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Identificação e análise da expressão de genes relacioanados com tolerância à seca em soja através de microarranjos de DNA e PCR em tempo real /Stolf, Renata. January 2007 (has links)
Resumo: A seca é, atualmente, o principal fator responsável por perdas na produção brasileira de soja. Em situações de déficit hídrico, vários mecanismos são acionados pela planta para aumentar a tolerância à seca. Conhecer esses mecanismos e como é regulada a expressão dos genes relacionados com resposta à seca, é essencial na identificação de rotas metabólicas envolvidas nos processos de defesa, e, conseqüentemente, no desenvolvimento de estratégias moleculares para obtenção de plantas mais tolerantes a essa condição. O estudo da expressão gênica em plantas requer a quantificação precisa de RNAm expressos em diferentes situações. Assim, inicialmente foram usados os eventos de soja geneticamente modificados para tolerância à seca, P58 e P1333, contendo a construção rd29a: Atdreb1a, em condições de 15% de umidade gravimétrica (UG) para hibridização em "chips" contendo 44 Kb de oligonucleotídeos, sendo possível identificar 100 genes diferencialmente expressos em cada evento, quando comparados com a planta controle. Posteriormente, foram utilizadas cultivares de soja contrastantes para a tolerância à seca, em diferentes condições de déficit hídrico no sistema de hidroponia, e construídos arranjos de cDNA a partir de biblioteca gerada, obtendo-se 145 genes diferencialmente expressos que codificam proteínas envolvidas direta elou indiretamente em rotas metabólicas de resposta a estresses bióticos e abióticos. Os grupos de genes identificados como diferencialmente expressos durante os tratamentos aplicados em ambos os experimentos foram classificados em categorias funcionais, entre eles genes envolvidos na produção de energia, fatores de transcrição, genes envolvidos em diferentes vias anabólicas e/ou catabólicas como aminoácidos, lipídeos, carboidratos e no metabolismo fotossintético, genes de respostas a estresses, genes que participam... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The drought is currently the main responsible factor for losses Brazilian soybeans production. In water stress situation, several mechanisms are triggered by the plant to increase tolerance to drought. Knowing these mechanisms and how is regulated the expression of genes related to the drought response is essential in identifying routes involved in the metabolic processes of defense, and, therefore, the development of molecular strategies to obtain more tolerant plants to this condition. The study of gene expression in plants requires the quantification of RNAm expressed in different situations. So, initially, two methodologies of DNA microarray for analysis in large scale of differential gene expression were conducted. First, soybeans events genetically modified for tolerance to drought, P58 and P1333 containing the construction rd29a: Atdreb1a under conditions of 15% gravimetric humidity (GH) were used in "chips" containing 44 Kb of oligonucleotides, being able to identify 100 differential gene expression in each event, compared with the control plant. Subsequently, contrasting cultivars to drought were used, in different conditions of water stress in the hidroponic system, and cDNA arrays were constructed, getting 145 differential gene expression that encode proteins involved directly and I or indirectly on routes of metabolic response to biotic and abiotic stresses. The groups of genes identified with differential expression during the treatments applied in both experiments were classified into functional categories, including genes involved in the production of energy, of transcription factors, genes involved in different ways anabolics and I or catabolics as amino acids, lipids, carbohydrates and the photosynthetic metabolism, gene responses to stresses, genes that participate in the synthesis of proteins, cell communication, the cell cycle, cellular transport genes with... (Complete abstract click electronic access below) / Orientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Coorientador: Alexandre Lima Nepomuceno / Banca: Ricardo Vilela Abdelnoor / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Francismar Corrêa Marcelino / Banca: João Martins Pizauro Junior / Doutor
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Perfil de expressão de genes modulados pela amilina em ilhotas pancreáticas de rato / Gene expression profile of genes modulated by amylin in rat pancreatic isletsLeonardo Sokolnik de Oliveira 04 March 2009 (has links)
O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM 2) é uma doença crônica na qual os pacientes apresentam capacidade secretória de insulina inadequada para suplantar a resistência insulínica concomitante e, como resultado, advém a hiperglicemia. Os mecanismos que explicam a diminuição da secreção insulínica não são completamente conhecidos e acredita-se que o depósito de amilina, um achado histopatológico freqüente nesses pacientes, esteja envolvido. A amilina humana é uma proteína co-secretada com a insulina capaz de se agregar e se depositar nas ilhotas pancreáticas. Ainda não está totalmente estabelecido se a toxicidade da amilina humana é mediada pelas fibrilas maduras, conforme demonstrado em trabalhos mais antigos, ou por oligômeros de tamanho intermediário, como tem sido aventado nos trabalhos mais recentes. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de genes modulados por oligômeros, bem como por fibrilas maduras de amilina, em ilhotas pancreáticas de rato. As ilhotas foram isoladas a partir de ratos Wistar, mantidas em cultura por 24 horas e a seguir tratadas com 10 M de oligômeros ou de fibrilas maduras de amilina por 24 horas adicionais em concentração fisiológica ou suprafisiológica de glicose. O RNA total foi extraído e utilizado para análise da expressão gênica por microarranjos de DNA. O conteúdo de RNA de alguns genes modulados nas condições experimentais estudadas também foi avaliado por RT-qPCR, a fim de validar os resultados obtidos pela análise de microarranjos. A análise das vias significativamente afetadas pelas preparações de amilina demonstrou que, em ilhotas mantidas em concentração fisiológica de glicose, os oligômeros de amilina modularam, entre outros, processos relacionados à Resposta ao Estresse e à Apoptose, processos não modulados pelas fibrilas maduras de amilina. Em concentração suprafisiológica de glicose, o tratamento com oligômeros de amilina deixou de modular as vias relacionadas a Estresse e Apoptose, surgindo como moduladas vias relacionadas aos processos de Regulação da endocitose e Biossíntese de óxido nítrico. Os resultados do RT-qPCR sugeriram que somente os oligômeros (e não as fibrilas maduras) de amilina modulam genes relacionados a apoptose (Anxa1, Rab5a) e ao estresse oxidativo (Nos2 e Xdh), o que vai ao encontro dos estudos mais recentes que atribuem às fibrilas intermediárias um papel na citotoxicidade das células . Um achado novo do presente estudo foi a identificação do mRNA do Gipr (receptor de polipeptídeo inibitório gástrico) como alvo de regulação negativa pelos oligômeros de amilina, o que sugere que esse possa ser um mecanismo adicional pelo qual essas fibrilas intermediárias de amilina sejam deletérias para a célula pancreática. / Type 2 diabetes mellitus is a chronic disease in which there is inability of pancreatic cells to secrete sufficient insulin to overcome the insulin resistance in the peripheral tissues with resultant hyperglycemia. Mechanisms leading to diminished insulin secretion are not completely known and the amyloid deposit, a frequent histopathological finding in patients with type 2 diabetes, is believed to be involved. Human amylin, a protein co-secreted with insulin, is capable of aggregating and forming deposits in the pancreatic islets. It is not fully established whether amylin cytotoxicity is mediated by mature amylin fibrils or by soluble oligomers. The objective of this study was to evaluate the gene profiling modulated by oligomers as well as by mature amylin fibrils in rat pancreatic islets. The islets were isolated from Wistar rats, maintained in culture for 24 hours and then treated with 10 M of oligomers or mature amylin fibrils for additional 24 hour in physiologic and supraphysiologic glucose concentrations. Total RNA was extracted and used for gene expression analysis by microarray. RNA content of some modulated genes was evaluated by RT-qPCR in order to validate the results obtained from the microarray analysis. The analysis of the pathways significantly affected by the two amylin preparations demonstrated that, in islets maintained in physiological glucose concentration, amylin oligomers modulated, among others, processes related to Response to stress and to Apoptosis, which were not modulated by mature amylin fibrils. In supraphysiological glucose concentration, treatment with oligomers did not modulate the pathways related to Stress and Apoptosis, which were replaced by processes related to Endocytosis regulation and Nitric oxide biosynthesis. RT-qPCR results suggested that only amylin oligomers modulate genes related to apoptosis (Anxa1, Rab5a) and oxidative stress (Nos2 e Xdh), which is in agreement with studies indicating a role for oligomers in the cytotoxicity of cells. A new finding of the present study was the identification of the Gipr (gastric inhibitory polypeptide receptor) mRNA as a target for downregulation by amylin oligomers, which suggests that this might be an additional mechanism by which these oligomers are deleterious to the pancreatic cells.
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Genotipagem de grupos sanguíneos no suporte transfusional para pacientes com anemia falciforme / Blood group genotyping in transfusion support for sickle cell disease patientsCosta, Daiane Cobianchi da 18 August 2018 (has links)
Orientador: Lilian Maria de Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T03:42:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2011 / Resumo: A genotipagem de grupos sanguíneos em larga escala pela técnica de "microarray" tem se mostrado importante para doadores e pacientes, pois permite a determinação simultânea de múltiplos alelos que codificam antígenos de grupos sanguíneos e pode contribuir para a seleção mais exata de unidades de sangue compatíveis para pacientes politransfundidos. Neste trabalho, avaliamos a utilização da genotipagem em larga escala em 283 amostras de DNA de pacientes falciformes e, em 504 amostras de DNA de doadores de sangue pela plataforma HEA BeadChipTM na seleção de doadores fenótipo compatíveis em 4 níveis de compatibilidade de antígenos de grupos sanguíneos. Com o auxílio de um software e considerando que todos os doadores eram do grupo sanguíneo O, fomos capazes de encontrar um número significativo de doadores de sangue antígeno-negativo para pacientes aloimunizados e não aloimunizados quando buscamos por compatibilidade Nível 1 (ABO, D e um aloanticorpo) e Nível 2 (ABO, D, C, c, E, e, K1). Em Nível 1 encontramos uma média de 482 doadores compatíveis e em Nível 2 uma média de 237 doadores compatíveis. Entretanto, a média de doadores compatíveis Nível 3 (ABO, D, C, c, E, e, K1, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, Dia) foi de 75 e, Nível 4 (ABO, D, C, c, E, e, K1, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, Dia, Lua, Lub, M, N, Doa, Dob, Hy, Joa, k, Jsb) foi de 31. Além disto, realizamos compatibilidade genética para 35 pacientes com as amostras de DNA dos pacientes e das unidades de sangue compatibilizadas para eles por técnicas sorológicas. Vinte e hum pacientes apresentaram discrepâncias para vários antígenos entre o seu perfil antigênico e as unidades de sangue sorológicamente compatibilizadas para eles, o que demonstra que as técnicas moleculares são superiores às técnicas sorológicas na identificação de unidades de sangue compatíveis para estes pacientes / Abstract: DNA arrays, with their high-throughput capability are particularly suited for mass screening donors because they permit the simultaneous determination of multiple alleles encoding RBC antigens and can facilitate the provision of more extensively matched blood for patients. Based on this we evaluated the usefulness of DNA array technology to provide a means to precisely genotype match donor blood units to the antigen-negative type of patients with SCD. We searched for compatible units for 283 SCD patients performing extended human erythrocyte antigen (xHEA) typing on the patient samples and on 504 donor samples. The degree of matching was determined at 4 increasingly stringent levels of compatibility. Using a special software, we were able to find 482 compatible donors for Level 1 (ABO, D and 1 Antibody) , 237 for Level 2 (ABO, D, C, c, E, e, K1), 75 for Level 3 (ABO, D, C, c, E, e, K1, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, Dia) and 31 for Level 4 (ABO, D, C, c, E, e, K1, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, Dia, Lua, Lub, M, N, Doa, Dob, Hy, Joa, k, Jsb). We also investigated antigen-match RBC units with 35 recipients using blood group genotypes at the 4 levels of matching stringency. Units selected were serologically matched to the patients based on their ABO, Rh and K phenotypes and presence of antibody (ies). Twenty-one from 35 SCD patients presented discrepancies or mismatches for multiple antigens between their xHEA antigen profile and the blood units antigen profile serologically matched for them. According to these results we were able to find a better match for the patients in our extended HEA (xHEA)-typed units, and in the majority of cases the degree of matching was enhanced and the patients benefit to receive the transfusions as shown by better in vivo RBCs survival. DNA array based blood grouping typing of donors and patients showed to be a cost-effective procedure and has demonstrated improvements in SCD patients care facilitating their transfusion support and preventing the alloimmunization and hemolytic transfusion reactions / Mestrado / Ciencias Medicas / Mestre em Clinica Medica
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Análise do microtranscritoma em variedades de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) submetidas a estresse hídrico / Microtranscriptome analysis of sugarcane (Saccharum spp.) cultivars under drought stressMattos, Raphael de Souza 18 August 2018 (has links)
Orientador: Marcelo Menossi Teixeira, Andréa Akemi Hoshino / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T07:51:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2011 / Resumo: A cana-de-açúcar é uma das mais importantes espécies vegetais cultiváveis do mundo, sendo o Brasil o principal produtor. É uma fonte eficiente e de baixo custo para a obtenção de açúcar e etanol, que é considerado o mais promissor substituto do petróleo como fonte de energia a médio prazo, especialmente nos transportes. A seca é um dos principais estresses que reduzem a produtividade da cana e a produção de variedades tolerantes não só representa ganhos econômicos como contribui para a sustentabilidade dos canaviais. Embora a base genética da tolerância à seca ainda seja pouco conhecida, variedades desenvolvidas em programas de melhoramento tem apresentado progresso, apesar do ritmo ser mais lento que o desejado. Genômica funcional e desenvolvimento de marcadores colaboram aumentando a eficiência do melhoramento tradicional, mas ainda existem elementos do genoma que podem ser aproveitados de novas formas. Foram descobertos recentemente genes de função regulatória chamados microRNAs (miRNA) que também desempenham um papel na adaptação de plantas a diferentes estresses. Utilizando ESTs de cana-de-açúcar, sequenciamento de nova geração e microarranjos para avaliar a expressão de miRNAs sobre estresse hídrico foram descobertos novos miRNAs associados à seca e possíveis genes de miRNAs ligados à tolerância a este tipo de estresse / Abstract: Sugarcane (Saccharum spp.) is amongst the most relevant crops in the world and Brazil is the most prominent producer. It is an inexpensive and efficient source for commodities such as sugar and ethanol, the latter being increasingly considered the most promising immediate energy source substitute for oil, mainly in transportation. Apart from being very productive, it is largely affected by stress-related yield losses, notably from abiotic triggers. Drought stress is determinant for every crop field, and this is true for sugarcane as well. Although the molecular basis drought stress tolerance lacks further elucidation, newly developed cultivars have successfully reduced yield loss due to water shortage, albeit not at the desirable pace. Functional genomics and molecular markers development assist new cultivar selection programs by identifying and locating agronomically relevant alleles and QTL's, but there are other elements in the genome which can provide new ways to approach crop field improvement. The recently discovered microRNAs (miRNA) are regulatory genes found to have an important role in plants adaptation under different kinds of stresses. By using sugarcane ESTs, deep-sequencing and microarray technology to access stress induced miRNA expression, we have found novel sugarcane miRNA participating in the drought stress response and identified possible tolerance related miRNA genes / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular
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Análise estrutural e funcional do genoma de Xanthomonas axonopodis pv. citri / Structural and functional analyses of Xanthomonas axonopodis pv. citri genomeLeandro Marcio Moreira 11 October 2006 (has links)
O cancro cítrico é uma doença que afeta diversas espécies de Citrus, cujo agente causal é Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). O genoma desta fitobactéria consiste de um cromossomo de ~5 Mpb e dois plasmídeos, que juntos codificam 4313 CDS (seqüências codificadoras), das quais 2710 apresentam similaridade com proteínas conhecidas. Neste trabalho realizamos uma análise comparativa detalhada do genoma de XAC com genomas de três fitopatógenos, Xanthomonas campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c e Xylella fastidiosa temecula. Com esta análise identificamos genes espécie e gênero-específicos, potencialmente relevantes para adaptação aos seus respectivos nichos ou hospedeiros, além de ilhas de inserção e deleção genômica putativas. Também identificamos vias metabólicas relacionadas com osmoproteção/osmorregulação e com degradação de compostos aromáticos em XAC, que possivelmente são determinantes na eficácia de sua interação com o hospedeiro. Analisamos o nível de expressão de 9 CDS após crescimento de XAC em diferentes concentrações de glicose e verificamos que este açúcar modula positivamente a expressão de CDS relacionadas à síntese de goma e ao sistema de osmoproteção. Além disso, descrevemos a construção de microarranjos de DNA representando 2760 CDS de XAC, constituindo-se uma nova ferramenta para estudos de genômica comparativa e expressão gênica deste fitopatógeno. / Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) is the bacterial pathogen that causes citrus canker disease in several species of Citrus plants. XAC genome consists of a main cromosome of ~5 Mpb and two plasmids that together encode 4313 CDS (coding sequences). Approximately 63% of the CDS have assigned biological functions. In this work, we present a detailed genomic comparison between the genomes of XAC and of three other phytopathogens, X. campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c and X. fastidiosa Temecula. Based on this analysis, we identified species and genus-specific genes that might be relevant for adaptation to their niches and hosts. We mapped putative insertion/deletion regions in the XAC genome possibly related to gene gains and losses during the divergence of the four bacterial lineages. We have identified the metabolic pathways related to osmoprotection/osmoregulation and aromatic compound degradation important for XAC efficient host colonization and interaction. Expression levels of 9 CDS were analyzed after XAC growth under different glucose concentrations revealing that this sugar upregulates the expression of CDS related to gum synthesis and to osmoregulation. In addition, we describe here the construction of a DNA microarray representing 2760 CDS of XAC as a new tool for comparative genomic and gene expression studies in this phytopathogen.
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Análise estatística na interpretação de imagens: microarranjos de DNA e ressonância magnética funcional / Statistical analysis of image interpretation: DNA microarrays and functional magnetic resonanceRicardo Zorzetto Nicoliello Vencio 01 September 2006 (has links)
O objetivo deste trabalho é apresentar os métodos originais em Bioinformática desenvolvidos para a análise estatística na interpretação dos dados de duas técnicas baseadas em imagens: a técnica de microarranjos de DNA e a técnica de ressonância magnética funcional. O interesse principal é abordar essas técnicas experimentais quando enfrenta-se uma situação clara de amostras escassas, isto é, quando existem relativamente poucas observações experimentais do fenômeno estudado, sendo a análise individual/personalizada o representante extremo desta situação, que tem que ser resolvida. Para tanto, opta-se pelo uso da Inferência Bayesiana no contexto da Teoria da Decisão sob Incerteza, implementada computacionalmente sob o arcabouço dos Sistemas de Suporte à Decisão. Ambas as tecnologias estudadas produzem dados complexos, baseados na interpretação das diferenças entre imagens obtidas da resposta do sistema a um estímulo e da resposta numa situação controle. O resultado deste trabalho é o desenvolvimento de dois sistemas de suporte à decisão, chamados HTself e Dotslashen, para a análise de dados de microarranjos e ressonância magnética funcional, respectivamente; e de seus métodos matemáticos/computacionais subjacentes. Os sistemas desenvolvidos extraem conhecimento racional de bancos-de-dados normativos, através de modelos matemáticos específicos, contornando então o problema de amostras escassas. Finalmente, neste trabalho são descritas aplicações a problemas reais, para destacar a utilidade dos sistemas de suporte à decisão desenvolvidos nas áreas de Biologia Molecular e Neuroimagem Funcional. / The goal of this work is to present the novel Bioinformatics methods that were developed aiming the statistical analysis of two image-based techniques: DNA microarrays and functional magnetic resonance imaging. The main interest is to approach these experimental techniques in small sample size situations, i.e., when there are relatively few experimental observations of the phenomena of interest, for which the case of single subject/datum analysis is its most extreme. In order to approach these problems we chose to use Bayesian Inference in the context of the Decision Theory under Uncertainty, computationally implemented under the Decision Support Systems framework. Both technologies produce complex data, based on the interpretation of differences between images from the response to a given stimulus and the control situation. The result of this work is the development of two decision support systems, called HTself and Dotslashen, to analyze microarray and functional magnetic resonance imaging data, respectively; and the underling mathematical and computational methods. These systems use the rational knowledge from normative databases implemented in specific mathematical models, overcoming the problem of small sample size. Finally, in this work it is described applications to real problems in order to stress the utility for Molecular Biology and Functional Neuroimaging of the developed decision support systems.
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Expressão gênica diferencial durante a esporulação de Blastocladiella emersonii e estudo da sinalização por GMP cíclico / Differential gene expression during Blastocladiella emersonii sporulation and analysis of the cyclic GMP signaling pathwayVieira, André Luiz Gomes 24 April 2009 (has links)
Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global durante a fase de esporulação do fungo aquático Blastocladiella emersonii utilizando a tecnologia dos microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3.773 genes distintos. Ao todo 615 genes foram classificados como induzidos enquanto 645 foram classificados como reprimidos ao longo da esporulação. As categorias funcionais mais representadas entre os genes induzidos foram: microtúbulo e citoesqueleto, transmissão de sinal, atividade de ligação ao íon Ca2+, proteólise (apenas no início da esporulação) e biogênese e organização do cromossomo (apenas no final da esporulação). Dentre os genes reprimidos, as categorias funcionais mais representadas foram: biossíntese de proteína, transporte de carboidratos e metabolismo energético. A comparação dos dados de expressão gênica da esporulação com aqueles obtidos recentemente em nosso laboratório para a germinação mostrou um grande número de genes regulados inversamente ao longo das duas fases de diferenciação do ciclo de vida de B. emersonii. Muitos genes induzidos na esporulação são reprimidos na germinação e vice versa. Analisamos também o efeito de glicose e triptofano sobre a expressão gênica durante a formação dos zoósporos, tendo em vista que tais nutrientes são capazes de inibir a esporulação de B. emersonii. Nossos resultados mostraram que na presença de glicose (1%) genes envolvidos na composição e atividade do citoesqueleto foram superexpressos, enquanto na presença do aminoácido triptofano houve um aumento na expressão de genes envolvidos no processo de enovelamento de proteínas e proteólise, e na resposta ao estresse oxidativo. Além disso, genes envolvidos no processo de esporulação propriamente dito foram reprimidos durante o tratamento com triptofano. Investigamos também a via de sinalização por GMP cíclico (cGMP), cujos níveis aumentam consideravelmente durante a esporulação de B. emersonii. Iniciamos o estudo com uma busca no banco de ESTs de B. emersonii (http://blasto.iq.usp.br) por seqüências que codificassem enzimas envolvidas na síntese e degradação de cGMP. Foram encontradas três ESTs que codificam domínios catalíticos que parecem pertencer a três diferentes guanilato ciclases e uma EST codificando uma fosfodiesterase com alta similaridade com fosfodiesterases que possuem alta afinidade por cGMP. Experimentos de microarranjos de cDNA validados por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram que os quatro transcritos são expressos durante esporulação, com picos de indução durante a fase tardia da esporulação, momento em que ocorre a biogênese dos zoósporos. Além disso, dados obtidos a partir de experimentos in vivo e in vitro utilizando inibidores das enzimas guanilato ciclase e óxido nítrico sintase, sugeriram a participação do íon Ca2+ e do radical livre óxido nítrico (•NO) na atividade de guanilato ciclase, em uma via do tipo Ca2+-•NO-cGMP. / In the present work, we analyzed global gene expression changes during the sporulation phase of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii using cDNA microarray technology with chips containing 3773 distinct genes. A total of 615 genes were upregulated and 645 were down-regulated along the sporulation of the fungus. The overrepresented functional categories among the induced genes were: microtubule and cytoskeleton, signal transduction, Ca2+ binding activity, proteolysis (only at the beginning of sporulation), and chromosome biogenesis and organization (only at the end of sporulation). Among the down-regulated genes, the over-represented functional categories were: protein biosynthesis, carbohydrate transport, and energetic metabolism. Sporulation gene expression data were compared with those obtained recently in our laboratory for the germination phase, showing that a great number of genes are inversely regulated along the two differentiation stages of B. emersonii life cycle. We also analyzed the effects of glucose and tryptophan on gene expression during biogenesis of the zoospores, as such nutrients are able to inhibit B. emersonii sporulation. Our results showed that in the presence of glucose (1%) genes related to activity and composition of cytoskeleton were over-expressed, while in the presence of tryptophan genes involved in protein folding, proteolysis and oxidative stress were induced. In addition, genes involved in the sporulation process per se were downregulated by tryptophan treatment. We also investigated the cyclic GMP signaling pathway, as the levels of this cyclic nucleotide increase considerably during B. emersonii sporulation. Firstly, we searched for sequences encoding enzymes involved in cGMP synthesis and degradation using the B. emersonii EST databank (http://blasto.iq.usp.br). Three sequences were found encoding distinct guanylate cyclase catalytic domains, and one showed high similarity with phosphodiesterases that exhibit high affinity for cGMP. Microarray experiments, validated by real time quantitative RT-PCR, showed that the four transcripts are induced during sporulation, reaching maximum levels at the late stages of sporulation, when zoospore biogenesis occurs. In addition, data obtained from in vivo and in vitro experiments using inhibitors for the enzymes guanylate cyclase and nitric oxide synthase indicated the involvement of the ion Ca2+ and the free radical nitric oxide (•NO) in guanylate cyclase activity, suggesting the existence of a Ca2+-• NO-cGMP signaling pathway.
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Planejamento, gerenciamento e análise de dados de microarranjos de DNA para identificação de biomarcadores de diagnóstico e prognóstico de cânceres humanos / Planning, management and analysis of DNA microarray data aiming at discovery of biomarkers for diagnosis and prognosis of human cancers.Simões, Ana Carolina Quirino 12 May 2009 (has links)
Nesta tese, apresentamos nossas estratégias para desenvolver um ambiente matemático e computacional para análises em larga-escala de dados de expressão gênica obtidos pela tecnologia de microarranjos de DNA. As análises realizadas visaram principalmente à identificação de marcadores moleculares de diagnóstico e prognóstico de cânceres humanos. Apresentamos o resultado de diversas análises implementadas através do ambiente desenvolvido, as quais conduziram a implementação de uma ferramenta computacional para a anotação automática de plataformas de microarranjos de DNA e de outra ferramenta destinada ao rastreamento da análise de dados realizada em ambiente R. Programação eXtrema (eXtreme Programming, XP) foi utilizada como técnica de planejamento e gerenciamento dos projetos de análise dados de expressão gênica. Todos os conjuntos de dados foram obtidos por nossos colaboradores, utilizando-se duas diferentes plataformas de microarranjos de DNA: a primeira enriquecida em regiões não-codificantes do genoma humano, em particular regiões intrônicas, e a segunda representando regiões exônicas de genes humanos. A primeira plataforma foi utilizada para avaliação do perfil de expressão gênica em tumores de próstata e rim humanos, sendo que análises utilizando SAM (Significance Analysis of Microarrays) permitiram a proposição de um conjunto de 49 sequências como potenciais biomarcadores de prognóstico de tumores de próstata. A segunda plataforma foi utilizada para avaliação do perfil de transcritos expressos em sarcomas, carcinomas epidermóide e carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço. As análises com sarcomas permitiram a identificação de um conjunto de 12 genes relacionados à agressividade local e metástase. As análises com carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço permitiram a identificação de 7 genes relacionados à metástase linfonodal. / In this PhD Thesis, we present our strategies to the development of a mathematical and computational environment aiming the analysis of large-scale microarray datasets. The analyses focused mainly on the identification of molecular markers for diagnosis and prognosis of human cancers. Here we show the results of several analyses implemented using this environment, which led to the development of a computational tool for automatic annotation of DNA microarray platforms and a tool for tracking the analysis within R environment. We also applied eXtreme Programming (XP) as a tool for planning and management of gene expression analyses projects. All data sets were obtained by our collaborators using two different microarray platforms. The first is enriched in non-coding human sequences, particularly intronic sequences. The second one represents exonic regions of human genes. Using the first platform, we evaluated gene expression profiles of prostate and kidney human tumors. Applying SAM to prostate tumor data revealed 49 potential molecular markers for prognosis of this disease. Gene expression in samples of sarcomas, epidermoid carcinomas and head and neck epidermoid carcinomas was investigated using the second platform. A set of 12 genes were identified as potential biomarkers for local aggressiveness and metastasis in sarcoma. In addition, the analyses of data obtained from head and neck epidermoid carcinomas allowed the identification of 7 potential biomarkers for lymph-nodal metastases.
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Análise da expressão de RNAs não codificadores longos em adenocarcinoma de pâncreas / Expression analysis of long noncoding RNAs in pancreatic adecarcinomaTahira, Ana Carolina 03 April 2013 (has links)
RNAs não codificadores longos (lncRNAs) compõem uma fração significativa do transcriptoma. Alterações na expressão de lncRNAs já foram observadas em vários cânceres humanos, mas ainda não foram exploradas no adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC), uma doença devastadora e agressiva para a qual faltam métodos para diagnóstico precoce e tratamentos efetivos. Utilizando uma plataforma de microarranjo de cDNA com sondas para 984 lncRNAs e 2371 mRNAs, o presente estudo identificou conjuntos de lncRNAs expressos em 38 amostras clínicas pancreáticas. O enriquecimento de (i) elementos regulatórios associados às regiões promotoras (H3K4me3); (ii) possíveis inícios de transcrição (CAGE-tags); (iii) presença de elementos conservados sugere que ao menos uma fração desses RNAs seja originada a partir de unidades transcricionais independentes, reguladas e possivelmente funcionais. Foram identificadas assinaturas de expressão gênica compostas por mRNA e lncRNAs associadas ao tumor primário e à metástase pancreática. A assinatura gIenica associada à metástase apresentou enriquecimento RNAs intrônicos de loci gênicos associados à via MAPK quinase. O aumento de expressão dos transcritos intrônicos dos loci PPP3CB, MAP3K14 e DAPK1 foi confirmado por qPCR em metástases. Em conjunto, este trabalho aponta para a importância de lncRNAs intrônicos no PDAC e para a necessidade de estudos mais aprofundados para uma melhor compreensão do papel dessa classe de transcritos na biologia da doença. / Long noncoding RNAs (lncRNAs) compose a significant fraction of transcriptome. Altered expression of lncRNAs has been observed in diverse human cancers, but has not being investigated in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), a devastating and aggressive disease that lack early diagnosis methods and effective treatments. Using a cDNA microarray platform with probes interrogating 984 lncRNAs and 2371 mRNA, the present study identified subsets of lncRNAs expressed in 38 pancreatic clinical samples. Enrichment of (i) regulatory elements associated to promoter region (H3K4me3); (ii) putative transcription start site (CAGEtags) and (iii) conserved elements, suggest that at least a fraction of these RNAs could be independent transcriptional unit, regulated, an possibly functional. Gene expression signatures comprised of mRNAs and lncRNAs and associated to primary or metastatic tumors were found. A gene signature associated to metastasis was enriched in intronic ncRNAs mapping to gene loci associated to the MAPK pathway. Over expression of intronic RNAs from PPP3CB, MAP3K14 and DAPK1 was confirmed by qPCR in metastatic samples. Taken together, this study points to the importance of intronic lncRNAs in PDAC and for the need to study this class of ncRNAs in greater detail to better understand its role in the biology of PDAC.
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Regulação da expressão gênica pela toxina da aranha Phoneutria nigriventer no corpo cavernoso in vivo / In vivo regulation of gene expression in the corpus cavernosum by the Phoneutria nigriventer toxinVillanova, Fabiola Elizabeth 04 September 2009 (has links)
INTRODUÇÃO: O aracnídeo Phoneutria nigriventer, também conhecido por aranha-armadeira, possui um veneno complexo, contendo vários peptídeos que ativam canais iônicos nas células. Dentre estes, só dois neuropeptídeos, Tx2-5 e Tx2-6, destacam-se por relaxar o músculo liso trabecular do corpo cavernoso, induzindo ereção peniana em camundongos e ratos. Este efeito tem sido associado à produção de oxido nítrico pela ativação de óxido nítrico sintases. No entanto, faltam estudos mais amplos para determinar o papel de Tx2-6 na indução da ereção. OBJETIVOS: Identificar os genes diferencialmente expressos no tecido erétil de camundongos após indução da ereção pela Tx2-6 utilizando microarranjos de oligonucleotídeos. Validação dos resultados obtidos nos microarranjos por PCR quantitativa e imuno-histoquímica. MATERIAIS E MÉTODOS: Camundongos machos e adultos da linhagem Swiss foram divididos em dois grupos: controle (n=10), inoculados pela via intracavernosa com 20 l de solução salina; e tratado (n=10), os quais receberam 0,006gg/animal do peptídeo Tx2-6 diluído em 20 l de salina pela via intracavernosa. Uma hora após o início da ereção no grupo tratado todos os animais foram sacrificados e retirou-se o pênis. Este último foi dividido em dois fragmentos, uma parte do material foi congelada em nitrogênio líquido e mantida a 80°C até a extração do RNA para os experimentos de microarranjos e PCR quantitativa; outra parte foi utilizada para avaliação imuno-histoquímica. RESULTADOS: No grupo tratado a ereção foi observada 30-45 minutos após aplicação de Tx2-6 e mantida durante 120 minutos. Os camundongos de grupo controle não apresentaram nenhum indício de ereção. Nos experimentos de microarranjos, onde foram analisados 34.000 genes representando o genoma total do camundongo, identificou-se 3.803 (12,3%) genes com expressão diferencial de pelo menos ±1,5 vez entre os grupos (1.823 genes superexpressos e 1.980 genes subexpressos no grupo tratado comparado ao controle). Os genes ednrb, sparc, fn1, sstr2, pdgfr foram selecionados para validação dos microarranjos por PCR quantitativa e confirmaram a superexpressão em relação aos controles. As proteínas Fn1, Sstr2 e Pdgfr resultaram aumentadas no grupo tratado após avaliação imuno-histoquímica. CONCLUSÕES: A inoculação de Tx2-6 pela via intracavernosa alterou o perfil de expressão gênica no tecido erétil de camundongos. O número de genes superexpressos foi similar ao de genes subexpressos. Serão necessários outros estudos para entender melhor as vias moleculares que Tx2-6 afeta na indução da ereção peniana. / INTRODUCTION: The Phoneutria nigriventer arachnid, also known as armed-spider, has a complex venom, composed by several peptides that affect cellular ionic channels. Among these, only two neuropeptides, Tx2-5 and Tx2-6 induce penile erection in mice and rats and this effect has been associated with the production of nitric oxide by the activation of nitric oxide synthases. Moreover, there is a scarcity of studies focusing on the role of Tx2-6 in the induction of erection. OBJECTIVES: To identify the differently expressed genes in the erectile tissue of mice after erection induction by Tx2-6 using oligonucleotide microarrays. To validate microarray results by quantitative PCR and immunohistochemistry. MATERIALS AND METHODS: Swiss adult male mice were divided in two groups: control (n=10) were injected intracavernously with 20 gl of saline solution; and treated (n=10) were injected intracavernously with 0.006gg/mouse of the Tx2-6 peptide diluted in 20 gl of saline solution. After checking the penile erection in the treated group, all mice were sacrificed one hour after the beginning of erection for the removal of the penis. Penile organ was divided into two fragments, one piece was immediately frozen in liquid-nitrogen and stored at -80°C until RNA extraction to make the microarray and quantitative PCR experiments; the other was reserved for immunohistochemistry analysis. RESULTS: In the treated group, erection was noticed 30-45 minutes after Tx2-6 inoculation and lasted for 120 minutes. Control mice did not present any sign of erection. Considering as differentially expressed genes with a ±1.5 fold expression difference, of the 34,000 genes on the microarray we identified 3,803 (12.3%) genes differentially expressed between the groups (1,823 genes up-regulated and 1,980 genes down-regulated in the treated group compared to controls). The ednrb, sparc, fn1, sstr2, pdgfr genes were selected for validation of microarray results by using quantitative PCR and confirmed the up-regulation when compared to controls. After immunohistochemistry analysis the Fn1, Sstr2 and Pdgfr proteins were found increased in the treated group. CONCLUSIONS: The intracavernous inoculation of Tx2-6 modified the gene expression profile of erectile tissue of mice. The number of upregulated and down-regulated genes was similar. Further studies are needed to understand the molecular pathways that Tx2-6 affect to induce penile erection.
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