Antecedentes & Objetivos: A produção de oxidação ocorre naturalmente no organismo via processos fisiológicos, entretanto, frente a situações patológicas verifica-se um desequilíbrio entre a oxidação e a antioxidação, ocasionando estresse oxidativo (EO). Estudos demonstram maiores níveis de EO associados a diversas doenças, incluindo a doença periodontal (DP) e a doença renal crônica (DRC). O objetivo do presente estudo foi avaliar o impacto da DP sobre os níveis de EO em doentes renais crônicos pré-dialíticos. Materiais e Métodos: Dados demográficos, socioeconômicos e de histórico médico de 139 pacientes do Serviço Nefrologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) foram obtidos por meio de entrevista e análise de prontuário. Foram realizados exames clínicos periodontais e coleta sanguínea e salivar. Associações entre a condição periodontal e níveis séricos e salivares de marcadores de estresse oxidativo foram avaliadas, através de antioxidação total (FRAP) e sulfidrilas. Também foi avaliada correlação entre os níveis séricos e salivares de antioxidação total. Resultados: Médias de profundidade de sondagem estiveram significativamente associadas a maiores níveis séricos de sulfidrilas (p=0,04), quando ajustados para sexo e atividade física. Não foi observada associação significativa com os outros parâmetros séricos ou salivares de EO. Os níveis salivares de FRAP estiveram significativamente associados aos seus níveis séricos (R²= 0,23, p<0,001). Conclusões: A concentração salivar de FRAP explica aproximadamente 23% dos seus níveis séricos, utilizando modelos ajustados. Pacientes com maiores médias de profundidade de sondagem apresentaram maiores níveis séricos de sulfidrilas. Análises adicionais, avaliando também oxidação e dano proteico, proporcionarão dados para uma melhor compreensão do processo oxidativo nessa mesma amostra. / Background & Aims: The oxidation occurs naturally through physiological activities, but in pathological states an imbalance between oxidation and antioxidation is observed, resulting in oxidative stress (OS). Studies have shown higher levels of OS associated with several diseases, including periodontal disease (PD) and chronic kidney disease (CKD). The aim of the present study was to evaluate the impact of PD on OS levels in chronic pre-dialytic renal patients. Materials & Methods: Demographic, socioeconomic and medical history data of 139 patients from the Department of Nephrology of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) were obtained through interview and medical records. Periodontal clinical examinations and salivary and blood collection were performed. Associations between periodontal status and serum and salivary levels of total antioxidation (FRAP) and sulfhydryl were evaluated, as well as a correlation between serum and salivary levels of total antioxidation. Results: Higher probing depth means were significantly associated with serum sulfhydryl levels (p = 0.04) when adjusted for sex and physical activity. No significant association was observed with other serum or salivary OE markers. The salivary levels of FRAP were significantly associated with serum FRAP levels (R² = 0.23, p <0.001). Conclusion: FRAP salivary levels accounts for approximately 23% of FRAP serum levels using multivariate models. Higher probing depth means were associated with higher serum levels of sulfhydryl. Further analysis evaluating oxidation and protein damage will provide data for a better understanding of the oxidative process in this sample.

O acidente vascular encefálico (AVE) é uma doença comum e de grande impacto para a saúde da população, uma vez que é considerado a principal causa de incapacidades neurológicas, principalmente motora e cognitiva. Considerando que os exossomos e o seu conteúdo podem ser marcadores prognóstico de demência em pacientes com Doença de Alzheimer, avaliamos o perfil exossomal circulante em pacientes pós AVE isquêmico com e sem comprometimento cognitivo. Ainda, é de conhecimento que os pacientes tratados com trombolíticos apresentam redução na dependência funcional a longo prazo, assim é de interesse avaliar os exossomos periféricos destes pacientes. Este trabalho visou investigar o perfil de exossomos circulantes em pacientes após diagnóstico de AVE isquêmico (AVEI) nas fases aguda e crônica. Foram determinados o conteúdo de proteína total e a atividade da acetilcolinesterase (AChE), marcadores de exossomos, além de correlacionar escores de comprometimento neurológico com os parâmetros bioquímicos. Ainda, considerando que o estresse oxidativo tem um papel central na fisiopatologia da isquemia cerebral, determinamos o conteúdo de espécies reativas e a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) em exossomos circulantes. Os fatores comprometimento cognitivo e o uso do trombolítico na fase aguda da doença não mostraram ter influência sobre os parâmetros estudados. Os resultados sugerem que uma diminuição de exossomos circulantes, já que houve uma redução na quantificação de proteínas totais na fase crônica, pode sugerir um prejuízo no sistema de remoção de materiais tóxicos levando ao acúmulo de materiais indesejados disso, o estado oxidativo exossomal, representado pelos níveis de espécies reativas e a atividade da SOD, foi alterado na fase crônica quando comparado com a fase aguda. Estes resultados sugerem que há uma alteração do perfil dos exossomos ao longo do tempo nos pacientes com AVE isquêmico. Nossos dados indicam que os níveis de espécies reativas na fase aguda podem predizer alterações no perfil dos exossomos na fase crônica de pacientes com comprometimento cognitivo, especificamente nas atividades das enzimas SOD e AChE e na concentração de proteínas totais. Estas associações não foram observadas em pacientes sem comprometimento cognitivo. Correlacionamos os parâmetros bioquímicos com as escalas de déficit neurológico, os escores do Mini-Exame do Estado Mental (MEEM) foram inversamente proporcionais aos níveis de AChE naqueles pacientes que não receberam o tratamento trombolítico na fase aguda. Assim, nossos dados demonstram que o prejuízo cognitivo (menores escores de MEEM) está associado a maiores níveis de atividade da AChE em exossomos circulantes. O papel dosexossomos na fisiopatologia da isquemia cerebral, assim como na predição de diagnóstico de comprometimento cognitivo precisa ser melhor investigado. / Stroke is a common disease and has a major impact on the public health, since it is considered the main cause of neurological disabilities, mainly motor and cognitive impairment. Considering that exosomes’ content may be prognostic markers of dementia in patients with Alzheimer's disease we evaluated the circulating exosomal profile in patients with ischemic stroke with and without cognitive impairment. Furthermore, it is known that thrombolytic therapy reduces long-term disability, so it is interesting to evaluate the peripheral exosomes of these patients. This work aimed to investigate the profile of circulating exosomes in patients after diagnosis of ischemic stroke in the acute and chronic phases. Total protein content and acetylcholinesterase activity (AChE), markers of exosomes were determined, also it was correlated the scores of cognitive function tests with biochemical parameters. Considering that oxidative stress plays a central role in the pathophysiology of cerebral ischemia, we determined the content of reactive species and the activity of the superoxide dismutase enzyme (SOD) in circulating exosomes. The factors cognitive impairment and the use of thrombolytic in the acute phase of the disease did not show influence on the studied parameters. The results suggest that a decrease in circulating exosomes, since there was a reduction in the quantification of total proteins in the chronic phase, may suggest a damage in the system of removal of toxic materials leading to the accumulation of unwanted materials. The exosomal oxidative state, represented by the reactive species levels and the SOD activity, was altered in the chronic phase when compared to the acute phase These results suggest that the profile of the exosomes is altered over time in patients with ischemic stroke. Our data indicate that reactive species levels in the acute phase may predict changes in the exosome profile in the chronic phase of patients with cognitive impairment, specifically in the activities of SOD and AChE enzymes and in the concentration of total proteins. These associations were not observed in patients without cognitive impairment. We correlated the biochemical parameters with the the scores of the assessment of cognitive function tests, the Mini-Mental State Examination (MMSE) scores were inversely proportional to the AChE levels in those patients who did not receive the thrombolytic treatment in the acute phase. Thus, our data demonstrate that cognitive impairment (lower MMSE scores) is associated with higher levels of AChE activity in circulating exosomes. The role of exosomes in the pathophysiology of cerebral ischemia, as well as in the prediction of diagnosis of cognitive impairment, needs to be better investigated.

Introdução: A acidemia 3-hidroxi-3-metilglutárica é causada pela deficiência da 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA-liase, uma enzima do metabolismo da leucina, levando ao acúmulo, especialmente, do ácido 3-hidroxi-3-metilglutárico nos tecidos. Estudos sugerem que o estresse oxidativo pode contribuir para os danos neurológicos observados em algumas acidúrias orgânicas. Objetivo: Avaliar parâmetros de estresse oxidativo em pacientes com acidúria 3-hidroxi-3-metilglutárica antes e após o tratamento. Materiais e Métodos: Amostras de sangue e urina foram coletadas de pacientes no momento do diagnóstico e após tratamento com dieta com restrição de proteínas e suplementação de L-carnitina (100mg/kg/dia) e de controles. O TBA, um subproduto final da peroxidação lipídica, foi medido no plasma. A determinação do teor de carbonilas e de grupos sulfidrila, marcadores de dano oxidativo a proteínas, foi realizada no plasma. Para avaliar na urina a oxidação de proteínas, os níveis de di-tirosina foram medidos por autofluorescência. O ensaio da capacidade antioxidante urinária foi realizado utilizando um kit comercial. Os níveis de carnitina livre e isovalerilcarnitina foram analisados em amostras de sangue por espectrometria de massas em tandem usando o método de monitorização de reação múltipla (MRM). A concentração de proteínas foi determinada pelo método de biureto em amostras de plasma usando um kit comercial. Resultados e Discussão: Os resultados demonstraram um aumento significativo nos níveis de isovalerilcarnitina em sangue total, das concentrações plasmáticas de malondialdeído e urinárias de di-tirosina, além de uma redução significativa da capacidade antioxidante urinária e dos níveis sanguíneos de carnitina livre nos pacientes no momento do diagnóstico em relação aos controles. Verificou-se uma diminuição nas concentrações do malondialdeído plasmático e da di-tirosina na urina dos pacientes tratados, o que sugere um efeito de proteção do tratamento sobre a peroxidação de lípidos e do dano oxidativo a proteínas, bem como uma normalização dos níveis de L-carnitina durante o tratamento. Conclusões: Esses resultados permitem sugerir que o estresse oxidativo ocorre em pacientes com acidemia 3-hidroxi-3-metilglutárica e que o tratamento com a dieta restrita de proteína e suplementada com L-carnitina pode oferecer proteção contra o dano oxidativo a biomoléculas. / Introduction: The 3-hydroxy-3-methylglutaric acidemia is caused by the deficiency of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA lyase, an enzyme of leucine metabolism, leading to accumulation of 3-hydroxy-3-methylglutaric acid in tissues. Studies have suggested that oxidative stress may contribute to the neurological damage observed in some organic acidurias. Objective: Evaluate oxidative stress parameters in patients with 3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria patiets before and after treatment. Materials and Methods: Blood and urine samples were collected from patients at diagnosis and after treatment with restricted protein diet and supplemented with L-carnitine (100mg/kg/dia) and from controls. TBA , an end subproduct of lipid peroxidation, was measured in plasma. Determination of carbonyl and sulphydryl content, biomarkers of oxidative damage to proteins, was done in plasma. To assess urine protein oxidation, levels of di-tyrosine were measured by autofluorescence. The assay of antioxidant urinary capacity was performed using a commercial kit. The levels of free carnitine and isovalerylcarnitine were analyzed in blood samples by tandem mass spectrometry using the method of multiple reaction monitoring (MRM). Protein content was determined by the biuret method for plasma samples using a commercial kit. Results and Discussion: The results demonstrated a significant increase of total blood isovalerylcarnitine, malondialdehyde plasma concentrations and di-tyrosine urinary levels and a significant reduction of the urinary antioxidant capacity and free-carnitine blood levels in pacients at diagnosis compared to controls. It was verified a decrease in plasma malondialdehyde concentrations and urinary di-tyrosine levels in treated patients, suggesting a protective effect of the treatment on lipid peroxidation and protein oxidative damage, as well as a normalization of L-carnitine levels during treatment. Conclusions: These results allow to suggest that oxidative stress occurs in 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA lyase deficient patients and treatment with restricted protein diet and L-carnitine may offer protection against oxidative damage.

Introdução: A lesão de isquemia e reperfusão (I/R) intestinal pode causar danos celular e tecidual local e em órgãos a distância. Alguns fatores podem estar envolvidos nesses processos, tais como: a geração de espécies reativas de oxigênio, mediadores inflamatórios, óxido nítrico (NO) e estresse do retículo endoplasmático (RE). Devido ao envolvimento do estresse oxidativo nas lesões de I/R intestinal, algumas opções terapêuticas com antioxidantes estão sendo estudadas e testadas nas lesões de I/R intestinal. Objetivo: Avaliar o efeito local e sistêmico da glutamina no intestino e fígado de animais submetidos à I/R intestinal. Métodos: Foram utilizados 20 ratos wistar machos divididos em quatro grupos: Sham operated (SO), Glutamina+Sham operated (G+SO), Isquemia e reperfusão intestinal (I/R); Glutamina+Isquemia e reperfusão intestinal (G+I/R). Os animais foram anestesiados e, após, realizada a laparotomia mediana e identificação da artéria mesentérica superior. A artéria foi clampeada por 30 e após esse tempo, os animais foram mantidos por mais 15 minutos em reperfusão intestinal. A glutamina foi administrada por via intraperitoneal, na dose de 25 mg/Kg diluída em 1 mL de solução fisiológica. O tratamento foi realizado uma vez ao dia, durante 48 horas antes da indução da isquemia. Foram realizadas análises séricas para a função de integridade hepática através das enzimas aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (FA) e danos ao DNA pelo ensaio cometa. Realizamos a análise histológica dos tecidos através da coloração de Hematoxilina-Eosina e imunohistoquímica para avaliar a quantidade de células marcadas com os anticorpos monoclonais IL-1β, IL-6, TNF-α e NF-B no intestino e fígado. O homogeneizado do intestino e fígado foram utilizados para a avaliação dos níveis de lipoperoxidação (LPO) através das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), avaliação da atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx), determinação dos níveis de glutationa (GSH), avaliação dos metabólitos do óxido nítrico (nitritos/nitratos) e para as análises moleculares das proteínas iNOS, NF-B, Nrf2, Keap1, SOD, NQO1, HSP70, GRP78 e ATF-6 por Western Blot. Resultados: O pré-tratamento com glutamina reduziu os níveis de LPO, óxido nítrico, danos ao DNA, bem como as enzimas de integridade hepática. Observamos que a glutamina foi eficaz na preservação da arquitetura tecidual do intestino e fígado dos animais submetidos a I/R intestinal, reduzindo parâmetros como infiltrado inflamatório, perda das vilosidades intestinais e necrose. Constatou-se que a glutamina ativou a via do Nrf2 e as enzimas antioxidantes, reduziu o dano celular, e inibiu o estresse do RE, além de reduzir os mediadores do processo inflamatório. Conclusão: Neste estudo, sugerimos que o pré-tratamento com a glutamina desempenhou um papel protetor tanto no intestino como no fígado dos animais submetidos a I/R intestinal, demonstrado pelas análises estudadas, possivelmente pela sua ação antioxidante e anti-inflamatória. / Background: Injury by intestinal ischemia and reperfusion (I/R) can cause local and cellular damage to tissues and organs at distance. Some factors may be involved in those processes, such as the generation of reactive oxygen species, inflammatory mediators, nitric oxide (NO) and endoplasmic reticulum stress. Due to the involvement of oxidative stress in intestinal I/R lesions, some therapeutic options with antioxidants are being studied and tested in order to reduce these damages. Objective: To evaluate the local and systemic effect of glutamine in the intestine and liver of animals submitted to intestinal I/R. Methods: Twenty male Wistar rats were divided into four groups: Sham operated (SO), Glutamine+Sham operated (G+SO), Intestinal Ischemia and reperfusion (I/R); Glutamine+intestinal ischemia and reperfusion (G+I/R). The animals were anesthetized and after we performed the median laparotomy and identification of the superior mesenteric artery. The artery was clamped for 30 minutes and after that the animals were maintained for another 15 minutes in intestinal reperfusion. Glutamine was administered intraperitoneally at a dose of 25 mg/kg diluted in 1 ml of saline solution. Treatment was performed once daily for 48 hours prior to induction of ischemia. Serum samples for hepatic integrity were collected, and the enzymes aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and alkaline phosphatase (FA) were accessed. DNA damage was evaluated by the comet assay. We performed the histological analysis of the tissues through the staining of Hematoxylin-Eosin and immunohistochemistry, in order to evaluate the amount of cells labeled with the monoclonal antibodies IL-1β, IL-6, TNF-α and NF-B in the intestine and liver. The intestinal and liver homogenates were used to evaluate the levels of lipoperoxidation (LPO) through thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), evaluation of the activity of antioxidant enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx), determination of glutathione levels (GSH) and nitric oxide (nitrites/nitrates), and for the molecular analyzes of the iNOS, NF-B, Nrf2, Keap1, SOD, NQO1, HSP70, GRP78 and ATF-6 proteins we performed Western blot analysis. Results: Pretreatment with glutamine reduced levels of LPO, nitric oxide, DNA damage, as well as liver integrity enzymes. We observed that glutamine was effective in preserving the intestinal and liver tissue architecture of animals submitted to intestinal I/R, reducing parameters such as inflammatory infiltrate, loss of intestinal villi and necrosis. It was found that glutamine activated the Nrf2 pathway and antioxidant enzymes, reduced cell damage, and inhibited endoplasmic reticulum stress in addition to reducing mediators of the inflammatory process. Conclusion: In this study, we suggest that pretreatment with glutamine played a protective role in both intestine and liver of animals submitted to intestinal I/R, demonstrated by the present analyzes, possibly for its antioxidant and anti-inflammatory action.

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) correspond à un groupe de maladies qui se caractérise par une obstruction vasculaire suite à une vasoconstriction excessive, une prolifération cellulaire et la création de thromboses in situ, conduisant à une augmentation progressive des résistances vasculaires pulmonaires puis au décès. De nombreuses avancées dans la prise en charge de l’HTAP ont été réalisées ces dernières années avec la mise à disposition de médicaments principalement vasodilatateurs. Cependant, aucun de ces médicaments n’est curatif de la maladie témoignant de la nécessité à obtenir de nouvelles thérapeutiques. Des molécules axant leur effet sur la lutte contre la prolifération cellulaire liée à l’activation des récepteurs à tyrosine-kinases (RTK) ou le stress oxydant (SO) paraissent aujourd’hui comme de potentielles innovations thérapeutiques dans l’HTAP. Cependant, à l’heure actuelle, les données sur le SO dans l’HTAP sont trop peu détaillées pour cibler correctement cette voie physiopathologique. De même, les inhibiteurs de tyrosine-kinases ont montré un bénéfice dans la prise en charge de l’HTAP mais associé à des effets indésirables graves tels qu’une toxicité cardiaque. Dans ce travail, nous avons approfondi le mécanisme d’action du SO dans la physiopathologie de l’HTAP et complété l’identification des RTK dans le remodelage vasculaire pulmonaire afin de permettre la mise au point de thérapeutiques efficaces avec un rapport bénéfice risque favorable pour le patient. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) corresponds to a group of diseases characterized by a vascular obstruction due to vasoconstriction, cellular proliferation and in situ thrombosis, leading to a progressive increase in pulmonary vascular resistances. New knowledge in the PAH management were performed in the last few years, specifically for vasodilators. However, none of those treatments cure the disease and new drugs are still needed. Molecules targeting cellular proliferation induced by tyrosine kinases receptors (TKR) activation or oxidative stress (OS) seem to be potential therapeutic innovations. However, knowledge on OS in PAH is not enough accomplished in PAH to target accurately this pathophysiologic pathway. Similarly, tyrosine kinase inhibitors have shown efficacy in PAH management but associated with severe adverse events as cardiac toxicity. In this study, mechanism of action of OS in pathophysiology of PAH was detailed and identification of TKR involved in vascular remodeling was completed in order to find efficient therapeutics with a favorable risk benefit ratio for PAH patient.

L'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une technique d’imagerie très utilisée de nos jours, notamment pour le diagnostic médical. L’utilisation d’agents de contraste lors d’un examen IRM permet d’obtenir des images de bonne qualité. Cependant, le manque de sensibilité de cette technique d’imagerie a conduit à l’utilisation d’espèces hyperpolarisées (3He, 13C, 129Xe) en IRM. Le xénon (Xe) apparait aujourd’hui comme un composé très prometteur pour de telles applications mais son manque de sélectivité rend l’imagerie moléculaire impossible. Le développement et l’utilisation de molécules cages capable d’encapsuler le xénon et de l’amener vers la cible à imager est donc indispensable. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés au cours de cette thèse à l’élaboration de telles molécules, et plus précisément, à l’obtention de nouveaux cryptophanes qui présentent la plus forte affinité pour le xénon afin de pouvoir utiliser ces molécules en tant qu’outils pour l’IRM Xe. Une nouvelle voie de synthèse du cryptophane ayant la plus grande affinité pour le xénon a été mise au point ; ce composé a été fonctionnalisé pour la première fois au laboratoire et ceci dans le but d’obtenir les premières biosondes dérivées de composé. Le greffage d’antenne de reconnaissance sur ces biosondes permettrait alors de faire de l’imagerie ciblée. Une sonde pour la détection du peroxyde d’hydrogène (H2O2) a été synthétisée. Le peroxyde d’hydrogène est impliqué dans le développement de stress oxydant cellulaire et présent en ces de maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer). La sonde obtenue a permis d’imager H2O2 par IRM Xe pour la première fois. Un hybride composé de nanotube de carbone et de cryptophanes a aussi été synthétisé en vue de disposer d’outil présentant une forte concentration de cryptophanes et d’améliorer la sensibilité de la technique d’imagerie utilisant du xénon. / Magnetic Resonance Imaging (MRI) is widely used today for early medical diagnosis. During the MRI examination, the use of contrast agent allows the obtention of well resolved images. However the lack of sensibility of this technic lead to the utilization of hyperpolarized species (3He, 13C, 129Xe) in MRI. The xenon (Xe) is the more promising but due to its weak selectivity, it cannot be used in molecular imaging. So, the development and utilization of host molecules able to encapsulate the xenon and bring it to a targeted biological tissue or organ is necessary. In these conditions, during this thesis, we worked on the elaboration of such molecules, and particularly, in cryptophanes since these compounds have strong affinity for xenon and could be used as tools for MRI by hyperpolarized xenon (Hp Xe). A new route synthesis of cryptophane-111, that has the highest affinity for xenon, was developed; first functionalized derivatives of this compound have been also obtained in order to obtain the first biosensors based on cryptophane-111. The coating of specific ligand on these functionalized compounds could allow targeted MRI. A probe for hydrogen peroxide (H2O2) detection was synthesized. Hydrogen peroxide is implicated in cellular oxidative stress and present in case of neurodegeneratives diseases (Parkinson, Alzheimer). The probe obtained allowed the imaging of H2O2 by MRI Xe for the first time. Nanotubes functionalized with strong concentration of cryptophane have been synthesized in order to increase the sensitivity of the imaging technic that uses xenon.

Le génome est sans cesse menacé dans sa structure par des stress génotoxiques d’origine endogène (stress oxydant, blocage de la réplication…) ou exogène (irradiations, produits chimiques, métaux lourds…). La voie de réponse aux dommages de l’ADN coordonne un réseau d’événements en cascades qui incluent les points de surveillance du cycle cellulaire, la réplication/réparation/recombinaison de l’ADN et la mort cellulaire programmée. Ces voies collaborent pour assurer la transmission fidèle du génome et empêcher la prolifération des cellules qui aurait accumulé des altérations génétiques. En général, des défauts dans une de ces voies entraînent un changement de sensibilité aux agents génotoxiques, une instabilité génétique et une prédisposition au cancer. La recombinaison homologue (RH) est une voie essentielle pour la réparation de l’ADN ; elle joue un rôle fondamental dans le maintien de la stabilité du génome. Le stress oxydant, résultant d’une augmentation de la concentration intracellulaire de ERO, est une des causes majeures de dommages aux lipides, aux protéines et à l’ADN et pour cela, il représente un défi pour la survie cellulaire et pour la stabilité du génome. Les ERO apparaissent physiologiquement lors de la respiration cellulaire ou résultent d’un stress environnemental, comme l’exposition aux radiations UV ou agents chimiques oxydants. Elles contribuent à certains processus comme la croissance cellulaire, l’activité et au repliement des protéines, la sénescence et la mort cellulaire programmée. Il est important de souligner qu’un état redox altéré est souvent associé à un fonctionnement anormal des cellules, comme il est observé pour les cellules cancéreuses et les cellules sénescentes. L’objectif de ce projet a été d’analyser l’interface entre les voies DDR et SAPK (Stress activated protein kinase) évolutivement conservées et d’en étudier les conséquences sur la stabilité du génome en utilisant comme organisme modèle la levure à fission. Nos résultats montrent que la voie SAPK joue un rôle sur la RH en promouvant la phosphorylation de Rad52, une protéine impliquée dans différentes sous-voies de la RH. Nous avons aussi montré que Rad52 est phosphorylée sur différents acides aminés, parmi lesquels certains sont les cibles de kinases inconnues qui n’ont aucun lien avec la voie SAPK. Nous avons observé que Rad52 est phosphorylée soit après un stress oxydant, soit dans des cellules génétiquement sujettes à des perturbations de la RH. Nous avons identifié deux sites de phosphorylation de la protéine Rad52, dont un seul est dépendant de la voie SAPK. En étudiant la phosphorylation de Rad52 dans les cellules invalidées pour la voie SAPK ou mutées pour un des sites de phosphorylation de Rad52, nous avons pu montrer que la RH est modulée par la voie SAPK même en absence de insulte externe. Notre travail ouvre le chemin vers une nouvelle compréhension des mécanismes fondamentaux du maintien de l’intégrité du génome. / Genomes are routinely submitted to injuries from either endogenous stress (oxidative stress, DNA replication block…) or from exogenous sources (radiations, chemicals, heavy metals…). The DNA damage response (DDR) coordinates a network of pathways including cell cycle checkpoints, DNA replication/repair/recombination, and programmed cell death, ensuring faithful genome transmission and preventing from the proliferation of cells bearing genetic alterations. Defect in one of these pathways generally results in altered sensitivity to genotoxins, genetic instability and cancer predisposition. Homologous recombination (HR) is an essential DNA repair pathway playing pivotal role to maintain genome stability.Oxidative stress, resulting from increased intracellular concentration of ROS, is one of the major causes of lipid, protein and DNA damage, and therefore a challenge for cell survival and genome stability. ROS are generated physiologically as by-products of cellular respiration, or as result of environmental stresses, such as exposure to solar UV radiations or to oxidant chemicals, and they actively participate in processes such as cellular growth, protein activity and folding, senescence and programmed cell death. It is noteworthy that an altered redox homeostasis is often associated to abnormally functioning cells, such as cancer and senescent cells. The aim of this project was to study the interface between two major evolutionarily conserved pathways, DDR and SAPK (Stress activated protein kinase) and the consequences on genome stability using fission yeast as a model organism. We report data showing that SAPK pathway impinges on HR by promoting phosphorylation of Rad52, a key protein involved in all sub-pathways of HR. We also revealed that Rad52 is phosphorylated at multiple different sites some of which are substrate for unidentified kinases unrelated to the SAPK pathway. Rad52 phosphorylation occurs either after oxidative stress or in cells genetically prone to HR perturbation. We identified two sites of phosphorylation, one of which is dependent on functional SAPK pathway. By studying Rad52 phosphorylation in cells mutated in the SAPK pathway or mutated at the Rad52 site of phosphorylation, we showed that HR is modulated by SAPK even in the absence of external insults. Our work pave the way to a novel understanding of fundamental mechanisms required for genome integrity maintenance.

O carcinoma de células escamosas de cavidade bucal tem alta prevalência e índice de mortalidade considerável entre as principais neoplasias malignas. Acredita-se que carcinógenos químicos promovem a carcinogênese através de danos oxidativos e mutações genéticas, entre outros mecanismos. O organismo evita o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs), ou seja, o estresse oxidativo, através da produção endógena de antioxidantes como o -tocoferol, o retinol e a glutationa. Diversos estudos têm demonstrado que a administração de glutamina pode aumentar a produção de glutationa, proteger células de danos oxidativos e alterações genéticas, e, assim, inibir ou retardar a carcinogênese. Esse aminoácido é considerado um agente quimiopreventivo por atuar em alvos moleculares e celulares específicos, no processo de inflamação ou transdução de sinais, além de induzir atividade de enzimas de detoxificação e suprimir proliferação celular. O protocolo de indução de carcinogênese bucal induzida por DMBA, dimetilbenzantraceno dilúido em acetona, aplicado três vezes por semana, foi bem estabelecido em hamsters e sabe-se que a formação de EROs durante sua metabolização pode se difundir a partir do local de geração, para fora da célula, e iniciar a cadeia de peroxidação lipídica. Sabe-se que existe metabolização hepática do DMBA quando aplicado em mucosa jugal. Nesse estudo avaliou-se o efeito da suplementação de glutamina via oral e intragástrica em carcinogênese DMBA-induzida em mucosa de bolsa jugal de hamsters. Dosaram-se níveis de malondialdeído (MDA), principal produto de peroxidação lipídica, e antioxidantes -tocoferol, retinol e glutationa. Obteve-se como resultado a formação de carcinoma de células escamosas na maioria dos animais, independentemente da administração de glutamina, na dosagem testada. Não foram observadas diferenças na quantidade de MDA, glutationa, proteína e retinol no fígado dos animais. Tampouco houve diferença entre os níveis plasmáticos de glutationa entre os grupos. Esses resultados demonstram que não houve estresse oxidativo significativo nos tecidos testados. Porém houve acúmulo de -tocoferol no fígado dos animais tratados com o carcinógeno por 15 semanas, independentemente da administração de glutamina. Conclui-se, portanto, que pode ter ocorrido agressão ao tecido hepático desses animais e que a glutamina não foi eficiente na prevenção de carcinogênese ou agressão hepática. Possivelmente o tecido tumoral apresentaria alteração do equilíbrio oxidante/antioxidante, mas não foi avaliado nesse estudo. / Oral cavity squamous cell carcinoma has a high prevalence and substantial mortality rate among the major malignancies. It is believed that chemical carcinogens promote carcinogenesis by oxidative damage and mutation, among other mechanisms. The body prevents the accumulation of reactive oxygen species (ROS), oxidative stress, through the production of endogenous antioxidants such as -tocopherol, retinol, and glutathione. Several studies have demonstrated that glutamine administration can increase the production of glutathione, protecting cells from oxidative damage and genetic changes, and thus inhibit or delay the carcinogenesis. This amino acid is considered a chemopreventive agent to act on specific molecular and cellular targets, in inflammation or signal transduction, and activity to induce detoxification enzymes and suppress cell proliferation. The dimethylbenzanthracene (DMBA) induced carcinogenesis protocol consists in three times a week application of DMBA diluted in acetone, in hamsters. It is known that the formation of ROS during its metabolism can diffuse from the site of generation, outside the cell, and initiate the lipid peroxidation chain. It is known that there is hepatic metabolism of DMBA when applied to the buccal mucosa. This study evaluated the effect of oral and intragastric glutamine supplementation in DMBA-induced carcinogenesis on the cheek pouch mucosa of hamsters. Levels were assayed for malondialdehyde (MDA), the main product of lipid peroxidation, and the antioxidants -tocopherol, retinol and glutathione. The results show the formation of squamous cell carcinoma in most animals, regardless of this glutamine amount administration. There were no differences in the amount of MDA, glutathione, protein and retinol in the liver of animals. There was no difference between plasma levels of glutathione between groups. These results demonstrate that there was no significant oxidative stress in the tissues tested. However, there was accumulation of -tocopherol in the liver of animals treated with the carcinogen for 15 weeks, regardless of the administration of glutamine. Therefore that may have occurred aggression liver tissue of animals and that glutamine was not effective in the prevention of carcinogenesis or liver injury. Possibly the tumor tissue present shift in the balance oxidant / antioxidant, but it was not evaluated in this study.

Em Medicina Veterinária, o uso do surfactante como conduta assistencial em neonatos pré-termos ainda é um desafio. Destarte, foram objetivos deste estudo: avaliar a terapia com surfactante porcino intra-traqueal, correlacionando-a com a evolução de neonatos ovinos prematuros. Para tal, gruparam-se os neonatos nos grupos Ventilação (VEN; n = 5), Surfactante-1aplicação (SURF1; n = 5), Surfactante-2 aplicações (SURF2; n = 6) e Surfactante-3 aplicações (SURF3, n = 6). Ao nascimento todos os neonatos foram intubados e ventilados com balão auto-inflável durante 2 horas. Para os grupos SURF 1, 2 e 3, instilou-se pela via traqueal 100 mg/kg PV de surfactante porcino e colheu-se amostras nos seguintes momentos: exame clínico pelo escore Apgar, temperatura retal e oximetria de pulso aos minutos 0, 5, a cada 10 minutos até 1,5h, 2, 4, 6 e 24h, radiografia torácica às 0 e 24 h, hemogasometria arterial, concentração sérica de enzimas antioxidantes (catalase-CAT, superóxido dismutase-SOD e glutationa peroxidase-GPx) e marcador do estresse oxidativo (TBARS); glicemia, lactatemia, uréia e creatinina séricas às 0, 2, 4, 6 e 24 h. Para a avaliação histopatológica pulmonar, incluiu-se o grupo CON (n = 3), formado por animais da mesma idade gestacional, não ventilados e sem acesso ao surfactante. No líquido amniótico, colhido intra-parto, foi avaliada a concentração de TBARS, SOD e GPx. Como resultados, houve maior sobrevida para o grupo VEN, em relação aos SURF1 e 3. Neonatos VEN apresentaram melhor evolução clínica, com notas Apgar, frequência cardíaca (FC), padrão respiratório (PR) e oximetria de pulso superiores aos demais. Todos os grupos apresentaram uremia e hiperlactatemia no primeiro dia de vida, com valores de lactato sérico significativamente superiores para SURF1. Na avaliação hemogasométrica, houve acidose para o grupo SURF1, hipoxemia e hipercapnia para todos os grupos, com valores de pO2 significativamente inferiores para SURF1, em relação ao VEN. Na avaliação do LA, não houve diferença entre os valores de TBARS, SOD e GPx entre os grupos. Todavia, na avaliação sanguínea, SOD e CAT correlacionaram-se com oximetria de pulso e GPx com lactato sérico. A avaliação histopatológica pulmonar evidenciou edema, congestão, atelectasia para todos os grupos, presença de monócitos mais evidente nos grupos SURF2 e 3 em relação ao VEN e CON; maior aporte de neutrófilos para o grupo SURF3 em relação ao VEN e CON e espessamento de parede mais evidente em VEN, SURF2 e 3, em comparação ao CON. Em conclusão, a terapia com surfactante intra-traqueal associada à ventilação manual acarretou menor vitalidade clínica e desempenho respiratório em cordeiros prematuros; foi determinado o perfil oxidativo no LA de fetos aos 135 dias de gestação, bem como, o grau de estresse oxidativo neonatal; a ventilação manual com balão auto-inflável, associada ou não à terapia com surfactante intra-traqueal, induziu alterações estruturais e inflamatórias no parênquima pulmonar neonatal; e, por fim, o protocolo terapêutico proposto a ovinos prematuros, com o desígnio de manter a adequada função respiratória e asseverar a sobrevivência neonatal mostrou-se pouco satisfatório em virtude da elevada mortalidade neonatal. / In veterinary medicine, the implement of surfactant therapy for preterm newborns is still a challenge. Thus, the aims of this study were: to evaluate the porcine surfactant intra-tracheal therapy, correlating with the overall evolution of preterm. Newborns were randomly allocated in groups: ventilation (VEN, n = 5), surfactant-1application (SURF1, n = 5), surfactant-2application (SURF2, n = 6) and surfactant-3 application (SURF3, n = 6). At birth, all neonates were tracheally intubated and ventilated with self-inflating bag for 2 hours. SURF1, 2 and 3 newborns were tracheally instilled with 100 mg/kg BW of porcine surfactant and samples were collected at the following times: clinical examination through the Apgar score, rectal temperature and pulse oximetry at birth, 5min, every 10 min, until 1,5h, 2, 4, 6 and 24h; chest radiography at 0 and 24 h; arterial blood gas analysis, serum TBARS, CAT, SOD and GPx, glucose, blood lactate, urea and serum creatinine at 0 , 2, 4, 6 and 24 h. For histopathological evaluation, a control group was included (CON, n = 3), constituted by animals of the same gestational age, non-ventilated and without access to the surfactant therapy. Amniotic fluid was collected during delivery and analysed for TBARS, SOD and GPx concentrations. Results demonstrated higher survival rate for VEN group, in relation to SURF1 and 3. VEN neonates showed better clinical outcome, with superior Apgar scores, HR, RP and pulse oximetry. All groups had uremia and hyperlactatemia, with serum lactate values significantly higher for SURF1. At hemogasometric evaluation, SURF1 group presented acidosis; all groups had hypercapnia and hypoxemia, with significantly lower values of pO2 for SURF1 group in relation to the VEN. Amniotic fluid evaluation showed no difference among groups for TBARS, SOD and GPx values. However, in blood analysis, SOD and CAT were correlated with pulse oximetry and GPx with serum lactate. Histopathology showed pulmonary edema, congestion, atelectasis for all groups. Monocytes were more evident in groups SURF2 and 3 compared to VEN and CON. Neutrophils were higher in SURF3 group compared to VEN and CON. Also, VEN, SURF2 and 3 groups presented more evident wall thickness compared to CON lambs. In conclusion, intra-tracheal surfactant therapy associated with manual ventilation leads to lower clinical vitality and respiratory performance in preterm lambs; AF oxidative profile was determined for ovin fetuses at 135 days of gestation, as well as the degree of neonatal oxidative stress; manual ventilation with self-inflating bag, with or without surfactant therapy induced inflammatory and structural changes in neonatal lung parenchyma; and finally, the therapeutic protocol proposed to preterm sheep, aiming to maintain adequate respiratory function and to assure neonatal survival was unsatisfactory due to the high neonatal mortality.

O presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da administração do chá de camomila durante 21 dias sobre parâmetros antioxidantes e estresse oxidativo das glândulas parótida e submandibular. Bem como o efeito do consumo do chá no transporte de glicose do fígado e possíveis alterações sistêmicas. Os grupos estudados foram divididos em controle não tratado (C), controle tratado com chá de camomila (CC), diabético não tratado (DM) e diabético tratado com chá de camomila (DMC). A indução do diabetes nos grupos DM e DMC foi realizada com injeção intraperitoneal de estreptozotocina (60 mg/Kg de peso corporal). No 7º dia experimental, os animais do grupo CC e DMC iniciaram o tratamento com o chá de camomila. Foram avaliados os sistemas antioxidantes enzimáticos por meio da atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx) e da via não enzimática pelo total antioxidante (TAS). O estresse oxidativo foi avaliado por meio da quantificação de malondialdeído (MDA). Além disso foram analisados os níveis de insulina séricos, glicemia, peso e consumo hídrico e alimentar. A via de transporte de glicose foi estudada por meio da avaliação da expressão e quantificação das proteínas AKT e AMPK. Os resultados obtidos confirmam o potencial hipoglicemiante do chá de camomila, bem como sua ação no controle da polidipsia. O chá não alterou os níveis de insulina além disso provocou uma redução da expressão da p-AMPK. O tratamento com chá ocasionou um aumento nos valores da atividade da GPx e CAT tanto na glândula parótida como na submandibular. No entanto, para o TAS o chá provocou aumento apenas na glândula submandibular. Na glândula parótida o chá diminuiu a peroxidação lipídica. Os resultados obtidos confirmam o potencial antioxidante do chá de camomila na glândula parótida dos animais diabéticos após tratamento. Conclusão: O tratamento com o chá de camomila aponta como sendo promissor na prevenção dos danos oxidativos presentes no diabetes mellitus, tanto nas glândulas salivares através da redução do MDA, quanto sistemicamente pelo seu potencial hipoglicemiante. / The present study aimed to evaluate the influence of the administration of chamomile tea for 21 days on antioxidant parameters and oxidative stress of the parotid and submandibular glands. As well as the effect of tea consumption on the transport of glucose from the liver and possible systemic alterations. The groups studied were divided into untreated control (C), control treated with chamomile tea (CC), untreated diabetic (DM) and diabetic treated with chamomile tea (DMC). The induction of diabetes in the DM and DMC groups was performed with intraperitoneal injection of streptozotocin (60 mg / kg body weight). On the 7th experimental day, the CC and DMC animals started treatment with chamomile tea. The enzymatic antioxidant systems were evaluated through the activity of the enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) and non-enzymatic pathway by total antioxidant (SAT). Oxidative stress was evaluated by the quantification of malondialdehyde (MDA). Serum insulin levels, glycemia, weight, and water and food intake were also analyzed. The glucose transport pathway was studied by evaluating the expression and quantification of AKT and AMPK proteins. The results confirm the hypoglycemic potential of chamomile tea, as well as its action in the control of polydipsia. The tea did not alter insulin levels, in addition it caused a reduction of p-AMPK expression. Treatment with tea caused an increase in the values of GPx and CAT activity in both the parotid gland and the submandibular gland. However, for TAS the tea caused only increase in the submandibular gland. In the parotid gland the tea decreased lipid peroxidation. The results confirm the antioxidant potential of chamomile tea in the parotid gland of diabetic animals after treatment. Conclusion: Treatment with chamomile tea is shown to be promising in preventing the oxidative damage present in diabetes mellitus, both in the salivary glands through the reduction of MDA and systemically due to its hypoglycemic potential.