O óleo de copaíba é largamente utilizado na medicina popular da região amazônica, principalmente para tratar enfermidades relacionadas a inflamações. Estudos prévios demonstraram que o óleo extraído da espécie Copaifera multijuga Hayne tem uma promissora atividade anti-inflamatória, assim como seu componente majoritário, o β-cariofileno. Entretanto, o caráter untuoso deste óleo torna pouco aceitável sua aplicação direta na pele. Nosso grupo de pesquisa propôs a formulação de nanoemulsões contendo o óleo, uma vez que estes sistemas, além de hidrofílicos, possuem pequeno tamanho de gotícula e alta área de superfície, o que pode melhorar a penetração de substâncias através da pele. O único inconveniente destes é a sua baixa viscosidade, que pode ser contornado por sua incorporação em um hidrogel. No presente estudo, foi desenvolvida uma formulação de hidrogel contendo a nanoemulsão de óleo de copaíba (Copaifera multijuga Hayne) e avaliado seu perfil de permeação/retenção cutânea no modelo de pele de orelha suína. A viabilidade de incorporação da nanoemulsão em dois agentes geleificantes (Carbopol 980® e quitosana) foi testada. No período de sete dias, a formulação de quitosana, ao contrário da formulação de Carbopol 980® (CARB-NE) que permaneceu estável por 60 dias, apresentou visível instabilidade e aumento dos valores de tamanho de gotícula e índice de polidispersão. Devido a isto, a formulação CARB-NE foi escolhida para dar continuidade aos estudos de perfil reológico e de permeação/retenção cutânea. O perfil reológico de CARB-NE foi caracterizado como pseudoplástico, assim como o do hidrogel controle, o que indica que a nanoemulsão não interferiu na matriz polimérica do hidrogel. A formulação CARB-NE aumentou significativamente a penetração do componente β-cariofileno na derme comparada com a nanoemulsão não incorporada em hidrogel. Não houve um aumento da penetração na epiderme, e os valores não foram significativamente diferentes para as duas formulações. Portanto, o hidrogel de Carbopol 980® demonstrou ser o melhor agente geleificante para a nanoemulsão de copaíba, já que permaneceu estável durante o tempo testado e aumentou a penetração de β-cariofileno na pele, especialmente na derme, camada de interesse no tratamento da inflamação pela via tópica. / Copaiba oil is a natural product widely used in folk medicine of the Amazon region mostly to treat diseases related to inflammation. Previous studies have shown that the oil extracted from Copaifera multijuga Hayne has a promising anti-inflammatory activity, as well as its major component, β-caryophyllene. However, the unctuous nature of this oil makes it slightly acceptable to apply directly to the skin. Our research group has proposed the formulation of nanoemulsions containing copaiba oil, since these systems are hydrophilic, have a small droplet size and high surface area, which can improve the penetration of substances through the skin. The only disadvantage of these systems is their low viscosity that can be modified by incorporating it into a hydrogel. In the present study, we developed a hydrogel formulation containing the nanoemulsion of copaiba oil (Copaifera multijuga Hayne) and evaluated its skin permeation/retention profile in porcine ear skin model. The feasibility of incorporating the nanoemulsion into two gelling agents (Carbopol® 980 and chitosan) was assessed. Within seven days, chitosan formulation had increased values for droplet size and polydispersity index, in opposite to Carbopol® 980 formulation (CARB-NE), which continued stable for 60 days. Due to this, the formulation CARB-NE was chosen to continue studies of the rheological profile and skin permeation/retention profile. The rheological profile of CARB-NE was characterized as pseudoplastic, the same was observed for the control hydrogel, which indicates that the nanoemulsion had no effect on the hydrogel polymer matrix. The CARB-NE formulation significantly increased the penetration of β-caryophyllene in the dermis compared to the nanoemulsion not incorporated. There was no increase in the epidermis permeation, nor the values were significantly different for the two formulations. Therefore, the hydrogel Carbopol® 980 proved to be the best gelling agent for copaiba nanoemulsion since it remained stable over the tested time and increased β-caryophyllene penetration in the skin, especially in the dermis, the layer of interest in the treatment of topical inflammation.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada pela deficiência de alfa-L-iduronidase (IDUA), responsável pelo catabolismo de glicosaminoglicanos (GAGs), levando ao acúmulo multissistêmico de sulfato de heparano e dermatano. Este estudo tem por objetivo avaliar o potencial de sistemas lipídicos nanoestruturados como carreadores do plasmídeo do sistema CRISPR/Cas9 e um vetor doador da sequência do gene IDUA/Idua para edição gênica em fibroblastos de pacientes e em modelo murino de MPS I. Foram produzidos lipossomas (DOTAP, DOPE e DSPE-PEG) e nanoemulsões (e TCM) por homogeneização à alta pressão e microfluidização. O DNA foi associado às formulações por adsorção, ou por encapsulamento dos complexos pré-formados DNA/DOTAP no núcleo oleoso da nanoemulsão. A eficiência de transfecção dos complexos foi avaliada em fibroblastos de pacientes MPS I e ocorreu um aumento significativo da atividade de IDUA em 2, 15 e 30 dias após os tratamentos, que promoveu uma redução na quantidade de lisossomos nos fibroblastos tratados. A caracterização físico-química de formulações produzidas por microfluidização complexadas a somente um plasmídeo ou juntamente com um oligonucleotídeo foi verificada e pode-se afirmar que a capacidade de complexação e transfecção depende diretamente do tipo celular e da relação de cargas, e não há implicações quanto ao tamanho das sequências de ácidos nucleicos. Camundongos MPS I receberam os complexos lipossomais por injeção hidrodinâmica e sua biodistribuição foi detectada principalmente no pulmão, coração e fígado. A atividade sérica de IDUA normal aumentou em cerca de 6% e foi mantida por seis meses. A atividade aumentada no pulmão, coração, fígado e rim após eutanásia promoveu redução dos GAGs na urina e nos mesmos tecidos, corroborando com as análises histológicas. Em um estudo em andamento, foi realizada uma investigação mais aprofundada do efeito do tratamento lipossomal na morfologia óssea, sistemas cardiovascular e respiratório, e funções cerebrais dos animais tratados. A análise ecocardiográfica demonstrou uma melhora na hipertrofia e contratilidade do coração, porém não houve melhora na espessura das válvulas. O diâmetro da aorta foi similar ao de animais normais, porém as quebras de elastina ficaram entre o grupo normal e o não tratado. A morfologia facial dos animais tratados foi intermediária, assim como a espessura do osso zigomático. Entretanto, o osso femoral demonstrou espessura comparável ao normal. Já a resistência pulmonar apresentou uma tendência de redução nos animais tratados em relação aos animais MPS I. O conjunto de resultados demonstra o potencial das nanoestruturas lipídicas co-complexadas com o plasmídeo CRISPR/Cas9 e um vetor doador da sequência IDUA/Idua para terapia gênica da MPS I. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by the deficiency of alpha-L-iduronidase (IDUA), responsible for the catabolism of glycosaminoglycans (GAGs), leading to multisystemic accumulation of heparan and dermatan sulfate. This study aims to evaluate the potential of lipid-based nanostructures as carriers of the CRISPR/Cas9 plasmid and a vector donor of the IDUA/Idua sequence for gene editing in patients’ fibroblasts and in a murine model of MPS I. Liposomes (DOTAP, DOPE, and DSPE-PEG) and nanoemulsions (also MCT) were produced through high-pressure homogenization or microfluidization. DNA was associated with liposomes and nanoemulsions by adsorption or by encapsulation of DNA/DOTAP preformed complexes in the oil core of nanoemulsions. The transfection efficiency of complexes was evaluated in fibroblasts from MPS I patients and a significant increase in IDUA activity was demonstrated at 2, 15, and 30 days after treatments. It was also possible to observe a significant reduction in lysosomal amount in treated fibroblasts. The physicochemical characterization of liposomes and nanoemulsions produced through microfluidization complexed with a single plasmid or along with an oligonucleotide has been verified and it can be stated that the complexing and transfection capacity of the complexes depends directly on the cell type and the charge ratio, and there are no implications of the size of the nucleic acid sequences. MPS I mice received the liposomal complexes by hydrodynamic injection and their immediate biodistribution was detected mainly in the lung, heart, and liver. An increase of about 6% in normal serum IDUA activity was maintained for six months, in addition to increased lung, heart, liver, and kidney activity after euthanasia. The enhanced enzymatic activity promoted a significant GAGs reduction in urine and in the same tissues, corroborating with histological analysis. In an ongoing study, a deeper investigation was carried out on the effect of liposomal treatment on bone morphology, cardiovascular and respiratory systems, and brain function. The echocardiographic analysis showed an improvement in the parameters of hypertrophy and contractility of the heart, but there was no improvement in heart valves. Aorta diameter was similar to that of normal animals, but elastin breaks were between the normal and untreated groups. Facial morphology of treated animals was intermediate, as well as the analysis of zygomatic bone thickness. However, femoral bone showed thickness comparable to normal animals. Lung resistance, on the other hand, showed a tendency to reduction in treated animals when compared to MPS I. The set of results demonstrates the potential of the co-complexed lipid nanostructures with the CRISPR/Cas9 plasmid and a donor vector of the IDUA/Idua sequence for MPS I gene therapy.

Os extratos obtidos a partir da própolis vermelha brasileira (PVB) têm sido investigados devido às suas amplas atividades biológicas. Recentemente, em nosso grupo de pesquisa, demonstramos a viabilidade da incorporação de um extrato n-hexânico de PVB em nanoemulsões de uso tópico, bem como sua permeação/retenção em pele de orelha suína. No presente estudo, avaliamos as propriedades físico-químicas e reológicas de hidrogéis contendo essas nanoemulsões visando a obtenção de um produto semissólido adequado para aplicação tópica. Em uma primeira fase, foram preparadas nanoemulsões compostas de núcleo oleoso contendo extrato n–hexânico de PVB, miristato de isopropila, lecitina de ovo (NE) e DOTAP (NE/DT), e fase externa aquosa. O polímero gelificante hidroxietilcelulose foi incorporado às formulações após a sua obtenção por emulsificação espontânea (H-NE e H-NE/DT). As formulações apresentaram-se monodispersas com diâmetro médio na faixa de 200-300 nm, confirmado por microscopia eletrônica de transmissão. H-NE apresentou um potencial zeta negativo (-38mV), enquanto o mesmo parâmetro para H-NE/DT foi positivo (+36mV), devido à presença do lipídeo catiônico DOTAP na formulação. O teor de benzofenonas totais, determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), foi de cerca de 85 mg/g de extrato. Esses parâmetros mantiveram-se constantes durante 90 dias de armazenamento a 4C. As formulações H/NE e H-NE/DT apresentaram um comportamento não-Newtoniano pseudoplástico. Estudos de permeação/retenção das benzofenonas através da pele de orelha suína foram realizados utilizando células de difusão do tipo Franz. A maior retenção das benzofenonas na pele (18,11 μg/cm² após 8h) foi observada para a formulação H-NE/DT, demonstrando o efeito do lipídeo catiônico DOTAP nesse parâmetro. Em uma última etapa, investigou-se a capacidade das formulações de conferirem proteção à pele de orelha suína frente ao dano oxidativo gerado pela sua exposição à luz UVA/UVB. A proteção da pele de orelha suína foi evidenciada pelas técnicas de TBARS, carbonilação de proteínas e grupamentos tióis totais. Os resultados obtidos sugerem que os Hidrogéis contendo extrato de PVB apresentam propriedades físico-químicas e reológicas adequadas para serem utilizadas topicamente para a prevenção do dano oxidativo causado pela exposição à luz UVA/UVB. / Brazilian red propolis (BRP) extracts have been investigated due to their extensive biological activities. Recently, in our research group, we demonstrated the feasibility of incorporating an n-hexane extract of BRP into topical nanoemulsions, as well as the permeation/retention of these compounds in porcine ear skin. In the present study, we evaluated the physicochemical and rheological properties of hydrogels containing these nanoemulsions in order to obtain a semi-solid product suitable for topical application. In a first step, nanoemulsions composed of an oil nucleus containing BRP n-hexane extract, isopropyl myristate, egg lecithin (NE) and DOTAP (NE/DT), and an aqueous external phase were prepared. The hydroxyethylcellulose gelling polymer was incorporated into the formulations after being obtained by spontaneous emulsification (H-NE and H-NE/DT). The formulations were monodisperse exhibiting a mean diameter in the 200-300 nm range, confirmed by transmission electron microscopy. H-NE presented a negative zeta potential (-38mV), while H-NE/DT showed a positive value (+ 36mV) due to the presence of the cationic lipid DOTAP in the formulation. The total benzophenone content, determined by high performance liquid chromatography (HPLC), was about 85 mg/g extract. These parameters were maintained constant for 90 days of storage at 4°C. The formulations H/NE and H-NE/DT presented a non-Newtonian pseudoplastic behavior. Permeation/retention studies of benzophenones through porcine ear skin were performed using Franz type diffusion cells. The highest retention of benzophenones in the skin (18.11 μg/cm² after 8h) was observed for the H-NE/DT formulation, demonstrating the effect of the DOTAP cationic lipid on this parameter. In a last step, the ability of the formulations to confer protection of porcine ear skin against oxidative damage, generated by its exposure to UVA/UVB light, was investigated. The protection was evidenced by the TBARS, carbonylation of proteins, and total thiol groups techniques. The results obtained suggest that the hydrogels containing BRP have adequate physicochemical and rheological properties to be used topically for the prevention of oxidative damage caused by exposure to UVA/UVB light.

This work aimed to develop nanoemulsions and polymeric nanocapsules containing tioconazole for the topical treatment of superficial mycoses. Initially, a method was validated by liquid chromatography with UV detection to quantify the tioconazole in the nanostructured formulations. The method proved to be specific, linear, precise, accurate and robust. The nanoemulsions and tioconazole-loaded PCL nanocapsules (1.0 mg/mL) were prepared by spontaneous emulsification and interfacial deposition of preformed polymer methods, respectively, and using as oily core medium chain triglycerides or green coffee oil. The physicochemical parameters evaluated were: particle size, polydispersity index, pH, zeta potential, drug content and encapsulation efficiency. Formulations presented nanometric mean size (150-200 nm), polydispersity index below 0.15, acid pH (5.5 to 6.3), negative zeta potential (-3.5 to -11.3 mV), drug content close to the theoretical and encapsulation efficiency close to 100%. With the exception of pH, all these parameters remained the same after 30 days of storage, proving the stability of systems. The study of photodegradation of tioconazole against UVC light has shown the importance of nanostructured photoprotection in the drug and the greater protection was observed for the nanocapsules containing green coffee oil. The antifungal activity of the nanostructures was evaluated by agar diffusion and the results showed that the formulations presented antifungal activity against the yeast C. albicans, C. glabrata and clinical isolate of C. albicans. The nanostructures were incorporated into Aristoflex® AVC hydrogels and those were characterized by size of particles when dispersed in water, polydispersity index, drug content, spreadability, rheological properties and stability. The hydrogels had nanometer size (196-203 nm), polydispersity index below 0.25, pH 6,3 to 6.5, tioconazole content close to theoretical (0.99 to 1.01 mg/g) plastic behavior (model Casson) and similar spreadability profiles. The formulations were stable for 30 days at room temperature, evidencing the importance of the polymeric wall in the nanocapsules to preserve the characteristics of the formulations. The study of the in vitro release of drug from the hydrogel was carried out using diffusion Franz cell. The results demonstrated the ability of nanostructures to control the release of tioconazole, with greater control observed for hydrogels containing polymeric nanocapsules. / Este trabalho objetivou o desenvolvimento de nanoemulsões e nanocápsulas poliméricas contendo tioconazol para o tratamento tópico de micoses superficiais. Inicialmente, foi validado um método por cromatografia líquida com detecção UV para quantificação do tioconazol nas formulações nanoestruturadas. O método apresentou-se específico, linear, preciso, exato e robusto. As nanoemulsões e nanocápsulas de PCL contendo o tioconazol (1,0 mg/mL) foram preparadas pelos métodos de emulsificação espontânea e deposição interfacial do polímero pré-formado, respectivamente, utilizando como núcleo oleoso os triglicerídeos de cadeia média ou o óleo de café verde. Os parâmetros físico-químicos avaliados foram tamanho de partículas, índice de polidispersão, pH, potencial zeta, teor e eficiência de encapsulamento. As formulações apresentaram tamanho nanométrico (150 - 200 nm), índice de polidispersão abaixo de 0,15, pH ácido (5,5 a 6,3), potencial zeta negativo (-3,5 a -11,3 mV), teor de fármaco próximo ao teórico e eficiência de encapsulamento próximo a 100%. Com exceção do pH, todos esses parâmetros mantiveram-se iguais após os 30 dias de armazenamento a temperatura ambiente, comprovando a estabilidade dos sistemas. O estudo de fotodegradação do tioconazol frente à luz UVC demonstrou a importância dos sistemas nanoestruturados na fotoproteção do fármaco e uma maior proteção foi verificada para as nanocápsulas contendo óleo de café verde. A atividade antifúngica das nanoestruturas foi avaliada pelo método de difusão em ágar e os resultados demonstraram que as formulações apresentaram ação frente à C. albicans, C. glabrata e isolado clínico de C. albicans. As nanoestruturas foram incorporadas em hidrogéis de Aristoflex® AVC e estes caracterizados quanto ao tamanho de partículas após dispersão em água, índice de polidispersão, teor, espalhabilidade, propriedades reológicas e estabilidade frente ao armazenamento. Os hidrogéis apresentaram tamanho nanométrico (196 - 203 nm), índice de polidispersão abaixo de 0,25, pH de 6,3 a 6,5, teor de tioconazol próximo ao teórico (0,99 a 1,01 mg/g), comportamento plástico (modelo de Casson) e perfis de espalhabilidade semelhantes. As formulações mantiveram-se estáveis por 30 dias à temperatura ambiente, sendo evidenciada a importância da parede polimérica nas nanocápsulas em preservar as características das formulações. O estudo de liberação in vitro do fármaco a partir dos hidrogéis foi realizado empregando célula de difusão do tipo Franz. Os resultados obtidos demonstraram a capacidade das nanoestruturas em controlar a liberação do tioconazol, sendo que um maior controle foi observado para os hidrogéis contendo as nanocápsulas poliméricas.

A atividade antiviral de compostos polifenólicos, especialmente flavonóides, tem sido extensivamente investigada. Neste contexto, diversos estudos têm como foco o efeito da quercetina (Q) e 3-O-metilquercetina (MQ) sobre o Vírus do Herpes Simplex (HSV) uma vez que eles são importantes patógenos humanos. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de nanoemulsões de uso tópico contendo os flavonóides Q e MQ. Primeiro, nanoemulsões compostas de octildodecanol, lecitina de gema de ovo (NE), brometo de cetil trimetilamônio – CTAB – (NEC), água e Q ou MQ foram preparadas através do procedimento de emulsificação espontânea. O procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões monodispersas (IP<0,2) com um diâmetro médio de gotícula de aproximadamente 200-300 nm, confirmado por microscopia eletrônica de transmissão. A viscosidade e a tensão superficial permanecem similares para as formulações NE e NEC, de aproximadamente 2 cP e 29 mN/m, respectivamente. O potencial zeta foi influenciado principalmente pela presença do tensoativo CTAB, sendo negativo para NE (-29 to -27 mV) e positivo para NEC (76 to 79 mV). Em uma segunda etapa, foi validado um método isocrático para a quantificação da Q e MQ por CLAE com detecção por UV em 368 e 354 nm. O método foi linear, preciso, exato e específico para a determinação da Q e MQ nas formulações. A quantidade dos flavonóides associada com as nanoemulsões foi de 100% (para 1 mg/mL). A reduzida solubilidade de Q e MQ no núcleo oleoso sugere a participação da lecitina na sua associação com as nanoemulsões. Em uma última etapa, foi realizado o estudo de permeação cutânea da Q e MQ a partir das formulações utilizando pele de orelha suína em células de difusão de Franz. Independente da formulação, foi demonstrado que a permeação da Q ou MQ é reduzida. Entretanto, existe um aumento significativo do fluxo de permeação dos flavonóides a partir das nanoemulsões NEC (~0,2 μg/cm2/h) comparado com NE (~0,08 μg/cm2/h), demonstrando o efeito da carga de superfície positiva da formulação NEC sobre este parâmetro. Os resultados também indicam o acúmulo de Q ou MQ na pele (maior que 250 μg/g) para ambas as formulações. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra o efeito da composição das nanoemulsões sobre propriedades físico-químicas e perfil de permeação cutânea de Q e MQ a partir das nanoemulsões. / The antiviral activity of polyphenolic compounds, especially flavonoids, has been extensively investigated. In this context, several studies have been focused on the effect of quercetin (Q) and 3-O-methylquercetin (MQ) over Herpes Simplex Virus (HSV) since they are important human pathogens. The objective of the present work was the development of topical nanoemulsions containing the flavonoids Q and MQ. First, nanoemulsions composed by octyldodecanol, egg lecithin (NE), cetyl trimetylamonium bromide – CTAB – (NEC), water and either Q or MQ were prepared by spontaneous emulsification procedure. The procedure yielded monodisperse nanoemulsions (IP<0.2) with a typical mean droplet size of approximately 200-300 nm, confirmed for transmission electron microscopy. The viscosity and surface tension remained quite similar for both NE and NEC, approximately 2cP and 29mN/m, respectively. The ζ-potential was mainly influenced by the presence of the cationic surfactant CTAB, being negative for NE (-29 to -27mV) and positive for NEC (76 to 79mV). In the second step, it has been validated an isocratic method to quantify Q or MQ by HPLC with UV detection at 368 and 354nm. The method was linear, precise, accurate and specific for the determination of Q and MQ in formulations. The amount of flavonoids associated with nanoemulsions was close to 100 % (to 1mg/mL). The low solubility of Q and MQ in the oil core suggests the role of lecithin on their association with nanoemulsions. In a last step, the permeation of Q or MQ from formulations using ear pigskin mounted in Franz diffusion cells was performed. Whatever the formulation, it was shown that Q or MQ permeation rate was low. However, there was a significant increase of the flavonoids flow rate from NEC (~0.2μg/cm2/h) compared to NE (~0.08μg/cm2/h), showing the effect of the positively charged surface of NEC on this parameter. The results also indicate the accumulation of Q or MQ in the skin (higher than 230μg/g) for both formulations. In conclusion, the overall results show the effect of the nanoemulsion components on both physico-chemical properties of the nanoemulsions and Q or MQ skin permeation profile.

Nanoemulsões catiônicas têm sido recentemente propostas como sistemas carreadores de DNA. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência de diferentes fosfolipídeos sobre propriedades dos complexos formados entre nanoemulsões e pDNA (pTracerTMCMV2). Em uma primeira etapa, nanoemulsões catiônicas constituídas de triglicerídeos de cadeia média, estearilamina, lecitina de gema de ovo ou fosfolipídeos isolados (DSPC, DOPC, DSPE ou DOPE), glicerol e água foram preparadas através do procedimento de emulsificação espontânea. Independente do tipo de fosfolipídeo empregado, esse procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões catiônicas monodispersas com diâmetro de gotícula e potencial zeta de cerca de 250 nm e +50 mV, respectivamente. A complexação do pDNA com as nanoemulsões catiônicas, avaliada através do retardamento de migração do pDNA em gel de agarose por eletroforese, foi total quando o complexo apresenta uma relação de cargas [+/-] ≥ 1,0. Nestas condições, os complexos formados foram protegidos da degradação pela enzima DNase I. Em uma segunda etapa, a citotoxicidade das nanoemulsões e dos complexos com o pDNA sobre células Hep G2 foi avaliada, através do ensaio de MTT. Os resultados obtidos demonstraram que a adição de quantidades crescentes das nanoemulsões, conduz a uma toxicidade progressiva sobre as células, independente do pH do meio. Dentre as formulações estudadas, aquelas estabilizadas pelos fosfolipídeos DSPC e DSPE, de elevada temperatura de transição de fases, foram marcadamente menos tóxicas, em comparação com as formulações obtidas com lecitina, DOPC e DOPE. Essa mesma tendência foi detectada para os complexos formados com o pDNA. Em uma última etapa, foi realizado um estudo preliminar de transferência gênica em células Hep G2, utilizando a técnica de PCR em tempo real. Dentre as diferentes formulações testadas, a maior quantidade de DNA de GFP detectada parece ser para a formulação obtida com o fosfolipídeo DSPC, ilustrando as potencialidades de uso das nanoemulsões desenvolvidas como reagentes de transfecção de pDNA em células Hep G2. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra o efeito dos fosfolipídeos empregados sobre propriedades físico-químicas, complexação, estabilidade, citotoxicidade e transfecção de nanoemulsões catiônicas como sistemas carreadores de pDNA. / Cationic nanoemulsions have been recently considered as potential delivery systems for DNA. The aim of the present work was to evaluate the influence of different phospholipids on the properties of complexes formed between nanoemulsions and pDNA (pTracerTM-CMV2). First, cationic nanoemulsions composed of medium chain triglycerides, stearlyamine, egg lecithin or isolated phospholipids (DSPC, DOPC, DSPE or DOPE), glycerol and water were prepared through spontaneous emulsification process. Independently of the type of phospholipid used this procedure results in monodisperses cationic nanoemulsions with droplet size and zeta potential of about 250 nm and +50 mV, respectively. The complexation of pDNA with cationic nanoemulsions, analyzed by agarose gel retardation assay was total when the complex possesses a charge relation [+/-] ≥ 1.0. In these conditions the complexes were protected from enzymatic degradation by DNase I. After that, the cytotoxicity of the nanoemulsion and the complexes with pDNA in Hep G2 cells was evaluated through MTT assay. The results showed that the addition of increasing amount of nanoemulsion leads to a progressive toxicity on the cells independently of the media’s pH. Among the studied formulations the ones stabilized with the phospholipids DSPC and DSPE, that have elevated phase transition temperatures, were much less cytotoxic in comparison with the formulations obtained with lecithin, DOPC and DOPE. This same trend was detected for the complexes formed with pDNA. Finally a preliminary study of gene transfer to Hep G2 cells was performed using real-time PCR technique. Among the different formulations tested, the major quantity of reporter DNA detected seems to be for the formulation obtained with the DSPC phospholipid. This shows the potentialities of the use of nanoemulsions as transfection reagents of pDNA in Hep G2 cells. In conclusion, the overall results show the effect of the phospholipids on physicochemical properties, complexation, stability, cytotoxicity and transfection of cationic nanoemulsions as delivery systems for pDNA.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar formulações tópicas semi-sólidas, utilizando como substância ativa a nimesulida, associando-a a sistemas coloidais (nanoesferas, nanocápsulas ou nanoemulsões). Os parâmetros de liberação, penetração transcutânea e retenção cutânea do antiinflamatório veículado aos sistemas nanoestruturados foram estudados através de metodologia “in vitro”, empregando pele humana como membrana. Os métodos de nanoprecipitação e nanodispersão foram utilizados e possibilitaram a obtenção de nanocápsulas, nanoesferas e nanoemulsões de nimesulida. A análise das características físico-químicas dos sistemas estudados demonstrou que os diâmetros médios obtidos foram em torno de 300 nm. As taxas de associação situaram-se próximas a 99 % e os valores de pH entre 5,1-5,3. As suspensões contendo nimesulida foram incorporadas em géis de Carbopol 940®, apresentando leve coloração amarelada e características organolépticas satisfatórias, após a incorporação das mesmas. As taxas de recuperação e os valores de pH para os géis contendo nanocápsulas, nanoesferas e nanoemulsão de nimesulida, mantiveramse estáveis durante o período de armazenagem (120 dias). Todas as formulações de géis foram caracterizadas como sistemas não-newtonianos apresentando comportamento pseudoplástico (shear thinning), sendo os reogramas ajustados pelo modelo de Ostwald (coeficiente de regressão>0,99). Experimentalmente, nenhum fenômeno de tixotropia foi detectado para as formulações testadas e a incorporação dos nanocarreadores não modificou o tipo de fluxo apresentado por estes sistemas. Os diferentes sistemas nanocarreadores incorporados nos géis hidrofílicos, foram investigados em função do potencial de liberação do fármaco na pele, usando célula de difusão tipo Franz e técnica de tape stripping em pele humana. O fármaco foi detectado no estrato córneo para o gel contendo nanocápsulas (GNM-NC) e para o gel contendo nanoesferas (GNM-NS) de nimesulida, não havendo diferença significativa entre estes dois valores. Por outro lado, o fármaco não foi detectado no estrato córneo para o gel contendo nanoemulsão de nimesulida, sendo permeado diretamente para a derme. A presença da nimesulida na epiderme/derme foi significativamente maior para o gel contendo nanocápsulas (GNM-NC) do que para o gel contendo nanoesferas (GNM-NS) ou nanoemulsão (GNM-NE). Os géis contendo nimesulida incorporada em nanocarreadores (GNM-NC, GNM-NS e GNM-NE) foram capazes de promover a penetração do fármaco no estrato córneo e/ou na camada de pele viável, com relação ao fármaco livre na mesma concentração. Estes estudos comparativos demonstraram a influência da presença do polímero e do tipo de nanocarreador na penetração do fármaco em pele humana. / The objective of this work was to develop and characterize semisolid topical formulations containing nimesulide-loaded nanospheres, nanocapsules or nanoemulsion. In order to study the in vitro percutaneous penetration of nimesulide from semi-solid topical formulations containing nanocarriers, an in vitro methodology using human skin was employed. The nanoprecipitation and the spontaneous emulsification methods were used to prepare the colloidal suspensions and nanoemulsion. For all formulation the diameters are in the sub 300 nm ranges. The encapsulation efficiencies were close to 99 % in all cases and pH values ranged between 5.1 and 5.3. Each drug-loaded nanocarrier formulation was incorporated in Carbopol 940® gels. The semisolid dosage forms showed yellowish, glossy and homogeneous aspect after the incorporation of the colloidal suspensions and nanoemulsion. The recovery of nimesulide and the pH values for the gels containing nanoemulsion, nanospheres or nanocapsules remained constant during storage (120 days). For all formulations, the rheograms exhibited a non-Newtonian behavior presenting pseudoplastic characteristics and shear thinning. The rheograms were adjusted to Ostwald’s model showing regression coefficients higher than 0.9900. None thixotropic phenomenon was experimentally detected under the test conditions for all formulations. The ability of delivering the drug into the human skin was investigated using stripping technique and Franz-type diffusion cells. The gel containing nanocapsules (GNM-NC) and the gel containing nanospheres (GNM-NS) released the nimesulide in the same extension into the stratum corneum (SC). On the other hand, for the gel containing nanoemulsion (GNM-NE), the nimesulide was not quantified in SC, but it has been directly permeated for the dermis. The penetration of the nimesulide using the gel containing nanocapsules (GNM-NC) was larger in the deeper skin than using the gel containing nanospheres (GNM-NS) or the one containing nanoemulsion (GNM-NE). The gels containing nanocarriers (GNM-NC, GNM-NS and GNM-NE) were able to release the drug in the viable layer of the skin, comparing to a non-particulated nimesulide-loaded formulation at the same concentration. For the first time, this comparative study showed the influence of the presence of the polymer and of the type of nanocarrier on the permeation of a drug through the human skin.

A malária é um problema de saúde mundial. Esta doença é causada pela infecção dos eritrócitos com o protozoário do gênero Plasmodium. A atovaquona (ATQ) é um análogo estrutural da coenzima Q, usado como monoterapia ou em combinação com proguanil no tratamento da malária. A incorporação de fármacos de reduzida hidrossolubilidade, como a ATQ, em veículos tradicionais, é frequentemente limitada devido a razões de solubilidade. Neste contexto, nanoemulsões oferecem uma alternativa promissora devido a sua efetividade na solubilização de fármacos, aumentando a eficácia, e reduzindo os efeitos adversos. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver nanoemulsões catiônicas contendo ATQ para administração intravenosa. Nanoemulsões compostas de ATQ, triglicerídeos de cadeia média, lecitina de gema de ovo, 1,2-dioleoil-3-trimetil amônio propano (DOTAP), glicerol, polissorbato 80 e água foram obtidas pelo método de emulsificação espontânea. Este método levou à obtenção de nanoemulsões monodispersas com um diâmetro médio de aproximadamente 200 nm, como confirmado pela microscopia eletrônica de transmissão. O potencial  das nanoemulsões foi positivo (> 30 mV em pH 5). Um método isocrático de cromatografia líquida de fase reversa foi validado para quantificar ATQ. O método foi específico, linear, preciso e exato para a quantificação de ATQ. O teor de fármaco para todas as formulações foi próximo a 95%. A ATQ liberada a partir das nanoemulsões foi avaliada em dois meios diferentes (RPMI-1640 + 0,5% albumina ou PBS + 0,5% polissorbato 80) após a separação de ATQ livre através das membranas de ultrafiltração (poro de 0,1m). Independente do meio utilizado, ATQ foi progressivamente liberada a partir das formulações em função do fator de diluição e permaneceu constante em função do tempo. A maior liberação de ATQ foi observada para nanoemulsões contendo polissorbato 80 e no meio contendo este tensoativo não iônico em condições sink. O diâmetro das nanoemulsões permaneceu inalterado nas condições de liberação para nanoemsulões contendo polissorbato 80 enquanto uma inversão do - potencial de valores positivos para negativos foi detectado. Tais formulações mostraram uma inibição do crescimento do parasita in vitro frente a cepas de P. falciparum resistentes à ATQ. / Malaria is a global public health problem. This disease is caused by infection of red blood cells with protozoan parasites of the genus Plasmodium. Atovaquone (ATQ) is a structural analogue of coenzyme Q used as monotherapy or in combination with proguanil in malaria treatment. The incorporation of poorly-water soluble drugs such as ATQ in well-accepted vehicles is frequently limited due to solubility reasons. In this context, nanoemulsions offer an appealing alternative due to their effectiveness in drug solubilization, improved efficacy, and reduced side effects. The main purpose of this study was to develop cationic nanoemulsions containing ATQ for intravenous administration. Nanoemulsions composed of ATQ, medium chain triglycerides, egg lecithin, dioleoyl trimethylammonium propane (DOTAP), glycerol, polysorbate 80 and water were obtained by means of spontaneous emulsification. This procedure led to obtaining monodisperse nanoemulsions with mean droplet size of approximately 200 nm, as attested by transmission electron microscopy. - potential of nanoemulsions was positive (> 30mV at pH 5). An isocratic reversed – phase liquid chromatography method was validated for ATQ quantification. The method was specific, linear, precise, and accurate for ATQ quantification. The drug content in all formulations was close 95%. The ATQ release from nanoemulsions was evaluated in two different media (RPMI-1640 + 0.5% albumin or PBS + 0.5% polysorbate 80) after separation of free ATQ on ultrafiltration membranes (cut off 0.1μm). Whatever the media used, ATQ was progressively released from formulations upon the dilution ratio and remained constant over time. A higher release of ATQ was observed for nanoemulsions containing polysorbate 80 and in the media containing this non-ionic surfactant in sink conditions. The droplet size of nanoemulsions remained unchanged in the release conditions for nanoemulsions containing polysorbate 80 whereas an inversion of the -potential from positive to negative values was detected. Such formulations showed in vitro an inhibition of parasite growth against an ATQ-resistant P. falciparum strain.

O β-cariofileno é um composto presente no óleo de diversas espécies vegetais, como as copaibeiras, e sua atividade frente a cicatrização cutânea ainda não está elucidada. O objetivo deste estudo foi produzir um hidrogel contendo β-cariofileno nanoemulsionado, e avaliar os perfis de liberação/permeação cutânea in vitro e a atividade cicatrizante in vivo. Para a nanoemulsão empregou-se um homogeneizador a alta pressão, e para o hidrogel, dispersão direta com Natrosol®. As formulações foram caracterizadas de acordo com o tamanho de gotícula, PDI, potencial zeta e teor (CG/MS). Nos estudos de liberação/permeação cutânea utilizou-se células tipo Franz. No estudo da atividade cicatrizante, empregou-se o modelo de feridas dorsais em ratos Wistar, avaliando o tamanho das lesões, marcadores de atividades anti-inflamatória, antioxidante e análise histológica, durante 12 dias. Após caracterizadas, as formulações desenvolvidas apresentaram-se estáveis durante 60 dias. No estudo de permeação cutânea, observou-se que o β-cariofileno puro não foi capaz de atravessar o estrato córneo da pele. Não foram observadas diferenças significativas entre as formulações na quantidade de β-cariofileno retido na derme, sugerindo haver uma situação de saturação. O estudo de liberação indicou maior cedência do β-cariofileno a partir da forma nanoemulsionada do que do hidrogel derivado. No estudo da atividade cicatrizante, o fechamento inicial da ferida foi alcançado em menos tempo no grupo tratado com o hidrogel contendo β-cariofileno nanoemulsionado (GHNβ), indicando um efeito anti-inflamatório nesta formulação. Já a análise histológica indicou que o GHNβ apresentou resultados semelhantes ao do grupo controle positivo (Dersani®), mostrando-se eficaz para a reparação tecidual cutânea. / β-caryophyllene is a compound present in the oil of many plant species, such as copaibeiras, and the healing activity is still being studied. The objectives of this study was to produce a hydrogel containing β-caryophyllene nanoemulsified and to evaluate the in vitro release and permeation profile, and the in vivo healing activity, yet unexplored. For the nanoemulsion, a high pressure homogenizer was used, and for the hydrogel, direct dispersion with Natrosol®. The formulations were characterized according to droplet size, PDI, zeta potential and content (GC/MS). In the release/permeation studies, Franz type cells were used. The study of the healing activity, the dorsal wound model was used in Wistar rats, evaluating lesion size, markers of anti-inflammatory and antioxidant activities, and histological analysis, for 12 days. After characterization, the formulations developed were stable for 60 days. In skin permeation study, was observed that the pure β-caryophyllene was not able to cross the stratum corneum. No significant differences were observed between the formulations in the amount of β-caryophyllene retained in the dermis, suggesting a saturation condition. The release study indicated higher yield of β-caryophyllene from the nanoemulsion form than from the derived hydrogel. In the study of healing activity, the initial closure of the wound was achieved in less time in the group treated with the hydrogel containing β-caryophyllene nanoemulsion (GHNβ), indicating an anti-inflammatory effect in this formulation. The histological analysis indicated that GHNβ presented similar results that of the positive control group (Dersani®), proving to be effective for cutaneous tissue repair.

O óleo de copaíba é um produto natural encontrado principalmente na região amazônica, onde é utilizado na medicina popular como tratamento para inflamações e como cicatrizante. A espécie Copaifera multijuga Hayne demonstrou um potencial efeito anti-inflamatório em relação a outras espécies de Copaífera L., tendo como principal responsável o composto majoritário β-cariofileno. Nosso grupo de pesquisa vem estudando a veiculação deste óleo em nanoemulsões e desenvolveu uma formulação que contém uma elevada proporção de óleo de copaíba no núcleo oleoso (20 % w/v), sem prejuízo da estabilidade do sistema. A partir desta formulação, seguiram-se os estudos de avaliação da permeação cutânea, de otimização da formulação e de avaliação de atividade anti-inflamatória, apresentados neste trabalho. Um método em cromatógrafo a gás acoplado à espectrômetro de massas no modo headspace (HS-CG/EM) foi validado a fim de analisar β-cariofileno em mostras de pele provenientes do teste de permeação cutânea com nanoemulsões de óleo de copaíba. O método mostrou-se específico, linear, preciso e exato. O teste de permeação cutânea demonstrou que apenas com a nanoemulsão é possível detectar β-cariofileno na camada da derme, enquanto que, com o óleo, somente no estrato córneo. A seguir, foram testados dois tensoativos catiônicos na formulação da nanoemulsão para verificar se a carga positiva na interface da gotícula poderia promover a permeação cutânea do β-cariofileno. O tensoativo brometo de cetiltrimetilamônio provou ser mais eficiente em concentrações consideradas seguras para o uso tópico, revertendo o potencial zeta para valores adequados, sem interferir no tamanho de gotícula e índice de polidispersão. O tensoativo oleilamina também reverteu o potencial zeta, porém somente em concentrações muito elevadas, podendo ser consideradas tóxicas. O teste de permeação cutânea demonstrou que a incorporação de tensoativos catiônicos aumenta a retenção de β-cariofileno na epiderme em três vezes, enquanto que, na derme, não há diferença estatística entre as formulações aniônica e catiônica. Após, as nanoemulsões escolhidas foram incorporadas em hidrogéis de Carbopol®, Natrosol® e quitosana com vistas ao espessamento e adequação da viscosidade ao uso tópico. O hidrogel com quitosana 8 apresentou-se instável, com aumento de tamanho de gotícula e índice de polidispersão, apesar de não ter afetado o potencial zeta. Os hidrogéis de Carbopol® e Natrosol® apresentaram bons resultados de caracterização físico-química, porém somente o hidrogel de Natrosol® foi escolhido para os estudos de permeação cutânea e atividade anti-inflamatória in vivo, devido ao seu caráter neutro. No estudo de permeação cutânea das nanoemulsões incorporadas em hidrogel, houve um aumento na retenção de β-cariofileno na derme em relação às nanoemulsões, e houve a facilitação de permeação até o fluido receptor. Por fim, o estudo da atividade in vivo das formulações selecionadas demonstrou que o óleo de copaíba apresenta atividade anti-inflamatória e que a sua incorporação em nanoemulsões aumenta este efeito. No entanto, ambas nanoemulsões, tanto negativamente quanto positivamente carregadas, apresentaram resultado semelhante para a inibição do edema. Quando compara-se a permeação cutânea das formulações verifica-se que na derme não há diferença estatística, o que pode justificar a semelhança do grau de inibição da inflamação no teste in vivo. Em relação à atividade das nanoemulsões incorporadas em hidrogéis, pode-se verificar que no teste de edema de pata apenas a formulação carregada positivamente teve um efeito mais pronunciado, enquanto no edema de orelha as formulações obtiveram um perfil equivalente ao controle cetoprofeno, porém não potencializaram o efeito do óleo. Quanto ao estudo com os parasitos causadores da Leishmaniose, os testes in vitro mostraram que os tratamentos (óleo de copaíba, β-cariofileno e suas nanoemulsões) foram mais eficazes contra as espécies L. major e L. donovani em comparação às espécies L. amazonensis e L. braziliensis. O teste in vivo mostrou que todos os tratamentos foram capazes de reduzir a área da ferida dos camundongos infectados com L. major. No entanto, eles não conseguiram recuperar totalmente os animais. / Copaiba oil is a natural product found especially in the Amazon region, where it is used as treatment for inflammations and as wound healer in the popular medicin. The species Copaifera multijuga Hayne showed a potential anti-inflammatory effect in relation to other Copaifera L. species, mainly due to its major compound, β-caryophyllene. Our research group studied the oil incorporation in nanoemulsions and developed a formulation containing a high copaiba oil proportion in the oil core (20% w/v) without loss of system stability. Based in this nanoemulsion, we present in this study the skin permeation, the formulation optimization and the anti-inflammatory activity. A method in gas chromatograph coupled with mass spectrometer in headspace mode (HS-GC/MS) was validated to analyze β-caryophyllene in skin samples from the skin permeation assay. The method proved to be specific, linear, precise and accurate. Skin permeation test showed that only with the nanoemulsion is possible to detect β-caryophyllene in the dermis layer, while with the oil, only in the stratum corneum. After, two cationic surfactants were tested in the nanoemulsion to prove if the positive charge on the droplet interface could promote β-caryophyllene permeation. Cetyltrimethylammonium bromide proved to be more effective at concentrations considered safe for topical use, reversing the zeta potential to suitable values, without interfering with droplet size and polydispersity index. Oleylamine also reversed the zeta potential, but only at very high concentrations, that may be considered toxic. Skin permeation test showed that the incorporation of cationic surfactants increases β-caryophyllene retention in the epidermis by three fold, whereas in the dermis, there is no statistical difference between the cationic and anionic nanoemulsions. Afterward, the chosen nanoemulsions were incorporated in Carbopol®, Natrosol® and chitosan hydrogels in order to adjust the viscosity for topical use. Chitosan hydrogel presented instability, with an increase in droplet size and polydispersity index, although it has not affected the zeta potential. Carbopol® and Natrosol® hydrogels showed good results in physicochemical characterization, but only Natrosol® hydrogel was chosen for the following skin permeation 10 and anti-inflammatory activity in vivo studies due to its neutral character. In nanoemulsions thickened-hydrogel skin permeation study, there was an increase in the β-caryophyllene retention in the dermis compared to nanoemulsions, and promoted permeation to the receptor fluid. Finally, in vivo anti-inflammatory activity from selected formulations showed that the copaiba oil has anti-inflammatory activity and that its incorporation into nanoemulsions increases this effect. However, both negative and positively charged nanoemulsions, showed similar results for inhibition of edema. When the nanoemulsions’ skin permeation is compared, it is found that in the dermis there is no statistical difference, which may explain the similarity degree of inflammation inhibition in the in vivo test. Regarding to the activity of the nanoemulsions incorporated in hydrogels, it can be verified that in paw edema assay, only the positively charged formulation had a more pronounced effect, whereas in the ear edema the formulations obtained a profile equivalent to the control, ketoprofen, but did not potentiate the effect of the oil. As for the study with the parasites causing Leishmaniasis, in vitro tests showed that the treatments (copaiba oil, β-caryophyllene and their nanoemulsions) were more effective against L. major and L. donovani compared to L. amazonensis and L. braziliensis. In vivo assay showed that all treatments were able to reduce the wound area of mice infected with L. major. However, they were unable to fully recover the animals from the disease.