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Análise da expressão gênica em resposta ao choque térmico e cádmio no fungo aquático Blastocladiella emersonii / Analysis of gene expression in response to cadmium and heat shock in the aquatic fungus Blastocladiella emersoniiRaphaela de Castro Georg 01 December 2006 (has links)
Neste trabalho realizamos um programa de seqüenciamento em larga escala de cDNAs obtidos de bibliotecas construídas a partir de mRNA de células de B. emersonii submetidas ao choque térmico e ao estresse por cádmio. Obtivemos 6350 seqüências expressas (ESTs) de alta qualidade, que representam 2326 seqüências únicas putativas (unigenes) do fungo. Destes unigenes putativos, 1282 genes foram classificados em pelo menos uma das categorias do Consórcio Gene Ontology (GO). A análise do transcriptoma parcial de B. emersonii determinado até o momento permitiu a identificação de 78 unigenes codificando chaperones moleculares de todas as famílias conhecidas. Para avaliarmos a expressão global dos genes em resposta a estresses ambientais, como o choque térmico e o cádmio, realizamos ensaios de microarranjos de DNA nestas condições de estresse. Observamos que em resposta ao choque térmico, B. emersonii induz a expressão de genes que codificam proteínas relacionadas com o enovelamento de proteínas e com a proteólise, o que seria esperado em condições de temperaturas elevadas, assim como genes que codificam proteínas com propriedades antioxidantes, além de proteínas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos e no metabolismo de carboidratos. Em resposta ao estresse por cádmio, verificou-se a indução de genes que codificam principalmente proteínas com propriedades antioxidantes, proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos, proteínas relacionadas com o transporte celular e proteínas envolvidas no enovelamento de proteínas e proteólise. Uma das conseqüências do estresse por cádmio é o aumento do estresse oxidativo e proteínas antioxidantes têm um papel fundamental na resposta a este tipo de estresse. Dentre os genes observados durante o seqüenciamento das ESTs de B. emersonii, observamos dez genes codificando proteínas distintas da família Hsp70. Nove genes hsp70 são expressos em pelo menos um dos estágios do desenvolvimento do fungo e sete apresentam uma indução significativa após o choque térmico. Estes dados sugerem que estes genes desempenham um papel importante durante o desenvolvimento e em resposta ao estresse térmico em B. emersonii. Outro dado interessante obtido neste trabalho foi o enriquecimento de ESTs que continham íntrons em sua seqüência nas bibliotecas de estresse. Portanto, o choque térmico e o estresse por cádmio em B. emersonii diminuem a eficiência de processamento dos íntrons permitindo sua caracterização. O cDNA da proteína Hsp17 foi o que apresentou o maior número de ESTs seqüenciadas nas bibliotecas de estresse. Experimentos de Northern blot indicaram que o gene hsp17 possui um nível de expressão muito baixo durante o ciclo de vida de B. emersonii, no entanto, como esperado sua expressão aumenta drasticamente quando as células de esporulação ou germinação são submetidas a choque térmico. Os níveis da proteína Hsp17 acompanham os níveis do seu mRNA, indicando que o controle da expressão do gene hsp17 deve ocorrer em nível de transcrição. / In this work we realized a large scale, sequencing program of cDNAs libraries obtained from mRNA of B. emersonii cells submitted to heat shock and cadmium stress. A total of 6350 high quality expressed sequence tags (ESTs) were obtained, representing 2326 unique putative genes (unigenes) of this fungus. From these putative unigenes, 1282 genes were classified at least in one of the three Gene Ontology Consortium (GO) categories. The analysis of the partial transcriptome of B. emersonii, determined until now, allowed the identification of 78 unigenes encoding molecular chaperones of all known protein families. To evaluate the global expression of the genes in response to environmental stresses, such as heat shock and cadmium, DNA microarray assays were performed. We observed that in response to heat shock B. emersonii induces the expreession of genes encoding proteins related to protein folding and proteolysis, as expected under high temperature conditions, as well as genes encoding proteins with antioxidant properties and proteins involved in nucleotide and carbohydrate metabolism. In response to cadmium stress, we mainly verified the induction of genes for proteins with antioxidant properties, proteins involved in amino acid metabolism, proteins related to cellular transport and proteins related to protein folding and proteolysis. One of the consequences of the exposure to cadmium is the increase of oxidative stress, and antioxidant proteins have a fundamental role in the response to this kind of injury. Amongst the genes observed during the B. emersonii EST sequencing program, ten genes encoding distinct proteins from the Hsp70 family were observed. Nine of them are expressed at least in one stage of the fungus development and seven genes presented a significant induction during heat shock treatment. These data suggest that the hsp70 genes perform an important role during development and in response to heat stress in B. emersonii. Another interesting result from this work was the enrichment of ESTs containing introns in the stress libraries. Thus, heat shock and cadmium stress decrease the efficiency of intron processing in B. emersonii, allowing for intron characterization. The cDNA for the Hsp17 protein presented the highest number of ESTs sequenced from the stress libraries. Northern blot experiments indicated that the hsp17 gene is expressed at very low levels throughout the life cycle of B. emersonii, however, as expected its expression increases drastically when sporulation or germination cells are submitted to heat shock. Hsp17 protein levels accompany its mRNA levels, indicating that the control of expression of the hsp17 gene occurs at a transcriptional level.
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Análise da expressão gênica global durante a germinação do fungo aquático Blastocladiella emersonii / Globlal gene expression analysis during germination of the aquatic fungus Blastocladiella emersoniiSilvia Maria Salem Izacc 04 April 2006 (has links)
Foi realizado um programa de seqüenciamento de cDNAs obtidos de bibliotecas da fase de germinação do fungo aquático Blastocladiella emersonii. Os dados gerados, em conjunto com o projeto de seqüenciamento de cDNAs da fase de esporulação do fungo, permitiram a descoberta de aproximadamente 4.900 genes diferentes de B. emersonii (Ribichich et al., 2005). Os genes putativos foram anotados e associados com as categorias funcionais descritas pelo Gene Ontology Consortium e encontram-se na base de dados http://www.blasto.iq.usp.br. O perfil de expressão dos genes foi avaliado por Northern digital e vários transcritos apresentaram perfil de expressão regulado durante a germinação. Numa segunda etapa deste trabalho, cerca de 3.600 genes putativos de B. emersonii foram arranjados em lâminas de vidro e empregados como sondas para a investigação da expressão gênica global em células de diferentes tempos após a indução da germinação. Analisamos ainda, as diferenças entre a germinação induzida em meio nutriente e a germinação em solução inorgânica, na qual os indutores efetivos da germinação foram adenina ou íons potássio. Na germinação em meio nutriente mais de 900 genes, cerca de 26% do total presente nos micro-arranjos, mostraram-se diferencialmente expressos em pelo menos um dos tempos analisados. Foram induzidos durante a germinação, principalmente, genes envolvidos no crescimento celular, incluindo biossíntese de proteínas, transcrição e ativação do metabolismo energético. No entanto, estes genes não foram induzidos quando a germinação ocorreu em solução inorgânica. Verificamos ainda que vários transcritos envolvidos com a percepção do meio extracelular e com a sinalização celular, codificando proteínas necessárias para disparar o programa de germinação, encontram-se presentes nos zoósporos. Além disso, observamos que alguns dos transcritos encontrados nos zoósporos foram reprimidos na germinação em meio nutriente, mas mantiveram níveis elevados de expressão quando a germinação foi feita em solução inorgânica, indicando que os nutrientes exercem um papel importante na regulação da expressão de determinados genes nesta fase do desenvolvimento. / We conducted large scale cDNA sequencing from libraries obtained using RNA from germinating cells of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. Data obtained in this work, along with cDNAs from sporulating cells, lead to the discovery of nearly 4.900 different genes from B. emersonii (Ribichich et al., 2005). The putative genes were annotated and associated with the functional categories described by the Gene Ontology Consortium and are available at the web site http://www.blasto.iq.usp.br. The expression patterns of these genes were evaluated by digital Northern analysis and we detected several transcripts that presented expression profile regulated during germination. In a second approach, nearly 3.600 putative genes from B. emersonii were spotted into glass slides and used as probes to investigate the global gene expression pattern in cells isolated at different times after induction of germination. We also analyzed the differences between the germination triggered in nutrient medium and the germination in inorganic solution, in which the effective inducers of germination were either adenine or potassium ions. More than 900 genes were differentially expressed during germination in nutrient medium in at least one of the time points analyzed, which correspond to 26 % of the total genes in the microarrays. The genes induced during this process were mainly those involved in cellular growth, including protein biosynthesis, transcription and energetic metabolism. However, these genes were not induced when germination occurred in inorganic solution. In addition, we verified that many transcripts involved in sensing the environment and also in signal transduction, encoding proteins necessary to trigger the germination program, were present in the zoospores. Another finding is that some of the transcripts found in zoospores were repressed when germination proceeded in nutrient medium, but were maintained at high levels when germination occurred in inorganic solution, suggesting that nutrients exert an important role in regulating the expression of some genes in this stage of development.
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Regulação da expressão gênica por oxigênio no fungo aquático Blastocladiella emersonii / Regulation of gene expression by oxygen in the aquatic fungus Blastocladiella emersoniiCesar Moisés Camilo 16 December 2009 (has links)
Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global do fungo aquático Blastocladiella emersonii submetido ao estresse de carência de oxigênio (hipóxia), utilizando a técnica de microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3773 genes distintos. Nos experimentos de hipóxia gradual (diminuição gradual da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) e hipóxia direta (diminuição direta da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) observamos que 650 genes foram diferencialmente expressos em pelo menos uma das condições de estresse e que 534 deles mostraram-se afetados (direta ou indiretamente) pela disponibilidade de oxigênio, uma vez que apresentaram recuperação (ou tendência à recuperação) da sua expressão aos níveis normais, quando as células foram reoxigenadas. Além de modular a expressão de diversos genes sem função conhecida, B. emersonii responde à hipóxia reajustando a expressão de genes responsáveis pela produção e consumo de energia. Pelo menos transcricionalmente, este fungo favorece o metabolismo anaeróbico, através da indução de genes que codificam enzimas da via glicolítica e lactato desidrogenase, ao passo que no ciclo do ácido cítrico, a maioria dos genes encontram-se reprimidos ou não sofrem alteração na expressão. Processos dispendiosos em energia como síntese protéica, metabolismo de aminoácidos, enovelamento de proteínas e transporte por membrana apresentaram perfis predominantemente de repressão gênica quando em carência de oxigênio. Ainda utilizando a técnica de microarranjos, mostramos semelhanças entre os perfis transcricionais nos experimentos hipóxia e de carência de Fe2+ (tratamento com quelante de Fe2+ 2,2´-dipyridyl) sugerem que estes estresses estão de alguma forma relacionados, fornecendo bons indícios de que o íon Fe2+ possa ter um papel importante no mecanismo sensor de oxigênio e/ou de resposta a hipóxia em B. emersonii. Além disso, o tratamento prévio de células submetidas à hipóxia com o antibiótico geldanamicina, um conhecido inibidor da proteína de choque térmico HSP90, levou à diminuição da indução de certos genes de hipóxia, indicando que este fungo pode possuir algum mecanismo semelhante ao do fator de transcrição de hipóxia HIF1-α de mamíferos, uma vez que este fator também é afetado por geldanamicina. Adicionalmente, desenvolvemos um protocolo para transformação de B. emersonii mediada por Agrobacterium tumefasciens que se mostrou promissor. A transferência do T-DNA contendo um gene de resistência a higromicina B, presente no vetor binário pBINPLUS-Hph, foi evidenciada pelo crescimento normal e esporulação das células transformadas, na presença do antibiótico e pela amplificação do gene de resistência no DNA genômico de células transformadas. / In this work we analyzed global gene expression changes in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii submitted to oxygen deprivation (hypoxia), using cDNA microarrays containing 3,773 distinct genes. In gradual hypoxia (gradual decrease in dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) and direct hypoxia (direct decrease of dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) we observed 650 differentially expressed genes in at least one of the stress conditions tested, 534 of them being affected (directly or indirectly) by oxygen availability, since they showed recovery of normal expression levels or a tendency to recover, when cells were reoxygenated. Besides modulating many genes with no previously assigned function, B. emersonii responds to hypoxia by readjusting the expression levels of genes responsible for energy production and consumption. At least transcriptionally, this fungus seems to favour anaerobic metabolism through the induction of genes encoding glycolytic enzymes and lactate dehydrogenase, while in the TCA-cycle, most genes were repressed or unchanged. Energy-costly processes like protein synthesis, amino acid metabolism, protein folding and transport had their gene expression profiles predominantly repressed during oxygen deprivation. Microarray experiments also showed similarities between the transcriptional profile of genes in hypoxia and iron (II) deprivation (treatment with the iron (II) chelator 2,2\'-dipyridyl), suggesting that these stresses are somehow related, giving good evidence that Fe2+ ion could have a role in the mechanism of oxygen sensing and/or response to hypoxia in B. emersonii. Furthermore, pretreatment of cells subjected to hypoxia with the antibiotic geldanamycin, a known inhibitor of the heat shock protein HSP90, caused a significant decrease in the induction of certain hypoxic genes, indicating that this fungus could have a mechanism similar to that of the mammalian hypoxia transcription factor HIF-1α, which is also affected by geldanamycin. Additionally, we developed an Agrobacterium tumefasciens-mediated protocol for transformation of B. emersonii that has shown to be promising. The capacity to transfer the T-DNA containing a hygromycin B resistance gene, present in the pBINPLUSHph binary vector, was evidenced by the normal growth and sporulation of the transformed cells in the presence of antibiotic and by amplification of the resistance gene from the genomic DNA of transformed cells
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Análise farmacogenômica de pacientes submetidos à dupla antiagregação plaquetária / Pharmacogenomics analysis of patients undergoing double platelet antiagregationLuchessi, André Ducati 11 August 2011 (has links)
O presente estudo avaliou o perfil farmacogenômico de 338 pacientes, sob terapia antiagregante. Os pacientes foram submetidos a tratamento prévio com AAS (100mg/dia) e clopidogrel (75mg/dia) por no mínimo cinco dias antes da angioplastia coronária. Os indivíduos com resposta considerada indesejada <30% de inibição de PRU (do inglês, P2RY12 Reaction Unit) para clopidogrel e >550 ARU (do inglês, Aspirin Reaction Unit), foram considerados como não respondedores. As concentrações plasmáticas dos antiagregantes foram determinadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa do tipo triploquadrupolo (LC-MS/MS). A taxa da inibição da agregação plaquetária foi medida utilizando-se o sistema VerifyNow®. A expressão gênica global das células totais do sangue periférico foi avaliada pela tecnologia de microarranjos de DNA Human Exon ST 1.0 Array. Características genotípicas dos pacientes também foram avaliadas pelo sistema Sequenom®. Assim, foi possível obter como resultados a identificação de 64% e 10% para pacientes não respondedores ao clopidogrel e AAS respectivamente, sendo que para o primeiro foi possível identificar a associação desta não resposta a variáveis clínicas como diabetes (p = 0,003), hipertensão (p = 0,011) e hábito de fumar (p = 0,041) e sexo (p = 0,022) e idade dos pacientes (p = 0,004) em relação à resposta ao AAS. O método de quantificação simultânea do clopidogrel, seu metabólito majoritário e do AS (metabólito do AAS), apresentou limites de quantificação entre de 2 a 500 ng/mL, 2 a 2000 ng/mL e de 20 a 2000 ng/mL, respectivamente. O estudo de associação encontrou uma relação significante da presença dos SNPs presentes nos genes CYP5A1 (rs2299890) e CYP2C19 (rs4244285 e rs3758580), com a variação na resposta ao clopidogrel, obtendo um valor de p corrigido pelo teste de permutação inferior a 0,001. Como também, uma fraca associação da variação na resposta do AAS com o SNP rs9605030 do gene COMT (p = 0,009). Os resultados do microarranjos relacionaram a resposta terapêutica ao clopidogrel com os genes CA2, MKRN1, ABCC3 e MBP seguido dos genes NFIA e IGF1R para a resposta ao AAS. Concluindo que o estudo farmacogenômico apresentou todo o seu potencial para relacionar variáveis como resposta, concentração farmacológica plasmática, SNPs e expressão global de RNAm, possibilitando assim compreender melhor a variação no tratamento antiagregante. / This study investigated the pharmacogenomics profile of 338 patients under antiplatelet therapy. Patients undergoing pretreatment with ASA (100 mg/day) and clopidogrel (75mg/day) for at least five days prior to coronary angioplasty. Individuals with response <30% of PRU (P2RY12 reaction unit) were considering non responder for clopidogrel and >550 of ARU (aspirin reaction unit), were considered as non responders for ASA. Plasma concentrations of the antiagregation drugs were determined by liquid chromatography followed mass spectrometry of triple quadrupole detection (LC-MS/MS). The rate of inhibition of platelet aggregation was measured using the VerifyNow® system. The global gene expression of total cells in blood was assessed by DNA microarray technology Human Exon 1.0 ST Array. Genotypic characteristics of the patients were also evaluated by the Sequenom® system. Thus it was possible to obtain results such as identification of 64% and 10% for patients non responders to clopidogrel and aspirin respectively, and for the first could identify the association of this response to variables such as diabetes (p = 0.003), hypertension (p = 0.011) and smoking (p = 0.041) for clopidogrel and sex and age in relation to response to ASA (p = 0.022 and p = 0.004, respectively). The method of simultaneous quantification of clopidogrel and its major metabolite of AS (metabolite of ASA), had quantification limits between 200 to 500 ng/mL 2000-2000 ng/mL and 20 to 2000 ng/mL, respectively. The association study found a significant grating presence of SNPs present in genes CYP5A1 (rs2299890) and CYP2C19 (rs4244285 and rs3758580), with the variation in the response to clopidogrel, obtaining a corrected p value by permutation test below 0.001. As well, a weak association of variation in the response of ASA with the SNP rs9605030 of the gene COMT (p = 0.009). The results of microarray related therapeutic response to clopidogrel with genes CA2, MKRN1, ABCC3 and MBP followed by NFIA and IGF1R genes for response to ASA. Concluding that the pharmacogenomics study showed its potential to relate variables such as response, plasma drug concentration, SNPs and global expression of mRNA, thus enabling better understand the variation in antiplatelet treatment.
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Análise estrutural e funcional do genoma de Xanthomonas axonopodis pv. citri / Structural and functional analyses of Xanthomonas axonopodis pv. citri genomeMoreira, Leandro Marcio 11 October 2006 (has links)
O cancro cítrico é uma doença que afeta diversas espécies de Citrus, cujo agente causal é Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). O genoma desta fitobactéria consiste de um cromossomo de ~5 Mpb e dois plasmídeos, que juntos codificam 4313 CDS (seqüências codificadoras), das quais 2710 apresentam similaridade com proteínas conhecidas. Neste trabalho realizamos uma análise comparativa detalhada do genoma de XAC com genomas de três fitopatógenos, Xanthomonas campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c e Xylella fastidiosa temecula. Com esta análise identificamos genes espécie e gênero-específicos, potencialmente relevantes para adaptação aos seus respectivos nichos ou hospedeiros, além de ilhas de inserção e deleção genômica putativas. Também identificamos vias metabólicas relacionadas com osmoproteção/osmorregulação e com degradação de compostos aromáticos em XAC, que possivelmente são determinantes na eficácia de sua interação com o hospedeiro. Analisamos o nível de expressão de 9 CDS após crescimento de XAC em diferentes concentrações de glicose e verificamos que este açúcar modula positivamente a expressão de CDS relacionadas à síntese de goma e ao sistema de osmoproteção. Além disso, descrevemos a construção de microarranjos de DNA representando 2760 CDS de XAC, constituindo-se uma nova ferramenta para estudos de genômica comparativa e expressão gênica deste fitopatógeno. / Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) is the bacterial pathogen that causes citrus canker disease in several species of Citrus plants. XAC genome consists of a main cromosome of ~5 Mpb and two plasmids that together encode 4313 CDS (coding sequences). Approximately 63% of the CDS have assigned biological functions. In this work, we present a detailed genomic comparison between the genomes of XAC and of three other phytopathogens, X. campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c and X. fastidiosa Temecula. Based on this analysis, we identified species and genus-specific genes that might be relevant for adaptation to their niches and hosts. We mapped putative insertion/deletion regions in the XAC genome possibly related to gene gains and losses during the divergence of the four bacterial lineages. We have identified the metabolic pathways related to osmoprotection/osmoregulation and aromatic compound degradation important for XAC efficient host colonization and interaction. Expression levels of 9 CDS were analyzed after XAC growth under different glucose concentrations revealing that this sugar upregulates the expression of CDS related to gum synthesis and to osmoregulation. In addition, we describe here the construction of a DNA microarray representing 2760 CDS of XAC as a new tool for comparative genomic and gene expression studies in this phytopathogen.
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Análise farmacogenômica de pacientes submetidos à dupla antiagregação plaquetária / Pharmacogenomics analysis of patients undergoing double platelet antiagregationAndré Ducati Luchessi 11 August 2011 (has links)
O presente estudo avaliou o perfil farmacogenômico de 338 pacientes, sob terapia antiagregante. Os pacientes foram submetidos a tratamento prévio com AAS (100mg/dia) e clopidogrel (75mg/dia) por no mínimo cinco dias antes da angioplastia coronária. Os indivíduos com resposta considerada indesejada <30% de inibição de PRU (do inglês, P2RY12 Reaction Unit) para clopidogrel e >550 ARU (do inglês, Aspirin Reaction Unit), foram considerados como não respondedores. As concentrações plasmáticas dos antiagregantes foram determinadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa do tipo triploquadrupolo (LC-MS/MS). A taxa da inibição da agregação plaquetária foi medida utilizando-se o sistema VerifyNow®. A expressão gênica global das células totais do sangue periférico foi avaliada pela tecnologia de microarranjos de DNA Human Exon ST 1.0 Array. Características genotípicas dos pacientes também foram avaliadas pelo sistema Sequenom®. Assim, foi possível obter como resultados a identificação de 64% e 10% para pacientes não respondedores ao clopidogrel e AAS respectivamente, sendo que para o primeiro foi possível identificar a associação desta não resposta a variáveis clínicas como diabetes (p = 0,003), hipertensão (p = 0,011) e hábito de fumar (p = 0,041) e sexo (p = 0,022) e idade dos pacientes (p = 0,004) em relação à resposta ao AAS. O método de quantificação simultânea do clopidogrel, seu metabólito majoritário e do AS (metabólito do AAS), apresentou limites de quantificação entre de 2 a 500 ng/mL, 2 a 2000 ng/mL e de 20 a 2000 ng/mL, respectivamente. O estudo de associação encontrou uma relação significante da presença dos SNPs presentes nos genes CYP5A1 (rs2299890) e CYP2C19 (rs4244285 e rs3758580), com a variação na resposta ao clopidogrel, obtendo um valor de p corrigido pelo teste de permutação inferior a 0,001. Como também, uma fraca associação da variação na resposta do AAS com o SNP rs9605030 do gene COMT (p = 0,009). Os resultados do microarranjos relacionaram a resposta terapêutica ao clopidogrel com os genes CA2, MKRN1, ABCC3 e MBP seguido dos genes NFIA e IGF1R para a resposta ao AAS. Concluindo que o estudo farmacogenômico apresentou todo o seu potencial para relacionar variáveis como resposta, concentração farmacológica plasmática, SNPs e expressão global de RNAm, possibilitando assim compreender melhor a variação no tratamento antiagregante. / This study investigated the pharmacogenomics profile of 338 patients under antiplatelet therapy. Patients undergoing pretreatment with ASA (100 mg/day) and clopidogrel (75mg/day) for at least five days prior to coronary angioplasty. Individuals with response <30% of PRU (P2RY12 reaction unit) were considering non responder for clopidogrel and >550 of ARU (aspirin reaction unit), were considered as non responders for ASA. Plasma concentrations of the antiagregation drugs were determined by liquid chromatography followed mass spectrometry of triple quadrupole detection (LC-MS/MS). The rate of inhibition of platelet aggregation was measured using the VerifyNow® system. The global gene expression of total cells in blood was assessed by DNA microarray technology Human Exon 1.0 ST Array. Genotypic characteristics of the patients were also evaluated by the Sequenom® system. Thus it was possible to obtain results such as identification of 64% and 10% for patients non responders to clopidogrel and aspirin respectively, and for the first could identify the association of this response to variables such as diabetes (p = 0.003), hypertension (p = 0.011) and smoking (p = 0.041) for clopidogrel and sex and age in relation to response to ASA (p = 0.022 and p = 0.004, respectively). The method of simultaneous quantification of clopidogrel and its major metabolite of AS (metabolite of ASA), had quantification limits between 200 to 500 ng/mL 2000-2000 ng/mL and 20 to 2000 ng/mL, respectively. The association study found a significant grating presence of SNPs present in genes CYP5A1 (rs2299890) and CYP2C19 (rs4244285 and rs3758580), with the variation in the response to clopidogrel, obtaining a corrected p value by permutation test below 0.001. As well, a weak association of variation in the response of ASA with the SNP rs9605030 of the gene COMT (p = 0.009). The results of microarray related therapeutic response to clopidogrel with genes CA2, MKRN1, ABCC3 and MBP followed by NFIA and IGF1R genes for response to ASA. Concluding that the pharmacogenomics study showed its potential to relate variables such as response, plasma drug concentration, SNPs and global expression of mRNA, thus enabling better understand the variation in antiplatelet treatment.
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Análise estatística na interpretação de imagens: microarranjos de DNA e ressonância magnética funcional / Statistical analysis of image interpretation: DNA microarrays and functional magnetic resonanceVencio, Ricardo Zorzetto Nicoliello 01 September 2006 (has links)
O objetivo deste trabalho é apresentar os métodos originais em Bioinformática desenvolvidos para a análise estatística na interpretação dos dados de duas técnicas baseadas em imagens: a técnica de microarranjos de DNA e a técnica de ressonância magnética funcional. O interesse principal é abordar essas técnicas experimentais quando enfrenta-se uma situação clara de amostras escassas, isto é, quando existem relativamente poucas observações experimentais do fenômeno estudado, sendo a análise individual/personalizada o representante extremo desta situação, que tem que ser resolvida. Para tanto, opta-se pelo uso da Inferência Bayesiana no contexto da Teoria da Decisão sob Incerteza, implementada computacionalmente sob o arcabouço dos Sistemas de Suporte à Decisão. Ambas as tecnologias estudadas produzem dados complexos, baseados na interpretação das diferenças entre imagens obtidas da resposta do sistema a um estímulo e da resposta numa situação controle. O resultado deste trabalho é o desenvolvimento de dois sistemas de suporte à decisão, chamados HTself e Dotslashen, para a análise de dados de microarranjos e ressonância magnética funcional, respectivamente; e de seus métodos matemáticos/computacionais subjacentes. Os sistemas desenvolvidos extraem conhecimento racional de bancos-de-dados normativos, através de modelos matemáticos específicos, contornando então o problema de amostras escassas. Finalmente, neste trabalho são descritas aplicações a problemas reais, para destacar a utilidade dos sistemas de suporte à decisão desenvolvidos nas áreas de Biologia Molecular e Neuroimagem Funcional. / The goal of this work is to present the novel Bioinformatics methods that were developed aiming the statistical analysis of two image-based techniques: DNA microarrays and functional magnetic resonance imaging. The main interest is to approach these experimental techniques in small sample size situations, i.e., when there are relatively few experimental observations of the phenomena of interest, for which the case of single subject/datum analysis is its most extreme. In order to approach these problems we chose to use Bayesian Inference in the context of the Decision Theory under Uncertainty, computationally implemented under the Decision Support Systems framework. Both technologies produce complex data, based on the interpretation of differences between images from the response to a given stimulus and the control situation. The result of this work is the development of two decision support systems, called HTself and Dotslashen, to analyze microarray and functional magnetic resonance imaging data, respectively; and the underling mathematical and computational methods. These systems use the rational knowledge from normative databases implemented in specific mathematical models, overcoming the problem of small sample size. Finally, in this work it is described applications to real problems in order to stress the utility for Molecular Biology and Functional Neuroimaging of the developed decision support systems.
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Perfil de expressão de genes modulados pela amilina em ilhotas pancreáticas de rato / Gene expression profile of genes modulated by amylin in rat pancreatic isletsOliveira, Leonardo Sokolnik de 04 March 2009 (has links)
O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM 2) é uma doença crônica na qual os pacientes apresentam capacidade secretória de insulina inadequada para suplantar a resistência insulínica concomitante e, como resultado, advém a hiperglicemia. Os mecanismos que explicam a diminuição da secreção insulínica não são completamente conhecidos e acredita-se que o depósito de amilina, um achado histopatológico freqüente nesses pacientes, esteja envolvido. A amilina humana é uma proteína co-secretada com a insulina capaz de se agregar e se depositar nas ilhotas pancreáticas. Ainda não está totalmente estabelecido se a toxicidade da amilina humana é mediada pelas fibrilas maduras, conforme demonstrado em trabalhos mais antigos, ou por oligômeros de tamanho intermediário, como tem sido aventado nos trabalhos mais recentes. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de genes modulados por oligômeros, bem como por fibrilas maduras de amilina, em ilhotas pancreáticas de rato. As ilhotas foram isoladas a partir de ratos Wistar, mantidas em cultura por 24 horas e a seguir tratadas com 10 M de oligômeros ou de fibrilas maduras de amilina por 24 horas adicionais em concentração fisiológica ou suprafisiológica de glicose. O RNA total foi extraído e utilizado para análise da expressão gênica por microarranjos de DNA. O conteúdo de RNA de alguns genes modulados nas condições experimentais estudadas também foi avaliado por RT-qPCR, a fim de validar os resultados obtidos pela análise de microarranjos. A análise das vias significativamente afetadas pelas preparações de amilina demonstrou que, em ilhotas mantidas em concentração fisiológica de glicose, os oligômeros de amilina modularam, entre outros, processos relacionados à Resposta ao Estresse e à Apoptose, processos não modulados pelas fibrilas maduras de amilina. Em concentração suprafisiológica de glicose, o tratamento com oligômeros de amilina deixou de modular as vias relacionadas a Estresse e Apoptose, surgindo como moduladas vias relacionadas aos processos de Regulação da endocitose e Biossíntese de óxido nítrico. Os resultados do RT-qPCR sugeriram que somente os oligômeros (e não as fibrilas maduras) de amilina modulam genes relacionados a apoptose (Anxa1, Rab5a) e ao estresse oxidativo (Nos2 e Xdh), o que vai ao encontro dos estudos mais recentes que atribuem às fibrilas intermediárias um papel na citotoxicidade das células . Um achado novo do presente estudo foi a identificação do mRNA do Gipr (receptor de polipeptídeo inibitório gástrico) como alvo de regulação negativa pelos oligômeros de amilina, o que sugere que esse possa ser um mecanismo adicional pelo qual essas fibrilas intermediárias de amilina sejam deletérias para a célula pancreática. / Type 2 diabetes mellitus is a chronic disease in which there is inability of pancreatic cells to secrete sufficient insulin to overcome the insulin resistance in the peripheral tissues with resultant hyperglycemia. Mechanisms leading to diminished insulin secretion are not completely known and the amyloid deposit, a frequent histopathological finding in patients with type 2 diabetes, is believed to be involved. Human amylin, a protein co-secreted with insulin, is capable of aggregating and forming deposits in the pancreatic islets. It is not fully established whether amylin cytotoxicity is mediated by mature amylin fibrils or by soluble oligomers. The objective of this study was to evaluate the gene profiling modulated by oligomers as well as by mature amylin fibrils in rat pancreatic islets. The islets were isolated from Wistar rats, maintained in culture for 24 hours and then treated with 10 M of oligomers or mature amylin fibrils for additional 24 hour in physiologic and supraphysiologic glucose concentrations. Total RNA was extracted and used for gene expression analysis by microarray. RNA content of some modulated genes was evaluated by RT-qPCR in order to validate the results obtained from the microarray analysis. The analysis of the pathways significantly affected by the two amylin preparations demonstrated that, in islets maintained in physiological glucose concentration, amylin oligomers modulated, among others, processes related to Response to stress and to Apoptosis, which were not modulated by mature amylin fibrils. In supraphysiological glucose concentration, treatment with oligomers did not modulate the pathways related to Stress and Apoptosis, which were replaced by processes related to Endocytosis regulation and Nitric oxide biosynthesis. RT-qPCR results suggested that only amylin oligomers modulate genes related to apoptosis (Anxa1, Rab5a) and oxidative stress (Nos2 e Xdh), which is in agreement with studies indicating a role for oligomers in the cytotoxicity of cells. A new finding of the present study was the identification of the Gipr (gastric inhibitory polypeptide receptor) mRNA as a target for downregulation by amylin oligomers, which suggests that this might be an additional mechanism by which these oligomers are deleterious to the pancreatic cells.
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Integração de dados de expressão gênica global em tuberculose / Integration of data from global gene expression in tuberculosisFerreira, Carlos Diego de Andrade January 2011 (has links)
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Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Vice Direção de Ensino, Informação e Comunicação. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A tuberculose (TB) continua sendo uma das principais doenças associadas à morbidade e mortalidade no mundo, correspondendo a 1,7 milhões de mortes somente em 2009. Cerca de um terço da população mundial está infectada com seu agente etiológico, o Mycobacterium tuberculosis. Doenças infecciosas como a TB levam a modulações na expressão gênica do hospedeiro, que podem ser detectadas globalmente por ensaios de microarranjos de DNA. Estudos recentes in silico das respostas imunológicas moduladas em estudos de expressão gênica globais foram capazes de observar a diferença de expressão gênica de biomarcadores com potencial de diagnóstico e ferramentas de prognóstico na evolução da fase latente da tuberculose para a forma ativa da doença. Entretanto, até o momento nenhuma integração de diferentes estudos foi realizada. Os dados de microarranjos de DNA precisam ser submetidos a bancos de dados públicos, como o Gene Expression Omnibus (GEO), antes da publicação em artigos científicos, tornando-os disponíveis para uso por outros pesquisadores. A reanálise desses dados pode levar a novas descobertas, permitindo ainda a integração entre dados de diferentes experimentos ou até gerados em diferentes plataformas, como Affymetrix e Agilent. Nesta dissertação, onze conjuntos de dados referentes à infecção por M. tuberculosis, in vivo e in vitro, em hospedeiros humanos e murinos foram selecionados no GEO. Esses conjuntos de dados foram reanalisados e integrados para determinar quais os principais processos biológicos e vias de regulação gênica que estavam sofrendo alterações durante o processo infeccioso. Foram constatados que os processos biológicos relacionados com a resposta imune do hospedeiro, além de vias metabólicas relacionadas aos lisossomos, ao processo de apoptose, a receptores para ligação de citocinas, a receptores tipo NOD e a receptores tipo toll apresentavam alteração significativa nos conjuntos de dados reanalisados. Esses resultados apontam para utilização desses genes como biomarcadores de infecção e progressão a doença. Esses biomarcadores podem ser úteis no desenvolvimento de testes visando o diagnóstico e o prognóstico de tuberculose, bem como podem servir como alvos para futuras pesquisas no desenvolvimento de vacinas. / Tuberculosis (TB) remains a major disease associated with morbidity and mortality worldwide, accounting for 1.7 million deaths only in 2009. About a third of the world population is infected with its causative agent, Mycobacterium tuberculosis. Infectious diseases such as TB lead to modulation of host gene expression, which can generally be detected by DNA microarray assays. Recent studies of immune responses in silico modulated in global gene expression studies were able to observe the difference in gene expression of biomarkers with potential as diagnostic and prognostic tools in the evolution of the latent stage of tuberculosis to active disease. However, until now no integration of different studies has been performed. The DNA microarray data must be submitted to public databases, such as Gene Expression Omnibus (GEO), before the publication of scientific articles, making them available for use by other researchers. A reanalysis of these data can lead to new discoveries, while allowing the integration of data from different experiments or even generated in different platforms such as Affymetrix and Agilent. In this thesis, eleven data sets describing in vivo and in vitro infection with M. tuberculosis in human or murine hosts were selected in GEO. These data sets were reviewed and integrated to determine which biological processes and pathways were undergoing changes during the infectious process. It has been found that biological processes related to the host immune response, and metabolic pathways related to lysosomes, the process of apoptosis, cytokines-cytokines binding receptors, NOD like receptors and toll like receptors had a significant change in reanalyzed data sets. These results points to the use of these genes as biomarkers of infection and progression to disease while may serve as diagnostic and prognostic tests as well as targets for future research concerning the development of vaccines.
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Análise da expressão gênica no músculo esquelético de bovinos das raças Nelore e Aberdeen Angus e sua relação com o desenvolvimento muscular e a maciez da carneFerraz, André Luiz Julien [UNESP] 24 July 2009 (has links) (PDF)
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ferraz_alj_dr_jabo.pdf: 613372 bytes, checksum: 0c16778d62f1e6d94f350b8efbbbd6d8 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A divergência genética entre Bos taurus taurus e Bos taurus indicus é estimada em ~ 250.000 anos mas, apesar dessa proximidade filogenética, estes dois grupos de bovinos apresentam diferenças marcantes em relação à taxa de crescimento muscular e a maciez da carne. De maneira que este estudo foi delineado para avaliar perfil da expressão gênica diferencial no musculo Longissimus dorsi das raças Nelore e Aberdeen Angus com o objetivo de identificar conjuntos de genes cuja expressão está associada à manifestação das características acima mencionadas. Vinte bezerros machos de cada raça foram criados e terminados em regime de confinamento, metade dos quais foi abatida aos 15 e a metade restante aos 19 meses de idade. Nossos resultados sugerem fortemente que a ação autócrina e/ou parácrina do IGF-1 produzido no tecido muscular deve exercer um papel crucial na modulação da taxa de crescimento muscular e na maciez da carne de bovinos. Por outro lado, nossa análise das redes de interação gênica mostrou um grande número de genes que codificam proteínas que agem na proteólise muscular, pequeno número de inibidores e reguladores de proteases, assim como diversos genes relacionados com a morte celular programada nos animais que apresentaram maior maciez da carne, reforçando a hipótese do envolvimento de um complexo multi-enzimático (incluindo as calpaínas e outras proteases) no processo de amaciamento da carne, o qual seria semelhante ao processo de apoptose. / The genetic divergence between Bos taurus taurus and Bos taurus indicus is estimated to be ~ 250.000 years but, in despite of their phylogenetic proximity, this two bovine groups show remarkable differences in regard to the muscle growth rate and meat tenderness. Thus, this study was aimed to evaluate the differential gene expression profile in Longissimus dorsi muscle of Nellore and Aberdeen Angus breeds in order to identify set of genes whose expression is associated with the manifestation of the above-mentioned traits. Twenty male calves of each breed were grown and finished in the feedlot system, half of which was slaughtered at 15 and the remaining half at 19 months of age. Our results strongly suggest that the autocrine and/or paracrine action of the IGF-1 produced in the muscle might play a crucial role in the modulation of muscle growth rate and meat tenderness in beef cattle. On the other hand, our gene interaction network analysis revealed a large number of genes encoding proteins acting in the skeletal muscle proteolysis, a small number of inhibitors and regulators of proteases, as well as several genes related to the programmed cell death in animals that had greater tenderness of meat, reinforcing the hypothesis of the involvement of a multi-enzymatic complex (including calpains and other proteases) in the meat tenderization process, which resembles the apoptosis process.
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