A prevalência de Doença Mental Grave (do inglês Severe Mental Illness, SMI) atinge 5,4% em um ano segundo os estudos Baltimore Epidemiologic Catchment Area e National Comorbidity Survey. O conceito de SMI surgiu na década de 1970 para o planejamento dos serviços de saúde e apresentou importância crescente a partir do movimento de desinstitucionalização psiquiátrica. Uma das definições para SMI deriva do NIMH (National Institute of Mental Health) em 1987, e utiliza como critérios a presença de prejuízo funcional, decorrente de déficits em aspectos básicos do dia-a-dia, bem como a duração da doença. Casos agudos de SMI podem necessitar tratamento em Unidade de Internação Psiquiátrica em Hospital Geral (UIPHG). No entanto, há poucos estudos disponíveis no Brasil avaliando esta modalidade de tratamento e os desfechos destes pacientes. Evidências também apontam que os pacientes com transtornos psiquiátricos apresentam níveis reduzidos de Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF). O BDNF age no sistema nervoso central (SNC) promovendo crescimento e diferenciação de neurônios. Dentro deste contexto, a presente tese apresenta como objetivo principal a avaliação naturalística de desfechos clínicos e funcionais, associados à avaliação dos níveis séricos de BDNF, em pacientes com SMI. Os pacientes que foram encaminhados para tratamento na Unidade de Internação Psiquiátrica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre foram incluídos se apresentassem os critérios de SMI: Avaliação Global de Funcionamento (Global Assessment of Functioning, GAF) menor ou igual a 50 e tempo de tratamento maior ou igual a dois anos. As avaliações ocorreram em dois momentos (admissão e alta). Compreenderam avaliação sociodemográfica, clínica e coleta de sangue (com dosagem de BDNF sérico). Foram realizadas avaliação diagnóstica pelo Mini-International Neuropsychiatric Interview (MINI) e aplicação das escalas Brief Psychiatric Rating Scale (BPRS), Clinical Global Impression scale (CGI-S), GAF e World Health Organization Quality of Life Instrument—Short Version (WHOQOL-Bref). Ainda, foram aplicadas escalas específicas nos diagnósticos principais (i.e., depressão maior, depressão bipolar, episódio maníaco, esquizofrenia): Hamilton Depression Rating Scale (HAM-D); Young Mania Rating Scale (YMRS). O primeiro artigo desta tese descreve os desfechos clínicos, funcionais e também de qualidade de vida durante a internação psiquiátrica. Observou-se melhora significativa nos parâmetros avaliados nos pacientes com SMI como um todo. Os pacientes com episódio maníaco apresentaram maior chance (em relação aos com episódio depressivo) de atingir remissão pela CGI (OR: 4.03; 95% CI: 1.14-14.30; p=0.03). A duração média da hospitalização (LOS) foi 28,95 (± 19,86) dias. No segundo artigo, observou-se redução dos níveis séricos de BDNF nos pacientes com SMI em relação aos controles saudáveis, independentemente do diagnóstico. Houve aumento significativo no BDNF entre a admissão e a alta. Os resultados apresentados replicam dados previamente publicados a partir de amostra única de pacientes com SMI, sua característica diferencial. Estes resultados reforçam que a internação em UIPHG, uma intervenção relativamente breve, demonstra desfechos positivos e é alternativa bem estabelecida no tratamento da SMI. Além disso, a redução inespecífica do BDNF sérico seguida de um pequeno aumento associado ao tratamento reforçam a possibilidade do BDNF como marcador transdiagnóstico de transtorno mental. / The estimated prevalence of Severe Mental Illness (SMI) according to Baltimore Epidemiologic Catchment Area and National Comorbidity Survey studies is 5.4% in one year. One suggested definition of Severe Mental Illness (SMI) derives from the 1987 National Institute of Mental Health (NIMH) definition and is based on two criteria: 1. duration, characterized as involving “prolonged illness”, and 2. disability, which includes dangerous or disturbing social behavior, and mild impairment in achieving basic needs. These acute psychiatric conditions may require psychiatric inpatient treatment located in acute wards in General Hospitals. However, little data is currently available evaluating the characteristics and the outcomes during an acute inpatient stay in Brazil. Evidence also suggests that Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels are significantly decreased in neuropsychiatric disorders. BDNF is found throughout the brain and is involved in neurogenesis and neuroplasticity. So, the main objectives of this work are to evaluate SMI patients’ outcomes during treatment in a psychiatric unit in a general hospital by symptomatology, functionality, quality of life and by the evaluation of BDNF serum levels. After the admission to a psychiatric unit in a general hospital in Brazil, patients were included and if they had two of the SMI criteria: Global Assessment of Functioning (GAF) ≤ 50 and duration of services contact ≥ 2 years. Patients were assessed in admission and upon discharge with Mini-International Neuropsychiatric Interview (MINI), Brief Psychiatric Rating Scale (BPRS), Clinical Global Impression Scale (CGI), GAF, World Health Organization’s QOL Instrument—Short Version (WHOQOL-Bref) and diagnostic specific scales (Hamilton Depression Rating Scale, HAM-D; Young Mania Rating Scale, YMRS; and Hamilton Anxiety Rating Scale, HAM-A). Blood samples were also obtained. The first manuscript showed that SMI patients had marked and significant improvements in symptomatic and functional measures during psychiatric hospitalization. Patients with manic episode had higher chance of CGI remission (OR: 4.03; 95% CI: 1.14-14.30; p=0.03) when compared with patients with depressive episode. Mean LOS was 28.95 (± 19.86) days. The second manuscript showed that BDNF serum levels were equally reduced among different SMI diagnoses. Also, the observed improvements in SMI patients were associated with a significant, but small increase in mean serum BDNF levels. Therefore, the results replicate evidence from previous findings in single samples, suggesting that SMI patients can have marked acute improvements during a a relatively short intervention (approximately 1 month) represented by the psychiatric hospitalization in a general tertiary hospital. Also, the similar reduction observed in BDNF levels among SMI patients with different diagnoses and the significant increase but non-restoration indicate that BDNF serum levels could be considered a marker for the presence of an unspecific psychiatric disorder and possibly a transdiagnostic and unspecific marker of disease activity.

A hipermetioninemia é uma condição caracterizada por altos níveis de metionina no sangue e em outros tecidos, podendo causar danos neurológicos, hepáticos e musculares. Considerando que a placenta transfere a metionina do sangue materno para a circulação fetal e que pouco se sabe sobre o efeito da hipermetioninemia gestacional sobre o feto em desenvolvimento, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo animal de hipermetioninemia materna quimicamente induzido em ratas e utilizar o mesmo para investigar parâmetros bioquímicos (estresse oxidativo, atividade da Mg2+-ATPase, atividade e imunoconteúdo da Na+,K+-ATPase, número de neurônios, níveis de neurotrofinas, metabolismo energético, inflamação e apoptose), moleculares (expressão gênica da Na+,K+-ATPase) e histológicos (microscopia eletrônica) nos encéfalos da prole, bem como avaliar tarefas comportamentais (campo aberto, esquiva inibitória e reconhecimento de objetos). Também analisamos parâmetros de estresse oxidativo/nitrosativo no músculo esquelético e parâmetros de dano muscular e inflamação no soro da prole. A hipermetioninemia foi induzida em ratas através de duas injeções subcutâneas diárias de metionina durante todo o período gestacional. Um grupo de ratas recebeu a dose 1 (1,34 μmol/g peso corporal) e outro recebeu a dose 2 (2,68 μmol/g peso corporal). O grupo controle recebeu salina. Após o nascimento, um grupo de filhotes foi eutanasiado no sétimo dia de vida e outro grupo foi eutanasiado aos 21 dias. Ambas as doses aumentaram os níveis encefálicos de metionina das mães e a dose 2 aumentou os níveis de metionina nos encéfalos da prole. Após estabelecer o modelo, a dose 2 de metionina foi escolhida para estudar os efeitos do tratamento sobre a prole. Os testes bioquímicos subsequentes foram realizados nos filhotes de 21 dias, a histologia foi realizada na prole de 21 e 30 dias e os testes comportamentais foram realizados em filhotes de 30 dias. Os resultados demonstraram que a hipermetioninemia materna reduziu a atividade da Na+,K+-ATPase, Mg2+- ATPase, catalase e complexo II/succinato desidrogenase, o conteúdo de sulfidrilas, número de neurônios e níveis de NGF e BDNF, bem como aumentou os níveis de RNAm e imunoconteúdo da Na+,K+-ATPase nos encéfalos dos filhotes. Foram observados também alterações morfológicas, indicativas de degeneração celular nos neurônios da prole, e os testes comportamentais indicaram deficit de memória. Com relação aos danos musculares, houve um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio e lipoperoxidação e uma redução do conteúdo de sulfidrilas, atividades das enzimas antioxidantes e nos níveis de nitritos no músculo esquelético da prole. A atividade da creatina cinase foi reduzida e os níveis de ureia e proteína C reativa foram aumentados no soro. Esses resultados foram acompanhados por perda de massa muscular. Tais achados mostraram que a hipermetioninemia gestacional induziu alterações bioquímicas, moleculares e histológicas no encéfalo e bioquímicas no músculo esquelético e soro dos filhotes, as quais podem contribuir para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos danos neurológicos e musculares causados por essa condição. Ressaltamos a importância do desenvolvimento do referido modelo de hipermetioninemia gestacional que além de ampliar o entendimento da toxicidade de altos níveis metionina, também abriu perspectivas para novos estudos a respeito dos efeitos ocasionados pela exposição ao excesso de metionina devido a uma condição genética ou uma dieta rica em proteína durante a vida pré-natal. / Hypermethioninemia is a condition characterized by elevated levels of methionine in blood and other tissues and may cause neurological, hepatic and muscular damages. Considering that placenta transfers methionine from maternal blood to the fetal circulation and little is known about the effect of gestational hypermetioninemia on the developing fetus, the main objective of this work was to develop a chemically induced animal model of maternal hypermethioninemia in rats and to use it to investigate biochemical (oxidative stress, activity of Mg2+-ATPase, activity and immunocontent of Na+,K+-ATPase, number of neurons, neurotrophins levels, energy metabolism, inflammation, and apoptosis), molecular (gene expression of Na+,K+-ATPase) and histological parameters (electron microscopy) in encephalon of the offspring, as well as evaluate behavioral tasks (open field, inhibitory avoidance and object recognition). We also analyzed oxidative/nitrosative stress parameters in skeletal muscle and parameters of muscle damage and inflammation in serum of the offspring. Hypermethioninemia was induced in rats through two daily subcutaneous injections of methionine throughout the gestational period. A group of pregnant rats received dose 1 (1.34 μmol/g body weight) and the other received dose 2 (2.68 μmol/g body weight). The control group received saline. After birth, a first group of pups was euthanized at the 7th day of life and the second group at the 21st day of life. Both doses 1 and 2 increased methionine levels in the brain of the mother rats and dose 2 increased methionine levels in encephalon of the offspring. After establishing the experimental model, the highest dose of methionine was chosen to study the effects of treatment on offspring. The subsequent biochemical tests were performed on 21-day-old pups, histological analyses were performed on offspring of 21 and 30 days of age, and behavioral tests were performed on 30-day-old pups. The results demonstrated that maternal hypermethioninemia reduced Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase, catalase and complex II/succinate dehydrogenase activities, sulfhydryl content, number of neurons and levels of NGF and BDNF, as well as increased levels of mRNA and immunocontent of Na+,K+-ATPase in the brains of the pups. Morphological changes indicative of cellular degeneration were also observed in offspring neurons, and behavioral tests indicated memory deficit. With regard to muscle damage, there was an increase in the production of reactive oxygen species and lipoperoxidation, and a reduction of the sulfhydryl content, antioxidant enzymes activities and in the levels of nitrites in skeletal muscle of the offspring. Creatine kinase activity was reduced and urea and C-reactive protein levels were increased in serum. These results were accompanied by loss of muscle mass. These findings showed that gestational hypermethioninemia induced biochemical, molecular and histological changes in the brain and biochemical changes in skeletal muscle and serum of pups, which may contribute to the understanding of the pathophysiological mechanisms involved in the neurological and muscular damages caused by this condition. We emphasize the importance of the development of this model of gestational hypermetioninemia that, in addition to increasing the understanding of toxicity of high methionine levels, also opened perspectives for new studies regarding the effects caused by exposure to excess methionine due to a genetic condition or a diet rich in protein during prenatal life.

Introdução O fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) tem um papel crítico no desenvolvimento e plasticidade neuronal. Acredita-se que a alteração na sinalização do BDNF contribua para a patogênese da esquizofrenia (SZ), especialmente em relação ao déficit cognitivo. Alguns estudos com pacientes esquizofrênicos têm mostrado um efeito benéfico, e outros um efeito prejudicial, da clozapina (CLZ) na cognição. Objetivos O presente estudo tem por objetivo avaliar a associação entre a dose diária de CLZ e os níveis séricos de BDNF em pacientes com SZ. Material e Métodos Foram selecionados dois grupos de pacientes com SZ (n=44) de acordo critério do DSM-IV-TR, cronicamente medicados com CLZ (n=31) e antipsicóticos típicos (n=13). Foram coletados 5ml de amostras de sangue por venopunção. Resultados Os níveis séricos de BDNF foram correlacionados significativamente com a dose diária de CLZ (r=0.394, p=0.028), mas não com a dose diária de antipsicóticos típicos (r=0.208, p=0.496). Conclusão Este estudo sugere que os níveis de BDNF sérico estão correlacionados com a dose diária de CLZ, e que isto deve levar à melhora na cognição observada nos pacientes com SZ tratados com CLZ. Apesar da forte evidência de que a administração crônica de CLZ é efetiva para pacientes com SZ, ainda não se sabe como os antipsicóticos atípicos regulam a expressão do BDNF. A concentração sérica de BDNF na SZ merece futuras investigações, visando o papel das neurotrofinas na resposta cognitiva ao tratamento com CLZ e outros antipsicóticos atípicos. / Introduction Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) plays a critical role in neurodevelopment and neuroplasticity. Altered BDNF signaling is thought to contribute to the pathogenesis of schizophrenia (SZ) especially in relation to cognitive deficits. Clozapine (CLZ) has shown a beneficial effect on cognition in SZ in some studies and a detrimental effect in others. Objectives The aim of the present study was to evaluate the association between CLZ daily dose and serum BDNF levels. Methods Two groups of chronically medicated DSM-IV-TR SZ patients (n=44), on treatment with CLZ (n=31) and typical antipsychotics (n=13) had 5ml blood samples collected by venipuncture. Results Serum BDNF levels were significantly correlated with CLZ daily dose (r=0.394, p=0.028), but not with typical antipsychotic daily dose (r=0.208, p=0.496). Conclusion This study suggests that serum BDNF levels are correlated with CLZ daily dose, and this may lead to the cognitive enhancement as seen in patients with SZ under CLZ. Despite the strong evidence that chronic administration of CLZ is effective for patients with SZ, it is still unknown whether atypical antipsychotic drugs regulate BDNF expression. Serum BDNF concentration in SZ merits further investigations with regard to the role of neurotrophins in the cognitive response to treatment with CLZ and other atypical antipsychotics.

Clinically, injuries affecting the spinal cord or peripheral nerves can leave those affected with severe disability and, at present, there are limited options for treatment. Peripheral nerve injury with a significant gap between the proximal and distal stumps is currently treated with autologous nerve grafting but this is limited by availability of donor nerve and has associated morbidities. In contrast, injuries to the spinal cord lead to an inhibitory environment caused by the glial cells and thereby, limit potential axonal regeneration. This thesis investigates the effects of human adipose derived stem cells (ASC) on regeneration after peripheral nerve and spinal cord injury in adult rats. Human ASC expressed various neurotrophic molecules and growth factor stimulation of the cells in vitro resulted in increased secretion of BDNF, GDNF, VEGF-A and angiopoietin-1 proteins. Stimulated ASC also showed an enhanced ability to induce capillary-like tube formation in an in vitro angiogenesis assay. In contrast to Schwann cells, ASC did not induce activation of astrocytes and supported neurite outgrowth from the adult rat sensory DRG neurons in culture. In a peripheral nerve injury model, ASC were seeded into a fibrin conduit, which was used to bridge a 10 mm rat sciatic nerve gap. After 2 weeks, ASC enhanced GAP-43 and ATF-3 expression in the spinal cord, reduced c-jun expression in the DRG and increased the vascularity of the fibrin nerve conduits. The animals treated with stimulated ASC showed an enhanced axon regeneration and reduced caspase-3 expression in the DRG. After transplantation into the injured C3-C4 cervical spinal cord. ASC continued to express neurotrophic factors and laminin and stimulated extensive ingrowths of 5HT-positive raphaespinal axons into the trauma zone. In addition, ASC induced sprouting of raphaespinal terminals in C2 contralateral ventral horn and C6 ventral horn on both sides. Transplanted cells also changed the structure and the density of the astroglial scar. Although the transplanted cells had no effect on the density of capillaries around the lesion site, the reactivity of OX42-positive microglial cells was markedly reduced.

As leucemias correspondem a 30% dos tumores pediátricos, e constituem as neoplasias mais frequentes em indivíduos com menos de 15 anos. Apesar da elevada taxa de cura, frequentemente a ela está associada resistência à quimioterapia e efeitos colaterais tardios. Por isso, novas estratégias de tratamento, diagnóstico e prognóstico são necessárias. O fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e seus receptores de quinase relacionados à tropomiosina (tropomyosin related kinase, ou Trk) estão envolvidos com muitos processos na medula óssea (MO). Entretanto, o papel do BDNF em leucemias agudas (LA) pediátricas ainda não é bem conhecido. O objetivo desse estudo foi analisar os níveis de BDNF em amostras de MO ou sangue periférico (SP) de crianças com LA, e iniciar a caracterização dos efeitos de agonistas e antagonistas de neurotrofinas sobre culturas primárias de leucemias linfóides agudas em diferentes momentos terapêuticos Foram coletadas amostras de MO ou SP de crianças e adolescentes com leucemia linfóide aguda (LLA), crianças e adolescentes com leucemia mielóide aguda (LMA), e indivíduos saudáveis (IS) da mesma faixa etária. Para análise dos níveis séricos de BDNF utilizou-se kit de imuno-ensaio enzimático tipo sanduíche. Quando comparados aos IS os níveis de BDNF de pacientes com LA, ao diagnóstico, foram significativamente menores. Resultados similares foram observados nos pacientes durante indução, consolidação, diagnóstico e tratamento de recidiva. Da mesma forma, os níveis de BDNF foram inferiores em pacientes que receberam transfusão de plaquetas e, ao diagnóstico naqueles pacientes que foram a óbito. Para a caracterização dos efeitos de agonistas e antagonistas de neurotrofinas em cultura de células, amostras de pacientes ao momento do diagnóstico e no momento de indução do tratamento foram utilizadas. Os linfócitos foram extraídos e, após plaqueamento, as células foram tratadas com BDNF (Sigma, B3795), NGF (Sigma, SRP3015) e K252a (Sigma, 05288) por 72 horas. A viabilidade foi avaliada pelo método de exclusão por azul de Tripan. Devido às dificuldades no cultivo das células, esses dados ainda estão em análise. / Leukemias account for 30% of pediatric tumors and are the most frequent cancers in people under 15 years. Despite the high cure rate, often it is associated with resistance to chemotherapy and late side effects. Therefore, new strategies for treatment, diagnosis and prognosis are necessary. The brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and their kinase receptor related tropomyosin (tropomyosin related kinase, and Trk) are involved in many processes in bone marrow (BM), however, the role of BDNF in acute leukemias (AL) pediatric it is not well known. The aim of this study was to analyze the BDNF levels in BM samples or peripheral blood (PB) of children with AL, and start the characterization of the effects of agonists and antagonists on neurotrophin primary cultures of acute lymphoblastic leukemias in different therapeutic moments. BM or PB samples were collected from children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia (ALL), children and adolescents with acute myeloid leukemia (AML), and healthy individuals (HI) of the same age. For analysis of serum levels of BDNF was used sandwich enzyme immunoassay kit. When compared to HI, BDNF levels in patients with AL at diagnosis were significantly lower. Similar results were observed in patients during induction, consolidation, diagnosis and treatment of relapse. Similarly, BDNF levels were lower in patients receiving platelet transfusion and at diagnosis in patients that died. To characterize the effects of agonists and antagonists for neurotrophin in cell culture, samples of patients at diagnosis and at the time of induction treatment were used. Lymphocytes were extracted and, after plating, cells were treated with BDNF (Sigma B3795), NGF (Sigma, SRP3015) and K252a (Sigma, 05288) for 72 hours. Viability was assessed by exclusion of trypan blue method. Due to difficulties in cell culture, these data are still under analysis.

A hipermetioninemia é uma condição caracterizada por altos níveis de metionina no sangue e em outros tecidos, podendo causar danos neurológicos, hepáticos e musculares. Considerando que a placenta transfere a metionina do sangue materno para a circulação fetal e que pouco se sabe sobre o efeito da hipermetioninemia gestacional sobre o feto em desenvolvimento, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo animal de hipermetioninemia materna quimicamente induzido em ratas e utilizar o mesmo para investigar parâmetros bioquímicos (estresse oxidativo, atividade da Mg2+-ATPase, atividade e imunoconteúdo da Na+,K+-ATPase, número de neurônios, níveis de neurotrofinas, metabolismo energético, inflamação e apoptose), moleculares (expressão gênica da Na+,K+-ATPase) e histológicos (microscopia eletrônica) nos encéfalos da prole, bem como avaliar tarefas comportamentais (campo aberto, esquiva inibitória e reconhecimento de objetos). Também analisamos parâmetros de estresse oxidativo/nitrosativo no músculo esquelético e parâmetros de dano muscular e inflamação no soro da prole. A hipermetioninemia foi induzida em ratas através de duas injeções subcutâneas diárias de metionina durante todo o período gestacional. Um grupo de ratas recebeu a dose 1 (1,34 μmol/g peso corporal) e outro recebeu a dose 2 (2,68 μmol/g peso corporal). O grupo controle recebeu salina. Após o nascimento, um grupo de filhotes foi eutanasiado no sétimo dia de vida e outro grupo foi eutanasiado aos 21 dias. Ambas as doses aumentaram os níveis encefálicos de metionina das mães e a dose 2 aumentou os níveis de metionina nos encéfalos da prole. Após estabelecer o modelo, a dose 2 de metionina foi escolhida para estudar os efeitos do tratamento sobre a prole. Os testes bioquímicos subsequentes foram realizados nos filhotes de 21 dias, a histologia foi realizada na prole de 21 e 30 dias e os testes comportamentais foram realizados em filhotes de 30 dias. Os resultados demonstraram que a hipermetioninemia materna reduziu a atividade da Na+,K+-ATPase, Mg2+- ATPase, catalase e complexo II/succinato desidrogenase, o conteúdo de sulfidrilas, número de neurônios e níveis de NGF e BDNF, bem como aumentou os níveis de RNAm e imunoconteúdo da Na+,K+-ATPase nos encéfalos dos filhotes. Foram observados também alterações morfológicas, indicativas de degeneração celular nos neurônios da prole, e os testes comportamentais indicaram deficit de memória. Com relação aos danos musculares, houve um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio e lipoperoxidação e uma redução do conteúdo de sulfidrilas, atividades das enzimas antioxidantes e nos níveis de nitritos no músculo esquelético da prole. A atividade da creatina cinase foi reduzida e os níveis de ureia e proteína C reativa foram aumentados no soro. Esses resultados foram acompanhados por perda de massa muscular. Tais achados mostraram que a hipermetioninemia gestacional induziu alterações bioquímicas, moleculares e histológicas no encéfalo e bioquímicas no músculo esquelético e soro dos filhotes, as quais podem contribuir para o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos danos neurológicos e musculares causados por essa condição. Ressaltamos a importância do desenvolvimento do referido modelo de hipermetioninemia gestacional que além de ampliar o entendimento da toxicidade de altos níveis metionina, também abriu perspectivas para novos estudos a respeito dos efeitos ocasionados pela exposição ao excesso de metionina devido a uma condição genética ou uma dieta rica em proteína durante a vida pré-natal. / Hypermethioninemia is a condition characterized by elevated levels of methionine in blood and other tissues and may cause neurological, hepatic and muscular damages. Considering that placenta transfers methionine from maternal blood to the fetal circulation and little is known about the effect of gestational hypermetioninemia on the developing fetus, the main objective of this work was to develop a chemically induced animal model of maternal hypermethioninemia in rats and to use it to investigate biochemical (oxidative stress, activity of Mg2+-ATPase, activity and immunocontent of Na+,K+-ATPase, number of neurons, neurotrophins levels, energy metabolism, inflammation, and apoptosis), molecular (gene expression of Na+,K+-ATPase) and histological parameters (electron microscopy) in encephalon of the offspring, as well as evaluate behavioral tasks (open field, inhibitory avoidance and object recognition). We also analyzed oxidative/nitrosative stress parameters in skeletal muscle and parameters of muscle damage and inflammation in serum of the offspring. Hypermethioninemia was induced in rats through two daily subcutaneous injections of methionine throughout the gestational period. A group of pregnant rats received dose 1 (1.34 μmol/g body weight) and the other received dose 2 (2.68 μmol/g body weight). The control group received saline. After birth, a first group of pups was euthanized at the 7th day of life and the second group at the 21st day of life. Both doses 1 and 2 increased methionine levels in the brain of the mother rats and dose 2 increased methionine levels in encephalon of the offspring. After establishing the experimental model, the highest dose of methionine was chosen to study the effects of treatment on offspring. The subsequent biochemical tests were performed on 21-day-old pups, histological analyses were performed on offspring of 21 and 30 days of age, and behavioral tests were performed on 30-day-old pups. The results demonstrated that maternal hypermethioninemia reduced Na+,K+-ATPase, Mg2+-ATPase, catalase and complex II/succinate dehydrogenase activities, sulfhydryl content, number of neurons and levels of NGF and BDNF, as well as increased levels of mRNA and immunocontent of Na+,K+-ATPase in the brains of the pups. Morphological changes indicative of cellular degeneration were also observed in offspring neurons, and behavioral tests indicated memory deficit. With regard to muscle damage, there was an increase in the production of reactive oxygen species and lipoperoxidation, and a reduction of the sulfhydryl content, antioxidant enzymes activities and in the levels of nitrites in skeletal muscle of the offspring. Creatine kinase activity was reduced and urea and C-reactive protein levels were increased in serum. These results were accompanied by loss of muscle mass. These findings showed that gestational hypermethioninemia induced biochemical, molecular and histological changes in the brain and biochemical changes in skeletal muscle and serum of pups, which may contribute to the understanding of the pathophysiological mechanisms involved in the neurological and muscular damages caused by this condition. We emphasize the importance of the development of this model of gestational hypermetioninemia that, in addition to increasing the understanding of toxicity of high methionine levels, also opened perspectives for new studies regarding the effects caused by exposure to excess methionine due to a genetic condition or a diet rich in protein during prenatal life.

Introdução: A cefaleia do tipo tensional crônica (CTTC) é caracterizada por dor de cabeça quase diária e sensibilização central. A acupuntura tem sido estudada no tratamento de diversos tipos de cefaleia, porém os resultados são controversos e apenas sugerem maior eficácia em relação ao placebo. A eletroacupuntura (EA) modula algumas das funções do sistema nervoso central (SNC), podendo modificar a neuroplasticidade. A plasticidade do SNC pode ser rastreada através dos níveis séricos do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), um mediador de neuroplasticidade. Objetivo: Este estudo testou a hipótese de que a analgesia pela EA na CTTC estaria relacionada à neuroplasticidade, avaliada através dos níveis séricos de BDNF. Métodos: Foram recrutadas mulheres, com idades entre 18-60 anos, portadoras de CTTC, para um ensaio clinico randomizado, cegado, controlado por placebo-sham. Foram aplicadas 10 sessões de EA, durante 30 minutos (2- 10 Hz, com intensidade conforme a tolerância) na cervical e áreas autonômicas, duas vezes por semana, que foram comparadas com placebosham. Os períodos de tratamento foram separados por duas semanas de intervalo. Avaliou-se dor (através de escala análoga visual (VAS) de 10 cm) e níveis séricos de BDNF como desfechos primários. Resultados: Trinta e quatro pacientes foram randomizadas e vinte e nove completaram o protocolo. Os escores da VAS foram menores durante o tratamento com EA, do que no tratamento com placebo-sham. (2.38±1.77, 3.02±2.49 respectivamente, P=0.005). Os escores de dor variaram conforme a sequência de intervenção, demonstrando efeito de carreamento (P<0.05). Utilizando regressão múltipla, os níveis séricos de BDNF foram ajustados para a escala de depressão de Hamilton e VAS (r-squared= 0.07, standard β coefficients= -0.2, -0.14, respectivamente). Ao final do período da primeira intervenção os valores de BDNF ajustados, foram maiores no grupo EA, (29.31±3.24, 27.53±2.94 ng/mL) a magnitude de efeito mensurada pela diferença na media padronizada expressou um efeito moderado (Cohen´s d= 0.55). Conclusão: A analgesia produzida pela EA pode estar relacionada à neuroplasticidade, avaliada através do BDNF ajustado para dor e depressão. A modulação pela EA na dor e BDNF depende da condição do SNC, uma vez que está relacionada à depressão e depende do momento da aplicação da intervenção. / Background: Chronic tension-type headache (CTTH) is characterized by almost daily headaches and central sensitization. Electroacupunture (EA) is effective for this condition and modules some central nervous system (CNS) functions. CNS plasticity could be tracked in serum using the brain derived neurotrophic factor (BDNF), a neuroplasticity mediator. Objective: We tested the hypothesis that EA analgesia in CTTH would be related to neuroplasticity indexed by the BDNF. Patients and methods: We enrolled females aging 18-60 with CTTH in a randomized, blinded, placebo-controlled crossover trial, comparing ten EA sessions applied during 30 minutes (2-10 Hz, intensity by tolerance) in cervical and autonomic areas twice per week, vs. placebo-sham (PS). Treatment periods were separated by two washout weeks. Pain on the 10 cm visual analog scale (VAS) and serum BDNF were assessed as primary outcomes. Results: Thirty-four subjects underwent randomization, twenty-nine completed the protocol. VAS during EA period was lower than during PS (2.38±1.77, 3.02±2.49 respectively, P=0.005). VAS differed according to intervention sequence demonstrating carry-over effect (P<0.05). Using multiple regression serum BDNF was adjusted for the Hamilton depression rating scale (HDRS) and VAS (r-squared=0.07, standard β coefficients=-0.2, -0.14, respectively; omnibus-test P<0.001). At the end of the first intervention period the adjusted BDNF was higher in the EA cohort (29.31±3.24, 27.53±2.94 ng/mL, Cohen´s d= 0.55). Conclusion: EA analgesia may relate to neuroplasticity indexed by the adjusted BDNF. EA modulation on pain and BDNF depends on the situation of the CNS, as is related to depression and depends on the timing of the intervention.

Introdução O fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) tem um papel crítico no desenvolvimento e plasticidade neuronal. Acredita-se que a alteração na sinalização do BDNF contribua para a patogênese da esquizofrenia (SZ), especialmente em relação ao déficit cognitivo. Alguns estudos com pacientes esquizofrênicos têm mostrado um efeito benéfico, e outros um efeito prejudicial, da clozapina (CLZ) na cognição. Objetivos O presente estudo tem por objetivo avaliar a associação entre a dose diária de CLZ e os níveis séricos de BDNF em pacientes com SZ. Material e Métodos Foram selecionados dois grupos de pacientes com SZ (n=44) de acordo critério do DSM-IV-TR, cronicamente medicados com CLZ (n=31) e antipsicóticos típicos (n=13). Foram coletados 5ml de amostras de sangue por venopunção. Resultados Os níveis séricos de BDNF foram correlacionados significativamente com a dose diária de CLZ (r=0.394, p=0.028), mas não com a dose diária de antipsicóticos típicos (r=0.208, p=0.496). Conclusão Este estudo sugere que os níveis de BDNF sérico estão correlacionados com a dose diária de CLZ, e que isto deve levar à melhora na cognição observada nos pacientes com SZ tratados com CLZ. Apesar da forte evidência de que a administração crônica de CLZ é efetiva para pacientes com SZ, ainda não se sabe como os antipsicóticos atípicos regulam a expressão do BDNF. A concentração sérica de BDNF na SZ merece futuras investigações, visando o papel das neurotrofinas na resposta cognitiva ao tratamento com CLZ e outros antipsicóticos atípicos. / Introduction Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) plays a critical role in neurodevelopment and neuroplasticity. Altered BDNF signaling is thought to contribute to the pathogenesis of schizophrenia (SZ) especially in relation to cognitive deficits. Clozapine (CLZ) has shown a beneficial effect on cognition in SZ in some studies and a detrimental effect in others. Objectives The aim of the present study was to evaluate the association between CLZ daily dose and serum BDNF levels. Methods Two groups of chronically medicated DSM-IV-TR SZ patients (n=44), on treatment with CLZ (n=31) and typical antipsychotics (n=13) had 5ml blood samples collected by venipuncture. Results Serum BDNF levels were significantly correlated with CLZ daily dose (r=0.394, p=0.028), but not with typical antipsychotic daily dose (r=0.208, p=0.496). Conclusion This study suggests that serum BDNF levels are correlated with CLZ daily dose, and this may lead to the cognitive enhancement as seen in patients with SZ under CLZ. Despite the strong evidence that chronic administration of CLZ is effective for patients with SZ, it is still unknown whether atypical antipsychotic drugs regulate BDNF expression. Serum BDNF concentration in SZ merits further investigations with regard to the role of neurotrophins in the cognitive response to treatment with CLZ and other atypical antipsychotics.

Orientador: Francesco Langone / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T01:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rezende_AlexandreCesarSantosde_D.pdf: 5210413 bytes, checksum: 60e511530e7c408001bf455f9968219f (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O fator neurotrófico ciliar (CNTF) despertou grande interesse com a descoberta do seu efeito neuroprotetor sobre motoneurônios após secção de nervos periféricos em ratos neonatos e camundongos adultos. Contudo, seus efeitos colaterais de perda de peso e caquexia impedem seu uso clínico. Uma via alternativa muito promissora, no sentido de eliminar estes efeitos colaterais, parece ser a administração do CNTF conjugado com peptídeos que possuem domínio de translocação de proteínas (PTD-protein transduction domain). Previamente, mostramos que o CNTF conjugado a um PTD derivado da proteína tat do vírus HIV-1 (TAT-CNTF) também tem efeito protetor sobre motoneurônios e não produziu efeitos colaterais no tratamento, por 5 dias, de ratos neonatos (P2-P7) que sofreram secção do nervo isquiático. O presente trabalho teve como objetivo investigar se a administração da TAT-CNTF por tempos mais prolongados seria capaz de manter a sobrevivência de motoneurônios e neurônios sensoriais, bem como de estimular a regeneração axonal, sem a ocorrência dos efeitos colaterais do CNTF. Desta forma, ratos Wistar neonatos (P2) receberam tratamento subcutâneo com CNTF (1,2mg/g/dia) durante 5 dias, TATCNTF (1,2mg/g/dia) ou PBS durante 5 ou 15 dias. Ao final do período de tratamento os animais foram sacrificados por decapitação, sendo coletado para posterior análise o sangue e gorduras marrom interescapular, branca retroperitonial e branca epididimal. Um outro grupo de animais tive o nervo isquiático esquerdo esmagado em P2 e recebeu o mesmo tratamento. No período entre 20 e 60 dias de vida foi realizada a avaliação da recuperação funcional motora por meio de Walking Track Test, e da recuperação funcional sensitiva através da medida do limiar da resposta de retirada da pata a um estímulo elétrico. No 30º ou 60º dia de vida foi realizada marcação retrógrada de neurônios cujos axônios compõem o nervo isquiático utilizando-se Amina Dextrano Biotinilado (BDA). Após 7 dias, os animais foram sacrificados, sendo coletada a intumescência lombar, os gânglios sensoriais L4 e L5 e o nervo isquiático para análise histológica. As análises dos níveis plasmáticos de glicose, triglicérides e ácidos graxos revelaram que o tratamento com TAT-CNTF ou CNTF por igual período (5 dias) produziu modificações no metabolismo energético em relação aos ratos controle (PBS), contudo diferiram quanto à intensidade dos efeitos produzidos. O tratamento prolongado com TAT-CNTF (15 dias) produziu significantes alterações nas concentrações plasmáticas de triglicérides e de colesterol. Entretanto, o tratamento com TAT-CNTF (5 ou 15 dias) produziu efeitos reduzidos sobre os tecidos adiposos quando comparados ao tratamento com CNTF. Os ratos do grupo TAT-CNTF apresentaram peso corporal significativamente menor que aqueles do grupo PBS a partir do 9º dia de tratamento, porém o grupo CNTF apresentou menor peso a partir do 2º dia. Em ambos tratamentos houve reversão desse efeito sobre o peso corporal, porém esta ocorreu mais precocemente nos ratos do grupo TAT-CNTF (P25) quando comparados ao grupo CNTF (P32). A recuperação funcional motora e sensorial dos grupos CNTF e TAT-CNTF foi 50% superior ao grupo controle. Os grupos CNTF e TAT-CNTF também apresentaram maior número de neurônios sensoriais e motores BDA positivos, além de maior número de axônios mielínicos no nervo isquiático quando comparados ao grupo controle. Nossos resultados mostraram que o tratamento com TAT-CNTF, mesmo por períodos mais longos, promoveu a sobrevivência e regeneração axonal de motoneurônios e neurônios sensitivos sem a ocorrência dos efeitos colaterais produzidos pelo tratamento com CNTF. Além disso, tais propriedades da TAT-CNTF contribuíram significativamente para a recuperação funcional motora e sensorial após lesões nervosas periféricas. / Abstract: Ciliary neurotrophic factor (CNTF) is known as a neuroprotective agent on motoneurons after peripheral nerve section in neonatal rats and adult mice. However, side effects like weight loss and caquexia have limited its clinical use. A promising approach for the avoidance of such side effects is the fusion of a protein transduction domain (PTD) with CNTF. Previously we showed that CNTF fused with HIV-1 PTD (TAT-CNTF) also had protective effect on motoneurons and did not produce side effects in a 5 days treatment of sciatic nerve transected neonatal rats (P2-P7). The aim of the present work was investigate if the TAT-CNTF administration for long time was capable to support the motoneurons and sensory neurons survival, as well as to stimulate the axonal regeneration, without CNTF side effects. Thus, neonatal Wistar rats (P2) were subcutaneously treated with CNTF (1.2mg/g/day) for 5 days, TAT-CNTF (1.2mg/g/day) or PBS during 5 or 15 days. By the end of treatment rats were killed by decaptation and blood, intrascapular brown adipose tissue and retroperitonial and epididimal white adipose tissue were collected for further analysis. Another group of animals had the left sciatic nerve crushed (NCE) in P2 and received the same treatment. From 20 to 60 days of age a Walking Track Test was performed in order to evaluate the motor function recovery, and the threshold for paw withdraw was used as a measure of sensitive functional recovery. The retrograde labeling of sciatic nerve neurons using Biotinilated Dextran Amine (BDA) was performed at 30 or 60 days of age. Rats were killed after 7 days and the lumbar enlargement, L4 and L5 dorsal root ganglia and the sciatic nerve were collected for histological analysis. The analysis glucose, triglycerides and fatty acid plasmatic levels demonstrated that 5 days TAT-CNTF or CNTF treatment induced changes in energy metabolism compared to control rats, however the effects of these treatments had different intensities. The long term treatment with TAT-CNTF (15 days) induced important changes in triglycerides and cholesterol plasmatic levels. However TAT-CNTF treatment (5 or 15 days) had reduced effects on adipose tissue when compared to CNTF. After the 9th day of treatment the TAT-CNTF group had a smaller body weight when compared to the PBS group, on the other hand the CNTF group had a smaller body weight after the 2nd day compared to the PBS group. In both treatments (CNTF and TATCNTF) there was a reversion of the body weight effect, however this was earlier in the TAT-CNTF group (P25) than on the CNTF group (P32). The motor and sensorial functional recovery of CNTF and TAT-CNTF groups was 50% greater than the control group. CNTF and TAT-CNTF groups also displayed a greater number of BDA positive motor and sensory neurons, and more myelinic axons in the sciatic nerve compared to the control group. Our results demonstrate that TAT-CNTF long term treatment was able to promote the survival and axonal regeneration of motor and sensory neurons without important CNTF related side effects. Moreover, TAT-CNTF properties had significant contribution for the motor and sensory functional recovery after peripheral nerve lesion. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

O número de pessoas acometidas por doenças cérebro vasculares, entre as quais, o acidente vascular cerebral (AVC), constitui um cenário alarmante nos dias atuais, fato que pode estar associado ao aumento da longevidade. A recuperação funcional de pessoas com sequelas de AVC requer a aplicação de técnicas de reabilitação que se baseiam em princípios de neuroplasticidade; no entanto, pouco se sabe quais são os benefícios morfofuncionais resultantes de diferentes abordagens terapêuticas. O presente estudo, portanto, teve como objetivos analisar a concentração plasmática de BDNF antes e após tratamento de reabilitação de indivíduos com AVC e correlacionar com o polimorfismo Val66Met; identificar e comparar a frequência do polimorfismo Val66Met na população brasileira e em pessoas que sofreram AVC. Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da EACH/USP. O estudo foi dividido em duas abordagens experimentais: (i) caracterização genotípica de pessoas com diagnóstico de AVC e sua relação com diferentes protocolos de reabilitação e com o BDNF plasmático e (ii) estudo genético populacional para caracterização da frequência do polimorfismo Val66Met na população brasileira. Participaram deste estudo indivíduos saudáveis dos estados de Alagoas, Rio Grande do Sul e São Paulo (n=1558) e pacientes com sequelas de AVC (n=54). A análise do BDNF plasmático foi realizada por meio do teste imunoenzimático de ELISA e somente os indivíduos submetidos à terapia robótica tiveram níveis aumentados de BDNF circulante. As análises do polimorfismo Val66Met foram realizadas utilizando a técnica de PCR-RFLP (HRM). Não houve associação entre o polimorfismo e os níveis plasmáticos de BDNF. As frequências genotípicas e alélicas do polimorfismo Val66Met dos indivíduos saudáveis e com AVC foram muito semelhantes. Os dados de gênero apontou aumento nos níveis de BDNF em mulheres, entretanto, a idade não interferiu nos níveis de BDNF. Considerando-se os resultados, podemos concluir que o polimorfismo não apresenta relação com a ocorrência de AVC e não interfere nos níveis plasmáticos de BDNF plasmático. No que concerne às técnicas de reabilitação, a terapia robótica pode ser mais efetiva para desencadear eventos de neuroplasticidade considerando o aumento de BDNF circulante após o tratamento. Através do estudo populacional foi possível verificar que o perfil da miscigenação mudou ao longo de três gerações analisadas e confirmamos a presença rara do polimorfismo em pessoas de cor/raça preta e indígena / The number of people affected by cerebrovascular diseases, including the stroke, is an alarming scenario nowadays, which may be associated with the increment of the longevity. Functional recovery of people with stroke sequelae requires the application of rehabilitation techniques based on principles of neuroplasticity, however, the knowledge about how the morphological and functional benefits of different therapeutic approaches is insipient. This study, therefore, aimed to analyze the plasma concentration of BDNF before and after rehabilitation program of patients with stroke and correlate with Val66Met polymorphism; to identify and to compare the frequency of Val66Met polymorphism in the Brazilian population and in the patients who have suffered strokes. The experimental procedures were approved by the Research Ethics Committee of EACH/USP. The study was divided into two experimental approaches: (i) genotypic characterization of people diagnosed with stroke and their relation to different rehabilitation protocols and plasma BDNF and (ii) populational genetic study to characterize the frequency of Val66Met polymorphism in the Brazilian population. The study included healthy individuals in the states of Alagoas, Rio Grande do Sul and São Paulo (n = 1558) and patients with stroke sequelae (n = 54). The analysis of plasma BDNF was performed by immunoenzymatic test ELISA, and only those individuals undergoing robotic therapy had increased levels of circulating BDNF. The analysis of the polymorphism Val66Met was performed using PCR-RFLP (HRM). There was no association between the polymorphism and the plasma levels of BDNF. The genotypic and allelic frequencies of the Val66Met polymorphism of healthy individuals and stroke were similar. The gender data showed an increase in BDNF levels in women, but age did not interfere with BDNF levels. Considering the results, we can conclude that the polymorphism is not related to the occurrence of stroke and does not affect the plasma levels of serum BDNF. As regards the rehabilitation techniques, robotic therapy may be more effective to trigger neuroplasticity events considering the increase of circulating BDNF after treatment. Through the study population was possible to verify that the profile of miscegenation has changed over the three generations examined and confirmed the presence of the rare polymorphism in black and indigenous people