Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Water stress, induced by drought or salinity, is the major environmental restriction to plant survive and crop sustainability, specially in semi-arid areas, where they are often associated to high temperatures and high radiation rates. Part of the effects exerted by these abiotic stresses on plant metabolism is mediated by oxidative damage due to an increased production of active oxygen species (AOS). The present study aims to elucidate the interactions and the importance of the catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX) enzymatic antioxidants systems in the protection of cowpea leaf tissues [Vigna unguiculata (L.) Walp.] against the oxidative damage induced by water deficit and salinity. The experimental approach adopted, involved 3 different experiments, using PEG-induced water stress or NaCl-induced salt stress, combined to the CAT inhibitor 3-Amino-1,2,4-trizole (3-AT) application. These experiments were conduced under two environmental conditions: in a growth chamber, under controlled conditions, and in a greenhouse, under the typical semiarid conditions of the Brazilian Northeast. PEG and NaCl treatments were applied to the nutritive solution for 72 h, while the 3-AT was daily sprayed in the shoot. The osmotic stress induced by PEG or NaCl caused acute declines in the transpiration rates, due to increase in stomatal resistance, as well as an intense growth reduction, in the plants cultivated in the greenhouse conditions. The osmotic stressed plants presented significant increases on lipid peroxidation and on the ascorbate content, in addition to a CAT activity reduction. The osmotic stress and 3-AT combination raised the APX activity levels that counteracted, at least in part, the CAT absence. The fall in the CAT activity was related to a strong mRNA expression restraint, followed by an up-regulation of the cytosolic APX mRNA. These results indicate the presence of a controlled synchrony between the expression and enzymatic activity of these antioxidant systems, in the regulation and detoxification of the AOS produced in plant cells, during environmental stresses situations. / O estresse hÃdrico induzido por seca ou salinidade à a principal restriÃÃo ambiental à sobrevivÃncia das plantas e sustentabilidade das culturas, principalmente nas regiÃes semiÃridas, onde estÃo frequentemente associados a altas temperaturas e taxas de luminosidade. Uma grande parte dos efeitos destes estresses ambientais no metabolismo das plantas à mediada por danos oxidativos devido ao aumento na produÃÃo de espÃcies ativas de oxigÃnio (AOS). O presente estudo se propÃs a estudar a interaÃÃo e a importÃncia dos sistemas antioxidantes enzimÃticos da catalase (CAT) e da peroxidase de ascorbato (APX) na proteÃÃo dos tecidos foliares de feijÃo caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] contra os danos oxidativos induzidos por condiÃÃes de deficiÃncia hÃdrica e salinidade. Para isso, foi utilizada uma abordagem experimental envolvendo 3 experimentos, utilizando combinaÃÃes de estresse hÃdrico, induzido por polietilenoglicol (PEG), ou salino, induzido por NaCl, com a pulverizaÃÃo do inibidor de catalases 3-Amino-1,2,4-Triazol (3-AT). Estes experimentos foram, ainda, realizados em duas condiÃÃes ambientais: uma em cÃmara de crescimento sob condiÃÃes controladas e em casa de vegetaÃÃo, sob condiÃÃes tÃpicas do semi-Ãrido. O PEG e o NaCl foram aplicados na soluÃÃo nutritiva durante 72 h, e o 3-AT pulverizado diariamente na parte aÃrea. O estresse osmÃtico causado pela aplicaÃÃo de PEG ou de NaCl induziu uma forte reduÃÃo na transpiraÃÃo, associada a uma maior resistÃncia estomÃtica, e uma acentuada reduÃÃo no crescimento nas plantas submetidas as condiÃÃes de casa de vegetaÃÃo. Houve um considerÃvel aumento na peroxidaÃÃo de lipÃdeos e do conteÃdo do antioxidante ascorbato das plantas tratadas, bem como uma diminuiÃÃo da atividade de CAT. As plantas submetidas a uma combinaÃÃo de estresse osmÃtico e a aplicaÃÃo do 3-AT apresentaram um acentuado aumento da atividade da enzima APX, compensando, em parte a ausÃncia da atividade da enzima CAT. Esta diminuiÃÃo da atividade enzimÃtica de CAT foi acompanhada por uma forte repressÃo dos mRNAs para esta enzima, enquanto que houve uma induÃÃo dos mRNAs da APX citossÃlica. Estes resultados indicam que hà uma controlada sincronia entre a expressÃo e a atividade enzimÃtica destes dois sistemas, na regulaÃÃo e desintoxicaÃÃo das AOS produzidas na cÃlula vegetal, durante situaÃÃes de estresse ambiental.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A anemia falciforme (AF) à uma hemoglobinopatia hereditÃria autossÃmica causada por uma mutaÃÃo pontual no gene da beta globina gerando uma hemoglobina anormal denominada de hemoglobina S (HbS), em homozigose. A doenÃa se caracteriza por apresentar uma variabilidade do quadro clÃnico, que se deve à mÃltiplos fatores, dentre eles a concentraÃÃo de hemoglobina fetal (HbF), os haplÃtipos do gene da beta globina e os polimorfismos do gene BCL11A, entre outros. A avaliaÃÃo dos moduladores genÃticos na AF tem sido desenvolvida com a finalidade de melhorar o entendimento da sua fisiopatologia e direcionar a abordagem terapÃutica objetivando sua individualizaÃÃo. A pesquisa se propÃs a determinar a modulaÃÃo genÃtica dos polimorfismos do gene BCL11A (rs4671393, rs7557939 e rs1186868) sobre o perfil inflamatÃrio, hemolÃtico, no estresse oxidativo e nas concentraÃÃes das HbF, HbS nos pacientes portadores de AF, em estado estacionÃrio. O estudo foi do tipo transversal e analÃtico com 42 pacientes adultos, em acompanhamento ambulatorial no Hospital UniversitÃrio Walter CantÃdio (HUWC), com diagnÃstico molecular e haplÃtipos do gene da beta globina S previamente realizados. Os pacientes estavam em uso de HidroxiurÃia (HU), em mÃdia, 20mg/kg de peso corporal. Amostras biolÃgicas de sangue perifÃrico foram obtidas para a realizaÃÃo dos exames laboratoriais: as dosagens das citocinas prà inflamatÃrias IL-6, IL-17, TNF-alpha e das antiinflamatÃrias IL-10 e TGF-beta, por Elisa; contagem de reticulÃcitos por metodologia manual, dosagem de metemoglobina (MetHb) e lactato desidrogenase (LDH), por espectrofotometria; do nitrito (NOx), malonaldeÃdo (MDA) sÃricos, as enzimas antioxidantes eritrocitÃrias, catalase (CAT) e da glutationa peroxidase (GPx) por kits e espectrofotometria. Os polimorfismos genÃticos do gene BCL11A nas regiÃes, rs4671393, rs7557939 e rs1186868 foram determinados por Real Time PCR. As dosagens da HbF e HbS foram realizadas por HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Os dados idade, sexo e eventos clÃnicos foram obtidos dos prontuÃrios. Toda a anÃlise estatÃstica foi realizada usando o software livre R, na versÃo 3.1.2. Para anÃlise da frequÃncia do sexo e dos genÃtipos, por regiÃo e das associaÃÃes entre o tipo de haplÃtipo e dos eventos clÃnicos com as regiÃes do BCL11A, foram usados os testes de Qui-quadrado e o exato de Fisher. Realizou-se o teste paramÃtrico de ANOVA (obtido sob suposiÃÃes distribucionais), bem como o teste nÃo-paramÃtrico de Kruskal-Wallis para a anÃlise da associaÃÃo dos genÃtipos do gene BCL11A com a idade, os nÃveis de HbS, HbF, perfil inflamatÃrio, hemolÃtico e do estresse oxidativo. Foi considerado significante ao nÃvel de 5%. A maioria dos pacientes (57,14%) era do sexo feminino. A idade dos pacientes incluÃdos foi de 18 a 65 anos, com valor mÃdio e mediano de 35,1 e 33 anos, respectivamente. Somente a rs7557939 do BCL11A, o genÃtipo A/G foi o mais prevalente e a prevalÃncia do genÃtipo A/G foi maior nas mulheres , enquanto nos homens a prevalÃncia maior foi do genÃtipo A/A. No entanto, a rs1186868 do BCL11A, a maioria (56,52%) das mulheres apresentaram o genÃtipo C/T e a metade dos homens apresentaram o genÃtipo T/T. Nenhuma regiÃo do gene BCL11A apresentou associaÃÃo significativa com os haplÃtipos do gene da beta globina S. Em relaÃÃo a moduÃÃo do gene BCL11A com os nÃveis de HbS e HbF, verificou-se que na rs1186868 houve resultado significativo do genÃtipo mutante T/T, que apresentou maiores nÃveis de HbS e menores nÃveis de HbF. Na rs7557939 houve uma diminuiÃÃo significante de HbF no alelo mutante A/A, porÃm, nÃo houve relaÃÃo com a HbS. NÃo houve associaÃÃo entre os SNPs, nas trÃs regiÃes estudadas, com relaÃÃo ao nÃmero mÃdio/mediano dos moduladores inflamatÃrios, marcadores de hemÃlise, do estresse oxidativo e dos eventos clÃnicos, ao nÃvel de 5%.Os achados reforÃam a hipÃtese da moduÃÃo genÃtica dos polimorfismos do gene BCL11A em relaÃÃo aos nÃveis de HbF, onde os alelos selvagens, nas regiÃes rs7557939 e rs1186868 apresentaram um carÃter protetor no prognÃstico em decorÃncia de terem apresentado aumento dos nÃveis de HbF, nos pacientes com AF do estudo.

Linfomas são as neoplasias hematopoiéticas mais comumente relatadas em cães, podendo ocorrer em qualquer idade. A etiologia ainda é desconhecida, porém se aceita que seja multifatorial. São classificadas de acordo com sua localização anatômica, estadio clínico da Organização Mundial de Saúde (OMS), critérios cito-histológicos e imunofenotípicos. A anemia é a anormalidade hematológica mais observada em pacientes com câncer e manifesta-se em cerca dois terços dos cães com linfoma. Os radicais livres de oxigênio produzidos pelas células tumorais aumentam o estresse oxidativo, sendo este demonstrado por mudanças na atividade das enzimas antioxidantes, podendo ocorrer oxidação de proteínas de DNA, aumento da peroxidação de lipídeos e alterações da fragilidade osmótica eritrocitária, acarretando a diminuição da meia vida das hemácias e, sendo essa diminuição um dos fatores que pode levar à anemia nos casos de linfoma. A superoxido dismutase (SOD) é uma enzima antioxidante que catalisa a dismutação do radical superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio, protegendo as células dos danos induzidos por estes radicais livres. O objetivo deste estudo foi determinar as concentrações eritrocitárias de superóxido dismutase, além de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (MDA), o estado antioxidante total (TAS) e a fragilidade osmótica eritrocitária, em cães hígidos e com linfoma multicêntrico com e sem anemia, para avaliar a influência desses mecanismos no desenvolvimento das anemias associadas a essa neoplasia. Amostras de sangue foram obtidas de 24 cães com linfoma multicêntrico, sendo 10 sem anemia e 14 com anemia, e 20 cães saudáveis. Foi observada diferença significante no estado antioxidante total entre os grupos controle, grupos experimentais com linfoma multicêntrico com anemia e sem anemia (p < 0,0001). Não houve diferença significante quando os cães com linfoma com anemia e sem anemia foram comparados, assim como na avaliação das concentrações plasmáticas do MDA entre o grupo controle, grupo experimental com linfoma multicêntrico com anemia e grupo experimental com linfoma multicêntrico sem anemia (p = 0,823). A diferença também não foi significante quando se comparou o grupo controle e o grupo dos animais doentes (p=0,671). A diferença não foi significante na avaliação das concentrações eritrocitárias de superoxido dismutase entre o grupo controle, grupo experimental com linfoma multicêntrico com anemia e grupo com linfoma multicêntrico sem anemia (p=0,0748.). Entretanto, foi observada diferença significante entre o grupo controle e o grupo experimental com linfoma multicêntrico (p=0,0168). Não foi observada diferença na fragilidade osmótica eritrocitária dos cães com linfoma multicêntrico com anemia e sem anemia, as concentrações de NaCl em que observou-se 50% de hemólise estavam dentro dos valores postulados por Jain, 1963. Os resultados obtidos indicam um aumento do estresse oxidativo em cães com linfoma e que a anemia observada nos pacientes com linfoma não esta relacionada diretamente a diminuição das defesas antioxidantes eritrocitárias ou à alterações nas propriedades de membrana secundarias a peroxidação lipídica, que poderiam interferir na fragilidade do eritrócito / Lymphoma is hematopoietic malignancies most commonly reported in dogs can occur at any age. The etiology is still unknown, but is accepted to be multifactorial. They are classified according to their anatomic location, clinical stage of the World Health Organization (WHO), cytological and histological criteria and immunophenotype. Anemia is the most commonly observed hematologic abnormalities in patients with cancer and manifests itself in about two thirds of dogs with lymphoma. The oxygen free radicals produced by tumor cells increases oxidative stress, which is demonstrated by changes in antioxidant enzyme activities, protein and DNA oxidation, increased lipid peroxidation and alterations of erythrocyte osmotic fragility, leading to a decrease in half life of red blood cells and this decrease is one factor that can lead to anemia in cases of lymphoma. The superoxide dismutase (SOD) is an antioxidant enzyme that catalyzes the dismutation of superoxide into oxygen and hydrogen peroxide, protecting cells from damage induced by these free radicals. The aim of this study was to determine erythrocyte superoxide dismutase, and thiobarbituric acid reactive substances (MDA), total antioxidant status (TAS) and erythrocyte osmotic fragility, and in healthy dogs with multicentric lymphoma with and without anemia, to evaluate the influence of these mechanisms in the development of anemia associated with this neoplasia. Blood samples were obtained from 24 dogs with multicentric lymphoma, 10 and 14 with anemia without anemia and 20 healthy dogs. Significant difference was observed in total antioxidant status between the control group, experimental groups with multicentric lymphoma with anemia and without anemia (p <0.0001). There was no significant difference when dogs with lymphoma with anemia and without anemia were compared no significant difference in assessment of plasma concentrations of MDA between the control group, experimental group with multicentric lymphoma with anemia and experimental group with multicentric lymphoma without anemia (p=0.823). The difference was not significant when comparing the control group and the group of sick animals (p = 0.671). The difference was not significant in the evaluation of erythrocyte superoxide dismutase concentrations between the control group, experimental group with multicentric lymphoma with anemia and patients with multicentric lymphoma without anemia (p = 0.0748).. However, significant difference was observed between the control and experimental group with multicentric lymphoma (p = 0.0168). No difference was observed in erythrocyte osmotic fragility of dogs with multicentric lymphoma with anemia and without anemia, the concentrations of NaCl in which there was 50% hemolysis were within the range postulated by Jain, 1963. The results indicate an increased oxidative stress in dogs with lymphoma and that the anemia observed in patients with lymphoma is not directly related to the decrease in erythrocyte antioxidant defenses or the changes in properties of secondary membrane lipid peroxidation, which could interfere with the fragility of erythrocyte

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A esquizofrenia à um transtorno mental crÃnico, grave e incapacitante que afeta cerca de 1% da populaÃÃo mundial, cujos sintomas podem ser induzidos pela Cetamina. Neste sentido, hà evidÃncias de que o estresse oxidativo tenha importante papel na patogÃnese desta doenÃa. Desta forma, o presente estudo avaliou os efeitos neurocomportamentais e neuroquÃmicos, atravÃs da determinaÃÃo de parÃmetros do estresse oxidativo, apÃs administraÃÃo aguda da Clorpromazina (Cp) ou Clozapina (Cz), no modelo de esquizofrenia induzido pela Cetamina (Ket) em camundongos. Este estudo examinou alteraÃÃes neurocomportamentais, apÃs administraÃÃo de Cp (1 ou 5mg/Kg, ip) ou Cz (5 ou 10mg/Kg, ip), sozinhos ou 30 minutos antes da Ket (10mg/kg, i.p) em camundongos, e no estresse oxidativo apÃs administraÃÃo de esquema anterior incluindo Vitamina E (Vit E) (400 mg/kg) sozinha ou 30 minutos antes da Ket. Os resultados mostraram que a Cetamina induziu a hiperlocomoÃÃo e aumentou o nÃmero de rearring e grooming no teste de campo aberto. No teste de suspensÃo de cauda, a Cetamina diminuiu o tempo de imobilidade. Sendo esses efeitos bloqueados pela Cp ou Cz nos testes neurocomportamentais. Em adiÃÃo as mudanÃas comportamentais, a cetamina induziu aumento na peroxidaÃÃo lipÃdica, atividade da catalase e concentraÃÃo de nitrito. A Cp ou Cz reverteram os efeitos da Cetamina sobre estresse oxidativo. Em conclusÃo, os resultados confirmam efeitos semelhantes à Esquizofrenia, atividade antidepressiva e pro-oxidativa pela cetamina e reversÃo destes efeitos pela Cp ou Cz. / Schizophrenia is a serious and debilitating chronic mental disease, affecting about 1% of the world population and whose symptoms can be induced by ketamine. In this sense, evidences show that oxidative stress has an important role in the pathogenesis of this condition. Thus, this study evaluated the neurobehavioral and neurochemical effects, through the dosage of oxidative stress, after acute administration of Chlorpromazine (Cp) or Clozapine (Cz), in a model of schizophrenia induced by ketamine (Ket) in mice. Neurobehavioral changes were examined after administration of Cp (1 or 5 mg/Kg, ip) or Cz (5 or 10 mg/Kg, ip), either alone or 30 minutes before Ket (10mg/kg, ip) in mice, and during oxidative stress after administration of the previous scheme including Vitamin E (Vit E) (400 mg/Kg) alone or 30 minutes before the Ket. Results showed that ketamine induced hyperlocomotion and increased the number of rearring and grooming events in the open field test and decreased the immobility time in the tail suspension test. Interestingly, these effects were blocked by Cp or Cz administration in the neurobehavioral tests. In addition to the behavioral changes, ketamine induced increase in lipid peroxidation, catalase activity and nitrite concentration. Again, either Cp or Cz reversed the effects of ketamine, this time on oxidative stress. In conclusion, these findings demonstrate effects similar to schizophrenia, antidepressant activity and pro-oxidative conditions induced by ketamine and reversal of these effects by Cp or Cz.

A produção de pólen apícola vem experimentando uma rápida e empolgante expansão desde o final da década de 1990. Tal crescimento pode ser explicado pelo aumento do interesse popular em alimentos de alto valor nutricional, bem como outras inúmeras aplicações desse produto na produção animal. Atualmente em torno de 1.500 toneladas de pólen são produzidas anualmente em todo o mundo. Apesar da importância econômica, social e ecológica assumida por esse setor da cadeia produtiva apícola, poucos estudos vêm abordando o tema, desde o fim da década de 1960. Tal desinteresse científico fez com que diversos aspectos relacionados às técnicas de manejo mais adequadas permanecessem pouco entendidos ou até mesmo nunca validados. Como agravante, um acentuado declínio populacional vem sendo percebido nas espécies de polinizadores, em especial A. mellifera. Apesar da gravidade e recorrência, tal fenômeno ainda é pouco entendido. Inúmeros agentes parecem exercer algum tipo de influencia negativa na biologia e fisiologia das abelhas melíferas (pesticidas, patógenos, ectoparasitas e perda de habitat), porém nenhum desses fatores foi comprovadamente identificado como desencadeador. Hoje a hipótese emergente, mais aceita entre os pesquisadores da área, trata do possível efeito sinergístico desses fatores como possível desencadeador dessa síndrome. É nesse contexto que estudos relativos à sanidade dessas abelhas se tornaram essenciais para a conservação da espécie e de seus serviços ecológicos. O pólen como imunoefetor e mitigador do estresse oxidativo se tornou, portanto, uma das mais proeminentes alternativas para proteção das abelhas A. mellifera. A pesquisa teve como principal objetivo a obtenção de informações que propiciassem o melhoramento das práticas vigentes de produção de pólen apícola, além do melhor entendimento do efeito do pólen no sistema imunológico de abelhas melíferas (analisado através do estudo da prevalência de patógenos) e no sistema de defesa antioxidante desses insetos. Este estudo traz informações importantes sobre o desenvolvimento de um sistema produtivo de pólen apícola mais eficaz. A utilização de populações coloniais de tamanhos médios (entre 19.000 e 30.000 indivíduos), combinada com suplementação de carboidrato, foi capaz de produzir resultados produtivos vantajosos. Também concluímos que apiários de produção devem ser prioritariamente instalados em regiões de temperaturas tropicais (com menores amplitudes térmicas), cujo ponto de orvalho também é elevado (alta umidade média) e com períodos moderados de precipitação (porém com frequência regular). Também concluimos que o uso de rainhas inseminadas deve ser considerado pelos apicultores com o objetivo de melhorar a suas produções, uma vez que tal técnica é capaz de produzir resultados mais rápidos e potencialmente mais duradouros do que as técnicas de seleção unilaterais mais comumente usadas nos sistemas produtivos de pólen no Brasil. Os dados obtidos nessa pesquisa também nos mostram indícios de que a expressão relativa dos genes PRX5, SOD2 e GSTS4 respondem significativamente à exposição ao herbicida Paraquat. Por este motivo, novos estudos são necessários para elucidar a real possibilidade dos mesmos serem utilizados como marcadores biológicos para a intoxicação causada por esse herbicida. Modificações significativas também foram observadas na prevalência de patógenos como Nosema, DWV e SBV (quando abelhas foram expostas ao Paraquat). Essa pesquisa destaca os efeitos mitigativos do pólen na redução do estresse oxidativo causado pela exposição ao Paraquat. As taxas de sobrevivência, promovidas por dietas ricas em pólen, parecem também estar ligadas à regulação positiva de genes antioxidantes como os CYPs, SODs, VG e GSTs assim como a menores cargas de IAPV, Nosema sp, e espécies tripanosomatídeas. Este é um indicativo da eficácia do pólen como antioxidante e imunoefetor, assim como uma possível alternativa para a manutenção da saúde das abelhas no mundo todo. / The demand for bee pollen has significantly increased in the last two decades. This growing consuption can be explained by the increasing incorporation of this product into human diets, as well as the efficiency of this product in improving livestock production. Currently around 1,500 tonnes of pollen are produced annually worldwide. Despite the economic, social and ecological importance assumed by this sector of the beekeeping industry chain, few studies have approached the subject since 1960. As a consequence of such scientific negligency, several aspects related to productive management remain poorly understood or even never validated. To make matters worse, a sharp population decline has been noticed in pollinator species, especially A. mellifera, since 2006. No single cause has been identified for these dramatic losses, but rather multiple interacting factors are likely responsible (such as pesticides, malnutrition, habitat loss, and pathogens). In this context, studies addressing the health of honey bees have become essential for the conservation of this pollinator as well as its ecological services. Thus, Pollen as imunoefetor and potencial source of antioxidants has became one of the most prominent alternatives for honey bees protection. This research aimed to obtain information able to foster the improvement of pollen production. We also tested the effects of a widely used herbicide on the physiology of honey bees, specifically focusing the effects of Paraquat on the expression of antioxidant-related genes. In doing so, we simultaneously identify the dynamics of pathogen prevalence when bees are exposed to different concentrations of Paraquat. Finally, we investigate the effect of pollen (added to the diet of tested bees) on both oxidative stress and pathogen loads. This study provides important information for the development of a more eficiente pollen productive system. The use of mid-sized swarms (e.g. 19,000 to 30,000 individuals) combined with carbohydrate supplementation is able to provide advantageous productive results. We also concluded that apiaries should prioritarily be settled in regions which present tropical weather (narrow temperature range), the humidity is high and the precipitation is frequent. We were able to conclude that the use of inseminated queens must be considered by beekeepers in order to improve their production, once this technique is able to produce result improvement faster than other unilateral breeding techniques. The data obtained in this study also showed us evidences that the relative expression of genes such PRX5, SOD2 and GSTS4 respond to exposure to the herbicide Paraquat. Therefore, further studies are required to better elucidate the real possibility of those antioxidante related genes to be applied as biological markers for intoxication produced by this herbicide. Significant changes were also observed in the found levels of pathogens such as Nosema, DWV and SBV (when bees were exposed to Paraquat). This research highlights the mitigating effects of pollen on reducing the oxidative stress caused by Paraquat exposure. Survival rates promoted by pollen-rich diets also seems to be linked to upregulation of genes such as CYPs, SODs, VG and GSTs, as well as reduced prevalence of IAPV, Nosema sp and tripanosomatyd species. This research sheds light into the antioxidant and imunoefetor effects of pollen as well as the promising use of those pollerich diets as alternative for improving honey bee\'s health.

A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5&micro;M de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p&lt;0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p&lt;0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p&lt;0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p&lt;0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p&lt;0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido. A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5µM de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p<0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p<0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p<0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p<0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p<0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido / Melatonin (MEL) is a lipophilic indolamine with well-known antioxidant properties, by an scavenger action, producing its metabolites such as N1-acetil- N2- formil-5 metoxykinuramin (AFMK) or through a membrane receptor pathway (MT1 and MT2). Although, little is known about its stability and ideal dose on in vitro bovine embryo culture (IVC). In this work, to evaluate if there is any loss of MEL to the IVC systems, we determinate by HPLC, the real concentration of MEL in each system, with and without mineral oil, after the addition of different initial doses of MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), and then analyzed at different incubation period (0, 24, 72 e 144 hours). Then, it was evaluated the action and consumption of MEL in IVC of embryos submitted to induced oxidative stress. The IVC was done in controlled atmosphere (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). At Day 5, embryos over 16 cells were randomly divided in the treatments 0, 25, 50 and 100 ng/ml of MEL, and all received the induction with 5&microM of menadione during 24 hours. After incubation, the media was collected for HPLC analysis (MEL and AFMK) and embryos returned for culture with DM until Day8 (D8). The blastocysts (D8) were designated to Reactive oxygen species (ROS) evaluation, total number of cell (nBLAST), detection of caspase-3 and -7 activity (CASP) and gene expression (GRP78, HSP60 and SOD1). Blastocyst rate (TXBL) was also assessed. Result show that there is no loss of MEL to the oil, or degradation over incubation time. At 50ng/ml there was a consumption of melatonin in the media and formation of AFMK (p&lt;0.05), higher TXBL (45,93 vs. 33,06%, p&lt;0.05) and nBLAST (143 vs. 93,1, p&lt;0.05), lower ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p&lt;0.05) and CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p&lt;0.05), when in contrast with the group without MEL. However, there was no difference in gene expression. In conclusion, melatonin has a stable behavior in IVC system, which allows the use in system with and without oil. Also, at the dose of 50ng/ml has an antioxidant effect, improving quality and production of embryos culture in vitro at induced oxidative stress

A fragmentação do DNA espermático é uma das principais causas de infertilidade nos machos. Alterações na integridade do DNA podem ser decorrentes da ação de espécies reativas de oxigênio (EROS), de defeitos na protaminação e da apoptose. A sensibilidade do espermatozoide ovino frente as biotecnologias reprodutivas pode ser resultado de uma alta suscetibilidade a ação de EROS ou alterações na protaminação espermática desencadeadas por estresse oxidativo induzido por estresse térmico, tornando o espermatozoide mais suscetível a fragmentação de DNA. Com o objetivo de entender mais este processo, foi realizado um primeiro experimento para avaliar o status oxidativo, os atributos espermáticos e a expressão gênica de proteínas envolvidas nos processos de protaminação em diferentes níveis de suscetibilidade a peroxidação lipídica (baixo, médio, alto e altíssimo) em sêmen ovino. Foi observado um aumento da atividade enzimática da glutationa peroxidase e uma diminuição da atividade enzimática da glutationa redutase no plasma seminal no grupo com suscetibilidade a peroxidação lipídica alta e altíssima. Com relação a catalase, não foi verificado esse aumento, no entanto houve maior imunodetecção desta enzima. Em relação a condição espermática, observou-se um aumento na porcentagem de defeitos totais e lesões nas membranas acrossomal e plasmática, além de porcentagens menores de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial no grupo com maior suscetibilidade a peroxidação lipídica. Este mesmo grupo também apresentou alta suscetibilidade ao dano da cromatina e aumento do número de cópias do gene da protamina 1 (PRM1) em espermatozoides. O segundo experimento avaliou os atributos de espermatozoides provenientes do ejaculado e do epidídimo frente ao estresse térmico induzido por insulação testicular (tratado), assim como as relações com o status antioxidante. Observou-se diminuição da motilidade, vigor, turbilhonamento e aumento na porcentagem de defeitos maiores e menores, e de lesões na membrana acrossomal e plasmática em espermatozoides ejaculados no grupo tratado. Essas diferenças não foram observadas em espermatozoides epididimais. Uma maior atividade enzimática da glutationa peroxidase e da glutationa redutase foi observada no plasma seminal do grupo tratado. Foi verificado uma diminuição de espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial no grupo tratado, indicando que o metabolismo mitocondrial parece estar envolvido no quadro de estresse oxidativo. Um terceiro estudo foi conduzido para verificar o efeito do estresse térmico na integridade da cromatina espermática, na protaminação do DNA espermático e na ativação de vias apoptóticas em testículo ovino. Em espermatozoides provenientes do ejaculado, houve um aumento da porcentagem de células com suscetibilidade a fragmentação da cromatina no grupo tratado; não observado em espermatozoides epididimais. Uma alta porcentagem de espermatozoides com fragmentação de DNA grau III (ensaio COMETA) e aumento do número de cópias de mRNA da proteína de transição 1 (TNP1) em espermatozoides provenientes do ejaculado, foi observada no grupo tratado. Já em espermatozoides provenientes do epidídimo, a PRM1 apresentou maior expressão no 30&omicron; dia do ciclo espermático comparado a 7&omicron; dia, enquanto que a TNP1 comportou-se de maneira contrária. Em relação a ativação de vias apoptóticas em testículo ovino, a proteína anti-apoptótica Bax foi imuno-identificada em espermatócitos e a Blc-2 em espermátides, sem diferença entre os grupos. Em conclusão, a alta susceptibidade dos espermatozoides ovinos a peroxidação lipídica altera o status oxidativo ocasionando um quadro de estresse oxidativo, principal causador de dano a cromatina. Adicionalmente, o estresse oxidativo induzido por estresse térmico prejudica os atributos espermáticos e aumenta a suscetibilidade dos espermatozoides a fragmentação de DNA. / Sperm DNA fragmentation is referred as one of the main causes of male\'s infertility. Among the etiologies of abnormalities on DNA integrity the action of reactive oxygen species (ROS), protamination failures and apoptosis are considered the most important. The known sensitivity of ram´s sperm to reproductive biotechnologies could be a result of a higher susceptibility to the action of ROS or changes in sperm protamination triggered by oxidative stress induced by heat stress. This would increase the susceptibility of sperm DNA to fragmentation. Initially, the ram sperm quality, seminal protamine gene expression and oxidative status were evaluated in semen samples of different levels of susceptibility to lipid peroxidation (low, medium, high and very high). There was an increase on glutathione peroxidase and decreased glutathione reductase enzymes&#39; activity in groups with high and very high susceptibility to lipid peroxidation. However, only catalase showed increased immunodetection. An increase on total defects and damaged acrosomal and plasmatic membranes were observed in the group showing the highest susceptibility to lipid peroxidation. Also, the percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential, the percentage of sperm susceptible to chromatin damage and the number of copies of protamine 1 (PRM1) mRNA were increased in the group showing higher susceptibility to lipid peroxidation. The second study evaluated sperm\'s attributes from the epididymis and ejaculated sperm subjected to heat stress induced by testicular insulation (treated group), as well as correlations with the antioxidant status. We observed decrease on motility, vigor, and mass motility and increase on the percentages of sperm showing major and minor defects, and damaged plasma and acrosome membranes in the treated group. These differences were not observed in epididymal sperm. Increased enzymatic activities of glutathione peroxidase and glutathione reductase were observed in the treated group. Mitochondrial metabolism appeared to be involved in the oxidative homeostasis imbalance. This was effectively observed by a decrease on the percentage of sperm with high mitochondrial membrane potential in the treated group. A third study was conducted to determine the effect of heat stress induced by testicular insulation on the integrity of chromatin, protamination and apoptotic activation pathway in ram testis. An increase on the percentage of sperm with susceptibility to chromatin fragmentation in the treated group was observed. However, the previous findings were not observed in epididymal sperm. A higher percentage of sperm showing DNA fragmentation level III (Comet assay) and an increase on the number of copies of transition protein 1(TNP1) mRNA were observed in the treated group. In epididymal sperm, a higher expression of the PMR1 gene was observed on the 30th day of the espermatogenic cycle, while TNP1 behaved contrarily. In the testicular samples, the anti-apoptotic protein Bax was detected only in spermatocytes while Bcl-2 was observed singularly in spermatids, with no difference between groups. In conclusion, the disruption of oxidative homeostasis may be exacerbated by the higher susceptibility of ram\'s sperm to lipid peroxidation, which could be the main etiology of chromatin damage. In addition, oxidative stress induced by heat stress impairs sperm attributes and DNA integrity.

A criação de equinos tem se desenvolvido ativamente no Brasil. Assim, o interesse dos proprietários em biotecnologias reprodutivas equinos vem aumentando. Entretanto, o sêmen equino tem baixa tolerância à criopreservação comparada com outras espécies, sendo o estresse oxidativo um entrave por seus efeitos deletérios sobre a célula espermática. Neste contexto, o plasma seminal possui antioxidantes que promovem um papel importante na proteção do espermatozoide. Porém o, durante o processo de criopreservação, o plasma seminal é retirado. Em estudo anterior verificamos que, na ausência do plasma seminal os espermatozoides equinos tornam-se mais susceptíveis ao estresse oxidativo, principalmente causado pelo malondialdeído (MDA), subproduto da oxidação de lipídeos. Um dos motivos para este resultado seria a retirada da carnosina, um dos principais antioxidantes responsáveis pela proteção contra o acúmulo de MDA e seus efeitos deletérios, presente no plasma seminal. O objetivo do presente estudo é identificar e quantificar carnosina no plasma seminal de garanhões e comparar as características seminais em diferentes grupos de bons e maus refrigeradores e congeladores, baseando-se na análise da motilidade posterior ao processo de refrigeração e congelação. Foram colhidos dois ejaculados de quarenta garanhões (idades entre 4 e 16 anos de idade). As variáveis analisadas foram cinética espermática pelo sistema CASA, avaliação funcional (coloração de eosina-nigrosina para membranas, fast-green/rosa bengala para acrossomos, coloração 3-3diaminobenzidina para atividade mitocondrial e SCSA&trade; para susceptibilidade a denaturação de cromatina) e avaliação do índice de peroxidação lipídica (TBARS) do espermatozoide e do plasma seminal. Também foram realizadas análises da integridade de membranas plasmática e acrossomal, e potencial de atividade mitocondrial pelas sondas fluorescentes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA e JC-1 além da produção de (ROS) pelo espermatozoide com a sonda fluorescente CellRox. A carnosina do plasma seminal foi mensurada utilizando kit de ELISA Biomatik&reg; comercial. Foram comparados os grupos bons e maus refrigeradores, e bons e maus congeladores (p&le;0,05). Verificamos uma maior concentração de carnosina nos bons refrigeradores em relação aos que refrigeraram mau. Isso pode ter ocorrido pela maior concentração de TBARS no plasma seminal destes animais, possivelmente por um efeito fisiológico de reações de oxidação. Além disto, os bons refrigeradores apresentaram porcentagens significativamente maiores de células com alta atividade mitocondrial, acrossomo intacto e membrana intacta sugerindo um efeito benéfico da carnosina. Em relação ao efeito da congelação do sêmen, não foi observada diferença na concentração de carnosina entre os que congelaram bem ou não. Este resultado era esperado uma vez que, durante o processo de criopreservação do sêmen equino o plasma seminal é retirado. De fato, a maior porcentagem de células com lesão mitocondrial, de membrana e DNA lesado nos maus congeladores e as correlações entre as lesões e o estresse oxidativo pode indicar um mecanismo mitocondrial de geração de estresse oxidativo e consequente lesão das estruturas celulares. Conclui-se que a carnosina apresentou efeito protetor durante a refrigeração espermática protegendo contra injúrias causadas pela mesma e consequentemente é um dos fatores que melhora a qualidade espermática após 24 horas de refrigeração. / Equine breeding has been actively developing in Brazil, leading to increased interest in reproductive biotechnology. However, there is a limitation due to a tolerance of some stallions to cryopreservation, especially when compared to other species. In this context, oxidative stress represents an obstacle due to its deleterious effects on equine sperm. To counterattack such effect, seminal plasma has antioxidants that play an important role in protecting the sperm. However, during the cryopreservation process, the seminal plasma is withdrawn. In a previous study we verified that, in the absence of seminal plasma, equine spermatozoa are more susceptible to oxidative stress, mainly caused by malondialdehyde (MDA), a product of lipid oxidation. One of the reasons for this result would be the removal of carnosine present in the seminal plasma, one of the main antioxidants responsible for protection against the MDA accumulation and its deleterious effects. The objective of the present study was to identify and quantify carnosine in the seminal plasma of stallions and to compare the seminal characteristics in different groups of sperm samples with high and low tolerance to the cryopreservation or cooling, based on analysis of total motility after these processes. Two ejaculates of forty stallions (N= 80; ages between 4 and 16 years old) were collected. Each ejaculate was divided into two aliquots, one submitted to a 24h cooling and the other submitted to cryopreservation. The variables analyzed were: Computer Assisted Sperm Analysis (CASA system), functional evaluation (eosin-nigrosin stain for membranes, fast-green/rose bengal for acrosomes, 3-3\'diaminobenzidine staining for mitochondrial activity and SCSA&trade; for susceptibility to chromatin denaturation) and lipid peroxidation index (TBARS assay) of sperm and seminal plasma. Furthermore, plasma and acrossomal membranes integrities and mitochondrial membrane potential were also analyzed using the fluorescence probes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA, JC-1 and ROS detection by CellRox fluorescent probes. Carnosine from the seminal plasma was measured using commercial Biomatik&reg; ELISA kit. Thus, samples with high and low tolerance were compared (p&le;0.05). We found a higher concentration of carnosine in good cooler compared to those showing low motility. This may have occurred in response to the higher concentration of TBARS in the seminal plasma of these animals, possibly due to a physiological effect of oxidation reactions. In addition, good coolers presented significantly higher percentages of cells with high mitochondrial activity, intact acrosome and intact membrane suggesting a beneficial effect of carnosine. Regarding the effect cryopreservation, no difference was observed between those with high and low post-thaw motility. This result was expected since, during the cryopreservation process of equine semen, the seminal plasma is removed. In fact, the higher percentage of cells with mitochondrial lesions, damaged membrane and fragmented DNA in bad freezers and the correlations between lesions and oxidative stress may indicate a mitochondrial mechanism of oxidative stress generation and consequent lesion of cellular structures. In conclusion, carnosine had a protective effect during sperm cooling, protecting against damages being probably one of the factors that improves sperm quality after 24 hours of refrigeration.

As espécies reativas de oxigênio (ROS) podem ser responsáveis por causar danos às membranas dos espermatozoides, fragmentação de DNA, entre outros fatores, influenciando assim na fertilidade principalmente no processo de criopreservação do sêmen. A melatonina (MEL) e o ácido ferúlico (AF) são potentes agentes antioxidantes que poderiam atuar no controle da produção de ROS no sêmen equino. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito dos antioxidantes AF e MEL na criopreservação do sêmen equino. Foram utilizados 5 ejaculados de 4 garanhões. Dentre os tratamentos aplicados, foram utilizadas duas concentrações de cada antioxidante (AF 0,5mM, AF 1,2mM, MEL 2mM e MEL 1µM) além do controle (diluidor de congelação convencional BotuCrio&reg;), totalizando 5 tratamentos. As variáveis analisadas foram cinética espermática pelo sistema CASA (programa SCA - Sperm Class Analyser), morfologia, integridade de membranas plasmática, acrossomal e potencial de membrana mitocondrial, com o uso das sondas fluorescentes PI, Hoescht 33342, FITC-PSA e JC-1 além da produção de (ROS) pelo espermatozoide com a sonda fluorescente CellRox Deep Red&reg;. Comparações entre os tratamentos foram realizadas pelo modelo linear generalizado (PROC GLM) do SAS (Versão 9.3) e as diferenças entre eles foram localizadas através do teste de Duncan. A probabilidade de P0,05 foi considerada como diferença significativa. Os resultados para características da motilidade tiveram diferença significativa em alguns aspectos, porém nenhum tratamento foi superior ao controle. Houve diminuição no percentual de defeitos maiores nas amostras tratadas com AF 1,2mM, MEL 2mM e MEL 1&micro;M comparadas ao grupo controle. No que diz respeito à integridade de membranas, o tratamento MEL 1&micro;M apresentou porcentagens significativamente melhores nas células com membrana plasmática intacta, acrossomo intacto e alto potencial de membrana mitocondrial, quando comparadas ao grupo controle. As células em estresse oxidativo não se diferenciaram entre os tratamentos. O uso da sonda fluorescente CellRox Deep Red&reg; foi validado para espermatozoides de equinos. Foram utilizados 4 ejaculados de 4 garanhões aos quais eram submetidos aos tratamentos T0 (fração do ejaculado não submetida à indução do estresse oxidativo), T50 (50% da amostra não induzida e 50% induzida ao estresse oxidativo) e T100 (amostra induzida ao estresse oxidativo). Os dados de porcentagem de células positivas (com estresse oxidativo) foram submetidos à análise de regressão polinomial pelo modelo linear generalizado (PROC GLM) do SAS (Versão 9.3). O valor do coeficiente de determinação (R2) foi igual a 0,88 e a probabilidade de P0,05 foi considerada significativa. Pode-se concluir que o tratamento MEL 1&micro;M contribui para a preservação da integridade de membranas espermáticas durante o processo de criopreservação do sêmen equino e que a sonda fluorescente CellRox Deep Red&reg; é eficiente na detecção de espécies reativas de oxigênio no espermatozoide de garanhões. / Reactive oxygen species (ROS) can be responsible for causing damage to the membranes of sperm, DNA fragmentation, among other factors influencing fertility especially in cryopreservation. Melatonin (MEL) and ferulic acid (FA) are potent antioxidants that could act in the control of ROS production in equine semen. This study aimed to evaluate the effect of antioxidants AF and MEL in cryopreservation of equine semen. Five ejaculates from four stallions were used. Among the treatments, we used two concentrations of each antioxidant (AF 0.5mM, AF 1.2mM, MEL 2 mM and MEL 1&micro;M) beyond the control (conventional freezing extender BotuCrio&reg;), totaling five treatments. The parameters analyzed were sperm kinetics with the CASA system (SCA program - Sperm Class Analyzer), morphology, plasma and acrossomal membrane integrity mitochondrial membrane potential, using fluorescent probes PI, Hoechst 33342, FITC-PSA and JC- 1 over production ROS by the sperm with the fluorescent probe CellRox Deep Red&reg;. Comparisons between treatments were performed by generalized linear model (PROC GLM) of SAS (version 9.3) and the differences between them were located with the Duncan test. The probability of P0.05 was considered significant. The results for the motility characteristics were significant differences in some aspects, but no treatment was superior to the control. There was a decrease in the percentage of major defects in the samples treated with AF 1.2mM, MEL 2 mM and MEL 1&micro;M compared to the control group. Regarding to membrane integrity, treatment MEL 1&micro;M showed significantly better in percentages of cells with intact plasma membrane, intact acrosome and high mitochondrial membrane potential compared to the control group. Cells with oxidative stress not differ between treatments. The fluorescent probe CellRox Deep Red&reg; was validated for equine sperm previously. Was used ejaculates of 4 stallion which were subjected to the treatments T0 (fraction of the ejaculate not subjected to induction of oxidative stress), T50 (50% sample uninduced and 50% induced to oxidative stress) and T100 (sample induced to oxidative stress). The data of percentage of positive cells (with oxidative stress) were submitted to polynomial regression analysis based on generalized linear model (GLM PROC) of SAS (version 9.3). The value of the coefficient of determination (R2) was 0.88 and a probability of P0.05 was considered significant. It can be conclude that the treatment MEL 1&micro;M contributes to the preservation of the integrity of sperm membranes during the equine sperm cryopreservation process and the fluorescent probe CellRox Deep Red&reg; is efficient in the detection of reactive oxygen species in stallions sperm.

Um dos fatores responsáveis pela diminuição expressiva da qualidade espermática pós-criopreservação seria um maior índice de estresse oxidativo, provocado por uma maior produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), não compensada pela proteção antioxidante. O presente experimento visa estudar o efeito do tratamento antioxidante com glutationa (GSH) e vitamina E, adicionados ao diluidor, na qualidade do espermatozóide pós-criopreservação em cães. Para isso, o sêmen de 12 cães foi dividido em mixes constituídos dos ejaculados provenientes de 3 cães com no mínimo 70% de motilidade. O mix de sêmen foi então dividido em 7 alíquotas e diluídas em extensor a base de gema de ovo e ácido círtrico suplementadas com 0, 1, 5 e 10 mM de GSH e 1, 5 e 10 mM de vitamina E. Após o período de refrigeração as amostras foram analisadas quanto a motilidade e vigor espermáticos. As amostras foram então descongeladas e avaliadas quanto à motilidade, vigor, porcentagem de espermatozóides com membrana (eosina/nigrosina) e acrossomo (Coloração simples) íntegros, atividade mitocondrial (coloração diaminobenzidina) e susceptibilidade das células ao estresse oxidativo (TBARS). Os resultados foram analisados através do SAS System for Windows. Verificou-se que as amostras tratadas com 1 mM de GSH apresentaram maior porcentagem de células com membrana íntegra quando comparadas ao controle (11,21 ± 2,84 e 6,21 ± 1,16, respectivamente; p<0,05). A concentração de 5 mM de GSH apresentou melhores resultados em relação à atividade mitocondrial. Para as amostras tratadas com vitamina E, não houve efeito significativo com exceção da porcentagem de células DAB III, em que amostras tratadas com 1 mM apresentaram melhores resultados em comparação ao controle (5,61 ± 0,7 e 8,62 ± 1,05, respectivamente; p<0,05). Os resultados do presente experimento indicam que o tratamento antioxidante de amostras criopreservadas de cães com GSH e vitamina E apresentaram efeitos benéficos para a atividade mitocondrial dos espermatozóides. / One of the main factors known to impair post thaw semen quality is oxidative stress (i.e., higher production of reactive oxygen species not compensated by improved antioxidant protection). The present experiment aimed to evaluate the effects of antioxidant treatment with glutathione (GSH) and vitamin E on the quality of dogs cryopreserved semen. Towards this aim, semen of twelve dogs was divided into mixes constituted of the ejaculate of three dogs with at least 70% motility. Each mix was then divided into 7 extender treatment groups as follows: Control, Vitamin E 1, 5, 10 mM, and GSH 1, 5 and 10 mM. O mix de sêmen foi então dividido em 7 alíquotas e diluídas em extensor a base de gema de ovo e ácido círtrico suplementadas com 0, 1, 5 e 10 mM de GSH e 1, 5 e 10 mM de vitamina E. After cooling, motility and vigor were assessed. Cryopreserved samples were thawed and evaluated for motility, vigor, percentage of sperm showing intact membrane (eosin/nigrosin) and acrosome (Simple stain), mitochondrial activity (diaminobenzidine) and susceptibility to oxidative stress (TBARS). Statistical analyses was performed using the SAS system for Windows. Samples treated with 1 mM of GSH showed higher percentage of intact membrane sperm when compared to the control (11.21 ± 2.84 and 6.21 ± 1.16, respectively; p<0.05). Treatment with 5 mM of GSH showed better results regarding mitochondrial activity. Effect of vitamina E treatment was observed only for the percentage of DAB III cels (i.e., cells with severe compromised mitochondrial activity), in which samples treated with 1 mM showed better results when compared to the control group (5.61 ± 0.7 and 8.62 ± 1.05, respectively; p<0.05). Results of the present study indicate that treatment with GSH and vitamin E to cryopreserved sperm samples of dogs improve post-thaw mitochondrial activity.