Introdução: O Erlotinibe é um inibidor oral da tirosina quinase localizada no domínio intracelular do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). É uma droga ativa contra o carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECCP) que apresenta alta expressão deste receptor, demonstrando desta forma possível sinergismo com a quimioterapia e a radioterapia. Objetivo: Avaliar a expressão do EGFR e da proteína Akt fosforilada por imuno-histoquímica como fator preditivo a resposta terapêutica ao Erlotinibe em um estudo fase II que incluiu 32 pacientes com CECCP localmente avançado; também foram analisados mutações do gene EGFR nos éxons 18,19,20 e 21. Pacientes e métodos: Neste estudo pacientes portadores de CECCP localmente avançado foram tratados com uma combinação de Cisplatina 100mg/m2 intravenoso, administrada nos dias 8, 29 e 50 do tratamento; e radioterapia na dose de 70 Gy administrada em 39 frações a partir do dia 8. O Erlotinibe foi iniciado uma semana antes da radioterapia e mantido até o último dia da radioterapia. Biópsias pré-tratamento, extraídas dos blocos de parafina, foram analisadas por imunohistoquímica para avaliar a expressão do EGFR e da Akt fosforilada. O resultado dessas amostras foi quantificado por um programa de análise digital de imagem. O status mutacional do gene EGFR (nos éxons 18, 19,20 e 21) foi analisado utilizando PCR convencional e sequenciamento. Resultados: A resposta completa ao tratamento ocorreu em vinte pacientes (62,5%), sendo que dois foram tratados com Laringectomia de resgate e ficaram sem evidência de doença. A análise de sobrevida com relação ao estadiamento e com o sítio anatômico evidenciou diferença estatisticamente significativa (p= 0.05). A análise das proteínas EGFR e p-Akt por imuno-histoquímica, quando os sítios estavam agrupados não apresentou valor preditivo de resposta ao tratamento; no entanto ao avaliarmos os sítios anatômicos separadamente, apenas a quantificação de EGFR em hipofaringe foi uma variável preditiva de resposta ao tratamento com erlotinibe (p=0.05). Em relação às análises moleculares nenhuma mutação foi detectada no seqüenciamento dos éxons estudados da proteína EGFR. Conclusão: A expressão do EGFR parece ser um fator preditivo à reposta terapêutica, no entanto outros estudos com identificação de outros biomarcadores e amostras maiores são necessários para elucidar quais pacientes com CECCP podem ser beneficiados com este tratamento / Purpose: Erlotinib, an oral tyrosine-kinase inhibitor, is active against squamous cell carcinoma of the head and neck (HNSCC) and possibly has a synergistic interaction with chemotherapy and radiotherapy. We investigated the expression of EGFR and phosphorylated AKT by immunohistochemistry as predictors of response to Erlotinib in a cohort of 32 locally advanced HNSCC, enrolled in a Phase II trial. In addition, we assessed mutation on hotspots of EGFR gene (exons18,19,20,21). Patients and Methods: This study was conducted in a Phase I/II trial of cisplatin 100 mg/m2 on days 8, 29 and 50; and radiotherapy 70 Gy starting on day 8. Erlotinib was started orally 1 week before chemo radiation and continued daily just to the last day of chemo radiation. Pretreatment archival tumor specimens were evaluated for EGFR and phosphorylated-Akt (p-Akt) by immunohistochemistry. These immunostains were quantified by digital image analysis. EGFR gene mutational status was also assessed using conventional PCR and sequencing. Results: Complete response to treatment occurred in twenty patients (62.5%), and two were treated with salvage laryngectomy and were without evidence of disease. Survival analysis in relation to the staging and the tumor site showed a statistically significant difference (p = 0.05). Analysis of EGFR protein and p-Akt by immunohistochemistry, when sites were grouped showed no predictive value for treatment response, however when evaluating the anatomical sites separately, only the quantification of EGFR in the hypopharynx was a significant predictor of response to treatment with erlotinib (p = 0.05). Regarding the molecular analysis no mutations were detected in the sequencing of the exons studied EGFR protein. Conclusion: The expression of EGFR seems to be a predictive factor for response to therapy, although other studies with identification of other biomarkers and larger samples are needed to elucidate which patients may benefit HNSCC with this treatment

Introdução: O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço tem na cirurgia e na radioterapia, as principais modalidades terapêuticas iniciais. Nas recidivas loco-regionais, a cirurgia é a escolha padrão de tratamento. Objetivos: Identificação de fatores prognósticos clínicos, histopatológicos e biomoleculares e a avaliação da sobrevida após cirurgia de resgate. Casuística e Métodos: Estudo retrospectivo de pacientes submetidos a tratamento cirúrgico inicial, com revisão de variáveis histopatológicas e expressão imunohistoquímica de VEGF, ciclina d1 e EGF-R no tumor inicial e no resgate. Das recidivas, 10 eram de estádio clínico precoce (I e II) e 18, avançado (III e IV). O período de seguimento médio foi de 33,4 meses. Resultados: A comparação das variáveis histológicas e dos marcadores moleculares no tumor inicial e na recidiva não apresentou alterações estatisticamente significantes. A sobrevida global após cirurgia de resgate foi superior nas recidivas com diagnóstico após seis meses (p=0,02). Conclusões: Os achados sugerem que a expressão de VEGF superior a 75% é fator preditivo para controle da doença após a recidiva. A sobrevida entre o tempo decorrido do tratamento inicial e a recidiva foi estatisticamente significante / Introduction: The usual management of squamous cell carcinoma (SCC) head and neck is the surgery associated or not to post surgical radiotherapy. Salvage surgery is the first therapeutic option for recurrent tumors. Objective: The identification of prognostic factors and to assess survival interval after salvage surgery for SCC. Methods: Retrospective analysis of patients treated with surgery and review of histopathological variables and immunohistochemical expression of VEGF, EGF-R and Ciclina in the initial tumor and salvage surgery. Twenty eight patients were submitted salvage surgery with 10 were staged as early tumors (I and II) and 18 as advanced ones (III and IV). The average follow-up was 33.4 months. Results: The comparison of histopathologicals variables in the initial tumor and loco regional recurrence no statistically significant changes. Survival after salvage surgery was 70% in cases with recurrences diagnosed after six months of follow-up (p=0.02). Conclusions: The findings suggest that variables immunohistopathologicals in loco regional recurrence were of minor importance in prognosis. The time between the initial treatment and recurrence loco regional was independent variable of survival

Introdução: Pacientes com câncer de laringe costumam apresentar histórico de tabagismo. Nos pacientes submetidos à tratamento cirúrgico, as complicações pulmonares podem levar à morte no período pós-operatório. Um método com dispositivo extratraqueal padronizado, simples e de baixo custo para a avaliação pulmonar dos pacientes laringectomizados seria muito útil. Objetivo: Validar a metodologia para a avaliação pulmonar em pacientes submetidos à laringectomia total por meio da aplicação de um dispositivo extratraqueal adesivo. Métodos: Participaram deste estudo transversal 50 pacientes submetidos à laringectomia total há pelo menos seis meses como modalidade de tratamento para o câncer de laringe em acompanhamento no Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Por meio da anamnese e do prontuário dos pacientes foram obtidos dados demográficos, tabagismo, a presença de doenças respiratórias nos últimos 30 dias, dados acerca do tumor e sobre o tratamento realizado. Os testes de função pulmonar foram utilizados para caracterizar a presença de limitação funcional respiratória e o padrão funcional do paciente laringectomizado. Na intenção de avaliar a reprodutibilidade dos exames realizados, foram utilizados parâmetros com respectivos critérios de aceitação dos exames. Os critérios de reprodutibilidade são indicadores de exatidão. Foi feita a comparação desses parâmetros com 50 exames realizados em pacientes não laringectomizados, no mesmo período com o mesmo equipamento, pareados para idade e gênero. Resultados: Em todos os casos de nosso estudo, uma vedação aérea foi mantida durante todo o procedimento com o uso do dispositivo extratraqueal adesivo. Após a realização dos testes de função pulmonar, encontramos que 44% dos pacientes apresentavam um padrão respiratório normal e 56% alterado. Comparando a frequência e porcentagem dos exames rejeitados entre os laringectomizados e o grupo controle, dos nove parâmetros avaliados, cinco foram exatamente iguais, três apresentaram frequência de rejeição maior no grupo controle e somente um mostrou uma maior frequência de exames rejeitados no grupo dos pacientes submetidos à laringectomia total. O total de exames rejeitados foi maior no grupo controle (72%) do que no grupo dos laringectomizados (46%). Conclusões: A maioria dos pacientes submetidos à laringectomia total apresenta função pulmonar alterada, de caráter obstrutivo, na maioria das vezes, devido ao histórico de tabagismo. A metodologia para a avaliação da função pulmonar por meio do uso do dispositivo extra-traqueal proposto é confiável, precisa e reprodutível / Introduction: Laryngeal cancer patients usually have a smoking history. In patients submitted to laryngectomy, pulmonary complications may lead to death in the post-operative phase. A simple and low-cost method with a standardized extra-tracheal device for the pulmonary assessment of laryngectomized patients would be very useful. Objective: Validate the methodology for pulmonary assessment in patients submitted to total laryngectomy through the application of an adhesive extra-tracheal device. Methods: This transversal study included 50 patients who had been submitted to total laryngectomy at least six months prior to this investigation, as choice of treatment for laryngeal cancer while followed by the Head and Neck Service from Hospital das Clínicas, São Paulo University. Through anamnesis and patients medical records the following information was collected: demographic data, smoking habits, the presence of respiratory diseases in the last 30 days, as well as information about the tumor and the performed treatment. Pulmonary tests were used to characterize the presence of respiratory functional limitation as well as laryngectomized patient\'s functional standards. Aiming at evaluating the reproducibility of the performed tests, parameters were used with the respective criteria for the acceptance of the tests. The reproducibility criteria are indicators of accuracy. A comparison of these parameters was made with 50 tests performed in non-laryngectomized patients, in the same period with the same equipment, paired up according to age and gender. Results: In all cases of our study, an air-tight seal was maintained through the entire procedure with the use of the adhesive extra-tracheal device. After the performance of pulmonary function tests, 44% of patients presented a normal respiratory standard whereas 56% had an altered one. When comparing the frequency and percentage of the rejected tests between laryngectomized and control group, out of nine assessed parameters, five were exactly the same, three presented a greater rejection frequency in the control group and only one showed a greater frequency of rejected tests in the group of patients submitted to total laryngectomy. The total of rejected tests was greater in the control group (72%) when compared to the laryngectomized one (46%). Conclusions: Most patients submitted to total laryngectomy present altered pulmonary function, of the obstructive type most of the times, due to a smoking history. The methodology for the assessment of the pulmonary function by using the extra-tracheal proposed device is reliable, accurate and reproducible

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_taina_guim.pdf: 1081277 bytes, checksum: 7c03f9dccecf657fea6e60fa6a359381 (MD5) Previous issue date: 2010-02-26 / Squamous cell carcinoma (SCC) is a cutaneous malignant neoplasm commonly observed in dog and cat. Especially in our country, the SCC represents a serious problem, since chronic exposure to ultraviolet radiation is one of the important factors for the development of the disease. In this way, the objective of this study was establish histomorphological markers as prognostic factors and determine the time and the estimated survival of dogs and cats carriers of SCCs. A survey of cases of SCCs in dog and cat diagnosed at the Regional Diagnostic Laboratory from the Federal University of Pelotas, was performed during the period of 1999 to 2009. Fifty samples were obtained from biopsies and/or necropsies. From the studied cases, 24 animals with the disease were followed for a period of one year. In this study, we used the histological grade and survival time of animals as a criterion to prognostic evaluation. The histological parameters evaluated as peritumoral lymphoplasmacytic infiltration, tissue eosinophilia associated with tumor, mitotic index, arrangement, invasion to adjacent tissues, emboli vascular blood and/or lymphatic, desmoplastic reaction and quantification of AgNORs were confronted with the histological grade and the survival time of affected animals. When the histological parameters were compared with survival, a significant relation was observed with the intensity of invasion to adjacent tissues (p <0.05). When confronted with the histological grade, the invasion show significant results only to poorly differentiated SCCs and desmoplasia were statistically significant (p <0.05). In this study, the estimate of survival was 23.4% in one year to animals with or without treatment. From the results obtained, it was concluded that the intensity of invasion is an important predictive prognostic factor for cutaneous SCCs in dogs and cats. Other parameters showed no relation with the histological grade and/or survival, thus, are not considered prognostic factors predictive. The time and the estimate of survival were low and therefore the prognosis for dogs and cats carrier of cutaneous SCCs is unfavorable. / Carcinoma de células escamosas (CCE) é um neoplasma cutâneo maligno comumente observado no cão e no gato. Especialmente em nosso país, o CCE representa um problema sério, uma vez que a exposição crônica à radiação ultravioleta é um dos fatores importantes para o desenvolvimento da doença. Neste sentido, o presente estudo teve como objetivo estabelecer marcadores histomorfológicos como fatores prognósticos e determinar o tempo e a estimativa de sobrevida de cães e gatos portadores de CCEs cutâneos. Foi realizado um levantamento dos casos de CCEs em cães e gatos diagnosticados no Laboratório Regional de Diagnóstico da Universidade Federal de Pelotas, durante o período de 1999 a 2009. Foram recuperadas 50 amostras provenientes de biópsias e/ou necropsias. Do total de casos estudados, 24 animais portadores da doença foram acompanhados durante um período de um ano. Neste estudo, utilizou-se o grau histológico e o tempo de sobrevida como critério de avaliação prognóstica. Os parâmetros histológicos avaliados como: infiltrado linfoplasmacítico peritumoral, eosinofilia tecidual associada a tumores, índice mitótico, arranjo, invasão para tecidos adjacentes, êmbolo vascular sanguíneo e/ou linfático, desmoplasia e quantificação das AgNORs, foram confrontados com o grau histológico e com a sobrevida dos animais acometidos. Quando os parâmetros histológicos foram confrontados com a sobrevida, observou-se relação estatística significativa com a intensidade de invasão para tecidos adjacentes (p<0,05) e, quando confrontados com o grau histológico, a invasão somente para CCEs pouco diferenciados e a desmoplasia foram estatisticamente significativos (p<0,05). No presente estudo, a estimativa de sobrevida para animais portadores de CCEs cutâneos foi 23,4% em um ano, independentemente de terem sido tratados ou não. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que a intensidade de invasão é um fator prognóstico preditivo importante para CCEs cutâneos em cães e gatos. Os demais parâmetros avaliados não mostraram relação com o grau histológico e/ou com a sobrevida, dessa forma, não são considerados fatores prognósticos preditivos. O tempo e a estimativa de sobrevida foram baixos e, portanto, o prognóstico para cães e gatos portadores de CCEs cutâneos é, de um modo geral, desfavorável.

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Le carcinome spinocellulaire (SCC) est le 2ème cancer de la peau le plus fréquent avec plus d’un million de nouveaux patients diagnostiqués dans le monde chaque année. On retrouve également des SCCs associés à un pronostic plus sombre au niveau de la tête, du cou, de la cavité orale et de l’œsophage. Des travaux récents ont démontré l’existence de cellules souches cancéreuses (CSCs) dans les SCCs cutanés mais les mécanismes moléculaires contrôlant leurs fonctions restent indéterminés. Dans une première étude, nous avons montré que Sox2, un facteur de transcription (TF) associé aux cellules souches, est détecté de manière hétérogène dans une grande majorité des papillomes et des SCCs chez la souris et chez l’humain. La délétion conditionnelle de Sox2 dans l’épiderme réduit drastiquement l’apparition de tumeurs démontrant le rôle clé de Sox2 dans l’initiation tumorale. En utilisant une souris génétiquement modifiée Sox2-GFP knock-in, nous avons démontré que les cellules tumorales Sox2+ sont enrichies en cellules propagatrices de tumeurs dont la proportion augmente au fur et à mesure des transplantations sériées. L’ablation des cellules Sox2+ dans les papillomes et les SCCs conduit à une importante régression des tumeurs, indiquant que ces cellules ont un rôle crucial dans le maintien des tumeurs. La délétion conditionnelle de Sox2 dans des papillomes et SCCs préexistants provoque également une régression majeure des tumeurs, soulignant le rôle essentiel de Sox2 dans la régulation des fonctions des cellules tumorales. Une analyse transcriptionnelle et des expériences d’immunoprécipitation de chromatine nous ont permis de mettre en évidence un réseau de gènes associés à des fonctions essentielles des cellules tumorales et régulés par Sox2 dans les tumeurs primaires in vivo. Dans une 2ème étude, nous avons montré que les SCCs issus de l’épiderme inter-folliculaire (IFE) présentent en général un caractère différencié alors que ceux issus du follicule pileux (HF) présentent fréquemment des caractéristiques de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). En réalisant une analyse transcriptionnelle et épigénétique, nous avons démontré que les différentes cellules à l’origine expriment un réseau de gènes spécifiques et présentent une accessibilité différentielle à des sites de liaison d’importants TFs associés soit à un phénotype épithélial soit à l’EMT. Ces résultats démontrent que l’état transcriptionnel et épigénétique de la cellule à l’origine amorce spécifiquement les tumeurs vers le processus d’EMT. L’ensemble de ces résultats souligne des mécanismes cruciaux à l’établissement de l’hétérogénéité tumorale et seront essentiels pour parvenir à des pronostics affinés et au développement de nouvelles thérapies ciblées dans le traitement du cancer. / Skin squamous cell carcinoma (SCC) is the second most frequent skin cancer with more than a million new patients affected every year throughout the world. It is also the predominant cancer of the head, neck, oral cavity and esophagus, associated with a poor prognosis. Recent studies have identified cancer stem cells (CSCs) in skin SCC but the molecular mechanisms controlling their functions remain unclear. In a first study, we show that Sox2, a transcription factor (TF) associated with stemness, is expressed in a heterogeneous manner in the vast majority of benign and malignant skin tumors in mouse and human. Sox2 conditional deletion in the epidermis impairs tumor development showing that Sox2 plays a crucial role in tumor initiation. Using a Sox2-GFP knock-in mouse model, we show that Sox2-expressing tumor cells are greatly enriched in tumor-propagating cells, which further increase upon serial transplantations. Lineage ablation of Sox2-expressing cells in primary benign and malignant SCCs leads to tumor regression, consistent with the critical role of Sox2-expressing cells in tumor maintenance. Conditional Sox2 deletion in pre-existing skin papilloma and SCC leads to tumor regression, supporting the essential role of Sox2 in regulating cancer cells functions. Using transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation, we uncovered a gene network controlling many cancer hallmarks regulated by Sox2 in primary tumour cells in vivo.In a second study, by targeting the same oncogenic mutations to distinct skin compartments, we show that interfollicular epidermis (IFE)-derived SCCs are generally well-differentiated, while hair follicle stem cells (HFSCs)-derived SCCs frequently exhibit features of epithelial-mesenchymal transition (EMT). Using transcriptional and epigenetic profiling, we show that IFE and HF tumor-initiating cells harbor distinct chromatin landscapes and gene regulatory networks associated with tumorigenesis and EMT. These different chromatin landscapes correlate with the differential accessibility of key epithelial and EMT TFs binding sites in the cancer cell of origin. These findings demonstrate that cell type-specific chromatin and transcriptional states differentially prime tumours towards EMT.Altogether, these results highlight crucial mechanisms for the establishment of tumor heterogeneity which will be relevant for better prognostic assessment and the development of novel targeted therapies for cancer treatment. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Skin cancers are very common in humans. The two most frequent epithelial skin cancers are the basal cell carcinoma (BCC) and the squamous cell carcinoma (SCC). For the vast majority of cancers, the cell at the origin of tumour initiation is still unknown and assumptions concerning their origin rely mainly on morphological and immunohistochemical studies. Recently, adult stem cells (SCs) have been suggested to be at the origin of tumour initiation based on their long term self-renewing capacities. According to these, two important questions arise; do epithelial skin cancers arise from mutations in a specific cell lineage of the epidermis? And are the stem cells more competent to initiate tumors than committed cells?<p>BCCs result from aberrant activation of HH signaling and several mouse models carrying mutations in HH signaling genes are capable to form tumors resembling to human BCCs. <p>To identify the cell lineage at the origin of BCC and to investigate the role of stem cells in tumor initiation, we followed a genetic approach where we conditionally expressed SmoM2 oncogene (a constitutively active Smoothened mutant) in distinct skin epidermal compartments including SCs. Targeting basal epidermis cells, showed that only SmoM2-clones in the inter follicular epidermis (IFE) and the infundibulum can progress into BCC, whereas SmoM2 expression in Bulge SCs or in matrix transit amplifying progenitor cells never leads to BCC formation. Progressively after SmoM2 expression, tumor-initiating cells lose their normal differentiation to adopt a hair placode-like shape and markers, demonstrating that biochemical and morphological tumour features can be misleading in extrapolating their cellular origin.<p><p>The molecular changes occurring in tumor initiating cells and the mechanisms regulating the early steps of cancer development are poorly characterized for the majority of tumors. To address these questions in BCC, we took advantage of our ability to isolate SmoM2 expressing cells at different stages of tumor initiation and progression. Transcriptional profiling of SmoM2-basal IFE cells isolated one week (normal histology) and 4 weeks (dysplastic lesion), suggests that adult IFE cells undergo a reprogramming into embryonic hair follicle (EHFP) like fate. In addition, we showed that Wnt/β-catenin signaling is essential for BCC initiating cell reprogramming into EHFP like fate and for tumor initiation in a cell autonomous manner. Finally, we show that EHFP reprogramming occurs also in human BCCs in addition to the presence of a similar canonical Wnt activation signature to the one revealed in the SmoM2-BCC mouse model.<p><p>SCC is the second most frequent skin cancers after BCC and mutations in p53 and Ras genes has been suggested to be potentially the primary events in this tumour. SCCs present signs of squamous differentiation, suggesting that SCCs may originate from the inter follicular epidermis (IFE). To identify the cell lineage at the origin of SCC and the role of the hair follicle SCs in tumor initiation, we use a genetic tools driving oncogenic KRas (KRasG12D) expression at physiological levels in different epidermal compartments. <p>Targeting KRasG12D expression in bulge SCs and their progeny or in IFE results in benign tumor development with no sign of malignant transformation. In contrast, KRasG12D expression in HF Transit amplifying (TA) matrix cells do not promotes any macroscopic tumors or microscopic defects in the epidermis. Interestingly, papillomas arising from the IFE express follicular markers such as CD34 and K17, indicating that the expression of HF markers by tumor cells does not necessarily reflect their cellular origin. Using a combination of deletion of both p53 alleles together with KRasG12D expression, we showed that bulge SCs and/or their progeny but not HF matrix TA cells, promote SCC formation, suggesting that additional genetic hits such as p53 are required to promote full-blown invasive skin SCC. <p><p>In summary, our work demonstrated the non-follicular origin of BCC resulting from Smo mutation, as well as the implication of the IFE progenitors in tumor initiation. We also revealed the progressive reprogramming of BCC initiating cells towards an EHFP-like fate and the key role of Wnt/β-catenin pathway in this process. In contrast, we showed the competence of several epidermal lineages to initiate benign tumors upon expression of KRasG12D oncogene at physiological levels. We also demonstrated that lineage -specific markers expression within tumor cells does not necessarily reflect their cellular origin. Finally, we demonstrated the requirement of additional hits, such as P53 loss, to promote malignant progression in the context of oncogenic Ras.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Introduction<p><p>Avec plus de 7000 cas diagnostiqués par an en Belgique, le cancer bronchique est l’un des cancers les plus fréquents chez l'homme. Son pronostic est très réservé, la survie à 5 ans tous stades confondus étant inférieure à 15 %. Ce faible taux de guérison s’explique en grande partie par le fait que le diagnostic se réalise généralement à un stade avancé de la maladie. Une méthode de détection précoce, l’endoscopie en autofluorescence, exploite des variations de la fluorescence bronchique sous l'effet d'un laser et permet ainsi de dévoiler des lésions précancéreuses invisibles en lumière blanche. Réalisée à l’Institut Jules Bordet depuis 1996, la photodétection nous a permis de constituer une banque de biopsies d’épithélium bronchique à tous les stades de la carcinogenèse bronchique, conservées initialement en blocs paraffinés et, depuis 2003, par congélation. <p><p>Hypothèse<p><p>Nous avons émis l’hypothèse que la compréhension de la genèse du carcinome épidermoïde bronchique par la caractérisation de l’évolution des anomalies moléculaires dans les lésions précancéreuses et cancéreuses de l'arbre bronchique nous permettrait d’identifier de nouvelles cibles de détection et éventuellement de chimioprévention pour le cancer bronchique. L'objectif de nos travaux a donc été de caractériser les modifications moléculaires successives et/ou cumulatives sous-jacentes à la transition entre les différents stades histologiques de la carcinogenèse épidermoïde bronchique (épithélium bronchique normal du fumeur, hyperplasie, métaplasie, dysplasies légère, modérée et sévère, CIS et les carcinomes invasifs). Différentes techniques complémentaires ont été successivement utilisées à cet effet :1) étude de l’expression protéique par immunohistochimie (IHC) et immunofluorescence (IF), 2) étude de l’expression des ARNs messagers par microdamiers, 3) étude de l’expression des microARNs par RT-PCR quantitative.<p><p>Travaux réalisés<p><p>Afin de sélectionner les protéines à étudier aux différents stades de la carcinogenèse épidermoïde bronchique, nous avons réalisé une étude méthodologique de la littérature chez les patients atteints de cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC). En effet, d’une part, la petite taille des biopsies bronchiques que nous projetions d’étudier et, d’autre part, le faible taux de découvertes de lésions de haut grade lors de la réalisation de bronchoscopies en fluorescence limitent le nombre d’analyses réalisables. Les revues systématiques de la littérature, intégrant une analyse méthodologique des études publiées et une méta-analyse de leur impact pronostique en terme de survie, ont permis de choisir une série de marqueurs sur base de leur intérêt potentiel grâce à la puissance apportée par l’agrégation de grands nombres de cas. <p><p>La mutation de KRAS identifiée par PCR constitue un facteur péjoratif pour la survie des patients atteints de CBNPC et plus spécifiquement des adénocarcinomes (ADC). Etant donné que notre projet est consacré à la genèse du carcinome épidermoïde bronchique (CEB), nous n’avons pas étudié ce facteur dans nos biopsies. <p><p>Par contre, les revues systématiques ont montré un impact en terme de survie dans les CBNPC, y compris dans les CEB, pour l’angiogenèse, des récepteurs de facteurs de croissance épithéliale (EGFR et c-erbB-2) et des marqueurs de la prolifération cellulaire (Ki-67). Nous avons donc étudié l’expression de ces protéines par IHC dans les lésions précurseurs de CEB et dans les CEB. L’expression de Ki-67 est augmentée aux stades de dysplasie sévère et de CIS par rapport à ceux de dysplasies légère et modérée. La mesure de l’expression de Ki-67 dans ces biopsies aide donc à les classifier en lésions de bas et de haut grade. L’étude de la corrélation de l’expression de plusieurs protéines (EGFR, c-erbB-2 et Ki-67) dans les mêmes lésions bronchiques a montré que la majorité des biopsies de haut grade (dysplasies sévères et CIS) expriment anormalement EGFR et/ou Ki-67. Par contre, l’homologue d’EGFR, c-erbB-2, n’apparaît que plus tardivement, dans les carcinomes invasifs. <p><p>Nous avons également caractérisé l’expression de protéines impliquées dans les voies de l'apoptose dans les lésions précurseurs de CEB. L’expression du facteur suppresseur de tumeurs p53 s’est avérée être un marqueur pronostique péjoratif important pour la survie des patients atteints de CNBPC et augmente dès les premières étapes de la tumorigenèse bronchique et même déjà dans l’épithélium morphologiquement normal du fumeur. L'altération de l'expression de p53 est donc un événement très précoce dans la genèse du CEB et la positivité de p53 augmente ensuite avec la sévérité des lésions. Dans le but de caractériser les voies de contrôle de p53 au cours de la carcinogenèse épidermoïde bronchique, nous avons analysé l'expression de 3 autres protéines, MDM2, p14arf et la nucléophosmine (NPM), dans une série de 200 biopsies. L’expression de MDM2, NPM et p14arf est respectivement altérée aux stades de dysplasie légère, modérée et sévère. Au stade de dysplasie sévère, l’expression de p14arf, inhibiteur de MDM2, peut soit disparaître, soit se concentrer dans les nucléoles. Tant la perte de p14arf que sa concentration dans les nucléoles sont associées à une augmentation de l’expression de MDM2. Nous avons également observé que la délocalisation de NPM depuis le nucléoplasme vers le nucléole est hautement corrélée à celle de p14arf. En IF, NPM et p14arf colocalisent dans le nucléoplasme dans les échantillons de bas grade ou dans les nucléoles dans les lésions de haut grade. Par contre, la protéine MDM2 n’est détectée dans les nucléoles quelles que soient les localisations de p14arf ou de NPM et quel que soit le stade. Ces données sont en faveur de l’hypothèse selon laquelle la localisation de p14arf dans les nucléoles empêcherait la formation des complexes p14arf–MDM2 et pourrait ainsi faciliter la carcinogenèse pulmonaire. Nos résultats suggèrent également que la présence de NPM dans le nucléoplasme pourrait jouer un rôle protecteur contre le dommage cellulaire et la transformation maligne tandis que sa délocalisation vers les nucléoles et ce, peut-être par la délocalisation de p14arf, favoriserait la carcinogenèse bronchique. Enfin, suite à la réalisation d’une méta-analyse montrant le rôle de la cyclooxygénase 2 (COX-2) en tant que facteur pronostique dans les CBNPC de stade précoce, l’expression de la protéine COX-2 a été analysée par IHC dans 106 biopsies. Cette étude montre que cette protéine s’accumule exclusivement à partir du stade de dysplasie sévère, permettant ainsi de séparer les lésions bronchiques de bas et de haut grade. Avec une haute valeur prédictive positive (100 %) et une bonne valeur prédictive négative (82,35 %), COX-2 apparaît donc comme un marqueur précoce potentiel à tester pour le dépistage du cancer bronchique.<p><p>En parallèle à ces travaux, nous avons collecté des biopsies fraîchement congelées aux différents stades de la carcinogenèse épidermoïde pour une analyse du transcriptome. La première étape a consisté à définir le profil d’expression génique par la technique des microdamiers. Après son extraction et sa rétrotranscription, l’ARN a été marqué et hybridé sur des lames commercialisées par Agilent Technologies. Au total, 122 échantillons, dont minimum 12 de chaque catégorie, ont été hybridés avec un contrôle commun (issu d’un mélange de biopsies bronchiques normales de non-fumeurs). Une analyse en composante principale a montré que la hiérarchie de la classification histologique était bien représentée par les profils d’expression génique des biospies aux différents stades. Quelle que soit la liste de gènes de départ sélectionnée pour réaliser le regroupement hiérarchisé, nous avons observé, de manière constante et robuste, une différence majeure de profil d’expression génique entre, d’une part, les tissus bronchiques les plus « normaux » (normal normofluorescent, histologiquement normal mais hypofluorescent et hyperplasie) et, d’autre part, toutes les autres catégories histologiques dites « anormales ou modifiées » à partir de la métaplasie jusqu’au carcinome invasif. Parmi les épithéliums bronchiques « modifiés », deux grands groupes se distinguent :d’un côté, les métaplasies et dysplasies légères, qui sont très souvent bénignes et réversibles pour la plupart, et de l’autre côté, les dysplasies sévères, les CIS et les carcinomes invasifs, lésions à risque beaucoup plus élevé d’évoluer vers un cancer ou déjà malignes. Les échantillons au stade de dysplasie modérée se classent tantôt dans le deuxième groupe avec les dysplasies légères tantôt dans le troisième avec les dysplasies sévères. Il semble donc que le stade histologique de la dysplasie modérée soit un groupe hétérogène n’ayant pas de réalité biologique et qu’il serait plus adéquat de les reclasser dans un des 2 autres groupes sur base des arguments moléculaires. Nous avons obtenu les listes de gènes dont l’expression varie de manière statistiquement significative entre les différentes étapes de la carcinogenèse épidermoïde bronchique. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence un profil d’expression génique permettant de discriminer les lésions bronchiques de mauvais pronostic (dysplasies sévères ou plus) de celles de meilleur pronostic (tissu normal et anomalies morphologiques de bas grade). Les gènes qui constituent ce profil permettant d’identifier les lésions de mauvais pronostic sont des candidats pour la détection précoce du cancer bronchique. De plus, nos données de génomique confirment la surexpression de certains ARNs messagers correspondant à des protéines dont la surexpression a été rapportée dans les études d’IHC comme COX-2, MDM2, Ki-67, les cytokératines, les métallopeptidases, les cyclines. Par ailleurs, certaines protéines dont le rôle dans les cancers pulmonaires invasifs a déjà été décrit mais pas aux stades pré-invasifs, parmi lesquelles la protéine PTH-like, des protéines liées à TNF ou d’autres liées à IGF, E2F ou à Wnt, semblent impliquées aux stades précoces de la carcinogenèse épidermoïde bronchique. Enfin, de nouveaux acteurs possibles de ce processus ont été mis en évidence.<p><p>Nous avons également étudié l’évolution de l’expression des microARNs au cours de la carcinogenèse bronchique par des RT-PCR quantitatives (LDA) sur 60 des biopsies dont nous avons étudié le transcriptome (6 par catégorie) et en utilisant la classification en 3 groupes issue des analyses des microdamiers d’expression génique. Cette étude montre que plusieurs miARNs sont différentiellement exprimés durant la carcinogenèse bronchique. De plus, deux étapes successives et distinctes ont été mises en évidence pour l’évolution de l’expression des miARNs au cours de la carcinogenèse bronchique. Aux stades les plus précoces, correspondant à la progression de l’épithélium normal du non-fumeur vers l’épithélium histologiquement normal du fumeur et l’hyperplasie jusqu’au groupe des anomalies morphologiques relativement bénignes (métaplasie, dysplasies légère et modérée), on observe une réduction significative de l’expression de la grande majorité des miARNs. Aux stades plus tardifs de la carcinogenèse (dysplasie sévère, CIS et CEB), même si 74 % des miARNs altérés restent encore régulés négativement par rapport à leur niveau d’expression dans l’épithélium normal du non-fumeur, la proportion de miARNs dont l’expression est augmentée (43 %) s’accroît par rapport à leur niveau d’expression dans les stades qui les précèdent (métaplasie, dysplasies légère et modérée). En outre, lorsque l’on compare ce dernier groupe à celui des lésions plus sévères (dysplasie sévère et CIS), qui progressent fréquemment vers des carcinomes invasifs, 80 % des miARNs augmentent leur niveau d’expression. Par ailleurs, l’expression de certains microARNs évolue de manière linéaire. En particulier, l’expression de miR 34c, cible transcriptionnelle de p53, et celle de miR 15a, inhibiteur de Bcl2, diminuent progressivement entre les différents stades à partir du tissu bronchique normal du non-fumeur jusqu’au CEB. Enfin, les profils d’expression des miARNs permettent de prédire avec précision la classification histologique non seulement entre les lésions de bas grade (métaplasie, dysplasies légère et modérée) et de haut grade (dysplasie sévère et CIS) mais également entre les CIS et les carcinomes invasifs. Les miARNs qui constituent ces signatures sont donc des candidats potentiels pour la détection précoce du cancer bronchique.<p><p>Conclusions<p><p>Nos travaux montrent que les anomalies moléculaires apparaissent aux stades les plus précoces de la transformation maligne de l’épithélium bronchique. L’expression protéique des marqueurs étudiés -p53, MDM2, p14arf, NPM, Ki-67, COX-2, c-erbB-2, et EGFR- permet d’affiner la classification des lésions bronchiques précancéreuses et de mieux comprendre les voies de la carcinogenèse précoce. Les profils d'expression des gènes et des microARNs apportent une approche originale des étapes successives du processus de carcinogenèse épidermoïde bronchique et ont mis en évidence des signatures permettant de discriminer les lésions qui sont à très haut risque de progression vers un cancer invasif ou qui sont déjà néoplasiques de celles de meilleur pronostic. Les marqueurs qui constituent ces profils sont des candidats potentiels pour la détection précoce du cancer bronchique.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / It is believed that papilloma formation is critical to pathogenesis of the upper digestive tract (UDT) squamous cell carcinomas (SCCs) in cattle, the so called papilloma-carcinoma syndrome. Due to the maintenance of papillomas for long periods of time in the UDT, due to immunosuppressive agents in bracken fern (Pteridium aquilinum), the keratinocytes of papilloma become target for carcinogens to promote carcinomatous transformation. Many evidences of the papilloma-carcinoma syndrome were observed in vitro. However, they have not been totally proved in vivo. The objectives of this study were therefore to assess key aspects of the pathogenesis of SCCs of the UDT in cattle naturally grazing in Pteridium aquilinum for long periods of time. For this, 168 initial epithelial lesions of the UDT were evaluated in 60 cattle with alimentary SCCs from areas with bracken fern. Developed papillomas had yielded more than 50% of the studied papillomas, with some in the growing phase (18.5%) and some carcinomatous transformation of papillomas (18.5%). A few papillomas were in regression (9%). The carcinomatous transformation of papillomas may represent morphological evidence of the need for papilloma formation in the development of alimentary SCCs. However, 72 squamous intraepithelial lesions (SILs) were also present in these bovines. Most SILs (70%) were moderate to severe dysplastic lesions and carcinomas in situ, with a significant amount of SCCs in an early stage of development. In humans, similar lesions are found in patients who chronically abuse of alcohol/tobacco. The SILs in the aerodigestive tract of humans are potentially malignant and can evolve to SCCs. The SILs of cattle in this study may therefore represent an alternative pathway for the development of SCCs in the UDT, without the necessity of carcinomatous transformation of papilloma to SCCs. The papillomatous origin of alimentary SCCs was also assessed by immunohistochemistry. Thirty SCCs of the cranial region of the UDT (including the base of tongue, pharynx/oropharynx and epiglottis) were evaluated about the acinar or ductal salivary origin using an anticytokeratin 7/8 antibody specific for simple epithelium. From the 30 SCCs examined, nine had morphological evidences of neoplastic transformation from a salivary duct. One of them was confirmed by immunohistochemistry to be of salivary origin. As papillomavirus requires a stratified epithelium for the formation of the papilloma, a confirmative SCCs from a simple salivary duct suggests that there is also no need of a papilloma to the development of SCCs of the UDT in cattle chronically grazing on bracken fern. In parallel, the degree of immunosuppression by lymphopenia, supposedly necessary for the maintenance of papillomas in the UDT, was evaluated in spontaneous cases of SCCs in the UDT of cattle. Alimentary papillomatosis was observed in all 40 cases studied. However, immunosuppression by lymphopenia was uncommon (three cases) and was not related to the degree of papillomatosis. The absence of lymphopenia in cattle with alimentary papillomatosis indicates that the mechanisms for maintenance of papilloma are not related to the amount of circulating lymphocytes. In conclusion, this study demonstrated an alternative route for the pathogenesis of SCCs in the UDT of cattle chronically poisoned by bracken fern and that the alimentary papillomatosis, observed in such cases, is not associated with lymphopenia. / Segundo a teoria da patogênese da síndrome papiloma-carcinoma, a formação do papiloma é o ponto crucial para o desenvolvimento dos carcinomas de células escamosas (CCEs) no trato alimentar superior (TAS) de bovinos. A partir da sua manutenção por longos períodos no TAS, devido aos imunossupressores presentes na samambaia (Pteridium aquilinum), os ceratinócitos do papiloma em constante multiplicação se tornariam alvos para os carcinógenos da planta promoverem a transformação carcinomatosa. Muitas evidências da síndrome papiloma-carcinoma foram observadas in vitro. No entanto, elas ainda não foram totalmente comprovadas in vivo. Os objetivos deste estudo foram, portanto, avaliar aspectos fundamentais da patogênese da formação dos CCEs no TAS em bovinos que pastoreiam naturalmente por longos períodos áreas altamente infestadas por Pteridium aquilinum. Para isso, 168 lesões epiteliais iniciais foram avaliadas no TAS de 60 bovinos com CCEs alimentares provenientes de áreas com samambaia. Papilomas desenvolvidos perfizeram mais de 50% dos papilomas estudados, com alguns em crescimento (18,5%), em transformação carcinomatosa (18,5%) e poucos em regressão (9%). A transformação carcinomatosa de papilomas pode representar a evidência morfológica da necessidade do papiloma para a formação de CCEs. No entanto, 72 lesões intra-epiteliais escamosas (SILs) também estavam presentes no TAS desses bovinos. A maior parte das SILs (70%) representava lesões displásicas moderadas, acentuadas e CCEs in situ, com quantidade significativa de CCEs em estágio inicial. Em humanos, lesões semelhantes estão presentes em pacientes que abusam cronicamente do álcool/tabaco. As SILs no trato aerodigestivo de humanos são potencialmente malignas e podem evoluir para CCEs. As SILs nos bovinos do presente estudo podem, portanto, representar uma via alternativa de formação de CCEs no TAS, sem a necessidade da transformação do papiloma em carcinoma. A necessidade do papiloma para a formação de CCEs alimentares em bovinos também foi avaliada através da imuno-histoquímica. Trinta CCEs da região cranial do TAS (incluindo base da lingual, faringe/orofaringe e epiglote) foram avaliados quanto à origem acinar ou ductal salivar utilizando-se o anticorpo anti-citoceratinas 7/8 para epitélio simples. Dos 30 CCEs analisados, nove tinham evidências morfológicas de transformação neoplásica proveniente de ducto salivar. Destes, um foi confirmado pela imuno-histoquímica. Como o papilomavírus necessita de estratificação epitelial para a formação do papiloma, a confirmação de CCE de origem ductal salivar simples sugere que também não haja a necessidade do papiloma para o desenvolvimento de CCEs no TAS de bovinos que pastoreiam em samambaia. Paralelamente, o grau de imunossupressão por linfopenia, supostamente necessária para a manutenção dos papilomas, também foi avaliada nos casos espontâneos de CCE no TAS de bovinos de áreas com samambaia. Papilomatose alimentar foi observada em todos os 40 casos estudados. No entanto, imunossupressão por linfopenia foi incomum (três casos) e não estava relacionada com o grau de papilomatose. A ausência de linfopenia em bovinos com papilomatose alimentar indica que os mecanismos para a manutenção dos papilomas não estejam relacionados com a quantidade de linfócitos circulantes. Em conclusão, o presente estudo demonstrou haver uma via alternativa para a patogênese dos CCEs do TAS de bovinos intoxicados cronicamente por samambaia e que a papilomatose alimentar, vista nesses casos, não está associada com linfopenia.

Abstract High risk human papilloma virus (hrHPV) infection is a necessary but not a sufficient cause of cervical cancer. In Finland, since 1990 the incidence of cervical cancer has increased among women younger than 40 years of age despite a nationwide screening programme. In this thesis, the overall objective is to address the role of possible, earlier hrHPV epidemic in this increased incidence of cervical cancer. The target population includes all fertile-aged women in Finland during 1983–2006. The actual study population comprised all women with a minimum of two pregnancies within five years and under 32 years of age in 1983–1997 and under 29 years of age in 1995–2003 identified from the Finnish Maternity Cohort (FMC). From this subpopulation, two subcohorts were selected for hrHPV antibody analysis by random sampling stratified by age and calendar time. All cases of cervical cancer diagnosed for women under 50 years of age during 1983–2002 and 1986–2006 were identified from the Finnish Cancer Registry. The case-cohort design, used for estimating population attributable fractions (PAF) associated with hrHPV, included the cases of cervical cancer and the first subcohort of FMC. A steady annual increase of 0.7% per year in the incidence of HPV16 was estimated to have taken place in Finland from 1983 to 1997 among the 23–31-year-old women with at least two pregnancies. The estimated seroprevalence of HPV16 increased from 17% to 24%, respectively. The PAF of hrHPV exposures in squamous cell carcinoma of the uterine cervix (SCC) was estimated as 73% (95% CI: 13% to 93%). For 26–31-year-old women born in the 1960s and 1970s the incidence of SCC was roughly double compared with women born in the late 1950s. Mathematical modelling indicated that changes in the sexual behaviour partly accounted for the increase seen in the incidence of cervical cancer in the 1990s. The findings of this thesis indicate that growth in the background exposure to HPV16 preceded the increase of incidence of cervical cancer in Finland. At younger birth cohorts, the increase of the incidence of SCC is visible among fertile-aged women in Finland. Whether overall screening starting at 25 years of age, higher participation rate for cervical screening or HPV vaccination of early adolescents is the future solution to lowering the incidence of cervical cancer among young women remains to be seen. / Tiivistelmä Ihmisen papilloomaviruksen (HPV), erityisesti korkean riskin tyypin (hrHPV), aiheuttama infektio on kohdunkaulan syövän välttämätön, mutta ei riittävä syytekijä. Suomessa vuoden 1990 jälkeen kohdunkaulan syövän ilmaantuvuus on valtakunnallisesta seulonnasta huolimatta noussut alle 40-vuotiailla naisilla. Tämän väitöskirjan tavoitteena on osoittaa, mikä rooli mahdollisella aiemmalla hrHPV-epidemialla on kyseiseen kohdunkaulan syövän ilmaantuvuuden kasvuun. Tutkimuksen kohdeväestöön kuuluvat kaikki lisääntymisikäiset suomalaiset naiset. Varsinainen tutkimusväestö koostui kaikista vuosina 1983–97 alle 32-vuotiaana ja vuosina 1995–2003 alle 29-vuotiaana kaksi kertaa raskaana olleista naisista, jotka identifioitiin Suomen äitikohortista (FMC). Tästä joukosta valittiin satunnaisotannalla kaksi alikohorttia hrHPV-laboratorioanalyysejä varten. Kaikki vuosina 1983–2002 ja 1986–2006 kohdunkaulan syöpädiagnoosin alle 50-vuotiaana saaneet naiset poimittiin Suomen syöpärekisteristä. Tapaus-kohorttiasetelma, jota käytettiin hrHPV altistukseen liittyvien väestösyyosuuksien (PAF) estimoinnissa, sisälsi kohdunkaulan syöpätapaukset ja ensimmäisen alikohortin. Suomalaisten 23–31 -vuotiaiden, vähintään kahdesti raskaana olleiden, naisten vuosittainen HPV16-ilmaantuvuus kasvoi tasaisesti 0.7&#160;% per vuosi ajanjaksolla 1983–1997. Vastaavasti HPV16:n vallitsevuus kasvoi 17 prosentista 24 prosenttiin. Kohdunkaulan levyepiteelisyövän hrHPV-altistukseen liittyvän PAF:n estimoitiin olevan 73&#160;% (95&#160;%:n luottamusväli 13–93&#160;%). Levyepiteelisyövän ilmaantuvuus oli suunnilleen kaksinkertainen 1960- ja 1970-luvulla syntyneillä naisilla, heidän ollessaan 26–31 -vuotiaita, verrattuna 1950-luvulla syntyneisiin samanikäisiin naisiin. Matemaattisen mallinnuksen tulosten perusteella kohdunkaulan syövän ilmaantuvuuden nousu 1990- luvulla selittyy ainakin osittain sukupuolikäyttäytymisen muutoksilla. Tämän väitöskirjan tulokset osoittavat, että kasvanut HPV16-virukselle altistuminen edelsi kohdunkaulan syövän ilmaantuvuuden nousua Suomessa. Levyepiteelisyövän ilmaantuvuuden nousu nuorimmissa syntymäkohorteissa on nähtävissä lisääntymisikäisillä naisilla Suomessa. Tulevaisuudessa nähdään, onko seulonnan aloittaminen 25-vuotiaana, korkeampi seulontaan osallistumisosuus vai nuorten aikuisten HPV-rokottaminen ratkaisu nuorten naisten kohdunkaulan syövän ilmaantuvuuden vähentämiseksi.