No description available.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La tasa de maduración in vitro de ovocitos (IVM) caninos ha sido tradicionalmente baja. En el presente estudio se propuso evaluar la IVM de ovocitos caninos considerando el desarrollo folicular desde donde provenían los ovocitos y las etapas del ciclo estral. Los ovocitos se obtuvieron de ovarios de perras ovariohisterectomizadas. Mediante las estructuras ováricas y progesterona plasmática se identificaron los estados del ciclo (Anestro, Proestro/Estro y Diestro) y el desarrollo folicular: preantral, antral chico, antral mediano y antral grande. De cada tamaño folicular se recolectaron ovocitos que se incubaron para maduración por 72 h en medio TCM-199 suplementado. El estado nuclear fue clasificado en vesícula germinal (VG), reinicio meiótico (GVBD) y metafase I y II (MI-MII). Los resultados se analizaron por ANOVA evaluando el estado nuclear de acuerdo al desarrollo folicular y ciclo reproductivo. El desarrollo folicular y estado reproductivo influyeron (P <0.05) en el desarrollo meiótico. Los mayores porcentajes de ovocitos en MI-MII correspondieron a perras en Proestro/Estro y Diestro (P <0.05) y de folículos antrales (P < 0.05). En Anestro, se obtuvo el mayor porcentaje de ovocitos en VG (P<0.05), correspondiendo a ovocitos (P <0.05) de folículos preantrales. La etapa del ciclo estral influenció el desarrollo meiótico independiente del tamaño folicular, siendo Proestro/Estro y Diestro las etapas con mayores tasas de MI-MII. Independiente de la etapa del ciclo, los tamaños foliculares con mayor desarrollo meiótico fueron los ovocitos de folículos antrales, principalmente medianos y grandes, indicando que la procedencia de los ovocitos influye en la capacidad de maduración in vitro. / Canine in vitro maturation rate (IVM) has been traditionally low. In the present study evaluated the IVM of canine oocytes, considering the stage of the follicular development and the phases of the estrous cycles. The oocytes were collected from ovaries from ovariohysterectomized bitches according sizes of developing follicles throughout the estrus cycle. The phases of the estrous cycle (anestrus, proestrous/estrus and diestrus) were assessed by evaluating the presence or absence of follicles and corpus luteum on the ovarian surface and by progesterone analysis. The oocytes were incubated for IVM for 72 h in a supplemented TCM-199. The nuclear development was classified in germinal vesicle (GV), meiotic resumption (GVBD) and metaphase I and II (MI-MII). The results were analyzed by ANOVA. The follicular development and reproductive phase influenced the oocyte meiotic development (P<0.05). The highest rates of oocytes in MI-MII were mostly from dogs in Proestrus/Estrus and Diestrus (P<0.05), in antral stage. In Anestrus, the mayor percentage (P<0.05) of oocytes remained at GV, being mainly at preantral follicles stage (P<0.05). The reproductive phases influenced the meiotic development regardless the follicular size. The oocytes from bitches at proestrus/estrus and diestrus phases showed the highest rates of MI-MII. Independently the reproductive phases, the highest advance in meiotic development were observed in oocytes from antral follicles, mostly medium and large, indicating that the source of oocytes influences the ability of in vitro maturation. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1140658.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / La perra presenta un alto porcentaje de folículos poliovocíticos (FPOs) con respecto a otras especies; sin embargo, se desconoce la capacidad de maduración de los ovocitos provenientes de estos folículos. Este estudio evaluó la maduración de ovocitos provenientes de FPOs in vitro, de acuerdo al estado de desarrollo folicular y de la etapa del ciclo estral de la perra. Se utilizaron ovarios de 64 perras adultas, identificando la etapa del ciclo estral en: anestro, proestro-estro y diestro. Se clasificaron, bajo lupa estereoscópica, distintos estados de desarrollo folicular en: pre-antrales (<300 µm), antrales pequeños (300-490 µm), antrales medianos (500-790 µm) y antrales grandes (>800 µm), separándolos en folículos mono y poli- ovocíticos. Los ovocitos de cada tipo folicular se extrajeron y se incubaron por 72h en TCM-199 suplementado bajo condiciones de cultivo. Posterior al cultivo se evaluó el desarrollo nuclear de los ovocitos previa fijación y tinción nuclear DAPI mediante microscopía de epifluorescencia. El desarrollo meiótico se clasificó en vesícula germinativa (VG), reinicio meiótico (GVBD) y metafase I y II (MI-MII). Los resultados analizados por ANOVA, indicaron que, aunque los ovocitos de FPOs presentaron en general mayor porcentaje de VG en comparación a los de folículos monovocíticos (P <0,05), no hubo diferencias en los porcentajes de MI-MII alcanzados entre los ovocitos provenientes de ambos tipos foliculares a través del desarrollo folicular y etapas del ciclo estral. Esto sugiere que los FPOs son una característica normal de la perra que no afectaría especialmente la maduración in vitro de los ovocitos. / The female dog presents a high percent of multioocyte follicles (MOFs) compared to other species; however, the maturation capacity of the oocytes from these follicles is unknown. The present study evaluated the in vitro maturation (IVM) of bitch oocytes from MOFs according to follicular development and phases of the estrous cycle. Canine oocytes obtained from 64 adult bitches at different phases of the estrous cycle r.g. anestrus, proestrus/estrus and diestrus were classified under stereomicroscope, according to stages of follicular development: pre-antral (<300 µm), small antral (300-490 µm), medium antral (500-790 µm) and preovulatory (>800 µm) and type of follicles: MOFs and unioocytes follicles (UOFs). The oocytes from each type of follicles were incubated for 72 h in TCM-199 medium supplemented under culture conditions. After fixation and DAPI staining, oocytes meiotic development was evaluated by epifluorescence microscopy. Meiotic developmental was classified into germinal vesicle (GV), germinal vesicle break down (GVBD) and metaphase I/II (MI/MII). The result analyzed by ANOVA indicated that although oocytes from MOFs showed mainly higher percentage of VG compared to those UOFs (P<0,05) there was no difference in the MI/MII rates between MOFs and UOFs follicles throughout development and estrus cycle. This suggests that MOFs might be a normal feature in bitches that this might not affect the in vitro oocytes maturation. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1140658.

El objetivo de este trabajo consistió en describir el papel del sistema plasminógeno/plasmina (PLG/PLA) en la fecundación bovina y porcina. Mediante fecundación in vitro, demostramos que la presencia de PLG ó PLA en el medio de coincubación de los gametos disminuía la penetración de los espermatozoides en los ovocitos y su unión a la zona pelúcida (ZP). Esta disminución no se debía a alteraciones de la funcionalidad espermática ni a cambios en la resistencia de la ZP a la proteolisis, sino a que la PLA provocaba la liberación de los espermatozoides adheridos a la ZP. Mediante inmunofluorescencia indirecta detectamos la presencia de PLG y sus activadores en la ZP y en el oolema de los ovocitos antes de la fecundación. Tras la fecundación, dicha presencia disminuyó o desapareció por completo, por lo que proponemos que el sistema PLG/PLA se activa durante la interacción espermatozoide-ovocito y contribuye a regular la polispermia. / The aim of this study was to describe the role of the plasminogen/plasmin system (PLG/PLA) in bovine and porcine fertilization. Through in vitro fertilization, we demonstrated that the presence of PLG or PLA in the incubation medium of gametes decreased penetration of oocytes and sperm binding to the zona pellucida (ZP). This decrease was not due to alterations in sperm function or changes in the ZP resistance to proteolysis, but the PLA caused the release of sperm previously bound to the ZP. By indirect immunofluorescence we detected the presence of PLG and its activators in the ZP and oolema of the oocytes before fertilization. After fertilization, this presence diminished or disappeared completely, so we propose that the PLG/PLA system is activated during sperm-oocyte interaction and contributes to the regulation of polyspermy.

La tetracaína (Ttc), cuyas moléculas en solución fisiológica se encuentran mayoritariamente (97 %) en forma protonada, bloquea la corriente (IACh) evocada por acetilcolina (ACh) en ovocitos a los que se ha microtrasplantado receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) de la electroplaca de Torpedo marmorata. El bloqueo del nAChRm por Ttc fue muy potente, en el rango submicromolar (IC50= 0.5 μM) y reversible, recuperándose las respuestas a valores control tras un periodo de varios minutos. A concentraciones tan bajas como 0.1 μM, la Ttc ejerció un bloqueo que fue dependiente de voltaje, indicando que ejerce un bloqueo a canal abierto. El sitio de unión se pudo determinar en el interior del canal mediante técnicas de acoplamiento molecular. A concentraciones mayores (0.7 μM) se pudo observar un mecanismo de bloqueo distinto, a canal cerrado, que es independiente de voltaje y que se puede explicar por la unión de la Ttc a lugares situados en el ECD del nAChRm, que fueron determinados en los experimentos de docking virtual. Además, a esta concentración la Ttc aceleró la cinética de desensibilización de la IACh, cuando las células se mantuvieron en presencia sostenida del agonista. Esta se evocó cuando se co-aplicó la Ttc junto a la ACh a potenciales negativos. Por el contrario, cuando solamente se pre-aplicó la Ttc (aplicación previa a la de ACh), o cuando se co-aplicó a potenciales positivos, no se modificó la cinética de desensibilización, a pesar de que sí hubo una cierta inhibición de la IACh. Estos experimentos permitieron determinar que el sitio de unión de la Ttc que acelera la desensibilización se encuentra en el interior del canal. El ensayo de docking permitió localizar los residuos a los que su une la Ttc dentro del canal a altas concentraciones (con menor afinidad), que es más superficial que el implicado en el bloqueo a canal abierto. El lugar de unión determinado por anclaje virtual incluye la interacción de Ttc con αE262, γN224, γK271, y γE274, residuos que han sido previamente involucrados en el proceso de activación y desensibilización (Bouzat y cols., 2008; Forman y cols., 2007). El otro anestésico local (LA) estudiado, la benzocaína (Bzc), no posee carga al pH al que se efectúan los registros electrofisiológicos. La Bzc, al igual que la Ttc, inhibió la IACh, pero con una potencia menor, en el rango submilimolar y, a diferencia de la Ttc, su bloqueo fue independiente de voltaje. A pesar de mediar un bloqueo independiente de voltaje, la Bzc, evoca una corriente de rebote (IRb), similar a la que median moléculas que ejercen un bloqueo de canal abierto, sugiriendo que la Bzc podría estar uniéndose en el interior del canal. Otro efecto destacado de la Bzc sobre el nAChRms fue la aceleración de la desensibilización, haciéndola marcadamente más rápida incluso a potenciales positivos (a diferencia del efecto mediado por la Ttc). Además, se observó que, tras su pre-aplicación, la cinética de activación de la IACh se enlenteció y hubo un bloqueo de nAChRs, a canal cerrado, cuya recuperación fue especialmente lenta. Los efectos de ambos LAs fueron muy diferentes sobre los GABAAR. Así, la Ttc apenas tuvo efectos sobre este receptor, incluso a una concentración 10 veces superior a la IC50 determinada para el nAChRm. Por el contrario, la Bzc, aplicada a concentraciones similares a las que inhiben la IACh, aumentó la desensibilización y evocó una IRb similar a la observada en los nAChRs. Adicionalmente, la Bzc tuvo efectos sobre otros canales, como el ClC-0 y el CaCC. En relación con la Bzc, es interesante destacar que debido a su estructura química tiene una muy baja solubilidad al agua y, por tanto, debe solubilizarse en solventes como el etanol (EtOH) o el DMSO. Debido a que estos solventes pueden no ser totalmente inertes se probaron, en las mismas condiciones experimentales. No observándose efectos sobre los nAChRms.

En un intento de optimizar el sistema de fecundación in vitro en la especie porcina se estudió la influencia de distintas condiciones de maduración y de cocultivo de los gametos. Se evaluó la reducción del tiempo de coincubación de los gametos a 10 min observándose un claro efecto del ratio espermatozoides:ovocito. El estudio de las necesidades de los espermatozoides en términos de aditivos del medio de fecundación y tiempo de coincubación reveló variaciones entre verracos. La utilización de un tiempo de coincubación tan corto como 2 min fue suficiente para obtener unas tasas de penetración y monospermia similares a las alcanzadas por los sistemas de FIV tradicionales. El sistema de FIV en pajuela con 10 min de coincubación aumentó la penetración monoespérmica y mejoró la calidad de los blastocistos. La adición de 5 nM de 9- cis ácido retinoico al medio de maduración aumentó significativamente la formación de blastocistos. / The present study was conducted in an attempt to optimize porcine in vitro fertilization system. For this purpose, the influence of maturation and gamete coculture conditions were studied. The coincubation time may be reduced to 10 min to increase the efficiency of fertilization depending on the sperm:oocytes ratio. The needs of boar spermatozoa for IVF, in terms of additives to IVF medium and coincubation times vary among boars. The use of coincubation time as brief as 2 min is long enough to obtain good fertilization rates similar to those achieved from current long term exposure times in IVF. A straw IVF system in combination with a 10 min coincubation increased monospermic penetration and the quality of blastocysts compared with the microdrop-IVF system. The addition of 5 nM of 9- cis retinoic acid in the IVM medium increased blastocyst formation rate, suggesting that RA may play an important role during IVM.