The formation of hypochlorous and hypobromous acids by heme peroxidases is a key property of certain immune cells. These products are not only involved in defense against pathogenic microorganisms and in regulation of inflammatory processes, but contribute also to tissue damage in certain pathologies. After a short introduction about experimental approaches for the assessment of the halogenating activity in vitro and in cell suspensions, we are focusing on novel applications of fluorescent dye systems to detect the formation of hypochlorous acid (HOCl) in leukocytes. Special attention is directed to properties and applications of the non-fluorescent dye aminophenyl fluorescein that is converted by HOCl, HOBr, and other strong oxidants to fluorescein. This dye allows the detection of the halogenating activity in samples containing free myeloperoxidase and eosinophil peroxidase as well as in intact granulocytes using fluorescence spectroscopy and flow cytometry, respectively.

Malaria ist die Erkrankung, die durch Infektion eines Säugetiers mit dem eukaryotischen Parasiten Plasmodium entsteht. Die Symptome dieser Erkrankungen reichen von Fieber und Gelenkschmerzen bis zu schweren Organschäden in Hirn, Lunge, Niere und Leber bei einem geringen Teil der Erkrankten. Diese klinischen Symptome treten nur auf, während der Parasit sich asexuell in roten Blutzellen vermehrt. Die Zerstörung von Erythrozyten und die daraus resultierende Freisetzung von Zytokinen sind die Verursacher der malariatypischen wiederkehrenden Fieberzyklen. Der Mechanismus, der zur Entstehung von Gewebsschäden führt, ist hingegen nur unzureichend bekannt. Eine notwendige Bedingung für das Auftreten von Gewebeschäden ist, dass infizierte rote Blutzellen an das Endothel der Mikrovaskulatur bin. Die Schwere der Erkrankung ist direkt mit dem extrazellulären Auftreten von Stoffen verbunden, die normalerweise von neutrophilen Granulozyten im Zellinnern gespeichert werden. Neutrophile sind dafür bekannt sind, ein ganzes Arsenal an Waffen bereitwillig durch Degranulierung oder programmierten Zelltod einzusetzen. In dieser Studie berichten wir von einem direkten kausalen Zusammenhang zwischen dem aktiven inflammatorischen Zelltod (NETose) von Neutrophilen und der Entstehung von Organschäden bei einer Plasmodium-Infektion. Wir zeigen, dass NETs in Zirkulation freigesetzt und von extrazellulären DNase verdaut werden. Dadurch werden systemisch Aktivierungssignale für eine weitere Immunantwort zur Verfügung gestellt und es kommt zur Freisetzung von Zytokinen, Notfallgranulopoese und der Hochregulierung von zellulären Adhäsionsmarkern auf Endothelzellen. Dies erlaubt das Binden von infizierten Erythrozyten und Immunzellen an die Mikrovaskulatur bestimmter Organe. Wir zeigen außerdem, dass eine Intervention mit der Entstehung von NETs oder der Freisetzung neuer Neutrophiler diesen Prozess unterbindet und einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz darstellt. / Malaria is the disease caused by an infection of a mammalian host by the mosquito borne eukaryotic parasite Plasmodium. The symptoms of the disease are diverse, ranging from fever and rigor in most patients to severe damage in solid organs such as brain, lung, kidney and liver in a small fraction of the afflicted. Clinical symptoms of the disease only occur when the parasite undergoes asexual replication within the red blood cells of the host. Destruction of these cells and subsequent release of cytokines are responsible for the recurring fever cycles of mild malaria. The mechanism underlying the occurrence of tissue damage however, remain mostly elusive. The adhesion of infected red blood cells to the endothelial wall of the microvasculature in the affected organs is a necessary requirement and pathology is associated with the activation of specific immune cells residing within the blood stream. Severity of disease is linked to extracellular accumulation of neutrophil proteins. Neutrophils are abundant white blood cells, known to readily deploy an arsenal of weaponry either by degranulation or by externalization of chromatin. In this study we report a direct causal relationship between the active inflammatory neutrophil cell death (NETosis) and the development of organ damage during a Plasmodium infection. We show that NETs are released in circulation, digested by extracellular DNase and thereby supply immune activation signals that drive inflammation. The systemic dissemination of these factors leads to the release of cytokines, emergency granulopoiesis and upregulation of cellular adhesion markers on endothelial cells thereby allowing for the binding of both infected red blood cells and immune cells to the microvasculature of specific organs. Furthermore we supply evidence, that repression of NETosis or inhibition of granulopoiesis abrogate these processes and present promising therapeutic strategies.

Les levures Candida sont des pathogènes opportunistes responsables d’infections graves chez les patients immunodéprimés. Au cours de ce travail, nous avons développé un modèle cellulaire in vitro pour la caractérisation multiparamétrique des phénotypes d’interaction entre les levures Candida et les macrophages et les neutrophiles, principaux effecteurs de la défense anti-Candida. Il repose sur l’utilisation de marqueurs fluorescents pour le suivi quantitatif de l’interaction en cytométrie en flux et en fluorimétrie. Ce modèle a été validé par la comparaison de l’interaction de trois espèces de levures, C. albicans, C. glabrata et C. lusitaniae, avec des macrophages murins et des neutrophiles humains. Deux stratégies principales de survie des levures à la phagocytose ont été mises en évidence : par la résistance à la phagolyse et la multiplication des levures à l’intérieur des phagocytes jusqu’à leur éclatement, ou par l’évitement de la phagocytose et la multiplication des levures à l’extérieur des phagocytes. L’interprétation des données quantitatives a été confirmée par microscopie à fluorescence et vidéo-microscopie. Afin de mieux comprendre les interactions Candida-phagocytes, nous avons mis au point des outils pour l’analyse fonctionnelle de gènes chez C. lusitaniae. Une stratégie de PCR chevauchante a été développée pour l’obtention de mutants nuls de C. lusitaniae, sans étape de clonage. C’est ainsi que le gène OLE2, codant une Δ9 désaturase d’acides gras potentiellement impliquée dans la biosynthèse de la prostaglandine PGE2, a été invalidé. Le mutant ole2Δ présentait de très nets défauts de filamentation et de reproduction sexuée. Par rapport à une souche sauvage, le mutant ole2∆ était massivement phagocyté par les macrophages, et la survie des phagocytes était plus importante, ce qui suggère un rôle important des lipides insaturés et des oxylipides dans la signalisation cellulaire au cours de l’interaction Candida-phagocytes. Dans la dernière partie de notre travail, nous avons construit une banque de 10 000 mutants de C. lusitaniae par l’intégration aléatoire d’un marqueur dans le génome. Le criblage de cette banque à travers notre modèle cellulaire d’interaction permettra d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans l’interaction avec les phagocytes afin de mieux comprendre la physiopathologie des candidoses et de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques. / Candida species are opportunistic pathogens causing severe infectious diseases in immunocompromised patients. In this work, we developed a tool for a multi-parameter characterization of the cell interactions between the yeasts Candida and both macrophages and neutrophils, which constitute the main defense against candidiasis. It relies on the labelling of each population with specific fluorescent markers, and on the use of fluorimetry and flow cytometry to assess interactions. The tool has been validated by comparing the interactions of three yeast species C. albicans, C. glabrata and C. lusitaniae, with murine macrophages and human neutrophils. We found that yeasts use two main ways for escaping phagocytosis, which has been confirmed using video-microscopy: either (1) by surviving to phagolysis and dividing into the phagosome until phagocytes burst, or (2) by avoiding phagocytosis and dividing outside phagocytes. In order to better understand the cellular and molecular mechanisms involved in Candida-phagocytes interactions, we developed new molecular tools for the functional analysis of genes in C. lusitaniae, notably a two-step cloning-free PCR-based method for the deletion of genes. This method was successfully used for the deletion of OLE2, a gene encoding a Δ9-desaturase of fatty acids, possibly implicated in prostaglandin PGE2 biosynthesis. The ole2Δ mutant exhibited strong defects in both pseudofilamention and sexual mating. During macrophages infection, ole2Δ yeast cells were massively internalized and triggered less phagocytes cell death than the wild type strain, suggesting that unsaturated fatty acids and/or oxylipids could play a role during interaction with phagocytes. Lastly, a bank of 10,000 mutants was constructed in C. lusitaniae by the random integration of a genetic marker in the genome. The screening of this bank through our tool to analyse cellular interactions will be undertaken to gain insights into understanding of the early stages of the infectious process.

Bakterielle Pneumonien sind weltweit eine der häufigsten Todesursachen und S. pneumoniae ist das häufigste klinische Isolat. Neutrophile Granulozyten gehören zur Klasse der myeloiden Zellen und sind eine wichtige Komponente der angeborenen Immunität gegen bakterielle Infektionen. Krüppel-like factor 4 (KLF4) spielt dabei nicht nur eine Rolle in der Differenzierung der Zellen des Immunsystems, sondern auch während der Infektion bei der Vermittlung inflammatorischer Signale in unterschiedlichen Zelltypen. Diese Studie zeigt zum ersten Mal in vivo, dass myeloides KLF4 Einfluss auf den Krankheitsverlauf hat und die mit einer bakteriellen Pneumonie einhergehende Entzündungsreaktion reguliert. Die hier aufgeführten Ergebnisse demonstrieren, dass der Transkriptionsfaktor KLF4 während einer Pneumokokken Pneumonie in humanen und murinen neutrophilen Granulozyten induziert wird. Diese Induktion ist Zeit- und Dosisabhängig. Außerdem wird die Expression von myeloidem KLF4 durch die Autolyse von S. pneumoniae reguliert, aber nicht über Toll-like Rezeptor 2 (TLR2), TLR4 oder TLR9 vermittelt. Studien in einem Maus-Pneumonie Modell zeigen, dass myeloides KLF4 einen proinflammatorischen Phänotyp bewirkt. Mäuse mit einem KLF4 knockout (KLF4-/-) in myeloiden Zellen haben im Vergleich zu Wildtyp (KLF4+/+) Mäusen eine höhere Bakterienlast in Lunge, Blut und Milz. Obwohl die Produktion proinflammatorischer Zytokine (wie TNF-α, IL-1β und KC) in BALF und Plasma von KLF4-/- Mäusen geringer war, gab es keine Unterschiede bei der Zellrekrutierung in der BALF von KLF4-/- und KLF4+/+ Mäusen. Allerdings war die Zellrekrutierung im Blut der KLF4-/- Mäuse geringer als bei den KLF4+/+ Mäusen. Außerdem wurde eine erhöhte vaskuläre Permeabilität verbunden mit perivaskulären Ödemen und Pleuritis bei KLF4-/- Mäusen während der S. pneumoniae-induzierten Infektion beobachtet. Diese Mäuse erreichten auch eher die humanen Endpunkte als die vergleichbaren KLF4+/+ Mäuse. / Bacterial pneumonia is one of the leading causes of death worldwide. Streptococcus pneumoniae is the most frequently isolated pathogen from clinical pneumonia samples. Neutrophils belong to the class of myeloid cells and forms an important component of this innate immune system against bacterial infections. Krüppel-like factor 4 (KLF4) has been reported to not only play a role in differentiation of cells of the immune system but also in mediating inflammatory signals in different kinds of host cells during infection. This study shows myeloid KLF4 has an impact on pneumococcal pneumonia outcome and regulates the inflammation associated with bacterial pneumonia in vivo in mice. The results presented in the work show that the transcription factor KLF4 is induced in human and mice neutrophils during pneumococcal pneumonia. The induction of KLF4 is time and dose dependent. Additionally, the expression of myeloid KLF4 is regulated by the autolysis of S. pneumoniae but is not mediated via Toll-like receptor (TLR) 2, TLR4 or TLR9. Studies using a mouse pneumonia model showed that myeloid KLF4 exhibits a pro-inflammatory phenotype. Mice with KLF4 knockout (KO) or KLF4-/- in myeloid cells had higher bacterial load in their lungs, blood and spleen in comparison to wildtype (WT) or KLF4+/+ mice. Although there was less pro-inflammatory cytokine (such as TNF-α, IL-1β and KC) production in the broncho-alveolar lavage fluid (BALF) and plasma of KLF4-/- mice yet there no differences in cell recruitment in the BALF of the KLF4-/- and KLF4+/+ mice. There was however less cell recruitment in the blood of KLF4-/- mice in comparison to KLF4+/+ mice. Additionally, an increased vascular permeability associated with perivascular edema and pleuritis was seen during Streptococcus pneumoniae-induced infection in KLF4-/- mice, which also reached earlier the human endpoints than the KLF4+/+ mice.

Die COPD (chronic obstructive pulmonary disease) ist eine weltweit vorkommende, chronisch obstruktive Erkrankung der Lunge. Sie gilt als vierthäufigste Todesursache weltweit, wobei ein Viertel der akuten bakteriellen Exazerbationen auf eine Infektion mit Moraxella catharralis zurückzuführen sind. Sowohl das akute, als auch das chronische Entzündungsbild der COPD wird überwiegend durch neutrophile Granulozyten in den Atemwegen bestimmt, die neben antimikrobiellen Effektorfunktionen durch Freisetzung von Zytokinen auch die Entzündungsreaktion bzw. Immunantwort regulieren können. In dieser Arbeit wurde untersucht inwiefern die Interaktion von M.catarrhalis mit dem humanen Granuloyzten-spezifischen Rezeptor carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (CEACAM)3 zu einer Aktivierung der neutrophilen Granuloyzten sowie zu einer NF-kappaB-abhängigen Chemokinproduktion führt. Primäre Granulozyten gesunder Spender sowie NB4 Zellen wurden mit M.catarrhalis in Anwesenheit verschiedener Inhibitoren, siRNA oder CEACAM-blockender Antikörper infiziert und anschließend die Chemokinsekretion mittels ELISA bestimmt. Mit Hilfe eines Luziferase Reportergenassays und Chromatinimmunpräzipitation wurde die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die spezifische Interaktion von CEACAM3 mit M. catarrhalis UspA1 in einer Aktivierung neutrophiler Granulozyten resultiert. Desweiteren kommt es zu einer CEACAM3-UspA1 abhängigen Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB und verstärkter Sekretion proinflammatorischer Chemokine. Die NF-kappaB-Aktivierung ist abhängig von der Phosphorylierung des CEACAM3 ITAM-like Motivs und erfolgt über den Syk und Card9 Signalweg. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass neutrophile Granulozyten in der Lage sind, die durch M. catarrhalis induzierte Atemwegsentzündung in der COPD über den Oberflächenrezeptor CEACAM3 spezifisch zu modulieren. / The chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is the fourth most common cause of death worldwide. 25 % of the acute bacterial exacerbations are caused by infection with the human restricted pathogen Moraxella catharralis. Both the acute and the chronic inflammatory stage of COPD are predominantly determined by neutrophil granulocytes in the respiratory tract, which in addition to antimicrobial effector functions can also regulate the inflammation or immune response by releasing cytokines. This work investigated if the interaction of M. catarrhalis with the human granulocyte-specific receptor carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (CEACAM) 3 leads to an activation of the neutrophil granulocytes and to a NF-kappaB-dependent chemokine production. Primary granulocytes from healthy donors as well as NB4 cells were infected with M. catarrhalis in the presence of various inhibitors, siRNA or CEACAM-blocking antibodies, and then chemokine secretion was determined by ELISA. Using a luciferase reporter gene assay and chromatin immunoprecipitation, activation of the transcription factor NF-kappaB was investigated. In this work it could be shown that the specific interaction of CEACAM3 with M. catarrhalis UspA1 results in the activation of neutrophil granulocytes. Furthermore, there is a CEACAM3-UspA1-dependent activation of the transcription factor NF-kappaB and increased secretion of proinflammatory chemokines. NF-kappaB activation is dependent on the phosphorylation of the CEACAM3 ITAM-like motif and occurs via the Syk and Card9 signaling pathways. The results suggest that neutrophil granulocytes are able to specifically modulate M. catarrhalis induced airway inflammation in COPD via the surface receptor CEACAM3.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Beeinflussung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase (EC 3.4.21.37) durch wässrige und Dichlormethan-Extrakte von 15 Basidiomyceten festgestellt. Durch aktivitätsgeleitete Fraktionierung (mehrfache SC, GC-MS) der Dichlormethan-Extrakte von Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. und Lactarius deterrimus Grög. wurden Fraktionen freier langkettiger Fettsäuren als ein wirksames Prinzip der Elastase-Hemmung und auch der Kollagenase-Hemmung (Clostridium histolyticum Kollagenase, EC 3.4.24.3) isoliert und identifiziert. Das Screening von 17 freien langkettigen Fettsäuren zeigte, dass einfach ungesättigte Fettsäuren eine stärkere Hemmung der Elastase-Aktivität bewirkten als ihre gesättigten bzw. mehrfach ungesättigten Homologa: Ölsäure (C18:1 cis-9): IC50 5µM; Stearin-(C18:0), Linolsäure (C18:2 cis-9,12): IC50 10µM; alpha- (C18:3 cis-9,12,15), gamma-Linolensäure (C18:3 cis-6,9,12): IC50 15µM. Inhibitorisch am stärksten wirksam war Erucasäur! e (C22:1 cis-13): IC50 450nM. Für Kollagenase wurde hingegen gezeigt, dass die gesättigten Fettsäuren eine erheblich stärkere Hemmaktivität als ihre ungesättigten Homologa aufwiesen. Aktivste Verbindungen waren Palmitin- (C16:0), Heptadecan- (C17:0), Stearin- und Nonadecansäure (C19:0) mit IC50-Werten von 20-45µM. Die Untersuchung von 9 ausgewählten Fettsäuren bezüglich der Hemmung der Aktivität der MMP-9 (EC 3.4.24.35) zeigte als aktivste Verbindungen Palmitolein- (16:1 cis-9), alpha- und gamma-Linolensäure. Die wirksamen Konzentrationen (250µM) lagen jedoch sehr hoch. Zytotoxizitätsuntersuchungen (ECV-304) der Extrakte von H. annosum und L. deterrimus sowie der freien Fettsäuren schlossen sich ebenso wie Untersuchungen zur Proteaseaktivität der Zelllinien ECV-304, MCF-7 und MDA-MB 231 an. Die Proteaseaktivität der Zellen nahm in der Reihenfolge ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231 zu. Die einzig untersuchte Fettsäure gamma-Linolensäure zeigte keine reproduzierbare Beeinflussung d! er Proteaseaktivität. / In the present paper it was established that the activity of humane neutrophil elastase (EC 3.4.21.37) is affected by aqueous and dichloromethane extracts of 15 basidiomycetes. Bioassay-guided fractionation (repeated CC, GC-MS) of dichloromethane extracts of Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. and Lactarius deterrimus Grög. led to isolation and identification of fractions of free fatty acids as one active principle of elastase inhibition as well as collagenase inhibition (Clostridium histolyticum collagenase, EC 3.4.24.3). By testing 17 free fatty acids for elastase inhibition it was shown that the inhibition rate of unsaturated acids was much higher than the rate of the saturated ones: oleic acid (C18:1 cis-9): IC50 5µM; stearic acid (C18:0), linoleic acid (C18:2 cis-9,12): IC50 10µM; linolenic acid (C18:3 cis-9,12,15), gamma-linolenic acid (C18:3 cis-6,9,12): IC50 15µM. The highly active erucic acid with an IC50 value of 450nM is remarkable. As a result for collagenase we can assume that the saturated fatty acids were more potent than the unsaturated ones. Palmitic acid (C16:0), heptadecanoic acid (C17:0), stearic acid, and nonadecanoic acid (C19:0) were the most potent fatty acids with IC50 values of 20-45µM. 9 selected fatty acids were investigated for their ability to inhibit the activity of MMP-9 (EC 3.4.24.35). Palmitoleic acid (16:1 cis-9), linolenic acid, and gamma-linolenic acid were the most potent fatty acids but their inhibiting concentrations were very high (250µM). Investigation of cytotoxicity of the extracts of H. annosum, L. deterrimus, and free fatty acids as well as investigation of protease activity of ECV-304, MCF-7, and MDA-MB 231 cells followed. Protease activity of cells increased in the following manner: ECV-304 < MCF-7 < MDA-MB 231. The only investigated fatty acid gamma-linolenic acid did not influence protease activity reproducibly.

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Die genaue Implikation natürlicher Killer(NK)-zellen und Neutrophile in Autoimmunerkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) ist nach wie vor ungeklärt und wurde daher im Mausmodell der multiplen Sklerose (MS), der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE), sowie bei MS und Neuromyelitis optica (NMO) Patienten untersucht. Bei MS Patienten konnte eine mit der Krankheitsaktivität korrelierende, reduzierte Zahl zirkulierender CX3CR1+NK Zellen festgestellt werden. Daher wurden die NK Zell-Dynamiken und der Einfluss von CX3CR1 auf diese im EAE Mausmodell untersucht. Hierbei konnte in Wildtyp(WT) sowie auch CX3CR1-defizienten EAE Mäusen eine Rekrutierung peripherer NK Zellen in das ZNS beobachtet werden. Anders als bei WT EAE Mäusen wiesen die NK Zellen bei CX3CR1-defizienten Mäusen einen primär unreifen Phänotyp auf, der möglicherweise als ursächlich für die erhöhte Krankheitsaktivität dieser Tiere gemutmaßt werden kann. Der Transfer reifer NK Zellen vor Immunisierung CX3CR1-defizienter Tiere zeigte folglich protektive Effekte und lässt schlussfolgern, dass die CX3CR1-vermittelte Rekrutierung reifer NK Zellen die EAE Neuroinflammation limitiert. Die Diskriminierung der MS von der klinisch ähnlichen NMO stellt nach wie vor eine Herausforderung dar. Neutrophile in ZNS-Läsionen und der Cerebrospinalflüssigkeit(CSF) können bei NMO, nicht aber MS Patienten nachgewiesen werden, weshalb Neutrophile aus dem Blut von NMO und MS Patienten hier vergleichend untersucht wurden. Die Neutrophile beider Patientengruppen wiesen einen aktivierten Phänotyp im Vergleich zu gesunden Kontrollen auf. Im Gegensatz dazu zeigte sich eine von Medikation und neurologischen Defiziten der Patienten unabhängige, kompromittierte Funktionalität der NMO verglichen mit MS Neutrophilen im Hinblick auf Migration, oxidativen Burst und Degranulierung. Die Neutrophilenfunktionalität könnte entsprechend potentiell als diagnostisches Diskriminierungskriterium zwischen der MS und der NMO dienen. / The implication of natural killer (NK) cells and neutrophils in autoimmune disorders of the central nervous system (CNS) remains elusive, and therefore was investigated in a mouse model for multiple sclerosis (MS), experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), and in patients with MS and neuromyelitis optica (NMO), respectively. In MS, a decreased frequency of circulating CX3CR1+NK cells correlating with the patient disease activity has been reported. Therefore, the pattern of NK cell mobilization and the contribution of CX3CR1 to NK cell dynamics in response to neuroinflammatory insult were investigated in the EAE model. Here, NK cells similarly mobilized from the periphery and accumulated in the CNS in both wild-type (WT) and CX3CR1-deficient mice during EAE. However, in mice lacking CX3CR1 the infiltrated NK cells displayed an immature phenotype contrasting with the mature infiltrates in the WT counterparts, apparently contributing to EAE exacerbation in those animals since transfer of mature WT NK cells prior to immunization of CX3CR1-deficient mice exerted a protective effect. Together, these data suggest that the CX3CR1-mediated recruitment of mature CX3CR1+NK cells limits EAE neuroinflammation. Due to clinical similarities, the discrimination between MS and NMO is still challenging. In contrast to MS, neutrophil accumulations were found in CNS lesions and the cerebrospinal fluid (CSF) of NMO patients wherefore a comparative analysis of peripheral blood neutrophils in NMO and MS patients was performed. The results revealed an activated neutrophil phenotype in NMO and MS when compared to healthy individuals. In contrast, analysis of neutrophil migration, oxidative burst activity and degranulation showed a compromised neutrophil functionality in NMO compared to MS, which was not influenced by the treatment regime and clinical parameters of the patients. Thus, neutrophil functionality may represent a new diagnostic tool to discriminate between NMO and MS.

Neutrophile sind Zellen des Immunsystems von Säugetieren. Ihre zerstörerische Kraft spielt eine essentielle Rolle bei der Bekämpfung von Mikroorganismen, birgt aber auch das Potential erheblicher Kollateralschäden. Um chronische Entzündungen zu vermeiden, müssen diese Zellen streng reguliert werden. Die Neutrophilen selber nehmen an dieser Regulierung durch das Freisetzen von pro- und antiinflammatorischen Signalen Teil, unter anderem produzieren sie Zytokine oder initiieren rechtzeitig die Apoptose. Ein Eckpfeiler der Regulierung dieser Funktionen ist der oxidative Burst, bei dem Neutrophile reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bilden. Die molekularen Ziele von ROS, welche diese Mechanismen regulieren, sind nicht alle identifiziert. Wir haben ataxia-telangiectasia mutated (ATM) Kinase, ein Regulator der DNA-Schadensantwort (DDR), als einen ROS-abhängigen Modulator von Neutrophilen identifiziert. Mutationen in ATM führen zu der Erkrankung Ataxia Telangiectasia (AT). AT Patienten leiden nicht nur unter den Folgen der fehlerhaften DNA-Reparatur sondern zeigen auch inflammationsassoziierte Krankheitserscheinigungen. Diese Beobachtung veranlasste uns, die Neutrophilen von AT Patienten genauer zu untersuchen. Wir zeigen, dass Neutrophile von AT Patienten erhöhte Menge an Zytokinen produzieren und Apoptose verzögern. Wir zeigen auch, dass DNA Schaden die Zytokinproduktion unterdrückt und Apoptose durch einen Mechanismus, der ATM, p38, und Chk2 verwendet initiiert. ROS sind notwendig für die endogene Regulierung dieser Prozesse. Diese Arbeit enthüllt einen neuartigen Mechanismus der Regulierung von Neutrophilen und etabliert die DDR als ein Ziel der ROS-gesteuerten Immunmodulation. Im Zusammenhang wird auch gezeigt, dass dysregulierte Neutrophilenaktivitäten einem inflammatorischen Phänotyp in AT zugrundeliegen könnte. Wir glauben, dass Entzündung eine treibende Kraft hinter Teilen der Pathologie von AT sein könnte und somit ein Ziel für klinische Intervention darstellt. / Neutrophils are cells of the mammalian innate immune system whose inflammatory functions are essential for microbial clearance but cause collateral tissue damage. Inflammation is regulated by both pro- and anti-inflammatory signals, including cytokine production and initiation of apoptosis. A cornerstone of the regulation of these functions is the oxidative burst, by which neutrophils generate reactive oxygen species (ROS). The downstream targets of ROS responsible for regulating these functions are not fully identified. We have identified ataxia telangiectasia mutated (ATM) kinase, a master regulator of the DNA damage response (DDR), as a ROS-dependent modulator of neutrophil responses. Mutations in ATM cause the disease Ataxia-telangiectasia (AT). In addition to disorders resulting from defective DNA repair, AT patients suffer from symptoms linked to inflammation, leading us to examine their neutrophil responses. We report that neutrophils from AT patients overproduce pro-inflammatory cytokines and delay apoptosis. We further show that DNA damage in neutrophils suppresses cytokine production and can initiate apoptosis via a mechanism involving ATM, p38, and Chk2. Furthermore, the oxidative burst was required for activation of ATM to regulate these processes.. This work reveals a novel mechanism for the regulation of neutrophil functions, establishing the DDR as a mediator of immune regulation by ROS. Furthermore, it indicates that neutrophil dysregulation may underlie chronic inflammation in AT patients. We propose that inflammation may be a driving force behind some of the pathology of AT, providing a potential target for clinical intervention for some symptoms of this currently untreatable disease.

Les polynucléaires neutrophiles représentent 50-70% des leucocytes sanguins et possèdent un rôle majeur dans la défense de l'organisme contre les pathogènes. Le Ca2+ est un second messager qui joue un rôle primordial dans le chimiotactisme, la phagocytose, la dégranulation et la production de formes réactives de l'oxygène (FRO) afin de neutraliser l'agent pathogène. Dans ces cellules, l'influx calcique de type SOCE est essentiel pour l'homéostasie calcique. Il est peu étudié en raison du manque d'outils pharmacologiques spécifiques d'où l'importance dans un premier temps de chercher de nouvelles molécules. Les cellules T Jurkat dont le SOCE est largement caractérisé servent de modèle pour la caractérisation initiale de ces molécules. Le 2-APB est parmi les molécules les plus largement utilisées dans la caractérisation du SOCE en raison de sa double activité sur le SOCE avec une potentialisation à [1-10 μM] et une inhibition à [> 20 μM]. En revanche, ce produit manque de spécificité et agit sur d'autres cibles cellulaires comme les récepteurs à l'inositol (1,4,5)-trisphosphate (InsP3Rs). La 1ère étape est de sélectionner à partir d'analogues commerciaux du 2-APB (Methoxy-APB, Dimethoxy-APB, Cyclic-APB, Benzothienyl-APB, Thienyl-APB et MDEB), des composés plus spécifiques et également plus efficaces que la molécule mère. Deux molécules se sont distinguées : le MDEB comme uniquement potentialisant du SOCE et le Benzothienyl-APB comme un puissant inhibiteur. En revanche, tous les analogues du 2-APB inhibent les InsP3Rs à l'exception du MDEB qui semble plus spécifique du SOCE. L'effet du MDEB sur le courant calcique, ICRAC, a été étudié grâce à la technique du patch-clamp. Il augmente d'environ 4 fois l'amplitude de ICRAC par rapport à celle enregistrée dans les cellules contrôle. Par ailleurs, le MDEB ralentie l'inactivation rapide de ICRAC due au Ca2+. Sur le plan physiologique, le MDEB à des concentrations croissantes inhibe la synthèse de l'IL-2 dans les cellules Jurkat stimulées et ceci malgré son effet potentialisant du SOCE. Cette activité est liée à son effet pro-apoptotique dans les cellules Jurkat stimulées. Le MDEB et le Benzothienyl-APB caractérisés dans la 1ère partie nous ont servi d'outils potentiels afin d'étudier le SOCE des cellules PLB-985 différenciées en cellules proches de neutrophiles. Le SOCE a été induit soit par un traitement des cellules avec la thapsigargine (Tg) soit de manière physiologique avec les peptides fMLF et le WKYMVm deux chimioattractants, ligands des récepteurs aux peptides formylés FPR et FPRL1 respectivement. En plus, le SOCE induit par la Tg est modulable par le 2-APB, potentialisé par le MDEB et inhibé par le Benzothienyl-APB. La phagocytose des levures par les cellules PLB-985 différenciées ainsi que la production de FRO intraphagosomales ont été inhibées par le MDEB et le Benzothienyl-APB. Les FRO extracellulaires ont été également inhibées par Benzothienyl-APB en revanche à cause de la forte interférence du MDEB avec la technique de mesure nous n'avons pas pu étudier ses activités. En conclusion, le MDEB et le Benzothienyl-APB sont de nouveaux outils pharmacologiques potentialisant ou inhibant le SOCE des leucocytes, qui nous permettront dans l'avenir une meilleure compréhension de l'entrée calcique et ses rôles dans ces cellules.