O câncer de próstata é o quinto tipo mais comum de câncer no mundo e o mais comum em homens. Fatores clínicos e anatomopatológicos atualmente usados na clínica não são capazes de distinguir entre a doença indolente e a agressiva. Existe uma grande necessidade de novos marcadores de prognóstico, a fim de melhorar o gerenciamento clínico de pacientes de câncer de próstata. Além das anormalidades em genes codificadores de proteínas, alterações em RNAs não codificadores (ncRNAs) contribuem para a patogênese do câncer e, portanto, representam outra fonte potencial de biomarcadores de câncer de próstata. Entretanto, até o momento, poucos estudos de perfis de expressão de ncRNAs foram publicados. Este projeto teve como principal objetivo identificar perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína correlacionados com recorrência de tumor de próstata, a fim de gerar um perfil prognóstico com potencial uso como biomarcadores e elucidar o possível papel de ncRNAs no desenvolvimento do câncer. Para isso, foram analisados os perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína de um conjunto de 42 amostras de tecido tumoral de câncer de próstata de pacientes de amostras de pacientes submetidos à prostatectomia radical, com longo acompanhamento clínico (cinco anos) e conhecida evolução da doença Nós utilizamos microarranjos por nós desenhados e fabricados pela Agilent sob encomenda, interrogando aproximadamente 18.709 transcritos não codificadores longos (>500 nt), sem evidência de splicing, que mapeiam em regiões intrônicas dentro de 5.660 loci genômicos. Os dados de expressão foram extraídos de cada arranjo, normalizados entre todas as 42 amostras de pacientes. Usando uma estratégia de múltipla amostragem, foi identificado um perfil de expressão de mau prognóstico, contendo 51 transcritos intrônicos não codificadores de proteína. O perfil prognóstico de ncRNAs foi aplicado a um conjunto teste independente de 22 pacientes, classificando corretamente 82% das amostras. Uma análise de Kaplan-Meier dos pacientes do conjunto teste indicou que as curvas de sobrevida dos grupos de alto e baixo risco foram significativamente distintas (Log-rank test p = 0,0009; Hazard ratio = 23,4, 95% CI = 3,62 a 151,2), confirmando assim que este classificador é útil para identificar pacientes com alto risco de recorrência. Além disso, estas descobertas indicam um potencial papel destes RNAs intrônicos não codificadores na progressão do tumor de próstata e apontam para os RNAs intrônicos como potenciais novos marcadores de câncer / Prostate cancer is the fifth most common type of cancer in the world, and the most common in men. Clinical and anatomo-pathological factors currently used in clinic are not able to distinguish between the indolent and the aggressive disease. There is a major need of new prognostic makers in order to improve the clinical management of prostate cancer patients. Apart from abnormalities in protein-coding genes, changes in non-coding RNAs (ncRNAs) contribute to the pathogenesis of cancer and thus represent another potential source of prostate cancer biomarkers. However, few studies of expression profiles of ncRNAs have been published. This project aimed to identify expression profiles of protein-coding and non-coding genes correlated to prostate cancer biochemical recurrence. For this, we analyzed the expression profile of 42 prostate cancer samples from patients undergoing radical prostatectomy, with long follow-up (five years), and know disease outcome. We used a custom microarray designed by us and printed by Agilent, that probes 18,709 long (>500 nt) ncRNAs mapping to intronic regions within 5,660 genomic loci. The expression data were extracted from each array and normalized across all 42 samples. Using a multiple random sampling validation strategy, we identified an expression profile of poor prognosis, comprising 51 ncRNAs. The prognostic profile of ncRNAs was applied to an independent test set of 22 patients, correctly classifying 82% of the samples. A Kaplan-Meier analysis of the test set of patients indicated that the survival curves of high and low risk groups were significantly different (Log-rank test p = 0.0009, Hazard ratio = 23.4, 95% CI = 3.62 to 151.2) thus confirming that this classifier is useful for identifying patients at high risk of recurrence. Furthermore, these findings indicate a potential role of these intronic non-coding RNAs in the progression of prostate tumors and points to the intronic ncRNAs as potential new markers of cancer.

Este trabalho teve o objetivo de identificar genes candidatos para deficiência mental de herança ligada ao cromossomo X (DMLX). Foram investigadas quatro famílias, nas quais a deficiência mental de causa desconhecida segregava num padrão típico de herança ligada ao X, e 24 irmandades que incluíam pelo menos dois afetados do sexo masculino. O padrão de inativação do cromossomo X foi determinado nas mães dos afetados, pois desvios extremos no padrão de inativação são frequentes em mulheres portadoras de mutações no cromossomo X que causam DMLX. Nas famílias com padrão de herança ligada ao X, a deficiência mental foi mapeada, usando marcadores moleculares do tipo microssatélite, localizados ao longo do cromossomo X. Desequilíbrios cromossômicos submicroscópicos foram investigados por hibridação genômica comparativa baseada em array (array-CGH). Genes candidatos posicionais que já haviam sido associados a deficiência mental foram sequenciados pelo método de Sanger, em busca de mutações patogênicas. Em três famílias com DMLX, o probando teve seu exoma sequenciado. Nas três famílias com DMLX em que o sequenciamento do exoma foi realizado, foram detectadas mutações missense, levando à substituição de resíduos de aminoácidos conservados, que segregavam com a deficiência mental. Essas mutações foram consideradas como prováveis causas dos fenótipos nessas famílias: c.12378C>G no gene HUWE1 (HECT, UBA and WWE domain containing 1, E3 ubiquitin protein ligase); c.1413C>A no gene SHROOM4 (shroom family member 4) e c.262G>A no gene KIAA2022. As mulheres heterozigóticas quanto a essas mutações apresentaram desvio completo de inativação do cromossomo X (100:0). Mutações de ponto ou interrupção desses genes por rearranjos cromossômicos foram previamente descritas em alguns pacientes com deficiência mental. Em uma família, em que a DMLX estava associada a microcefalia e malformação de Dandy-Walker, uma microduplicação de aproximadamente 300 kb em Xq28 (ChrX :153,578,110-153,880,794;Hg19) foi detectada segregando com a doença. As mulheres heterozigóticas quanto a essa duplicação apresentaram desvios de inativação do X (80:20 e 90:10). Duplicações semelhantes foram anteriormente descritas em três famílias europeias e em um caso esporádico; a malformação de Dandy-Walker foi documentada em alguns desses pacientes. No estudo das 24 irmandades com pelo menos dois indivíduos do sexo masculino apresentando deficiência mental, o padrão de inativação do cromossomo X de suas mães foi determinado. Quatro mulheres (16,7%) apresentaram desvio total de inativação do cromossomo X (100:0), frequência significativamente maior do que a descrita para população geral de mulheres adultas (cerca de 2 %). Considerando que desvios extremos de inativação do cromossomo X são observados em aproximadamente 30% das portadoras de mutações que causam DMLX, concluiu-se que as quatro mães de homens que apresentam deficiência mental eram provavelmente portadores de mutações no cromossomo X, causadoras da deficiência mental em seus filhos. Não foram encontradas microdeleções ou microduplicações no cromossomo X nos probandos das quatro irmandades. / This study aimed at identifying candidate genes for X-linked intellectual disability (ID). Four families in which ID of unknown cause segregated as an X-linked trait, and 24 sibships with at least two affected males were investigated. The pattern of X-inactivation was determined in the mothers of affected males, taking into account that extremely skewing of X-inactivation is frequently found in women carrying mutations causative of X-linked intellectual disability (XLID). In the XLID families, ID was mapped by the genotyping of microsatellite markers localized throughout the X chromosome. Cryptic X-chromosome imbalances were investigated by array-based comparative genomic hybridization (a-CGH). Positional candidate genes that had been associated with ID were directly sequenced in the search for causative mutations. In three XLID families, the propositus had their exome sequenced. In three XLID families missense mutations that led to substitutions of conservative aminoacid residues were found that segregated with ID, and were probably causative of the clinical phenotypes: c.12378C>G in HUWE1 (HECT, UBA and WWE domain containing 1, E3 ubiquitin protein ligase) gene; c.1413C>A in the SHROOM4 (shroom family member 4) gene; c.262G>A in the KIAA2022 gene. Heterozygotes for these mutations had completely skewed X-inactivation (100:0 inactivation ratio). Point mutations or disruption of these genes by rearrangement breakpoints have been previously described in a few patients with ID. In one family in which XLID was associated with microcephaly and Dandy-Walker malformation, a duplication of approximately 300 kb at Xq28 (ChrX:153,578,110-153,880,794 - Hg19) was found segregating with the disease. Heterozygotes for this duplication had skewed X-inactivation (80:20 and 90:10 inactivation ratios). Similar duplications have been described in three European families and one sporadic case, Dandy-Walker malformation being documented in some patients. In the study of the 24 sibships with at least two males presenting with ID, the maternal pattern of X-inactivation was determined. Four women (16.7%) showed completely skewing of X-inactivation (100:0 inactivation ratio), a frequency significantly higher than the reported frequency of skewing >= 95% in women from the general population (about 2%). Considering this finding and that extremely skewed X-inactivation have been reported in about 30% of carriers of mutations causing XLID, it was assumed that the four mothers of males presenting with ID were most probably carriers of the mutations causative of ID in their sons. Chromosome X microimbalances were not found in the propositus, in these four sibships.

This work presents a methodology to describe the dynamics and topology of biological regulatory networks through the application of graph theory. We model these networks using Boolean rules and simulations performed with algorithms implemented in MATHEMATICA 7.0. Through this methodology, we characterize the regulatory network of opening and closing of the stomata of a plant by abscisic acid (ABA), including the relationships between the network s elements during the dynamics and the description of the state-space by comparing each one of its elements. For the state of cellular replicative senescence in humans, the goal is to describe a regulatory network of proteins involving the mechanisms of Shelterin complex, DNA double-strand break signaling, and the cell cycle arrest in G1 phase. The network topology must involve a combination of pathways and modules to ensure the stability of the signal and the permanent cell-cycle arrest. The state senescent is also characterized by establishing a secretory phenotype (SASP) with both beneficial and harmful effects for the organism. Different pathways are identified along with the activation of NF-kB in the regulation of these phenotypes and in this sense, a regulatory network to regulate the SASP in replicative senescence is proposed and the main consequences of the SASP for human colon are identified via analysis of microarray data related to normal colon, inflamed colon, colonic adenoma and carcinoma of the colon. / Este trabalho apresenta uma metodologia para descrever a dinâmica e a topologia de redes biológicas regulatórias através da aplicação da teoria de grafos, da modelagem de redes a partir de regras booleanas e através do uso de simulações baseadas em algoritmos implementados no software MATHEMATICA 7.0. Por meio desta metodologia procurou-se caracterizar a rede de regulação de abertura e fechamento dos estômatos de uma planta pelo ácido abscísico (ABA), incluindo a relação entre os elementos da rede durante a dinâmica e a descrição do espaço de estados. No estudo do estado celular de senescência replicativa em humanos, o objetivo é descrever uma rede regulatória de proteínas envolvendo os mecanismos do complexo de Shelterin com a sinalização de duplas quebras no DNA e a sinalização da parada do ciclo celular na fase G1. Por meio desta rede, a topologia deve envolver a combinação de vias e módulos para garantir a estabilidade da sinalização e a parada permanente da célula no estado senescente. O estado senescente também é caracterizado pelo estabelecimento de um fenótipo secretor (SASP) com efeitos tanto benéficos quanto prejudiciais para o organismo. Diferentes vias estão identificadas juntamente com a ativação de NF-kB na regulação deste fenótipo e nesse sentido, uma rede regulatória do SASP em senescência replicativa é proposta e as principais consequências do SASP para o cólon humano são identificadas através da análise de dados de microarranjos que relacionam cólon normal, cólon inflamado, adenoma de cólon e carcinoma de cólon.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-19Bitstream added on 2014-06-13T19:42:46Z : No. of bitstreams: 1 stolf_r_dr_jabo.pdf: 614846 bytes, checksum: 82111cb3ffddd8bb8eb4829df0158e4a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A seca é, atualmente, o principal fator responsável por perdas na produção brasileira de soja. Em situações de déficit hídrico, vários mecanismos são acionados pela planta para aumentar a tolerância à seca. Conhecer esses mecanismos e como é regulada a expressão dos genes relacionados com resposta à seca, é essencial na identificação de rotas metabólicas envolvidas nos processos de defesa, e, conseqüentemente, no desenvolvimento de estratégias moleculares para obtenção de plantas mais tolerantes a essa condição. O estudo da expressão gênica em plantas requer a quantificação precisa de RNAm expressos em diferentes situações. Assim, inicialmente foram usados os eventos de soja geneticamente modificados para tolerância à seca, P58 e P1333, contendo a construção rd29a: Atdreb1a, em condições de 15% de umidade gravimétrica (UG) para hibridização em chips contendo 44 Kb de oligonucleotídeos, sendo possível identificar 100 genes diferencialmente expressos em cada evento, quando comparados com a planta controle. Posteriormente, foram utilizadas cultivares de soja contrastantes para a tolerância à seca, em diferentes condições de déficit hídrico no sistema de hidroponia, e construídos arranjos de cDNA a partir de biblioteca gerada, obtendo-se 145 genes diferencialmente expressos que codificam proteínas envolvidas direta elou indiretamente em rotas metabólicas de resposta a estresses bióticos e abióticos. Os grupos de genes identificados como diferencialmente expressos durante os tratamentos aplicados em ambos os experimentos foram classificados em categorias funcionais, entre eles genes envolvidos na produção de energia, fatores de transcrição, genes envolvidos em diferentes vias anabólicas e/ou catabólicas como aminoácidos, lipídeos, carboidratos e no metabolismo fotossintético, genes de respostas a estresses, genes que participam... / The drought is currently the main responsible factor for losses Brazilian soybeans production. In water stress situation, several mechanisms are triggered by the plant to increase tolerance to drought. Knowing these mechanisms and how is regulated the expression of genes related to the drought response is essential in identifying routes involved in the metabolic processes of defense, and, therefore, the development of molecular strategies to obtain more tolerant plants to this condition. The study of gene expression in plants requires the quantification of RNAm expressed in different situations. So, initially, two methodologies of DNA microarray for analysis in large scale of differential gene expression were conducted. First, soybeans events genetically modified for tolerance to drought, P58 and P1333 containing the construction rd29a: Atdreb1a under conditions of 15% gravimetric humidity (GH) were used in chips containing 44 Kb of oligonucleotides, being able to identify 100 differential gene expression in each event, compared with the control plant. Subsequently, contrasting cultivars to drought were used, in different conditions of water stress in the hidroponic system, and cDNA arrays were constructed, getting 145 differential gene expression that encode proteins involved directly and I or indirectly on routes of metabolic response to biotic and abiotic stresses. The groups of genes identified with differential expression during the treatments applied in both experiments were classified into functional categories, including genes involved in the production of energy, of transcription factors, genes involved in different ways anabolics and I or catabolics as amino acids, lipids, carbohydrates and the photosynthetic metabolism, gene responses to stresses, genes that participate in the synthesis of proteins, cell communication, the cell cycle, cellular transport genes with... (Complete abstract click electronic access below)

A análise da expressão gênica em larga escala é de fundamental importância para a melhor compreensão do funcionamento celular e dos mecanismos de regulação gênica. Ela possibilita a medida dos níveis de expressão de milhares de genes simultaneamente, o que torna possível uma visão mais abrangente do sistema biológico. Dentre as principais técnicas experimentais disponíveis para esta finalidade, a tecnologia de microarranjo tem sido amplamente utilizada. O objetivo desta dissertação foi determinar os genes de V. parahaemolyticus que têm sua expressão induzida ou reprimida na presença do aminoaçúcar N-acetilglucosamina (NAG). V. parahaemolyticus é uma bactéria marinha, comumente encontrada na água e em associação com organismos marinhos. O NAG é um dos aminoaçúcares mais abundantes no meio marinho. Para isso, Vibro parahaemolyticus RIMD2210633, foi cultivada em dois meios como fontes de energia. O primeiro meio composto por maltose e NAG e o segundo apenas por NAG. O cultivo bacteriano foi feito em condições aeróbicas, sob baixa agitação, a 28C. Foram retiradas duas amostras do cultivo no tempo de 24 horas após o início do experimento a fim de realizar a extração de mRNA e a preparação do cDNA. Os experimentos foram feitos em três replicas. As misturas de cDNA preparadas a partir do RNA extraído de cada réplica foram utilizadas em hibridizações em lâminas de microarranjo contendo um total de 4832 ORFS do genoma de V. parahaemolyticus RIMD2210633. A análise comparativa da expressão gênica de V. parahaemolyticus nas duas condições de cultivo resultou na detecção de 59 genes com expressão induzida, 38 genes reprimidos, e 4245 sem expressão modificada (aumentada ou diminuída) na presença de NAG. No total, 523 genes foram excluídos da comparação pois a hibridização não foi satisfatória. Ocorreu uma ordenação dos genes seguindo a classificação funcional do banco de dados TIGR-CMR e KEGG. Os genes com expressão induzida, pertencem principalmente às classes de funções regulatórias, metabolismo de energia, e proteínas de transporte. Foram também encontradas proteínas PilA e de quimiotaxia, sugerindo um papel da NAG na transformação. Já os genes de expressão reprimida compreendem principalmente as funções de metabolismo de energia, endereçamento celular, e proteínas hipotéticas. O presente estudo demonstrou que NAG interfere na regulação de diferentes processos celulales, incluindo a capacidade de captura de DNA do meio por V. parahaemolyticus. / Large scale gene expression analysis has fundamental importance for understanding cellular function and gene regulation mechanics. It enables the measurement of expression levels of thousands of genes simultaneously, and makes possible a wider understanding of the biological system. Among the main experimental techniques available for this purpose, microarray technology has been widely used. The objective of this work was to determine the genes of Vibrio parahaemolyticus which have their expression induced or repressed in presence of amino-sugars N-acetylglucosamine (NAG). V. parahaemolyticus is a marine bacterium, commonly found in water and in association with marine organisms. NAG is one of the most abundant amino sugars in the marine environment. For this, V. parahaemolyticus RIMD2210633, was cultivated in two media as sources of energy. The first medium consists of maltose and NAG (control) and the second only by NAG (treatment). Bacterial culture was done under aerobic conditions and low agitation at 28C. Two samples were drawn from the medium 24 hours after the experiment beginning in order to perform the extraction of mRNA and preparation of cDNA. Three replicas of the experiments were made. Mixtures of cDNA prepared from RNA extracted from each replicate were used in hybridizations in microarray slides containing a total of 4832 ORFS from the V. parahaemolyticus RIMD2210633 genome. Comparative analysis of gene expression of V. parahaemolyticus in two culture conditions resulted in detection of 59 genes with expression induced, 38 repressed genes, and 4245 without modified expression (increased or decreased) in presence of NAG. In total, 523 genes were excluded from this comparison because the hybridization was unsatisfactory. There was a gene ordination following the functional classification of the database TIGR-CMR and KEGG. The genes with induced expression mainly belong to classes of regulatory functions, energy metabolism, and transport proteins. PilA and Chemotaxis proteins were found, suggesting a role of NAG in the transformation. Repressed expression genes are mainly included in the functions of energy metabolism, cell address, and hypothetical proteins. This study demonstrated that NAG interfere in regulation of different cell processes, including the ability to capture DNA from the medium by V. parahaemolyticus.

RNAs não codificadores longos (lncRNAs) compõem uma fração significativa do transcriptoma. Alterações na expressão de lncRNAs já foram observadas em vários cânceres humanos, mas ainda não foram exploradas no adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC), uma doença devastadora e agressiva para a qual faltam métodos para diagnóstico precoce e tratamentos efetivos. Utilizando uma plataforma de microarranjo de cDNA com sondas para 984 lncRNAs e 2371 mRNAs, o presente estudo identificou conjuntos de lncRNAs expressos em 38 amostras clínicas pancreáticas. O enriquecimento de (i) elementos regulatórios associados às regiões promotoras (H3K4me3); (ii) possíveis inícios de transcrição (CAGE-tags); (iii) presença de elementos conservados sugere que ao menos uma fração desses RNAs seja originada a partir de unidades transcricionais independentes, reguladas e possivelmente funcionais. Foram identificadas assinaturas de expressão gênica compostas por mRNA e lncRNAs associadas ao tumor primário e à metástase pancreática. A assinatura gIenica associada à metástase apresentou enriquecimento RNAs intrônicos de loci gênicos associados à via MAPK quinase. O aumento de expressão dos transcritos intrônicos dos loci PPP3CB, MAP3K14 e DAPK1 foi confirmado por qPCR em metástases. Em conjunto, este trabalho aponta para a importância de lncRNAs intrônicos no PDAC e para a necessidade de estudos mais aprofundados para uma melhor compreensão do papel dessa classe de transcritos na biologia da doença. / Long noncoding RNAs (lncRNAs) compose a significant fraction of transcriptome. Altered expression of lncRNAs has been observed in diverse human cancers, but has not being investigated in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), a devastating and aggressive disease that lack early diagnosis methods and effective treatments. Using a cDNA microarray platform with probes interrogating 984 lncRNAs and 2371 mRNA, the present study identified subsets of lncRNAs expressed in 38 pancreatic clinical samples. Enrichment of (i) regulatory elements associated to promoter region (H3K4me3); (ii) putative transcription start site (CAGEtags) and (iii) conserved elements, suggest that at least a fraction of these RNAs could be independent transcriptional unit, regulated, an possibly functional. Gene expression signatures comprised of mRNAs and lncRNAs and associated to primary or metastatic tumors were found. A gene signature associated to metastasis was enriched in intronic ncRNAs mapping to gene loci associated to the MAPK pathway. Over expression of intronic RNAs from PPP3CB, MAP3K14 and DAPK1 was confirmed by qPCR in metastatic samples. Taken together, this study points to the importance of intronic lncRNAs in PDAC and for the need to study this class of ncRNAs in greater detail to better understand its role in the biology of PDAC.

Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global durante a fase de esporulação do fungo aquático Blastocladiella emersonii utilizando a tecnologia dos microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3.773 genes distintos. Ao todo 615 genes foram classificados como induzidos enquanto 645 foram classificados como reprimidos ao longo da esporulação. As categorias funcionais mais representadas entre os genes induzidos foram: microtúbulo e citoesqueleto, transmissão de sinal, atividade de ligação ao íon Ca2+, proteólise (apenas no início da esporulação) e biogênese e organização do cromossomo (apenas no final da esporulação). Dentre os genes reprimidos, as categorias funcionais mais representadas foram: biossíntese de proteína, transporte de carboidratos e metabolismo energético. A comparação dos dados de expressão gênica da esporulação com aqueles obtidos recentemente em nosso laboratório para a germinação mostrou um grande número de genes regulados inversamente ao longo das duas fases de diferenciação do ciclo de vida de B. emersonii. Muitos genes induzidos na esporulação são reprimidos na germinação e vice versa. Analisamos também o efeito de glicose e triptofano sobre a expressão gênica durante a formação dos zoósporos, tendo em vista que tais nutrientes são capazes de inibir a esporulação de B. emersonii. Nossos resultados mostraram que na presença de glicose (1%) genes envolvidos na composição e atividade do citoesqueleto foram superexpressos, enquanto na presença do aminoácido triptofano houve um aumento na expressão de genes envolvidos no processo de enovelamento de proteínas e proteólise, e na resposta ao estresse oxidativo. Além disso, genes envolvidos no processo de esporulação propriamente dito foram reprimidos durante o tratamento com triptofano. Investigamos também a via de sinalização por GMP cíclico (cGMP), cujos níveis aumentam consideravelmente durante a esporulação de B. emersonii. Iniciamos o estudo com uma busca no banco de ESTs de B. emersonii (http://blasto.iq.usp.br) por seqüências que codificassem enzimas envolvidas na síntese e degradação de cGMP. Foram encontradas três ESTs que codificam domínios catalíticos que parecem pertencer a três diferentes guanilato ciclases e uma EST codificando uma fosfodiesterase com alta similaridade com fosfodiesterases que possuem alta afinidade por cGMP. Experimentos de microarranjos de cDNA validados por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram que os quatro transcritos são expressos durante esporulação, com picos de indução durante a fase tardia da esporulação, momento em que ocorre a biogênese dos zoósporos. Além disso, dados obtidos a partir de experimentos in vivo e in vitro utilizando inibidores das enzimas guanilato ciclase e óxido nítrico sintase, sugeriram a participação do íon Ca2+ e do radical livre óxido nítrico (•NO) na atividade de guanilato ciclase, em uma via do tipo Ca2+-•NO-cGMP. / In the present work, we analyzed global gene expression changes during the sporulation phase of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii using cDNA microarray technology with chips containing 3773 distinct genes. A total of 615 genes were upregulated and 645 were down-regulated along the sporulation of the fungus. The overrepresented functional categories among the induced genes were: microtubule and cytoskeleton, signal transduction, Ca2+ binding activity, proteolysis (only at the beginning of sporulation), and chromosome biogenesis and organization (only at the end of sporulation). Among the down-regulated genes, the over-represented functional categories were: protein biosynthesis, carbohydrate transport, and energetic metabolism. Sporulation gene expression data were compared with those obtained recently in our laboratory for the germination phase, showing that a great number of genes are inversely regulated along the two differentiation stages of B. emersonii life cycle. We also analyzed the effects of glucose and tryptophan on gene expression during biogenesis of the zoospores, as such nutrients are able to inhibit B. emersonii sporulation. Our results showed that in the presence of glucose (1%) genes related to activity and composition of cytoskeleton were over-expressed, while in the presence of tryptophan genes involved in protein folding, proteolysis and oxidative stress were induced. In addition, genes involved in the sporulation process per se were downregulated by tryptophan treatment. We also investigated the cyclic GMP signaling pathway, as the levels of this cyclic nucleotide increase considerably during B. emersonii sporulation. Firstly, we searched for sequences encoding enzymes involved in cGMP synthesis and degradation using the B. emersonii EST databank (http://blasto.iq.usp.br). Three sequences were found encoding distinct guanylate cyclase catalytic domains, and one showed high similarity with phosphodiesterases that exhibit high affinity for cGMP. Microarray experiments, validated by real time quantitative RT-PCR, showed that the four transcripts are induced during sporulation, reaching maximum levels at the late stages of sporulation, when zoospore biogenesis occurs. In addition, data obtained from in vivo and in vitro experiments using inhibitors for the enzymes guanylate cyclase and nitric oxide synthase indicated the involvement of the ion Ca2+ and the free radical nitric oxide (•NO) in guanylate cyclase activity, suggesting the existence of a Ca2+-• NO-cGMP signaling pathway.

INTRODUÇÃO: O aracnídeo Phoneutria nigriventer, também conhecido por aranha-armadeira, possui um veneno complexo, contendo vários peptídeos que ativam canais iônicos nas células. Dentre estes, só dois neuropeptídeos, Tx2-5 e Tx2-6, destacam-se por relaxar o músculo liso trabecular do corpo cavernoso, induzindo ereção peniana em camundongos e ratos. Este efeito tem sido associado à produção de oxido nítrico pela ativação de óxido nítrico sintases. No entanto, faltam estudos mais amplos para determinar o papel de Tx2-6 na indução da ereção. OBJETIVOS: Identificar os genes diferencialmente expressos no tecido erétil de camundongos após indução da ereção pela Tx2-6 utilizando microarranjos de oligonucleotídeos. Validação dos resultados obtidos nos microarranjos por PCR quantitativa e imuno-histoquímica. MATERIAIS E MÉTODOS: Camundongos machos e adultos da linhagem Swiss foram divididos em dois grupos: controle (n=10), inoculados pela via intracavernosa com 20 l de solução salina; e tratado (n=10), os quais receberam 0,006gg/animal do peptídeo Tx2-6 diluído em 20 l de salina pela via intracavernosa. Uma hora após o início da ereção no grupo tratado todos os animais foram sacrificados e retirou-se o pênis. Este último foi dividido em dois fragmentos, uma parte do material foi congelada em nitrogênio líquido e mantida a 80°C até a extração do RNA para os experimentos de microarranjos e PCR quantitativa; outra parte foi utilizada para avaliação imuno-histoquímica. RESULTADOS: No grupo tratado a ereção foi observada 30-45 minutos após aplicação de Tx2-6 e mantida durante 120 minutos. Os camundongos de grupo controle não apresentaram nenhum indício de ereção. Nos experimentos de microarranjos, onde foram analisados 34.000 genes representando o genoma total do camundongo, identificou-se 3.803 (12,3%) genes com expressão diferencial de pelo menos ±1,5 vez entre os grupos (1.823 genes superexpressos e 1.980 genes subexpressos no grupo tratado comparado ao controle). Os genes ednrb, sparc, fn1, sstr2, pdgfr foram selecionados para validação dos microarranjos por PCR quantitativa e confirmaram a superexpressão em relação aos controles. As proteínas Fn1, Sstr2 e Pdgfr resultaram aumentadas no grupo tratado após avaliação imuno-histoquímica. CONCLUSÕES: A inoculação de Tx2-6 pela via intracavernosa alterou o perfil de expressão gênica no tecido erétil de camundongos. O número de genes superexpressos foi similar ao de genes subexpressos. Serão necessários outros estudos para entender melhor as vias moleculares que Tx2-6 afeta na indução da ereção peniana. / INTRODUCTION: The Phoneutria nigriventer arachnid, also known as armed-spider, has a complex venom, composed by several peptides that affect cellular ionic channels. Among these, only two neuropeptides, Tx2-5 and Tx2-6 induce penile erection in mice and rats and this effect has been associated with the production of nitric oxide by the activation of nitric oxide synthases. Moreover, there is a scarcity of studies focusing on the role of Tx2-6 in the induction of erection. OBJECTIVES: To identify the differently expressed genes in the erectile tissue of mice after erection induction by Tx2-6 using oligonucleotide microarrays. To validate microarray results by quantitative PCR and immunohistochemistry. MATERIALS AND METHODS: Swiss adult male mice were divided in two groups: control (n=10) were injected intracavernously with 20 gl of saline solution; and treated (n=10) were injected intracavernously with 0.006gg/mouse of the Tx2-6 peptide diluted in 20 gl of saline solution. After checking the penile erection in the treated group, all mice were sacrificed one hour after the beginning of erection for the removal of the penis. Penile organ was divided into two fragments, one piece was immediately frozen in liquid-nitrogen and stored at -80°C until RNA extraction to make the microarray and quantitative PCR experiments; the other was reserved for immunohistochemistry analysis. RESULTS: In the treated group, erection was noticed 30-45 minutes after Tx2-6 inoculation and lasted for 120 minutes. Control mice did not present any sign of erection. Considering as differentially expressed genes with a ±1.5 fold expression difference, of the 34,000 genes on the microarray we identified 3,803 (12.3%) genes differentially expressed between the groups (1,823 genes up-regulated and 1,980 genes down-regulated in the treated group compared to controls). The ednrb, sparc, fn1, sstr2, pdgfr genes were selected for validation of microarray results by using quantitative PCR and confirmed the up-regulation when compared to controls. After immunohistochemistry analysis the Fn1, Sstr2 and Pdgfr proteins were found increased in the treated group. CONCLUSIONS: The intracavernous inoculation of Tx2-6 modified the gene expression profile of erectile tissue of mice. The number of upregulated and down-regulated genes was similar. Further studies are needed to understand the molecular pathways that Tx2-6 affect to induce penile erection.

Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T16:47:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_KaliandradeAlmeida_D.pdf: 14162647 bytes, checksum: a062a24283fc9889ec54663e0b624c2f (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A proteína Ki-1/57 foi descoberta através da reação cruzada do anticorpo monoclonal Ki-1 em células do linfoma de Hodgkin. Estudos anteriores demonstraram que Ki-1/57 interage com a proteína RACK-1, sofre fosforilação por PKCs e metilação por PRMT1, uma arginino metiltransferase que modula diversas proteínas ligantes ao RNA. Estudos mostraram que Ki- 1/57 é capaz de controlar o splicing do pré-mRNA do gene viral E1A. Análises por SAXS, gel filtração analítica e ultracentrifugação analítica indicaram uma estrutura bastante alongada e flexível para a construção C-terminal 6xhis-(122-413)Ki-1/57. Ensaios de proteólise limitada também mostraram uma baixa composição de núcleos hidrofóbicos estáveis e compactos, sugerindo que a proteína é intrinsecamente desordenada, o que pode explicar o elevado número de diferentes proteínas parceiras que ela é capaz de interagir. Neste trabalho foi identificada a interação de Ki-1/57 com proteínas da Família do X frágil, e sua localização no Perfil Ribossomal, além de ser capaz de ativar a tradução quando conectada ao gene repórter da Luciferase. Outra observação importante é que Ki-1/57 é sumoilada in vitro e in vivo, sendo as lisinas alvos desta sumoilação identificadas, e a proteína não sumoilada é incapaz de atuar no splicing do pré-mRNA do gene viral E1A. Mais experimentos foram feitos no sentido de caracterizar a interação RACK-Ki-1/57. A interação entre as duas proteínas é forte, possuindo uma constante de dissociação de 0,7 ?M, seguindo uma estequiometria de 1:1 observada em experimentos de sedimentação em equilíbrio. Experimentos de ultracentrifugação analítica mostraram que a proteína RACK1 tem propriedades hidrodinâmicas similares ao seu modelo predito por homologia, e que em solução ela é encontrada em sua forma monomérica, possuindo uma leve tendência a agregação. A superexpressão de Ki-1/57 e CGI-55 provocou a alteração de 413 e 217 genes respectivamente, que em sua grande maioria foram regulados negativamente. A maioria dos genes, que foram inibidos pela superexpressão de Ki-1/57, estão envolvidos na proliferação celular, muitos sendo expressos em diferentes tumores. Os dados obtidos no teste do MTS confirmam que houve uma diminuição na proliferação celular em células superexpressando as proteínas Ki-1/57 e CGI-55. Com base nos resultados obtidos neste trabalho, novas funções da proteína Ki-1/57 foram descritas, tais como: a influência de Ki-1/57 na proliferação celular, na tradução proteica e o papel importante que a modificação pós traducional, como a sumoilação, representa para que a proteína Ki-1/57 desempenhe sua função / Abstract: The protein Ki-1/57 was discovered through cross reactivity of the monoclonal antibody Ki-1 in cells of Hodgkin lymphoma. Previously studies demonstrated that Ki-1/57 interacts with RACK-1 protein, undergoes phosphorylation by PKCs and methylation by PRMT1, an arginine methyltransferase that modulates several RNA binding proteins. Studies have shown that Ki- 1/57 is able to control the pre-mRNA splicing of the viral E1A gene. SAXS analysis, analytical gel filtration and analytical ultracentrifugation indicate a rather elongated and flexible structure to build C-terminal 6xhis-(122-413) Ki-1/57. Limited proteolysis assays also showed a low composition of stable and compact hydrophobic cores, suggesting that the protein is intrinsically unstructured, it could explain the wide array of protein partners with which it is able to interact. In this work we identified the interaction of Ki-1/57 proteins with Family fragile X, and its location on Ribosomal profile, besides being able to increase the translation when tethered to the reporter gene Luciferase. Another important observation is that Ki-1/57 is sumoylated in vitro and in vivo, the targets of this lysine sumoylated were identified, and the not somoylated protein is unable to act in the pre-mRNA splicing of E1A. More experiments were made to characterize the interaction of RACK1 with Ki-1/57. The interaction between the two proteins is strong, possessing a dissociation constant of 0.7 ?M and follows the stoichiometry of 1:1 as observed by sedimentation equilibrium experiments. Analytical ultracentrifugation experiments showed that human RACK1 has similar hydrodynamic properties to that predicted to homology model, and that in solution it is found in its monomeric form, with a slight tendency to aggregation. Overexpression of Ki-1/57 and CGI-55 caused changes in 413 and 217 genes respectively, which were mostly negative regulated. Most genes that were inhibited by overexpression of Ki-1/57 are involved in cell proliferation, and expressed in different types tumors. The MTS data obtained confirm a decrease in cell proliferation through overexpressing of Ki-1/57 and CGI-55 protein. Based on the results of this study new functions for Ki-1/57 protein have been described such as: the influence of Ki- 1/57 in cell proliferation, in protein translation and the important role that the post translational modification, such as sumoylation, represents so that the protein Ki-1/57 performs its function / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Nesta tese, apresentamos nossas estratégias para desenvolver um ambiente matemático e computacional para análises em larga-escala de dados de expressão gênica obtidos pela tecnologia de microarranjos de DNA. As análises realizadas visaram principalmente à identificação de marcadores moleculares de diagnóstico e prognóstico de cânceres humanos. Apresentamos o resultado de diversas análises implementadas através do ambiente desenvolvido, as quais conduziram a implementação de uma ferramenta computacional para a anotação automática de plataformas de microarranjos de DNA e de outra ferramenta destinada ao rastreamento da análise de dados realizada em ambiente R. Programação eXtrema (eXtreme Programming, XP) foi utilizada como técnica de planejamento e gerenciamento dos projetos de análise dados de expressão gênica. Todos os conjuntos de dados foram obtidos por nossos colaboradores, utilizando-se duas diferentes plataformas de microarranjos de DNA: a primeira enriquecida em regiões não-codificantes do genoma humano, em particular regiões intrônicas, e a segunda representando regiões exônicas de genes humanos. A primeira plataforma foi utilizada para avaliação do perfil de expressão gênica em tumores de próstata e rim humanos, sendo que análises utilizando SAM (Significance Analysis of Microarrays) permitiram a proposição de um conjunto de 49 sequências como potenciais biomarcadores de prognóstico de tumores de próstata. A segunda plataforma foi utilizada para avaliação do perfil de transcritos expressos em sarcomas, carcinomas epidermóide e carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço. As análises com sarcomas permitiram a identificação de um conjunto de 12 genes relacionados à agressividade local e metástase. As análises com carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço permitiram a identificação de 7 genes relacionados à metástase linfonodal. / In this PhD Thesis, we present our strategies to the development of a mathematical and computational environment aiming the analysis of large-scale microarray datasets. The analyses focused mainly on the identification of molecular markers for diagnosis and prognosis of human cancers. Here we show the results of several analyses implemented using this environment, which led to the development of a computational tool for automatic annotation of DNA microarray platforms and a tool for tracking the analysis within R environment. We also applied eXtreme Programming (XP) as a tool for planning and management of gene expression analyses projects. All data sets were obtained by our collaborators using two different microarray platforms. The first is enriched in non-coding human sequences, particularly intronic sequences. The second one represents exonic regions of human genes. Using the first platform, we evaluated gene expression profiles of prostate and kidney human tumors. Applying SAM to prostate tumor data revealed 49 potential molecular markers for prognosis of this disease. Gene expression in samples of sarcomas, epidermoid carcinomas and head and neck epidermoid carcinomas was investigated using the second platform. A set of 12 genes were identified as potential biomarkers for local aggressiveness and metastasis in sarcoma. In addition, the analyses of data obtained from head and neck epidermoid carcinomas allowed the identification of 7 potential biomarkers for lymph-nodal metastases.