et de leur tubulogenèse. In vivo, la supplémentation intravitréenne en mir-125a permettait de maintenir une expression physiologique de TNF-a, IL-6 et IL-16, ce qui était associé à une diminution de la vaso-oblitération rétinienne. Collectivement, ces travaux ont permis d’identifier et de caractériser le rôle du miR-96 dans la dysfonction angiogénique et du miR-125a dans la dysfonction inflammatoire lors de l’OIR. Cette thèse démontre pour la première fois qu’une thérapie basée sur la modulation de miRs spécifiques permettait de prévenir la dégénérescence vasculaire de l’OIR. Ces résultats pourraient constituer la base de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement précoce des rétinopathies ischémiques comme la rétinopathie du prématuré. / Retinopathy of prematurity is one of the leading causes of blindness in childhood and is represented by oxygen-induced retinopathy (OIR) models. It’s characterized by a first phase of retinal and choroidal vasoobliteration followed by a retinal neovascularization. The vascular degeneration is partly linked to a decrease in the expression of pro-angiogenic factors and to an excessive retinal inflammation. However, the post-transcriptional mechanisms implicated remain poorly understood. microRNAs (miRs) are non-coding RNAs that negatively regulate gene expression. Dysregulation of miRs is involved in the modulation of multiple physiological and pathological processes including angiogenesis and inflammation. However, the role of miRs in angiogenesis and inflammation during OIR remains to be explored. Based on the prior establishment of the modulation profile of miRs expression during OIR, we selected and characterized in this thesis the role of a miR on the angiogenic function then another miR on the inflammatory function in OIR. We first characterized the miR-96. In vivo, miR-96 expression was significantly downregulated in the retina and choroid during the vaso-obliteration phase of OIR rat. In vitro, miR-96 was downregulated by hyperoxia in retinal endothelial cells. miR-96 overexpression had a pro-angiogenic effect on retinal endothelial cells subjected to hyperoxia by preserving the signaling of angiogenic factors including VEGF and Ang2. This allowed to maintain their capacity for migration and tubulogenesis. In vivo, intravitreal supplementation with miR-96 also exerted these vasoprotective functions and preserved retinal and choroidal microvasculature by maintaining the physiological expression level of VEGF and Ang2. Secondly, we characterized the miR-125a. In vivo, the expression of miR-125a was significantly reduced in the retina during the vaso-obliteration phase of the OIR rat. In vitro, miR-125a was downregulated in microglial cells subjected to inflammation by hyperoxia or LPS, which was inversely correlated with an increase in pro-inflammatory cytokines such as TNF-a, IL-6 and IL-16. miR-125a was characterized as anti-inflammatory and its overexpression in activated microglial cells significantly decreased the expression of these pro-inflammatory markers. The modification of the secretome of the microglial cells allowed a recovery of the angiogenic capacities of the retinal endothelial cells with improvement of their proliferation and their tubulogenesis. In vivo, intravitreal supplementation with mir-125a maintained a physiological expression of TNF-a, IL-6 and IL-16, which was associated with a decrease in retinal vaso-obliteration. Collectively, these tasks identified and characterized the role of miR-96 in angiogenic dysfunction and miR-125a in inflammatory dysfunction during OIR. This thesis demonstrates for the first time that a therapy based on the modulation of specific miRs can prevent the OIR vascular degeneration. These results could form the basis of new therapeutic strategies in the early treatment of ischemic retinopathies such as retinopathy of prematurity.

No description available.

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des proliférations malignes de progéniteurs bloqués lors de la différenciation myéloïde. Le caryotype des blastes leucémiques identifie 3 groupes pronostiques distincts. Parmi les LAM à risque cytogénétique favorable, figurent les leucémies aiguës promyélocytaires (LAP), et celles avec inv(16) ou t(8;21). Les micro-ARNs sont des acteurs clef de l’hématopoïèse et sont aussi impliqués dans la leucémogénèse des LAM. Ils sont très stables dans le sérum et sont utilisés comme biomarqueurs dans les cancers. Le but de cette thèse était d’évaluer si une caractérisation pangénomique des micro-ARNs sériques permettait de distinguer ces 3 types de LAM entre elles ainsi que les LAM avec caryotype normal (NK-AML); d’identifier des micro-ARNs circulants fortement surexprimés dans les NK-AML par rapport à des sujets sains, pour une utilisation ultérieure comme marqueurs de maladie résiduelle; et de mieux préciser le pronostic des NK-AML. Ainsi, nous avons identifié une signature sérique spécifique des LAP liée à une dérégulation des micro-ARNs localisés dans la région DLK1-DIO3 soumise à l’empreinte, en 14q32. Ces micro-ARNs, dont l’origine était le blaste leucémique, étaient corrélés aux facteurs pronostiques connus des LAP. Par ailleurs, deux micro-ARNs, miR-10a-3p et miR-196b-5p, distinguant les NK-AML des LAM avec inv(16) ou t(8 ;21) ont été montré surexprimés dans les NK-LAM avec une mutation de NPM1 et/ou de FLT3-ITD. Enfin l’expression de ces deux micro-ARNs est corrélée à la dérégulation transcriptionnelle et à la méthylation de l’ADN affectant les gènes HOX et TALE. En conclusion, cette étude des micro-ARNs sériques ouvre un nouveau champ d’exploration à visée pronostique dans les LAM. / Acute myeloid leukaemia (AML) is a malignant proliferation of progenitors blocked during myeloid differentiation. The karyotype of the leukemic blasts identified three distinct prognostic groups. Among the favourable risk cytogenetics AML include acute promyelocytic leukaemia (APL), and those with inv (16) or t (8; 21). Micro-RNAs are key players in hematopoiesis and are also involved in leukemogenesis of AML. They are very stable in serum and used as biomarkers in cancers. The aim of this thesis was to evaluate whether a genome-wide characterization of serum micro-RNAs possible to distinguish these three types of AML them as well as AML with normal karyotype (NK-AML); identify micro-RNAs circulating highly overexpressed in NK-AML compared to healthy subjects, for later use as markers of residual disease; and to better define the prognosis of NK-AML. Thus, we have identified a specific serum signing of LAP related to a deregulation of micro-RNAs located in the DLK1-DIO3 under the imprinting, in 14q32. These micro-RNAs whose origin was the leukemic blasts were correlated with known prognosis factors of APL. In addition, two micro-RNAs, miR-10a-3p and miR-196b-5p, distinguishing the NK-AML with inv (16)-AML or t (8; 21)-AML have been shown overexpressed in NK-AML with mutation NPM1 and / or FLT3-ITD. Finally the expression of these two micro-RNAs correlates withtranscriptional deregulation and DNA methylation affectingTALE and HOX genes. In conclusion, this study of serum microRNAs opens a new field of exploration to assess the prognosis in AML.

No description available.