Einleitung Streptococcus (S.) suis ist weltweit in Schweinepopulationen verbreitet. S. suis verursacht hohe wirtschaftliche Verluste durch das Auftreten von Meningitis, Arthritis, Serositis und Endokarditis und stellt als Zoonoseerreger gleichzeitig ein Risiko für den Menschen dar. Im Zusammenhang mit Infektionen in europäischen Schweinebetrieben werden Serotyp 2, 7 und 9 am häufigsten nachgewiesen. Die Bakteriämie spielt eine Schlüsselrolle in der invasiven S. suis Erkrankung und die Interaktion der Streptokokken mit den Immunzellen des Wirts im Blut ist entscheidend für den Ausgang der Infektion. Ziele der Untersuchung Das Ziel der vorliegenden Arbeit, war die Untersuchung der Fähigkeit von porzinen Immunzellen S. suis durch Phagozytose und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu töten. Dabei wurden vor allem die Bedeutung von IgM und des Komplementsystems beleuchtet. In diesem Sinne, wurde auch die Arbeitshypothese untersucht, dass eine Modifizierung der bakteriellen Zellwand durch D-Alanylierung von Lipoteichonsäuren (LTAs) S. suis hilft, angeborene Immunfunktionen zu umgehen, wie z. B. die Opsonisierung mit Komplementfaktoren, sowie dass diese Zellwandveränderung die Interaktion von S. suis mit Leukozyten beeinflusst. Material und Methoden Die Bestimmung von ROS und dem Überleben der Streptokokken wurde in vivo im Blut zweier mit S. suis-infizierter Ferkel und in vitro in einem rekonstituierten Blutmodel durchgeführt. Die ROS-Messung erfolgte unter Zugabe von Dihydrorhodamine 123 mittels Durchflusszytometrie in Granulozyten. Verschiedene Inhibitoren wurden dabei eingesetzt: Apocynin um die NADPH Oxidase und damit die ROS-Bildung zu hemmen, Vaccinia Virus Complement Control Protein (VCP) für die Inaktivierung der Komplementkaskade und IdeSsuis um porzines IgM zu spalten. Mithilfe eines thermosensitiven Vektors wurde eine isogene Deletionsmutante des dltA Gens erstellt, um den Einfluss der D-Alanylierung von LTAs zu untersuchen. Die Sequenzierung des entsprechenden Genabschnitts und ein Southern Blot dienten der genetischen Verifizierung der Mutante. Weiterhin wurden Wachstumsverhalten, Hydrophobie und Ladung der Oberfläche sowie minimale Hemmkonzentrationen einer Reihe antimikrobieller Peptide für die dltA Mutante untersucht. Die Assoziation von Blutleukozyten mit S. suis wurde mithilfe von Far Red markierten Bakterien in der Durchflusszytometrie bestimmt. Die Zytokin-Messung erfolgte mit kommerziell erhältlichen Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA)-Kits. Ergebnisse S. suis Stämme der Serotypen 2, 7 und 9 zeigten sich hochsensibel gegenüber Wasserstoffperoxid. Eine Hemmung der Bildung von ROS in rekonstituierten Blutproben führte selbst in Anwesenheit einer hohen Konzentration von S. suis-spezifischen Antikörpern zu einem signifikanten Anstieg des bakteriellen Überlebens. Die Induktion von ROS durch S. suis in Granulozyten wurde durch spezifische Antikörper verstärkt und hing partiell von der Anwesenheit funktionellen Komplements ab. In der Abwesenheit von IgG reduzierte die Spaltung von IgM oder die Inaktivierung von Komplement die ROS Produktion um mehr als das Dreifache, was in einem Anstieg des bakteriellen Überlebens resultierte. Der Mechanismus von S. suis D-Alanin in seine LTAs einzulagern, erhöhte die Hydrophobie der bakteriellen Oberfläche und reduzierte die Opsonisierung mit Komplementfaktor C3b, sowie die Phagozytose durch Granulozyten in Vollblut und die Assoziation von S. suis mit Monozyten and Lymphozyten. Trotzdem wurde das Überleben der Streptokokken in Blut, welches S. suis-spezifische Antikörper enthielt, nicht signifikant durch diese Zellwandmodifikation gesteigert. Allerdings war der durch die dltA Mutante induzierte Gehalt an IL-1β im Blut signifikant geringer als der durch den Wildtyp induzierte. Hohe Antikörperspiegel verursachten einen hochsignifikanten Anstieg der Interaktion von S. suis mit Monozyten, was bei diesen zum inflammatorischen Zelltod mit einer starken Sekretion von IL-1β und TNF-α führte. Schlussfolgerung Trotz einer Vielzahl an Abwehrmechanismen von S. suis gegen oxidativen Stress, stellen Phagozytose und ROS einen sehr effektiven Mechanismus des Immunsystems dar, um die eingedrungenen Streptokokken zu töten. Die Induktion von ROS durch S. suis hängt dabei stark von der Anwesenheit spezifischer Antikörper und teilweise von aktivem Komplement ab. Die Fähigkeit von S. suis D-Alanin in seine LTAs einzulagern, verändert Eigenschaften der bakteriellen Zellwand und vermittelt dabei Schutz vor angeborenen Immunmechanismen, wie antimikrobiellen Peptiden und dem Komplementsystem, aber sie sorgt nicht für ein besseres Überleben der Streptokokken, in der Anwesenheit von spezifischen Immunglobulinen. Sie reduziert die Assoziation von S. suis mit Monozyten, was etwas in Diskrepanz zu einer 2000 postulierten modifizierten „Trojanisches Pferd“-Theorie steht. Die durch LTA D-Alanylierung gesteigerte IL 1β Sekretion im Vollblut, führt zu der Schlussfolgerung, dass S. suis durch diese Zellwandmodifikation Entzündungsprozesse im Wirt beeinflusst.:Contents 1 Introduction 2 Literature 2.1 Streptococcus suis 2.1.1 Characteristics and classification 2.1.2 Epidemiology and Pathology 2.1.3 Pathogenesis of S. suis infection 2.1.4 Cell wall modifications of S. suis 2.2 Selected aspects of the porcine blood immune system 2.2.1 Characteristics and components of porcine blood 2.2.2 Innate immunity 2.2.2.1 Cellular innate immunity in blood 2.2.2.2 Humoral innate immunity in blood 2.2.3 Adaptive immunity 2.2.3.1 Cellular adaptive immunity in blood 2.2.3.2 Humoral adaptive immunity in blood 2.3 Interaction of S. suis with the blood immune system 2.3.1 Immune evasion strategies against blood leukocytes 2.3.2 Complement evasion and S. suis cell wall modifications 3 Publications 3.1 Survival of Streptococcus suis in Porcine Blood Is Limited by the Antibody- and Complement-Dependent Oxidative Burst Response of Granulocytes 3.2 D-Alanylation of Lipoteichoic Acids in Streptococcus suis Reduces Association with Leukocytes in Porcine Blood 4 Discussion 4.1 Phagocytosis and oxidative burst in porcine blood 4.2 Interaction of S. suis with blood monocytes and lymphocytes 4.3 Conclusion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 References 8 Appendix 8.1 Presentations given during the development of this thesis / Introduction Streptococcus (S.) suis is a widespread pathobiont in the porcine population. It is reason for high economic losses in the swine industry by causing meningitis, arthritis, serositis, and endocarditis, but also poses a threat to human health as a zoonotic pathogen. Serotype 2, 7 and 9 play an important role in European disease cases on pig farms. Bacteremia is a hallmark of invasive S. suis infections and the interaction of the streptococci with blood immune cells is crucial for the outcome of infection. Aim of the study The objective of this thesis was to investigate the ability of porcine blood immune cells to kill S. suis by phagocytosis and oxidative burst and the importance of IgM and the complement system in the killing process. In this context, I investigated the working hypothesis that modifying its cell wall by D-alanylation of lipoteichoic acids (LTAs) aids S. suis to evade certain functions of innate immunity, like opsonization with complement components, and influences the interaction of S. suis with blood leukocytes. Materials and Methods The investigation of reactive oxygen species (ROS) and colony forming units (CFU) was performed in vivo in the blood of two S. suis-infected piglets and in vitro in a reconstituted blood model. ROS were measured by addition of dihydrorhodamine 123 and flow cytometry analysis of granulocytes. To analyze the influence of immunological components, different inhibitors were used: apocynin inhibits the NADPH oxidase and therefore the ROS production, vaccinia virus complement control protein (VCP) inhibits the complement cascade and IdeSsuis cleaves porcine IgM. To investigate the role of D-alanylation of S. suis-LTA an isogenic in-frame deletion mutant of the dltA gene, ΔdltA, was generated by using a thermosensitive shuttle vector. It was genetically verified by sequencing of the respective gene sequence and southern blotting. Phenotypical characterization included growth behavior, evaluation of surface hydrophobicity and electric charge and minimal inhibitory concentrations of a number of antimicrobial peptides. The association of blood leukocytes with S. suis was investigated by flow cytometry, using Far Red-labeled S. suis stocks. Cytokines were detected by commercially available Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Results S. suis strains of serotype 2, 7 and 9 were shown to be highly susceptible to oxidative burst intermediate hydrogen peroxide and inhibition of oxidative burst in reconstituted blood samples led to a significant increase of bacterial survival, even in the presence of high S. suis-specific antibody levels. The induction of ROS in granulocytes in response to S. suis was enhanced by specific antibodies and partially depended on the presence of functional complement. In the absence of IgG, IgM cleavage or complement inactivation both reduced the ROS production more than 3-fold and resulted in increased bacterial survival in accordance with an IgM-complement-oxidative burst axis. The mechanism of S. suis to introduce D-alanine into its LTAs increased the hydrophobicity of its surface, reduced opsonization with complement factor C3b, reduced phagocytosis by granulocytes in whole blood and association with monocytes and lymphocytes in isolated peripheral blood mononuclear cells. Nevertheless, in whole blood containing S. suis-specific antibodies, survival of the streptococci was not significantly increased by this cell wall modification, but levels of IL-1β induced by ΔdltA were significantly lower than those induced by the wt. High antibody levels caused a highly significant increase in the interaction of S. suis with monocytes in isolated PBMCs leading to an inflammatory cell death associated with the secretion of high levels of IL-1β and TNF-α. Conclusion Despite numerous described defense mechanisms of S. suis against oxidative stress, phagocytosis and ROS represent a very effective way of the porcine immune system to kill the invading streptococci. The induction of ROS by S. suis is highly dependent on the presence of specific antibodies and partially depends on active complement. The ability of S. suis to D-alanylate its LTAs changes surface properties of S. suis and provides protection from innate host defenses like antimicrobial peptides and the complement system, but does not help the bacteria to survive in the presence of specific immunoglobulins. It reduces the association with monocytes, in contradiction to a proposed “modified trojan horse theory”. The increased IL-1β production in response to S. suis, due to LTA D-alanylation, leads to the suggestion that this surface modification influences inflammatory processes is the host.:Contents 1 Introduction 2 Literature 2.1 Streptococcus suis 2.1.1 Characteristics and classification 2.1.2 Epidemiology and Pathology 2.1.3 Pathogenesis of S. suis infection 2.1.4 Cell wall modifications of S. suis 2.2 Selected aspects of the porcine blood immune system 2.2.1 Characteristics and components of porcine blood 2.2.2 Innate immunity 2.2.2.1 Cellular innate immunity in blood 2.2.2.2 Humoral innate immunity in blood 2.2.3 Adaptive immunity 2.2.3.1 Cellular adaptive immunity in blood 2.2.3.2 Humoral adaptive immunity in blood 2.3 Interaction of S. suis with the blood immune system 2.3.1 Immune evasion strategies against blood leukocytes 2.3.2 Complement evasion and S. suis cell wall modifications 3 Publications 3.1 Survival of Streptococcus suis in Porcine Blood Is Limited by the Antibody- and Complement-Dependent Oxidative Burst Response of Granulocytes 3.2 D-Alanylation of Lipoteichoic Acids in Streptococcus suis Reduces Association with Leukocytes in Porcine Blood 4 Discussion 4.1 Phagocytosis and oxidative burst in porcine blood 4.2 Interaction of S. suis with blood monocytes and lymphocytes 4.3 Conclusion 5 Zusammenfassung 6 Summary 7 References 8 Appendix 8.1 Presentations given during the development of this thesis

The formation of hypochlorous and hypobromous acids by heme peroxidases is a key property of certain immune cells. These products are not only involved in defense against pathogenic microorganisms and in regulation of inflammatory processes, but contribute also to tissue damage in certain pathologies. After a short introduction about experimental approaches for the assessment of the halogenating activity in vitro and in cell suspensions, we are focusing on novel applications of fluorescent dye systems to detect the formation of hypochlorous acid (HOCl) in leukocytes. Special attention is directed to properties and applications of the non-fluorescent dye aminophenyl fluorescein that is converted by HOCl, HOBr, and other strong oxidants to fluorescein. This dye allows the detection of the halogenating activity in samples containing free myeloperoxidase and eosinophil peroxidase as well as in intact granulocytes using fluorescence spectroscopy and flow cytometry, respectively.

Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, ob es sich bei der leukozytoklastischen Zelldesintegration der neutrophilen Granulozyten in kutaner leukozytoklastischer Vaskulitis (kLV) um Apoptose handelt. Um die zugrundeliegenden Mechanismen dieses Zellzerfalls näher zu charakterisieren, wurden Hautbiopsien von 9 Patienten mit klinisch und histologisch gesicherter kLV und 13 Hautbiopsien von Patienten mit kLV folgend auf intrakutane Histamin-Injektion im zeitlichen Verlauf untersucht. Licht und elektronenmikroskopisch wurde die Morphologie der Leukozytoklasie beurteilt. Immunhistologische Untersuchungen beinhalteten klassische pro-apoptotische Rezeptoren (CD95/CD95L), desweiteren über die Mitochondrien (Bax/Bcl-2) und auf genetischer Ebene die Apoptose regulierende Proteine (p53/p21). Es wurde zusätzlich die Expression von Zelloberflächen-Rezeptoren (FcgammaRIII/ FcgammaRII) beurteilt. Mittels der TUNEL-Methode wurde versucht die klassische DNA-Fragmentierung nachzuweisen. Obwohl strukturell und ultrastrukturell die klassischen morphologischen Merkmale der Apoptose vorlagen, konnte diese biochemisch nicht untermauert werden. DNA-Fragmentierung liess sich nur in schon von Makrophagen phagozytierten Kernfragmenten nachweisen. Neutrophile waren negativ und ihre Fragmente waren es vorwiegend. Den untersuchten Rezeptoren CD95/CD95L kommt allenfalls eine geringe und den Proteine, Bax/Bcl-2 und p53/p21 keine Rolle im Zellzerfall der Neutrophilen in dieser selbstlimitierten Entzündung zu. Interessanterweise wurde jedoch FcgammaRIII sehr stark auf der Oberfläche nicht nur intakter, sondern auch schon fragmentierter neutrophiler Granulozyten exprimiert. Dementsprechend ist anzunehmen, dass diese konstitutionell exprimierten Rezeptoren nicht nur eine Rolle in der Aktivierung, sondern auch eine Rolle in der darauf folgenden Auslösung der Apoptose in diesen Zellen spielen. Desweiteren dienen diese stark glykosylierten Rezeptoren möglicherweise als Phagozytose-Erkennungsmerkmal für Makrophagen. FcgammaRII liess sich hingegen nicht auf der Oberfläche der Neutrophilen und ihrer Fragmente nachweisen. Dies könnte einerseits durch eine Verdrängung durch FcgammaRIII bedingt sein, andrerseits könnten sie durch Immnunkomplex-Bindung eine separate oder zusätzliche Rolle in der Induktion des Zellzerfalls spielen. Zusammenfassend weist der leukozytoklastische Zellzerfall der Neutrophilen in kLV die klassischen morphologischen Merkmale der Apoptose auf, die biochemisch jedoch auf atypische Weise abläuft. In dieser Hinsicht zu erwähnen, ist vor allem die verzögerte oder durch DNasen der Makrophagen bedingte DNA-Fragmentierung. / The aim of this study was to find out whether leukocytoklastic cell desintegration of neutrophils in cutaneous leukocytoklastic vasculitis (clv) is apoptosis. In order to find out more about the underlying mechanisms leading to this form of cell desintegration and subsequent cell death skin sections of 9 patients with clinically and histologically verified clv and of 13 patients with clv after intradermal injection of histamine were examined at different timepoints. The structural and ultrastructural morphological features of leukoctyoklasia were evaluated light- and electronmicroscopically. Immunhistochemistry included well known death receptors (CD95/CD95L), mitochondrial proteins (Bax/Bcl-2), proteins interfering with the cell cycle (p53/p21) and cell surface receptors (FcgammaRIII/FcgammaRII). Furthermore DNAfragmentation was assessed by the TUNEL-method. Although the structural and ultrastructural features of leukocytoklastic cell desintegration of neutrophils in clv revealed typical apoptotic morphology, the underlying biochemistry didn`t match apoptotic means. DNA-fragmentation was only seen in a minor fraction of fragmented nuclei and prominent in already phagocytosed debris. Neutrophils at different locations (in the lumen of the postcapillary venules, within the wall of the blood vessels and in the perivascular tissue) were always negative.The examined death receptors, mitochondrial proteins and DNA-interfering proteins play no (Bcl-2/Bax, p53/p21) or only a minor (CD95/CD95L) role in the biochemical mechanism leading to the cell desintegration of these cells in this self-limited inflammation. Interestingly FcgammaRIII was highly expressed not only in intact but also extremely desintegrated neutrophils as well as on the surface of their fragments. One could therefore assume that this receptor not only plays a role in activation of these cells, but also might be involved in the following induction of the cell death programm. Maybe this highly glycosylated receptor also functions as an `eat me flag` in the recognition-mechansim by macrophages. FcgammaRII could not be shown on the cell surface of these cells in this context, which on the one hand could be due to the high expression of FcgammaRIII with no room left for FcgammaRII on the cell surface or due to a separate or additional role in the induction of the cell death programm. Finally leukocytoklastic cell desintegration shows strong resemblance to apoptosis but with non classical underlying biochmical mechanisms, most importantly to mention the delay in DNA-fragmentation which could also be due to DNAdegradation by DNases of macrophages.

Neutrophile Granulocyten wirken als einer der ersten Abwehrmechanismen gegen invasive Mikroorganismen im angeborenen Immunsystem von Mammalia. Aktiviert durch inflammatorische Signale verlassen diese Granulocyten das vaskuläre System und migrieren durch das Gewebe zum Infektionsherd. Dort binden sie die Mikroorganismen, phagozytieren und eliminieren diese schließlich mit hoher Effizienz. Humane Neutrophile Elastase (NE) ist Bestandteil der neutrophilen Granula und spielt eine entscheidende Rolle im Abbau von Virulenzfaktoren enteroinvasiver Bakterien, einschließlich der Shigella Virulenzfaktoren IpaB (invasion antigen plasmid B) und IcsA (intracellular spread A). NE gehört zu der Familie der Chymotrypsin-ähnlichen Serinproteasen, die sich durch Sequenz- und Strukurähnlichkeit auszeichnen, jedoch sehr unterschiedliche biologische Funktionen aufweisen. Cathepsin G (CG) ist wie NE eine Chymotrypsin-ähnliche Serinprotease und ebenfalls in neutrophilen Granula lokalisiert. Allerdings zeigt CG keine Aktivität gegenüber Virulenzfaktoren von Shigella. Obwohl die Kristallstrukturen von CG und NE fast identisch sind, konnten einzelne oder mehrere Aminosäuren in der Substratbindungsspalte identifiziert werden, die zwischen den beiden Enzymen differieren. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Spezifität von NE gegenüber Virulenzfaktoren in diesen Unterschieden codiert sein könnte. Daher wurden diese Aminosäuren durch die analogen CG Aminosäuren oder durch Alanin ersetzt. Der Vergleich der funktionellen Eigenschaften der NE Mutanten mit wildtyp NE zeigte, dass die Aminosäuren an den Positionen 98 und 216-224 entscheidend für die Substratspezifität von NE sind. Die NE Mutanten N98A, 216-218 und 216-224 waren nicht mehr in der Lage, die Virulenzfaktoren IcsA und IpaB sowie das NE Peptidsubstrat abzubauen. Stattdessen haben diese Mutanten die Fähigkeit erlangt, das CG Peptidsubstrat abzubauen. Zusammenfassend konnten wir Aminosäuren in NE identifizieren, die sowohl die Spezifität von NE für das Peptidsubstrat als auch für die Virulenzfaktoren von Shigella flexneri determinieren. / Neutrophil granulocytes are one of the first lines of defense of the mammalian innate immune system against invading microorganisms. In response to inflammatory stimuli, neutrophils migrate from the blood stream to infected tissues where they bind, engulf and inactivate microorganisms efficiently. Human neutrophil elastase (NE), a neutrophil granule component, is a key host defense protein that rapidly destroys virulence factors of enteroinvasive pathogens including IpaB (invasion plasmid antigen B) and IcsA (intracellular spread A) from Shigella. NE belongs to the family of chymotrypsin-like serine proteases with sequence and structural similarity but with very different biological functions. Cathepsin G (CG) is another abundant chymotrypsin-like serine protease in neutrophil granules. However, in contrast to NE, CG does not cleave virulence factors of Shigella. The crystallographic structures of NE and CG are very similar but we identified single or multiple residues in the substrate-binding cleft to differ in these two enzymes. We hypothesized that NE specificity for bacterial virulence factors resides within these structural differences. Therefore these specific residues in NE were replaced with the analogous amino acids of CG or with alanine. By comparing the functional properties of these NE mutants to wildtype NE we were able to show that the amino acids at position 98 and 216-224 are crucial for the substrate specificity of NE. The NE mutants N98A, 216-218 and 216-224 did not cleave the virulence factors IcsA and IpaB as well as the NE peptide substrate but cleaved the CG peptide substrate. In summary, we identified residues in NE that determine the specificity of NE for the peptide substrate and for the Shigella flexneri virulence factors.

Le sepsis constitue une pathologie fréquente, grevée d’une morbi-mortalité encore élevée. Sa physiopathologie fait notamment intervenir des dysrégulations du système immunitaire inné et adaptatif et des voies de l’apoptose. Ce travail aborde l’expression leucocytaire de deux familles de protéines potentiellement impliquées dans sa physiopathologie :les phosphodiestérases (PDE) et les apolipoprotéines L (apoL). L’étude de l’expression des PDE sous-tend le fait que ces enzymes, qui dégradent les nucléotides cycliques (AMPc et GMPc), sont impliquées dans la modulation de nombreux processus inflammatoires, tant d’origine infectieuse que non-infectieuse. L’expression des PDE après administration de LPS chez l’Homme est cependant mal caractérisée, de même qu’au cours du sepsis. Le présent travail teste l’hypothèse selon laquelle le sepsis, caractérisé par un état de dysrégulation immune complexe, s’accompagne d’une répression de l’expression des PDE au sein des leucocytes circulants, contrairement à ce qui est observé dans des modèles standardisés d’inflammation aiguë (LPS) ;il met également en perspective, dans une démarche observationnelle, l’expression des PDE avec l’expression du complexe HLA-DR, un ensemble protéique permettant la présentation de l’antigène et dont l’expression est partiellement dépendante de l’AMPc. Trois études ont ainsi été menées :étude de l’expression des PDE au cours d’une endotoxinémie chez le volontaire sain (1), et au cours du sepsis au sein de leucocytes totaux circulants (2) ou de sous-populations leucocytaires de l’immunité innée (monocytes CD14+ou granulocytes CD15+) (3). Alors que l’administration intraveineuse de LPS chez le volontaire sain mène à l’induction précoce et transitoire de certaines PDE, de façon similaire aux observations in vitro, les patients septiques présentent au contraire dès leur admission, et jusqu’au 5ème jour, une réduction de l’expression de plusieurs PDE en comparaison aux volontaires sains, tant dans les leucocytes totaux que dans les populations CD14+ et CD15+. L’expression de plusieurs de ces PDE est corrélée aux ratios TNF-α/IL-10 qui sont suggestifs d’un état d’immunodépression, attesté par une réduction significative de l’expression du complexe HLA-DR. L’étude des apoL au cours du sepsis sous-tend quant à elle le fait que cette famille de protéines, qui partage des homologies avec des membres du groupe Bcl-2 impliqué dans l’apoptose, a été associée notamment à l’induction de phénomènes pro-apoptotiques ;or, le sepsis est associé à une apoptose retardée des polynucléaires neutrophiles, un phénomène potentiellement délétère au niveau tissulaire. L’hypothèse d’une répression de l’expression des apoL leucocytaires au cours du sepsis est ainsi posée. Dans le présent travail, une diminution de l’expression des apoL-1, 2, 3 et -6 est observée chez les patients de soins intensifs présentant ou non un sepsis en comparaison à des volontaires sains ;cette réduction, corrélée aux taux de protéine C-réactive, concerne tant les populations leucocytaires totales que les granulocytes CD15+, et intéresse tant les ARNm que l’expression protéique (apoL-6 excepté). Le pourcentage de cellules CD15+ apoptotiques est par ailleurs fortement corrélé aux taux d’ARNm des apoL-1 et -2. Ces observations sont reproduites in vitro en incubant des granulocytes CD15+ de volontaire sain avec du sérum de patients septiques ou non septiques. Ces résultats préliminaires suggèrent ainsi une implication des apoL dans la régulation de l’apoptose des neutrophiles au cours du sepsis. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les polynucléaires neutrophiles (PN) sont des cellules essentielles au cours de la réponse immunitaire innée ; recrutés rapidement au site inflammatoire où ils participent à la phase aigüe, ils vont aussi contribuer à la résolution de l’inflammation. Ils peuvent en effet moduler la réponse adaptative par interaction avec les lymphocytes (Ly) ou les cellules dendritiques (DC) via des médiateurs solubles ou des interactions cellulaires directes. Les Neutrophil Extracellular Traps (NETs) libérés par les PN activés pourraient jouer un rôle important dans ce contexte. Les NETs sont des filaments de chromatine décondensée associés à des protéines issues principalement des granulations et du cytoplasme. Ils sont essentiels dans la réponse anti-infectieuse mais semblent également impliqués dans la physiopathologie de certaines maladies auto-immunes et inflammatoires. L’objectif de ce travail a été d’évaluer les effets des NETs sur la maturation des DC dans un contexte inflammatoire au cours duquel les PN et les DC peuvent co-exister, assurant ainsi un pont entre immunité innée et immunité adaptative. La première partie de ce travail a consisté à développer un modèle de production, isolement et caractérisation des NETs issus de PN sanguins humains. L’ionophore de calcium A23187 a été choisi pour induire les NETs et l'enzyme de restriction AluI a permis la récupération de fragments de NETs de taille hétérogène. Certains des composants de ces NETs sont quantifiables (ADN, élastase, histone 3 en particulier), et nous avons montré qu’ils conservaient leurs capacités bactéricides in vitro. Ces échantillons de NETs constituent donc un outil biologique standardisé, permettant d’évaluer leurs effets sur des cellules ou des tissus. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons mis en évidence que ces NETs purifiés régulaient négativement la maturation de moDC induites par le LPS (expression de HLA-DR, CD80, CD83, CD86 et production de TNFα, IL-12, IL-6, IL-23). De plus, les NETs diminuent la capacité de ces moDC à induire la prolifération des LyT, et leur polarisation est modulée en favorisant la production de cytokines de type Th2 (IL-5 et IL-13) aux dépens de cytokines de types Th1 (INFγ) et Th17 (IL-17). De manière intéressante, la capacité de migration des moDC activées par le LPS n’est pas modifiée en présence de NETs. En résumé, ces résultats suggèrent que les NETs pourraient jouer un rôle immunorégulateur sur la maturation des moDC dans des conditions inflammatoires. Les NETs produits par les PN activés pourraient ainsi participer à la régulation indispensable de la réponse inflammatoire. / Polymorphonuclear neutrophils (PMN) are innate immune cells rapidly recruited to the inflammatory sites where they play a major role during the acute phase response but also contribute to resolution and repair. They can also modulate the adaptive response by interacting with lymphocytes (Ly) or dendritic cells (DC) via soluble mediators or cell-cell contacts. Activated PMN release Neutrophil Extracellular Traps (NETs) that could play a role in this context. NETs are decondensed chromatin fibers associated with granule and cytoplasmic proteins. As they are mainly involved in host defense against infection, they contribute to some autoimmune and inflammatory diseases. The aim of this work was to evaluate NET effects on DC maturation in an inflammatory context where PMN and DC co-exist, thus bridging innate and adaptive immunity. We first developed a model to induce, isolate and characterize NETs from human PMN. Calcium ionophore A23187 was chosen to induce NETs and the restriction enzyme AluI allowed the recovery of heterogeneous-sized fragments of NETs. Some of their components were quantified (DNA, elastase, histone 3, in particular) and we found that they retained their bactericidal activity. These NETs samples thus constitute a new and important biological tool to study their effects on immune cells or tissues. In the second part of this work, we found that isolated NETs were able to down-regulate LPS-induced moDC maturation as evidenced by the expressions of HLA-DR, CD80, CD83, CD86 and cytokine release (TNFα, Il-6, IL-12, Il-23). Moreover, the presence of NETs during moDC maturation lead to a decrease capacity of these moDC to induce T lymphocyte proliferation and modulated polarization by promoting the production of Th2 cytokines (IL-5 and IL-13) and decreasing Th1 cytokines (INFγ) and Th17 (IL- 17). Interestingly, moDC migration capacity was not modified when moDC maturation was done in the presence of NETs. In summary, these data suggest that NETs could downregulate DC activation. NETs produced by activated PMN could thus participate to the regulation of inflammation.

Les polynucléaires neutrophiles (PN) sont des cellules essentielles au cours de la réponse immunitaire innée ; recrutés rapidement au site inflammatoire où ils participent à la phase aigüe, ils vont aussi contribuer à la résolution de l'inflammation. Ils peuvent en effet moduler la réponse adaptative par interaction avec les lymphocytes (Ly) ou les cellules dendritiques (DC) via des médiateurs solubles ou des interactions cellulaires directes. Les Neutrophil Extracellular Traps (NETs) libérés par les PN activés pourraient jouer un rôle important dans ce contexte. Les NETs sont des filaments de chromatine décondensée associés à des protéines issues principalement des granulations et du cytoplasme. Ils sont essentiels dans la réponse anti-infectieuse mais semblent également impliqués dans la physiopathologie de certaines maladies auto-immunes et inflammatoires. L'objectif de ce travail a été d'évaluer les effets des NETs sur la maturation des DC dans un contexte inflammatoire au cours duquel les PN et les DC peuvent co-exister, assurant ainsi un pont entre immunité innée et immunité adaptative. La première partie de ce travail a consisté à développer un modèle de production, isolement et caractérisation des NETs issus de PN sanguins humains. L'ionophore de calcium A23187 a été choisi pour induire les NETs et l'enzyme de restriction AluI a permis la récupération de fragments de NETs de taille hétérogène. Certains des composants de ces NETs sont quantifiables (ADN, élastase, histone 3 en particulier), et nous avons montré qu'ils conservaient leurs capacités bactéricides in vitro. Ces échantillons de NETs constituent donc un outil biologique standardisé, permettant d'évaluer leurs effets sur des cellules ou des tissus. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons mis en évidence que ces NETs purifiés régulaient négativement la maturation de moDC induites par le LPS (expression de HLA-DR, CD80, CD83, CD86 et production de TNFα, IL-12, IL-6, IL-23). De plus, les NETs diminuent la capacité de ces moDC à induire la prolifération des LyT, et leur polarisation est modulée en favorisant la production de cytokines de type Th2 (IL-5 et IL-13) aux dépens de cytokines de types Th1 (INFγ) et Th17 (IL-17). De manière intéressante, la capacité de migration des moDC activées par le LPS n'est pas modifiée en présence de NETs. En résumé, ces résultats suggèrent que les NETs pourraient jouer un rôle immunorégulateur sur la maturation des moDC dans des conditions inflammatoires. Les NETs produits par les PN activés pourraient ainsi participer à la régulation indispensable de la réponse inflammatoire.

Le TRALI représente un œdème pulmonaire lésionnel aigu survenant au cours d’une transfusion. Son mécanisme étiopathologique encore très imprécis conduit aujourd’hui à une sous-estimation de son incidence. Des études clinico-anatomiques ont souligné le rôle central des polynucléaires neutrophiles (PMN) en montrant que le TRALI résulte de l’accumulation de PMN au contact de l’endothélium lésé des capillaires pulmonaires. De nombreux investigateurs ont tenté de définir le facteur déclenchant présent dans le produit sanguin transfusé et évoquèrent l’existence d’un conflit immunologique par infusion d’anticorps anti-HLA. En appui avec les données de la littérature, ce travail a pour but d’apporter une meilleure connaissance du mécanisme du TRALI afin d’en améliorer son diagnostic, sa prévention et la prise en charge du patient. Tout d’abord, nous confirmons l’implication des anticorps anti-HLA dans la survenue du TRALI en validant pour la première fois l’hypothèse du modèle en deux étapes: une première étape préalable est requise chez le patient présentant une situation clinique ou thérapeutique prédisposante qui aboutit à une pré-stimulation des PMN, puis une seconde étape, dépendante de l’apport d’anticorps anti-HLA lors de la transfusion, entraîne l’activation de la NADPH oxydase phagocytaire. Cela conduit à l’activation des PMN et la libération de dérivés réactifs de l’oxygène qui sont directement responsables de la lésion endothéliale pulmonaire et provoque une augmentation de la perméabilité endothéliale. Nous démontrons en plus l’existence d’un seuil d’anticorps anti-HLA nécessaire pour déclencher une forte activation des PMN. Enfin, nous avons mis en évidence un mécanisme d’activation des PMN par les anticorps anti-HLA faisant intervenir la formation de complexes immuns antigène – anticorps à la surface des PMN. Ces complexes immuns sont reconnus avec une affinité plus grande que les anticorps seuls par les récepteurs Fc des PMN. Cette double interaction au sein d’un même PMN pourrait favoriser la formation de cluster de récepteurs Fc activés au niveau de radeaux lipidiques, ce qui induirait une activation optimisée de ces récepteurs, entraînant une cascade de signalisation aboutissant à l’activation de la NADPH oxydase des PMN. Nos résultats constituent un rationnel scientifique solide pour accéder à une meilleure connaissance du TRALI. / TRALI represents an acute non-cardiogenic pulmonary oedema following blood transfusion. The unknown etiopathological mechanism of TRALI leads to an underestimation of the incidence. Clinical and anatomical studies highlighted the major role of neutrophils (PMN) and showed that TRALI results from an increased number of neutrophils within the pulmonary capillary endothelium. Many evidence suggest that antibodies recognizing human leukocyte antigens (HLA) present in the blood transfusion are the predominant trigger leading to TRALI. Towards theses findings, we investigated the precise mechanism in TRALI in order to get a better knowledge of its diagnosis, its prevention and the patient care. We confirm the major role of anti-HLA antibodies and validate for the first time the two-hit model: the first-hit related to the patient clinical condition leads to their PMN stimulation, followed in the second-hit by the infusion of blood products containing anti-HLA antibodies that activate the phagocytic NADPH oxidase. This event induces PMN activation and the release of reactive oxygen species that are directly responsible for the pulmonary endothelial damage and cause the endothelial permeability increase. We also demonstrate the cut-off of anti-HLA antibodies that raises PMN activation. Finally, we showed that both the antigen-binding and the Fc-binding systems to antibodies are needed to induce a major PMN activation. We found that the binding of anti-HLA antibodies to HLA antigens promote the formation of cluster of Fc receptors within lipid rafts. The translocation of Fc receptors into lipid rafts improve Fc receptors activation, leading to intracellular signal transduction and activation of effector functions, such as NADPH oxidase activation and release of reactive oxygen species involved in tissue damage.

Les neutrophiles infiltrent la muqueuse colique inflammatoire en maladie de Crohn (CD). Cependant, on ignore l’existence d’une corrélation entre la sévérité endoscopique et la fréquence et/ou l’activation des neutrophiles et autres granulocytes. Une cohorte de 73 patients atteints de CD fut recrutée prospectivement. Les participants furent stratifiés selon la Classification de Montréal ou subdivisés selon le phénotype endoscopique (phénotype typique vs apparence endoscopique « UC-Like »). L’index d’Harvey Bradshaw (HBI) et le Simple Endoscopic score (SES-CD) furent calculés au moment de la coloscopie. La fréquence et l’expression de CD66b et de CD64 sur les granulocytes furent évaluées en cytométrie de flux sur des échantillons sanguins et des biopsies coliques. Le SES-CD corrélait avec l’expression du CD66b sur les neutrophiles coliques et du CD64 sur les neutrophiles circulants en présence de maladie active avec comportement inflammatoire (B1). Les fréquences des neutrophiles et des basophiles mais non des eosinophiles étaient augmentées au sein de la muqueuse inflammatoire, mais la fréquence des neutrophiles coliques n’était corrélée avec le SES-CD uniquement en présence d’un phénotype endoscopique « UC-like ». Deux scores d’activation granulocytaire étaient discriminant entre les individus avec maladie légère et sévère dans l’ensemble de la cohorte avec maladie active. L’activation des granulocytes dans le sang et la muqueuse colique corrèle avec le SES-CD dans des sous-groupes de patients avec une maladie B1, alors que les scores d’activation granulocytaire pourraient être pertinent cliniquement pour évaluer la sévérité de la maladie et possiblement avoir une valeur prognostique parmi les individus avec maladie active. / Neutrophils infiltrate the inflamed colon in Crohn’s disease (CD). However, correlation between endoscopic severity, and frequency and/or activation of neutrophils and other granulocytes like basophils and eosinophils remains to be investigated. A cohort of 73 CD patients was prospectively enrolled according to endoscopic severity and treatment history. Patients with active disease were stratified according to Montreal classification or subdivided into typical CD and UC-like endoscopic features. Harvey Bradshaw Index (HBI) and Simple Endoscopic score (SES-CD) were performed at the time of ileocolonoscopy. Frequency and expression of CD66b and CD64 on granulocytes were assessed in paired blood and colonic biopsies using flow cytometry. SES-CD correlated with neutrophil CD66b expression in mucosa but not blood and conversely, with neutrophil CD64 expression in blood but not mucosa in CD patients with inflammatory (B1) active disease. Frequencies of neutrophils and basophils but not eosinophils, increased in inflamed colon, but only in a subgroup of CD patients presenting “UC-like” endoscopic features were the frequencies of colonic neutrophils correlated with SES-CD. Furthermore, a neutrophil activation score (CD66b X CD64 on neutrophils) and a blood granulocyte score (CD66b on eosinophils X CD64 on neutrophils) discriminated between mild and severe disease in the entire cohort of patients with active disease. Activation of granulocytes in blood and/or mucosa correlated with SES-CD in subgroups of patients with B1 inflammatory disease while granulocyte activation scoring systems may be clinically relevant to evaluate disease severity and predict prognosis in the entire cohort of active disease patients.

Human 5-lipoxygenase (5-LOX) oxidizes arachidonic acid to 5S-hydroperoxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid (5-HpETE) and leukotriene (LT) A4. In neutrophils, LTA4 is further converted to the potent chemoattractant LTB4. These cells also contain the heme enzyme myeloperoxidase (MPO), which produces several potent oxidants such as hypochlorous acid (HOCl), which are involved in pathogen defense and immune regulation. Here, we addressed the question whether MPO-derived oxidants are able to affect the activity of 5-LOX and the product profile of this enzyme. Human 5-LOX was incubated with increasing amounts of HOCl or HOBr. Afterward, arachidonic acid metabolites of 5-LOX were analyzed by reverse-phase high-performance liquid chromatography as well as by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry. The incubation of 5-LOX with the MPO-derived oxidants significantly changed the product profile of 5-LOX. Thereby, HOCl and HOBr increased the ratio of 5-H(p)ETE to 6-trans-LTB4 in a concentration-dependent manner. At low oxidant concentrations, there was a strong decrease in the yield of 6-trans-LTB4, whereas 5-HpETE did not change or increased. Additionally, the formation of 8-HpETE and 12-HpETE by 5-LOX rose slightly with increasing HOCl and HOBr. Comparable results were obtained with the MPO-H2O2-Cl– system when glucose oxidase and glucose were applied as a source of H2O2. This was necessary because of a strong impairment of 5-LOX activity by H2O2. In summary, MPO-derived oxidants showed a considerable impact on 5-LOX, impairing the epoxidation of 5-HpETE, whereas the hydroperoxidation of arachidonic acid was unaffected. Apparently, this was caused by an oxidative modification of critical amino acid residues of 5-LOX. Further work is necessary to assess the specific type and position of oxidation in the substrate-binding cavity of 5-LOX and to specify whether this interaction between 5-LOX and MPO-derived oxidants also takes place in stimulated neutrophils.