Essa Dissertação de Mestrado é apresentada em três capítulos que originarão três futuras publicações. Os capítulos só não estão sob a forma de artigos porque, para isso, tanto texto como figuras teriam de ser reduzidos. Nosso intuito é apresentar o trabalho de forma mais pormenorizada, gerando assim uma discussão mais rica, que poderá posteriormente gerar outros trabalhos mais específicos. Pilostyles (Apodanthaceae) são angiospermas endoparasitas de caules de Fabaceae e um dos mais notáveis exemplos de redução do corpo vegetativo. Apesar da ocorrência de muitas espécies na América do Sul, os relatos concentram-se em espécies de outras regiões, como Estados Unidos, Austrália e Oriente Médio. Para aperfeiçoar a interpretação desse corpo vegetativo, o primeiro capítulo desse trabalho investiga anatomicamente Pilostyles ulei, uma espécie sul-americana, em três hospedeiros diferentes de Fabaceae: Mimosa foliolosa var. multipinna, M. maguirei (ambas com ocorrência em Minas Gerais) e M. setosa var. paludosa (com ocorrência na Bahia). São abordados a constituição e o posicionamento do corpo da parasita, bem como a plasticidade da zona de contato entre parasita e hospedeiro. Fragmentos de caules parasitados e saudáveis foram processados e proporcionaram observações principalmente em Microscopia Óptica (tanto colorações simples e duplas quanto testes histoquímicos e macerações) e Microscopia Confocal. As imagens produzidas a partir de ambos os tipos de microscopia foram usadas conjuntamente e reunidas para interpretar a estrutura tridimensional que a parasita adquire em seu hospedeiro. Além disso, foi utilizada a Microscopia Eletrônica de Transmissão com o intuito de procurar por outros tipos celulares parasitas (p.ex. elementos crivados). Tem-se que as pequenas flores que rompem a periderme do hospedeiro estão conectadas a massas de corpo vegetativo parasita. As massas, formadas por parênquima (sem função de armazenamento), ocupam principalmente a região floemática dos hospedeiros Mimosoidea. A partir delas, grupos de elementos traqueais retorcidos cercados por células parenquimáticas - denominadas extensores - direcionam-se ao interior do xilema secundário hospedeiro. Nossos dados apontam que o corpo vegetativo se expande de maneira disjunta e constante, organizando-se igualmente nas três espécies hospedeiras. Os elementos traqueais são classificados como traqueídes, mostrando espessamento helical-escalariforme. Devido à desorganização e ao retorcimento, pode-se dizer que as traqueídes parasitas não estão perfeitamente conectadas umas às outras e ao restante do corpo. A zona de contato apresenta muita plasticidade. Descreve-se pela primeira vez a ampla gama de posicionamento de um extensor na interface parasita-hospedeiro. Geralmente, o parênquima do extensor está em contato com o parênquima hospedeiro. Imagens sucessivas demonstram que apenas algumas poucas traqueídes parasitas alcançam com êxito o vaso hospedeiro. Existem associações singulares entre traqueídes parasitas e vasos hospedeiros que levam às outras formas de contato. O extensor pode rotacionar e se posicionar lateralmente segundo o mesmo eixo do vaso hospedeiro. Além disso, elementos de vaso hospedeiros podem se deslocar em direção aos extensores, numa maneira de atração muito conspícua nunca antes documentada. O segundo capítulo se propõe a verificar a existência da continuidade simplástica entre parasita e hospedeiro e a ocupação do interior de células hospedeiras por células parasitas. Ambos os objetivos foram alvos de muitas controvérsias em estudos anteriores. A análise também se baseou em unir elementos constatados em Microscopia Óptica, Microscopia Confocal e Microscopia Eletrônica de Transmissão. O desenvolvimento do extensor provoca muitas lacunas nos tecidos hospedeiros, porém nem sempre as células parasitas ocupam tais espaços. Por outro lado, protoplastos de células isoladas, não pertencentes aos extensores, ocupam o lúmen de células hospedeiras. O início se dá nas células do raio (na porção junto ao câmbio) e depois são também invadidas células do xilema secundário. Não foram observados plasmodesmas secundários entre parasita e hospedeiro. Porém, a degeneração de parede celular hospedeira pode ocorrer bem ao lado de uma célula parasita. As células hospedeiras podem se desorganizar e deteriorar completamente ou acumular substâncias fenólicas. O terceiro capítulo aborda o impacto do parasitismo sobre o xilema secundário hospedeiro. Esse estudo se destaca como primeiro a focar as conseqüências do parasitismo de uma holoparasita sobre aspectos anatômicos do lenho (e não o floema hospedeiro). A partir de populações das três espécies foram obtidos caules parasitados e saudáveis, dos quais foram medidos: comprimento de elemento de vaso, comprimento de fibra, freqüência de vasos e diâmetro tangencial de vaso. Além disso, são apresentados dados sobre a altura, diâmetro basal e circunferência na base nos indivíduos da população de M. setosa. Os dados foram comparados com Teste T de Student lineares e correlações. O parasitismo influencia negativamente o tamanho (altura, diâmetro basal e circunferência na base), comprimento de elemento de vaso, comprimento de fibra e diâmetro tangencial de vaso. No entanto, lenhos parasitados têm maior freqüência de vasos. Os resultados apresentam modificações semelhantes àquelas observadas em lenhos de plantas sob estresse de poluição ou seca. A teoria da eficiênciasegurança pode ser aplicada na interpretação do parasitismo. O hospedeiro responde à parasita aumentando a segurança, mas mantendo a condutividade hidráulica total em seus níveis normais. / Pilostyles (Apodanthaceae) are endoparasitic angiosperms of Fabaceae stems and one of the most remarkable situations of body reduction. This study focuses the vegetative body of P. ulei. From an external view, there are only tiny flowers which break out the host periderm. Internally, they are connected to masses of vegetative body. These masses, formed by parenchyma (which have no storage function), occupy especially the phloem area of the Mimosoidea hosts. From them, groups of twisted tracheary elements surrounded by parenchyma cells - called sinkers - run into the host secondary xylem. Tracheary elements were interpreted as tracheids, with helicoidal to scalariform thickening. Due to their disorganised and twisted features, parasite tracheids could be considered not perfectly connected to each other and from the rest of the body. The contact zone shows wide morphological plasticity. Here is described, by the first time, the wide range of sinker positioning in the host-parasite interface. Usually, sinker parenchyma contacts host parenchyma. Successive images show that only a few parasite tracheids successfully reach the host vessel. There are unique associations between parasite tracheids and host vessels which lead to other forms of contact. Sinker can rotate and be laterally positioned to the host vessel. Moreover, host vessels elements can head for sinkers, in ways of a strong attraction never documented.¶ Pilostyles (Apodanthaceae) are endoparasitic angiosperms of Fabaceae stems. The vegetative body, the endophyte, consists of masses of parenchyma cells and sinkers. Sinker development causes gaps in host tissues. Parasite protoplast parenchyma, not associated with sinkers, can occupy host cell lumina. The entrance starts in host ray cells and spread to secondary xylem cells. Parasite and host cells do not form secondary plamodesmata. However, host wall degeneration can occur beside a parasite cell. Host cells also can be completely deteriorated or promote phenol compounds accumulation. Pilostyles (Apodanthaceae) are endoparasites of Fabaceae stems. The body structure consists of masses of parenchyma cells in the host phloem and groups of twisted tracheary elements surrounded by parenchyma cells - called sinkers - running into the host secondary xylem. This is the first study focusing the impact of the holoparasite Pilostyles parasitism on the host secondary xylem stem. From populations of Mimosa foliolosa, M. maguirei and M. setosa were obtained \"healthy\" and parasited stems by P. ulei. Measurements of vessel element lenght, fiber lenght, vessel diameter and vessel frequency were made on digital imaging. Height, basal diameter and basal circumference of stem in M. setosa population were also measured. The data were comparated by linear Student\'s Tests T and correlations. The parasitism performs a negative influence on size (height, basal diameter and circumference), vessel diameter, vessel element lenght and fiber lenght. On the other hand, parasited stems have the higher vessel frequency. The results show similar modifications on xylem architecture as observed on plants stressed by polution or drought. It seems that the theory of efficiency/safety can also be applied on the interpretation of parasitism, even considering that is a case of endoparasitism. The host responds to the parasite increasing the safety but keeping the total hydraulic conductivity at normal levels.¶

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-27T19:09:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2350400 bytes, checksum: eed0dbcac6153d182266a36986649ce9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-27T19:09:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2350400 bytes, checksum: eed0dbcac6153d182266a36986649ce9 (MD5) Previous issue date: 2001-07-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A utilização de inimigos naturais no manejo de pragas de grãos armazenados é ainda pouco estudada, embora seja freqüente a sua ocorrência na massa de grãos. O ácaro Acarophenax lacunatus (Prostigmata: Acarophenacidae) vem demonstrando ser importante agente na redução de populações de pragas de grãos devido ao fato de parasitar grande quantidade de ovos de Rhyzopertha dominica (Coleoptera: Bostrichidae). Por isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de parasitismo de A. lacunatus e sua integração com inseticidas utilizados no controle de pragas de grãos armazenados. Para tal, avaliou-se o efeito dos piretróides, bifentrina e deltametrina, e dos organofosforados, pirimifós metílico e fenitrotiom, sobre A. lacunatus nas doses que corresponderam a 0,00%, 6,25%, 12,50%, 25,00%, 50,00% e 100,00% da recomendada pelo fabricante, em câmara climática tipo B.O.D, a 30±1o C, 65±5% de U.R. e escotofase de 24 horas . As unidades experimentais consistiram de placas de Petri de 140 x 10 mm, com 25 g de grãos de trigo com teor de umidade de 13% b.u., infestadas com 25 adultos de R. dominica, com idade entre três e sete dias. Sete dias após a infestação, foram inoculados zero, um, dois, três, quatro e oito ácaros, em quatro repetições por unidade experimental. O ácaro A. lacunatus mostrou-se eficiente na redução de populações de R. dominica em laboratório. Quando associado aos inseticidas piretróides e aos organofosforados, a redução das doses desses inseticidas e o aumento da densidade inoculada do ácaro levaram a um maior número de fêmeas fisogástricas desse inimigo natural. A taxa instantânea de crescimento populacional (r i ) de A. lacunatus foi menor quando se aumentaram as doses dos inseticidas e as densidades inoculadas desse ácaro . A aplicação dos inseticidas piretróides bifentrina e deltametrina, nas doses recomendadas, em grãos armazenados não interferiu no parasitismo do ácaro A. lacunatus.No entanto, devem-se reduzir as doses dos inseticidas organofosforados pirimifós metílico e fenitrotiom para se maximizar o potencial de parasitismo de A. lacunatus. Esse agente de controle biológico mostrou plena atividade (parasitando ovos de R. dominica) em todas as doses dos inseticidas testados, o que pode indicar tolerância a esses produtos. / The use of natural enemies in the inte grated pest management of stored grains is still little studied despite their frequent presence in the grain mass. The mite species Acarophenax lacunatus (Prostigmata: Acarophenacidae) has been showing to be an important agent in reducing populations of stored grain pests due to be fact that it is able to parasitize large amount of eggs of Rhyzopertha dominica (Coleoptera: Bostrichidae). The objective of the present work was to assess the parasitism potential of A. lacunatus and its integration with insecticides used for controlling stored grain pests. To achieve this, the effect of the pyrethroids bifenthrin and deltamethrin e the organophosphates pirimiphos - methyl and fenitrothion on A. lacunatus was assessed in doses corresponding to 0,00%, 6,25%, 12,50%, 25,00%, 50,00% and 100,00% of the manufactor recommendation, in B.O.D. climatic chamber, at 30±1o C, 65±5% R.H. and 24 hours scotophase. The experimental units consisted of Petri dishes (140 x 10 mm) containing 25 g of whole wheat grains (13% m.c.) infested with 25 adults of R. dominica three to seven days -old. Seven days after the infestation, zero, one, two, three, four or eight mites were inoculated in each experimental unit using four replicates per each treatment. The mite A. lacunatus was efficient in reducing laboratory populations of R. dominica. When associated with pyrethroids and organophosphate insecticides, their decrease in dose and increase in inoculated mite density led to a greater number of physogastric females of this natural enemy. The instantaneous rate of population increase (r i ) of A. lacunatus was smaller when the insecticide doses and mite densities used where higher. The application of the pyrethroids bifenthrin and deltamethrin at the recommended doses in stored grains did not affect the parasitism by the mite A. lacunatus. Nonetheless, the doses of the organophosphate insecticides pirimiphos -methyl and fenitrothion should be reduced to maximize the parasitism potential of A. lacunatus. This biological control agent showed activity towards eggs of R. dominica in all of the insecticide doses tested which indicates tolerance to these compounds.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-09-13T16:56:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2092738 bytes, checksum: 991c21e0ecefbc7be1990a39f757c9bb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-13T16:56:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2092738 bytes, checksum: 991c21e0ecefbc7be1990a39f757c9bb (MD5) Previous issue date: 2016-11-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Translationally controlled tumor protein (TCTP) é uma proteína amplamente distribuída em eucariotos. Ela está envolvida na regulação de processos básicos como progressão do ciclo celular, crescimento celular, proteção contra estresses e apoptose. Durante a infecção de tomateiro (Solanum lycopersicum) e Nicotiana benthamiana pelo potyvírus Pepper yellow mosaic virus ocorre aumento dos níveis de seu mRNA. Plantas silenciadas para TCTP acumulam menos vírus do que plantas selvagens, mostrando que esta proteína é importante para a infecção por potyvírus. Neste trabalho, o envolvimento da TCTP na infecção por potyvírus foi analisado detalhadamente utilizando-se o potyvírus Turnip mosaic virus (TuMV). Em plantas de N. benthamiana silenciadas para TCTP também ocorre uma diminuição no acúmulo do TuMV quando comparado com plantas não silenciadas. Além disso, plantas superexpressando TCTP de maneira transiente acumularam mais vírus do que plantas controle, confirmando o efeito positivo desta proteína na infecção por diferentes espécies de potyvírus. Para analisar a localização subcelular de TCTP no contexto da infecção, TCTP fusionada a GFP foi co-expressa com TuMV/6K2:mCherry. TCTP co-localiza-se com as vesículas replicativas e com estrutura a globular perinuclear tipicamente observada em células infectadas. O fracionamento de proteínas celulares demonstrou que TCTP está predominantemente na fração solúvel e uma pequena porção se associa com membranas, tanto em plantas sadias quanto em plantas infectadas. A co- localização com vesículas marcadas por 6K2 e a presença de TCTP em frações membranosas da célula sugerem um possível envolvimento desta proteína na replicação viral. Para verificar esta hipótese, protoplastos obtidos a partir de plantas silenciadas para TCTP foram infectados com TuMV e com o mutante TuMV VNN , o qual não é capaz de replicar-se. Os resultados demonstraram que o acúmulo de TuMV é reduzido em protoplastos silenciados, indicando que TCTP é necessária para a replicação. O acúmulo da proteína TCTP durante a infecção também foi avaliado. A infecção viral induz o aumento dos níveis de mRNA mas não de proteína, sugerindo que o mRNA que codifica TCTP atue na replicação. Desta forma, foi analisado se expressão de um RNA não traduzível de TCTP possui efeito sobre a infecção viral. Os resultados mostraram que apenas a expressão de um RNA traduzível é capaz de aumentar a infecção viral, indicando que a proteína TCTP, ou que a tradução se seu mRNA, é importante para a replicação viral. / The translationally controlled tumor protein (TCTP) is widely distributed among eukaryotes. It is involved in the regulation of basic processes such as cell cycle progression, cell growth, stress protection and apoptosis. During tomato (Solanum lycopersicum) and Nicotiana benthamiana infection by the potyvirus Pepper yellow mosaic virus, an increase of TCTP mRNA levels was observed. Plants silenced for TCTP accumulate fewer viruses than control plants, showing the importance of that gene for potyvirus infection. In this work, TCTP involvement in potyvirus infection was analyzed in details using the potyvirus Turnip mosaic virus (TuMV). N. benthamiana plants silenced for TCTP accumulated fewer viruses than non-silenced plants. In addition, plants overexpressing TCTP transiently accumulated more viruses than control plants, confirming that TCTP has a positive effect on infection by different potyviruses. To study TCTP subcellular localization in potyvirus infected plants, TCTP fused to GFP was co- expressed with TuMV/6K2:mCherry. Confocal analysis has shown that TCTP co- localizes with 6K2-tagged structures such as replicative vesicles and the perinuclear globular structure that is typically observed in potyvirus-infected cells. Cellular fractioning demonstrated that TCTP is mainly present in the soluble fraction but is also associated with membranes. The co-localization of TCTP with 6K2-tagged vesicles and its presence in cellular membranous fractions suggests a possible involvement of TCTP in virus replication. To test this hypothesis, protoplasts obtained from TCTP silenced plants were infected with TuMV and its mutant TuMV VNN , which is defective for replication. The results showed that TuMV accumulation is reduced in silenced protoplasts, indicating that TCTP is necessary for replication. TCTP accumulation during infection was also analyzed. Viral infection induces TCTP mRNA expression, but not protein accumulation, suggesting that the TCTP mRNA and not the protein has a role in viral infection. To check this, we expressed a non-translatable form of TCTP RNA in plants and analyzed its effect in virus accumulation. The results showed that only the expression of a translatable RNA resulting in protein production is able to increase virus infection, indicating that the protein and/or the translation of TCTP is important for potyvirus replication.

Made available in DSpace on 2014-05-29T12:32:35Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69316.pdf: 16389099 bytes, checksum: 74eb72078f131d9d9be7efc37391f1e6 (MD5) 69316.pdf.txt: 484412 bytes, checksum: 46c33af71747059817ce7b4a20b609af (MD5) 69316.pdf.jpg: 1433 bytes, checksum: 084dde94865696f7af0cab1566875cf5 (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical negligenciada que representa um grave problema de saúde pública. Assim, compreender a biologia da interação T. cruzi-hospedeiros constitui um grande desafio, uma vez que o ciclo de vida deste parasito exige um repertório de adaptações para garantir sua dispersão em hospedeiros vertebrados e invertebrados. O presente estudo demonstra o potencial das proteínas com propriedade de ligação à heparina (PLHs) em atuar no ciclo biológico do T. cruzi. Durante este trabalho foi oportuno isolar uma fração de proteínas hidrofóbicas com propriedade de ligação à heparina, com massas moleculares entre 70 kDa e 59 kDa em formas epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi por cromatografia de afinidade à heparina. A presença destas proteínas na superfície celular destes parasitos foi confirmada por ressonância plasmônica de superfície. Tais ensaios também foram decisivos na determinação da especificidade e estabilidade da ligação das PLHs a heparina, heparam sulfato (HS) e condroitim sulfato (CS). Os ensaios de competição realizados indicaram que a interação entre PLHs e GAGs pode influenciar a adesão dos epimastigotas à superfície de células epiteliais do trato intestinal de Rhodnius prolixus O envolvimento de GAGs na invasão de amastigotas em cardiomiócitos, célula alvo da infecção pelo T. cruzi, também foi demonstrado através de ensaios de competição com 20 \03BCg/ml de GAGs solúveis, incluindo heparina, HS, CS, dermatam sulfato (DS) e queratam sulfato (KS). Uma drástica redução no nível de infecção foi evidenciada apenas com heparina e HS, atingindo 82% e 65% de redução da invasão, respectivamente. Ensaios com células deficientes em GAGs (CHO-745) corroboraram o importante papel destes componentes de matriz extracelular no processo de reconhecimento e invasão de amastigotas. Na continuidade deste estudo, avançamos na caracterização bioquímica de PLHs, na determinação da expressão e distribuição espacial destas proteínas em tripomastigotas. As análises por citometria de fluxo revelaram que PLHs são abundantes na superfície de tripomastigotas, clone Dm28c, e a detecção destas proteínas por imunofluorescência indireta revelou uma localização predominante na membrana flagelar do parasito. Com os ensaios de zimografia realizados neste trabalho, revelamos que as PLHs de tripomastigotas tem atividade de protease sobre gelatina em uma ampla faixa de pH (5,5 - 8,0). A sensibilidade destas enzimas a presença de inibidores de serino protease indicam que as PLHs de tripomastigotas têm propriedades similares à tripsina. O conjunto de resultados deste trabalho aponta para o importante papel das PLHs em todas as etapas do ciclo biológico do T. cruzi a partir de eventos de adesão e invasão celular, através do reconhecimento de glicosaminoglicanos sulfatados / Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a neglected tropical disease that causes a serious public health problem. Thus, understanding the biology of the T. cruzi-hosts interaction is a major challenge, since the life cycle of this parasite requires a repertoire of adaptations to ensure their dispersion in vertebrate and invertebrate hosts. The present study demonstrates the potential of proteins with heparin-binding property (HBPs) to act in the biological cycle of T. cruzi. During this study, it was opportune to isolate a hydrophobic protein fraction with property to bind to heparin, with molecular weights ranging from 70 kDa to 59 kDa, in epimastigotes and trypomastigotes of T. cruzi by heparin affinity chromatography. The presence of these proteins on the cell surface of these parasites was confirmed by surface plasmon resonance. These assays were also decisive in determining the specificity and stability of the binding of HBPs to heparin, heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS). The competition assays indicated that the interaction between HBPs and GAGs can influence the adhesion of the epimastigote to the surface of epithelial cells of the intestinal tract of Rhodnius prolixus. The involvement of GAGs in the invasion of amastigotes in cardiomyocytes, target cell of T. cruzi infection, was also demonstrated by competition assays with 20 μg/ml of soluble GAGs, including heparin, HS, CS, dermatan sulfate (DS) and keratan sulfate (KS). A drastic reduction in the level of infection was observed only with heparin and HS, reaching 82% and 65% reduction of the invasion, respectively. Experimental assays using cells deficient in GAGs (CHO-745) corroborated the important role of extracellular matrix components in the recognition and invasion of amastigotes. In continuation of this study, we advanced in the biochemical characterization of HBPs and also determined the expression and spatial distribution of these proteins in trypomastigotes. The flow cytometric analysis revealed that HBPs are abundant at the surface of trypomastigotes, Dm28c clone, and the detection of these proteins by indirect immunofluorescence revealed a predominant location in the flagellar membrane of the parasite. With the zymography assays conducted in this work, we revealed that HBPs of trypomastigotes have proteinase activity on gelatin in a wide pH range (5.5 - 8.0). The sensitivity of these enzymes in the presence of serine proteinase inhibitors indicates that HBPs of trypomastigotes have properties similar to trypsin. All together, the results of this study points out to the important role of HBPs at all stages of the life cycle of T. cruzi from events of adhesion and cell invasion, through the recognition of sulfated glycosaminoglycans

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:18:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andres_quesne_ioc_mest_2014.pdf: 2284982 bytes, checksum: 60f23c8536661b9357f727cee49ed7ee (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Giardia intestinalis (G. intestinalis) é o parasita gastrointestinal mais comum que coloniza o trato intestinal humano onde permanece extracelular e aderido às células intestinais. O parasita tem uma distribuição mundial, causando um número estimado de 2.8x108 casos por ano e recentemente a doença foi incluída como parte da Iniciativa das Doenças Negligenciadas da Organização Mundial de Saúde. As manifestações clínicas da giardíase são variáveis, e vão desde a ausência de sintomas até diarreias agudas ou crônicas. Adicionalmente, estudos recentes indicam que distúrbios gastrintestinais funcionais, tais como a síndrome do intestino irritável, e o déficit de crescimento em crianças podem ser associados com a infecção por G. intestinalis. Apesar da alta prevalência e das consequências desta doença, os mecanismos fisiopatológicos subjacentes na giardíase ainda permanecem incompreendidos. Os trofozoítos causam a doença sem penetrar no epitélio intestinal, nem entrar na corrente sanguínea e sem secretar nenhuma toxina conhecida. Nos últimos anos, tem sido descrito que as vesículas extracelulares podem participar na interação parasita-célula hospedeira. As vesículas extracelulares podem ser: microvesículas (MVs) e derivadas da membrana plasmática; exosomos, pequenas vesículas originadas a partir de membranas de endossomos; e corpos apoptóticos contendo material do núcleo celular. As MVs têm sido mostradas como importantes fatores na interação parasita-célula hospedeira No presente trabalho, foi utilizada uma combinação de metodologias, incluindo citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, proliferação celular, análises de proteoma e ensaios de aderência celular para investigar o papel das microvesículas liberadas por trofozoítos de G. intestinalis nas propriedades patogênicas deste parasita. Demonstramos que G. intestinalis produz e secreta microvesículas com exposição superficial de fosfatidilserina. Além disso, o processo de liberação de MVs é dependente do tempo e da concentração de cálcio, envolve microdomínios de membrana e as microvesículas contêm RNA de baixo peso molecular. Observamos também que os microdomínios de membrana estão envolvidos na adesão do parasita à células Caco-2. Nossa análise proteômica preliminar sugere presença de componentes do citoesqueleto, alfa giardinas, enzimas metabólicas e proteínas variáveis de xi superfície (VSP) nas MVs isoladas de G. intestinalis. Foi demonstrado também que as MVs de G. intestinalis interagem com as células do hospedeiro aumentando a proliferação destas e incrementado também o número de trofozóitos aderidas à estas células. O presente estudo é o primeiro a sugerir um papel potencial para as microvesículas de G. intestinalis na colonização do hospedeiro. Uma melhor compreensão do papel das MVs liberadas pelo parasita na interação com a célula hospedeira poderá fornecer novas perspectivas sobre patogênese e possivelmente novas ferramentas para o diagnóstico e a terapia da doença / Giardia intestinalis ( G. intestinalis ) is the most common gastrointestinal parasite that colonizes the human intestinal tract where it remains extracellular and adheres to intestinal cells . The parasite has a global distribution causing an estimated 2.8x10 8 cases per year and the illness was recently included in the World Health Organization Neglected Disease Initiative . Clinical manifestations of giardiasis are quite variable, and range from the absence of symptoms to acute or chronic diarrhea. Aditionally, r ecent studies indicate that functional gastrointestinal disorders , such as irritable bowel syndrome , and failure of children to thrive can be associated with G. intestinalis infection . Even though the high prevalence and consequences of this disease , pathophysiological mechanisms underlying symptomatic giardiasis remain incompletely understood . Trophozoites cause disease without penetrating the intestinal epithelium , entering the bloodstream or secreting toxin s . In recent years it has been described that extracellular ves icles could participate in parasite - host cell interaction. The extracellular vesicles ma y be: microvesicles (MVs) and derived f rom the plasma membrane; exosome s, small vesicles originated from endosomal limiting membrane ; and apoptotic bodies containing nuclear material. MVs have been shown to be important factors in the parasite - host cell in teraction. Here, we used a combination of methodologies including flow cytometry, fl u orescence microscopy, cell proliferation, proteomics analysis and cell adherence assays to investigate the role of released microvesicles from G. intestinalis trophozoites on the pathogenic properties of this parasite . We have found that G. intestinalis produces and secretes microvesicles with superficial exposition of phosphatidilserine. Additionally , the shedding process was calcium and time - dependent , involve s membrane microdomains and the microvesicles contain low - molecular weight RNA . We also observed that membrane microdomains are involved in parasite attachment to Caco - 2 cells. Our preliminary proteomic analysi s suggested the presence of cytoskeleton components, alpha giardins, metabolic enzymes and variant - specific surface protein ( VSP ) in the isolated MVs from G. intestinalis. We demonstrate that G. intestinalis microvesicles interact with host cells xiii increasing their prolifer ation and augment ing the number of trophozoites adhered t o these cells . The present study is the first to suggest a potential role for G. intestinalis microvesicles in host cell colonization. A better understanding of the role of the released microvesicles by the parasite on the host - cell interaction will provide insights into pathogenesis and possibly new tools for diagnosis and therapy

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:16:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ellen_altoe_ioc_mest_2013.pdf: 1397353 bytes, checksum: 107b103e24982f28206bdb6e9749cd60 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A gp63, metalopeptidase altamente abundante na superfície de Leishmania, contribui para uma infinidade de funções bem estabelecidas na interação deste parasito com o hospedeiro mamífero. No entanto, apesar desta molécula ser abundantemente expressa na superfície das formas promastigotas, encontradas no inseto vetor, pouco é conhecido sobre as funções desempenhadas por essa metalopeptidase no flebotomíneo. Nosso grupo de pesquisa, utilizando abordagens bioquímicas, tem demonstrado que moléculas de gp63 de vários tripanosomatídeos não patogênicos ao homem estão implicadas na adesão ao intestino de insetos hospedeiros. Aqui, nós analisamos o papel da gp63 na interação de Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, com os seus respectivos insetos hospedeiros, Lutzomyia intermedia e Lu. longipalpis e com a linhagem celular derivada de Lu. longipalpis (LL5). Os intestinos dissecados de insetos foram prétratados ou não com o fosfoglicano (PG) puro derivado do lipofosfoglicano e colocados para interagir com os parasitos. Em paralelo, promastigotas de L. braziliensis e L. infantum foram pré-tratados com anticorpo anti-gp63 ou com inibidores da metalopeptidase. Depois disso, os parasitos foram colocados para interagir com os intestinos dissecados de insetos ou com as células LL5 Como esperado, o PG praticamente elimina a capacidade dos parasitos de se ligarem ao intestino dos insetos. Todos os tratamentos relacionados com a gp63 também provocaram uma diminuição acentuada nestes ensaios de ligação. Além disso, o sobrenadante de cultura de L. braziliensis foi concentrado por precipitação com sulfato de amônio e analisado por SDS-PAGE e SDS-PAGE-gelatina. Observamos uma degradação proteolítica, por volta de 63 kDa, que corresponde à enzima gp63 já identificada e caracterizada em várias espécies de Leishmania. Esses resultados em conjunto demonstram uma possível participação da gp63 na interação com o inseto vetor e nos estimulam a continuar estudando o papel dessa metalopeptidase no ciclo de vida de Leishmania / The highly abundant surface metallopeptidase of Leishmania, gp63, contributes to a myriad of well-established functions in the interaction of this parasite with the mammalian host. However, despite this molecule being abundantly expressed on the surface of promastigote forms, found in the insect vector, little is known about the functions performed by this metallopeptidase in the phlebotomine. Our research group, using biochemical approaches, has demonstrated that gp63 molecules from several not pathogenic trypanosomatids to man are implicated in the adhesion to guts of insect hosts. Here, we analyzed the role of gp63 in the interaction of Leishmania braziliensis and Leishmania infantum with their respective insect hosts, Lutzomyia intermedia and Lu. longipalpis and with the cell line derived from Lu. longipalpis (LL5). The dissected insect guts were pretreated or not with purified phosphoglycan (PG) derived from the lipophosphoglycan and placed to bind with the parasites. In parallel, promastigotes of L. braziliensis and L. infantum were pretreated with anti-gp63 antibodies or with metallopeptidase inhibitors. Thereafter, the parasites were placed to interact with dissected insect guts or with the LL5 cells. As expected, PG virtually eliminates parasites ability of bind to the insect guts. All treatments related to gp63 also provoked a pronounced decrease in these binding assays. Moreover, the culture supernatant of L. braziliensis was concentrated by precipitation with ammonium sulfate and analyzed by SDS-PAGE and SDS-PAGE-gelatin. We observed a proteolytic degradation around 63 kDa, which corresponds to the gp63 enzyme already identified and characterized in several Leishmania species. These results together demonstrate a possible role of gp63 in the interaction with the insect vector and stimulate us to continue studying the role of this metallopeptidase in the life cycle of Leishmania.

Submitted by Gilvan Almeida (gilvan.almeida@icict.fiocruz.br) on 2016-10-11T17:37:06Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 72047.pdf: 2371893 bytes, checksum: 77f3735b9ff714c38d542ea95b2fc9b8 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-10-17T13:57:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 72047.pdf: 2371893 bytes, checksum: 77f3735b9ff714c38d542ea95b2fc9b8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-17T13:57:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 72047.pdf: 2371893 bytes, checksum: 77f3735b9ff714c38d542ea95b2fc9b8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A esquistossomose mansônica ainda constitui um grave problema de saúde pública no Brasil e, portanto, o conhecimento dos diversos aspectos da interação Schistosoma mansoni-Biomphalaria, são pertinentes e relevantes como subsídios à medidas de controle e prevenção desta parasitose. Estudos in vitro têm mostrado que a suscetibilidade dos hospedeiros intermediários de S. mansoni, Biomphalaria straminea e Biomphalaria glabrata está relacionado à presença de lectinas. Importante transmissor da Esquistossomose no Brasil, B. straminea apresenta baixos índices de infecção em condições experimentais. Apesar disto, existem poucos estudos a respeito das características morfológicas e do comportamento in vitro dos hemócitos deste molusco frente à infecção por S. mansoni. Com o objetivo de caracterizar a resposta hemocitária de B. straminea (cepa Souza-PB) expostas a miracídios de S. mansoni, os moluscos foram expostos em massa e expostos individualmente a cinco miracídios. Exemplares de B. glabrata foram utilizadas como controle positivo. A hemolinfa foi coletada, corada em Azul de Tripan e os hemócitos foram contados em câmara de Neubauer. Alguns hemócitos foram colocados em placa de cultura para observação da interação das células com os parasitos e outros foram submetidos à marcação por lectinas fluoresceinadas de Griffonia simplicifolia e Lens culinaris conjugadas a FITC. As imagens foram obtidas e gravadas através de microscópio AxioObserver e câmera McR5 Zeiss. Os moluscos expostos em massa foram sacrificados logo após a penetração inicial do parasito (0 minuto), 24, 48, 72 horas e 30 dias após exposição (dpe) Moluscos expostos a cinco miracídios foram mortos após 0, 15, 30 e 45 minutos de exposição. Os órgãos foram fixados em formalina Millonig de Carson, incluídos em parafina e corados em HE. Após a exposição em massa verificou-se um aumento de 496,37% de células na hemolinfa de B. straminea e de 230,29% na hemolinfa de B. glabrata logo após a penetração dos miracídios. Na exposição por cinco miracídios houve um aumento de 78,14% de células na hemolinfa de B. straminea e de 36,36% na hemolinfa de B. glabrata logo após a penetração dos miracídios. A maioria das células encontradas na hemolinfa eram células blásticas e seu diâmetro foi em torno de 6\03BCm para B. straminea e 7\03BCm para B. glabrata. Hemócitos de B. straminea exibiram marcação mais intensa para lectina de G. simplicifolia nos tempos iniciais após a exposição, enquanto que aos 30 dias dpe as células estavam mais positivas para L. culinaris. Na análise histológica dos tempos iniciais, não foram observadas reações celulares nem parasitos mortos nos tecidos de ambos os hospedeiros. Entretanto, B. glabrata apresentou esporocistos secundários na região da massa cefalopediosa aos 30 dias após a infecção. Concluímos que a resistência de B. straminea está associada a modulação de lectinas expressas nos hemócitos. Além do mais, verificamos que as células blásticas, as células precursoras de outros hemócitos, são as mais abundantes nos dois hospedeiros estudados / Schistosomiasis still remain as an important parasitic disease under the public health point of view. Thus, studies that involve the interaction between Schistosoma mansoni-Biomphalaria are pertinent and useful to the disease prevention and control. In vitro studies have shown that the susceptibility of Biomphalaria straminea and Biomphalaria glabrata, intermediate hosts of Schistosoma mansoni, is related to the presence of lectins. As an important carrier of schistosomiasis in Brazil, B. straminea presents low infection rates under laboratory conditions. Despite of that, there are few studies regarding the morphological features and in vitro behavior of this mollusc's haemocytes challenged by S. mansoni miracidia. For this purpose, we analyzed the haemocyte response of B. straminea (Sousa \2013 PB strain) challenged by the parasite, so the molluscs were put under mass exposure and individual exposure to five miracidia. B. glabrata molluscs were used as positive controls. The molluscs had their haemolymph drawn, the haemocytes were stained in Trypan Blue and counted in Neubauer chamber. Some haemocytes were put into cell culture plates in order to observe the interaction between the cells and the parasites and other cells were stained by FITC conjugated lectins from Griffonia simplicifolia and Lens culinaris. The images and films were made at the microscope AxioObserver with McR5 camera from Zeiss. The mass exposed molluscs were killed at 0 minutes (first penetration of the miracidia), 24, 48, 72 hours and 30 days after exposure (dae) and the five miracidia exposed molluscs were killed after 0, 15, 30 and 45 minutes The organs were fixed in Carsons's Millonig Formalin, embedded in paraffin and stained with Hematoxylin and Eosin. After mass exposure, an increase of 496,37% in the haemolymph cells from B. straminea and an increase of 230,29% in the haemolymph cells from B. glabrata right after the miracidia penetration was observed. Most cells observed were blast cells and their diameter was 6\03BCm for B. straminea and 7\03BCm for B. glabrata. In the histological analysis of the earlier times, there were no cell reactions nor dead parasites found as the result of the exposure in both hosts tissues. Whereas at 30 dae B. glabrata shown parasites in its cephalopedal region. B. straminea haemocytes showed an intense staining for G. simplicifolia at the initial times of the exposure whereas 30 dae the cells were positive for L. culinaris lectin. Our conclusion is that B. straminea resistance to S. mansoni is associated with lectin modulation expressed by haemocytes and the fast response to miracidial penetration. Furthermore, we have seen that blast cells, precursor cells that origin other types of haemocytes, are more plentiful among both hosts studied

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:39:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318771.pdf: 16152173 bytes, checksum: 56737a2c8ed48b635f3f979d2c95cd94 (MD5) Previous issue date: 2013 / As trans-sialidades de Trypanosoma cruzi (TcTS) são capazes de clivar resíduos de ácidos siálicos da célula hospedeira e transferí-los à superfície do parasito, e portanto, fundamentais nessa interação. Já o Trypanosoma rangeli, considerado não patogênico para mamíferos e com ciclo desconhecido nestes hospedeiros, possui no seu genoma genes similares aos membros da família das Trans-sialidase (TS), embora sem nenhuma atividade catalítica. Uma vez que essa atividade está relacionada a pontos cruciais do ciclo do parasito patogênico e que, a ausência de atividade TS em T. rangeli é apontada como um dos motivos de sua incapacidade de infectar e sobreviver em células de mamíferos, o objetivo do presente trabalho foi estudar o envolvimento da TS a partir daexpressão heteróloga de uma TcTS ativa pelo T. rangeli. Após a transfecção e a confirmação da atividade de TS em T. rangeli transfectado (T. rangeli TcTS), ninfas de 4° e 5° estágio de Rhodnius prolixus (R. prolixus) foram infectadas por inoculação intracelômica com formas epimastigotas de T. rangeli selvagem e T. rangeli TcTS. Observamos uma diferença estatística no número de glândulas infectadas para T. rangeli selvagem (92%), e T. rangeli TcTS (16%), seis semanas p.i.. A infecção em camundongos BALB/c e C57BL/6 não revelou diferenças na de parasitemia entre parasitos selvagens e transfectados. Já nos ensaios de infecção in vitro utilizando-se células Vero, observou-se que o T.rangeli TcTS apresentou maior capacidade de infecção quando comparados ao T. rangeli selvagem, não sendo observado nenhum indício de divisão celular para esses parasitos após 120 horas de interação. Os resultados apontam que a expressão heteróloga da TcTS por T. rangeli embora não altere o tempo e o padrão da parasitemia experimental in vivo em camundongos, promoveu mudanças no comportamento da interação parasito-vetor e parasito-célula, reduzindo sua capacidade de penetração nas glândulas salivares de R. prolixus e facilitando a entrada do parasito em células in vitro. <br> / Abstract: The Trypanosoma cruzi trans-sialidases (TcTS) are able to cut and transfer sialic acid from the host cell to the parasite surface and are important molecules on this interaction. Trypanosoma rangeli is a non-pathogenic parasite to mammal, that posses an unknown life cicle in this host, and it has similar genes to TS family members in the genome, however, with no catalytic activity. Once TS are crucial molecules involved in parasite-host cell interaction in the pathogenic parasite, and the absence of TS activity is pointed as one of the reasons of its inability capacity of infecting and surviving in mammals cells, the aim of this work was to study the roll of TS in the host-parasite interaction using T. rangeli expressing an active TcTS (T. rangeli TcTS). After transfection and assessment of protein activity, 4° and 5° instar nymphs of Rhodnius prolixus were infected by intracelomic inoculation of T. rangeli wild type and T. rangeli TcTS epimastigote forms. A statistically significant difference was observed in the number of salivary gland infected for T. rangeli wild type (92%) and for T. rangeli TcTS (16%) at six weeks p.i.. Parasitemia of BALB/c mice and C57BL/6 infected by T. rangeli TcTS showed no difference from mice infected with non-transfected parasites. For in vitro infection assays with Vero cells, T. rangeli TcTS presented higher infection rates when compared with T. rangeli wild type, but no indication of intracellular division was detected for these parasites up to 120 hours. Despite not altering the parasitemia in mice, our results indicate that TcTS expressed by T. rangeli may be responsible for changes on the interaction between vector-parasite and cell-parasite by reducing the ability to penetrate on R. prolixus salivary glands and facilitating cell entry in vitro.

Noctiliostrebla Wenzel, 1966 pertence a Streblidae, uma família de moscas parasitas exclusivas de morcegos, e compreende atualmente quatro espécies divididas em dois grupos, grupo A: Noctiliostrebla dúbia (Rudow, 1871) e N. traubi Wenzel, 1966; e grupo B: N. aitkeni Wenzel, 1966 e N. maai Wenzel, 1966. O gênero está incluído dentro da subfamília Trichobiinae, junto com Paradyschiria Speiser, 1900, sugerido como seu grupo-irmão hipotético. Com uma classificação sistemática complicada e poucos estudos taxonômicos, Noctiliostrebla caracteriza-se como um grupo muito homogêneo e de difícil distinção entre suas espécies. Restrito ao continente americano, exibe um alto grau de especificidade em relação às duas únicas espécies de morcegos do gênero Noctilio Linnaeus, 1766, N. albiventris Desmarest, 1818 e N. leporinus (Linnaeus, 1758). Não existem trabalhos filogenéticos para Noctiliostrebla, sendo que, os únicos estudos envolvendo Streblidae foram feitos para propor uma hipótese de relacionamentos entre as famílias de Hippoboscoidea. O projeto tem como objetivos realizar a revisão taxonômica do gênero Noctilostrebla e reconstruir uma hipótese de relacionamento entre as espécies do gênero, utilizando caracteres morfológicos e um conjunto de dados moleculares composto por três genes mitocondriais (12S, COI e cytB) e um gene nuclear (CAD). Dois métodos de análise foram empregados: análise de parcimônia, com pesagem igual dos caracteres, e análise de máxima verossimillhança. As análises foram realizadas com dados morfológicos e moleculares separados, enquanto os dados moleculares foram analisados com genes concatenados e separados em mitocondriais e nucleares. Como resultados, as quatro espécies já descritas foram consideradas válidas, sendo aqui redescritas, e outras seis novas espécies foram descritas. Do total de onze espécies, cinco são parasitas restritos de N. albiventris e seis de N. leporinus. As estruturas abdominais forneceram os únicos caracteres diagnósticos encontrados para separação entre as espécies. Tanto a análise morfológica como a molecular recuperaram Noctiliostrebla como monofilético e corroboraram a divisão do gênero em dois clados morfologicamente distintos. As análises com genes mitocondriais e nucleares foram incongruentes com relação a alguns clados, o que pode ser um indicativo de histórias filogenéticas diferentes. Os resultados obtidos para Noctiliostrebla apresentaram semelhanças com as hipóteses consideradas para os hospedeiros / Noctiliostrebla Wenzel 1966 belongs to Streblida, a family of batflies, and currently comprises four species divided into two groups, group A: Noctiliostrebla dubia (Rudow, 1871) and N. traubi Wenzel, 1966; Group B: N. aitkeni. Wenzel, 1966 and N. maai Wenzel, 1966. The genus is included within the Trichobiinae subfamily, along with Paradyschiria Speiser, 1900, suggested as your hypothetical sister group. With a complicated systematic classification and a few taxonomic studies, Noctiliostrebla is characterized as a very homogeneous group and difficult to distinguish between their species. Restricted to the American continent, exhibits a high degree of specificity with the only two bats species of the genus Noctilio Linnaeus, 1766, N. albiventris Desmarest, 1818 and N. leporinus (Linnaeus, 1758). There are no phylogenetic works with Noctiliostrebla and the only studies involving Streblidae were made to propose a relationship hypothesis among Hippoboscoidea families. The project aims to conduct a taxonomic revision of the Noctilostrebla genus and to rebuild a relationship hypothesis among Noctilostrebla species using morphological and molecular data set, with three mitochondrial genes (12S, COI and cytB) and one nuclear gene (CAD). Two analysis methods were used: parsimony with equal weighting of characters and lielihood. The analyses were performed using morphological and molecular data separate, while the molecular data were analyzed with concatenated genes and separated into mitochondrial and nuclear genes. As a result, the four described species were considered valid being here redescribed, and six new species have been described. Of all eleven species, five are restricted parasites of N. albiventris and six are restricted parasites of N. leporinus. The abdominal structures provided the only diagnostic characters found for separation of the species. Both morphological and molecular analysis recovered a monophyletic Noctiliostrebla and supported the division of the genus into two distinct clades. The analyses of mitochondrial and nuclear genes showed inconsistent clades, which may be indicative of different phylogenetic histories. The results obtained for Noctiliostrebla showed similarities with the assumptions for the hosts

Orientador: Tomomasa Yano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-20T10:47:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_UlyssesMoraesde_D.pdf: 2448644 bytes, checksum: a8c06336047dc5096dd7e6f7259d48ee (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic digital document / Doutorado / Anatomia Patologica / Doutor em Medicina