In Bakterien werden Phospholipide auf der cytoplasmatischen Seite der Plasmamembran synthetisiert. Damit ein gleichmäßiges Wachstum und somit die Stabilität biogener Membranen, d.h. Membranen, an bzw. in denen Lipidsynthese stattfindet, gewährleistet ist, muss zumindestens die Hälfte neu synthetisierter Lipide auf die entgegengesetzte Membranhälfte gelangen. Aus früheren Untersuchungen ist bereits bekannt, dass dieser transversale Phospholipidaustausch, auch als Flip-Flop bezeichnet, sehr schnell, kopfgruppenunabhängig und möglicherweise proteinabhängig ist. Dennoch sind die genauen Mechanismen dieser Prozesse noch weitgehend unverstanden. Um die oben erwähnten grundlegenden Phospholipidtransportprozesse zwischen beiden Membranhälften genauer untersuchen zu können, wandten wir einen neuartigen, sogenannten stopped-flow BSA back-extraction Assay an. Mit Hilfe dieses Assays, waren wir in der Lage, die transversale Bewegung und die Verteilung von kurzkettigen, fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga über beide Membranhälften in ex vivo-Membranen zu charakterisieren. Der stopped-flow BSA back-extraction Assay basiert auf der Technik der stopped-flow-Spektroskopie und der Tatsache, dass BSA in der Lage ist, kurzkettige, fluoreszenzmarkierte Lipidanaloga aus der äußeren Leaflet von (biologischen) Membranen zu extrahieren. Wir entschieden uns für invertierte Membranvesikel der Plasmamembran (IIMV) vom E.coli Wildtypstamm MG1655 als Untersuchungsobjekt, einerseits, weil diese Vesikel nur eine Membran besitzen und zum Anderen, weil IIMV sich sehr gut als Modell für den Flip-Flop von Phospholipiden nutzen lassen. Wir beobachteten, dass kurzkettige, fluoreszenzmarkierte Analoga der beiden am häufigsten in E.coli vorkommenden Phospholipide, Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylglycerol (PG), sehr schnell, d.h. mit Halbwertzeiten von weniger als drei Minuten, über die Membran von IIMV verteilten. Weiterhin verhielten sich kurzkettige, fluoreszenzmarkierte Analoga von den E.coli-fremden Phospholipiden, Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylserin (PS), ähnlich wie die Analoga von PE und PG. Überraschenderweise, fanden wir heraus, dass alle oben genannten Phospholipidanaloga im Gleichgewichtszustand nicht gleichmässig über beide Membranhälften verteilt waren. Inwiefern Proteine an dieser transversalen Bewegung der Phospholipidanaloga beteiligt sind, sollten Messungen des Flip-Flop von Analoga an unbehandelten und mit Proteinase K inkubierten Vesikeln zeigen, die aus einem Detergenzextrakt von IIMV rekonstituiert wurden. Zunächst konnten wir zeigen, dass die schnelle Bewegung der Phospholipidanaloga über die Membran von rekonstituierten, nicht mit Proteinase K behandelten Vesikeln (Proteoliposomen) erhalten blieb. Nach Inkubation mit Proteinase K wurde jedoch der Flip-Flop von PE- und PG-Analoga vollständig inhibiert. Untersuchungen an rekonstituierten Serien von Proteoliposomen mit ansteigendem bakteriellen Proteingehalt zeigten, dass in Proteoliposomen ohne bakterielle Proteine kein Flip-Flop stattfand und somit nur 50% der fluoreszenten Analoga extrahiert wurden. In Proteoliposomen, die bakterielle Proteine enthielten, stieg das Ausmass der Extrahierbarkeit der untersuchten Analoga mit steigendem Proteingehalt. Diese Daten zeigten sehr deutlich, dass die transversale Bewegung von Phospholipiden über die innere Membran von E.coli durch Proteine vermittelt wird. Schlussfolgernd aus unseren Analysen konnten wir zeigen, dass die transversale Bewegung von Phospholipidanaloga über die Membran von IIMV sehr schnell, proteinabhängig, bidirektional und kopfgruppenunbhängig ist. Zur Identifizierung der molekularen Grundlagen der proteinvermittelten, schnellen Transversalbewegung von Phospholipiden über IIMV-Membranen, nutzen wir Ionenaustauschchromatografie. Zur unserer Überraschung mussten wir feststellen, dass in keiner der rekonstituierten Fraktionen eine nennenswerte Anreicherung der Flippaseaktivität auftrat. Möglicherweise sind mehrere Proteine, mit unterschiedlichen Nettoladungen, oder aber auch Untereinheiten, die sich nicht durch Anionenaustauscher trennen liessen, am Flip-Flop von Phospholipiden beteiligt. Weitergehende Analysen mit anderen Proteinfraktionierungsmethoden sind notwendig, um den oder die Flippasekomplex(e) zu identifizieren. / In the plasma membrane of bacteria, phospholipids are synthesized on the cytoplasmic leaflet of the plasma membrane. To ensure balanced growth and thus, stability of biogenic membranes, half of the newly synthesized lipids must move to the opposing leaflet. It is known that this phospholipid transmembrane movement (flip-flop) is rapid, head-group independent and possibly protein mediated. However, the exact mechanism of this process remains elusive. To investigate these fundamental transbilayer phospholipid transport processes in biogenic membranes, a novel stopped-flow BSA back-exchange assay was utilized to characterize the transmembrane movement and transbilayer distribution of fluorescent labeled, short-chain phospholipid analogues in ex vivo membranes. This approach is based on stopped-flow fluorescence spectroscopy, and the fact that BSA is able to extract fluorescent labeled, short-chain phospholipid analogues from the outer leaflet of (bio)membranes. We chose isolated inverted inner membrane vesicles (IIMV) derived from E.coli wild type MG1655, both for their simple membrane organization and for their suitability as a simple model organism for phospholipid flip-flop. We observed that fluorescent-labeled, short-chain analogues of the major phospholipids in E.coli, phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylglycerol (PG), rapidly redistributed across the IIMV bilayer with half-times of less than three minutes. Furthermore, fluorescent, short-chain phospholipid analogues of phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylserine (PS), which are not naturally occurring phospholipids in E.coli membranes, behaved similar to the PE and PG analogues. To analyze the relevance of proteins for the transmembrane movement of fluorescent analogues, we measured flip-flop of phospholipid analogues in reconstituted and/or untreated and proteinase K treated vesicles generated from protein detergent extracts of IIMV. The amount of extractable fluorescent phospholipids analogues correlated with the amount of protein reconstituted into the proteoliposomes, strongly indicating, that protein concentrations below 100 µg/ml were not sufficient to equip every vesicle with proteins that facilitate the transmembrane movement of the fluorescent analogues. We found that the rapid transbilayer movement of phospholipid analogues across the membrane was maintained in untreated reconstituted vesicles. However, the flip-flop of fluorescent PG and PE analogues was eliminated in proteinase K treated vesicles. In conclusion, our analysis showed that the transmembrane movement of the phospholipid analogues across the membrane of IIMV was protein-mediated, very rapid, bi-directional and head-group independent. To identify the molecular basis of the protein-mediated, rapid transmembrane movement of phospholipids across IIMV membranes, we used ion exchange chromatography (IEC) to separate the IIMV proteins. To our surprise, we did not observe an enhanced flip-flop activity in any of the fractions, indicating that at least two proteins with possibly opposite net charges or several subunits, which were not separable by AEC, are involved. Further analysis using different protein separation techniques will be necessary to identify the putative flippase complex.

Les maladies métaboliques d’origine nutritionnelle sont caractérisées par un métabolisme des lipides perturbé et une inflammation métabolique. Les lipides polaires (LP) sont des agents émulsifiants utilisés dans l’industrie agroalimentaire. Le but de notre étude a été d’évaluer l’impact de l’utilisation de nouveaux LP issus du lait sur (i) la digestion et le métabolisme postprandial des lipides, et (ii) à plus long terme sur l’adiposité et l’inflammation dans le tissu adipeux (TA), en comparaison avec les LP de soja, actuellement les plus consommés.Chez la souris, les LP laitiers induisent une cinétique de lipémie postprandiale plus précoce en comparaison avec les LP de soja, associée à une augmentation de la lipolyse intestinale in vitro. De plus, les chylomicrons sécrétés durant le pic de lipémie sont plus petits avec les LP laitiers. D’autre part, la substitution d’une partie des lipides d’un régime hyper-lipidique par des LP laitiers ne modifie pas le stockage des lipides dans le foie et le TA contrairement aux LP de soja qui induisent une augmentation des lipides hépatiques, des adipocytes et des marqueurs inflammatoires dans le TA. Par ailleurs, Les LP laitiers induisent une diminution de l’expression génique de marqueurs de l’infiltration macrophagique dans le TA et du nombre de cellules à gobelet dans le côlon, suggérant une barrière intestinale renforcée.Ces travaux démontrent que les LP laitiers, par rapport aux LP de soja, stimulent la digestion des lipides et induisent une cinétique plus rapide de lipémie postprandiale. A long terme ils n’induisent pas les altérations métaboliques du TA observées en présence de LP de soja dans un régime hyper-lipidique / Metabolic diseases are characterized by an altered lipid metabolism and metabolic inflammation. Numerous food products contain polar lipid (PL) emulsifiers that could impact these risk factors. We evaluated the impact of using PL from milk (MPL) (i) acutely on lipid digestion and postprandial lipemia and (ii) in the longer term in addition to a high fat diet on adiposity and adipose tissue inflammation. We compared MPL to soybean PL (SPL) that is currently the main commercial source of PL.In mice, an emulsion stabilized by MPL results in a more rapid postprandial lipemia than an emulsion stabilized by SPL, with an early increase in lipemia and a faster clearance. Differences in lipemia can originate from differential kinetics of lipid hydrolysis in the mouse gut, as an increase intestinal TG hydrolysis is observed in vitro. Moreover, early MPL-derived chylomicrons are smaller than SPL-derived chylomicrons. In the longer term, compared with HF diet, HF-SPL diet increases hepatic lipids, white adipose tissue (WAT) mass, with larger and more numerous adipocytes and increases expression of pro-inflammatory adipokines. This is not observed with HF-MPL diet despite similar dietary intakes. HFP-MPL mice have a lower expression in WAT of marker of macrophage infiltration and more numerous goblet cells in the colon, suggesting an improved gut barrier function with this diet.Postprandial lipemia in mice can be modulated by emulsifying with MPL compared with SPL, partly through differences in chylomicron assembly, and intestinal TG hydrolysis rate. Moreover unlike SPL, MPL in a high fat diet do not induce WAT hypertrophy and inflammation

Les lipides cationiques sont des molécules amphiphiles chargées positivement et couramment utilisées comme vecteur de transfection tant in vitro qu'in vivo avec une bonne efficacité. <p><p>Cependant, la transfection in vivo par voie intraveineuse à l'aide de complexes lipides cationiques/ADN (lipoplexes) induit une réponse inflammatoire, attribuée à la présence de séquences CpG dans les plasmides transportés, et qui limite l'efficacité de transfection des complexes.<p><p>Il a été montré dans notre laboratoire que la pré-injection de liposomes de diC14-amidine, un lipide cationique mis au point dans notre laboratoire, avant l'injection des lipoplexes diC14-amidine/ADN permettait d'augmenter l'efficacité de transfection tout en diminuant la production de TNF-¦Á dans le sérum [Elouahabi et al. 2003b]. Ce résultat suggérait une nouvelle propriété anti-inflammatoire de la diC14-amidine dans le cas d'une inflammation causée par les lipoplexes de diC14-amidine/ADN. <p><p>Dans le présent travail, nous d¨¦montrons que les macrophages de la rate sont les principales cellules productrices de TNF-¦Á suite à l'injection intraveineuse des lipoplexes à des souris. Ces mêmes cellules sont également la principale cible des liposomes de diC14-amidine après injection intraveineuse. Nous avons dès lors centré notre étude sur ce type cellulaire, en utilisant une lignée établie de macrophages murins. <p><p>Nos résultats ont permis de confirmer la capacité des liposomes de diC14-amidine à inhiber la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires induites par des séquences CpG, des lipopolysaccharides ou des poly(I :C). Fait intéressant, la présence de sérum est indispensable à la propriété anti-inflammatoire des liposomes de diC14-amidine. Par fractionnement successifs des composants du sérum, nous avons pu montrer que seuls les phospholipides des lipoprotéines pouvaient conférer cette propriété aux liposomes de diC14-amidine. <p> / Doctorat en sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cette thèse est une étude théorique et expérimentale sur la formation de liposomes par des procédés utilisant le dioxyde de carbone (CO2) supercritique. Les liposomes sont des vésicules sphériques nano- ou micrométriques dont la paroi est composée d’une ou plusieurs bicouches concentriques de phospholipides séparant un milieu aqueux d’un autre. L’efficacité des procédés supercritiques, comme alternative aux méthodes conventionnelles pour former des liposomes, a déjà été démontrée. Une synthèse critique des résultats de la littérature a été réalisée au cours de ce travail. Parallèlement, une étude fondamentale sur le comportement des systèmes ternaires CO2/eau/surfactant sous pression a été menée et il a été démontré qu’en fonction du type d’émulsions formées au cours du procédé sous pression, les caractéristiques des liposomes produits lors de la dépressurisation sont différentes. Le procédé Supercritical Anti-Solvent a été utilisé pour microniser des phospholipides. Des liposomes sphériques, multilamellaires et de tailles comprises entre 0,1 et 1µm ont ensuite été formés de manière reproductible par hydratation des phospholipides micronisés. Dans les mêmes conditions (même solvant), la méthode conventionnelle de Bangham n’a pas donné des résultats reproductibles et les liposomes formés n’étaient pas tous sphériques. Le résultat majeur de ce travail est la mise au point d’un procédé supercritique innovant. Innovant car continu et en une seule étape, le procédé Continuous Anti-Solvent permet de former de manière reproductible des liposomes sphériques, multilamellaires et de tailles comprises entre 10 et 100µm. / The present thesis is dedicated to liposome formation using supercritical carbon dioxide (CO2). Liposomes are spherical vesicles composed of one or more concentric phospholipid bilayers surrounding an aqueous core. Dense gas processes offer reliable alternatives to conventional methods in liposome formation. We present a review of the literature and we summarized all of the results in a discussion section, with particular attention to emulsion formation under pressure. As it has been shown, the phase behaviour of the ternary CO2/water/surfactant system under pressure greatly influences liposome formation during depressurization. The Supercritical Anti-Solvent process has been used to micronized phospholipids. Then, the micronized particles were hydrated to form spherical and multilamellar liposomes with diameters between 0.1 and 1µm in a reproducible way. Using the same conditions (the same solvent), the conventional Bangham method did not provide reproducible assay results and formed liposomes were not all spherical. The main result of this work is the design of a new supercritical process dedicated to liposome formation. Unlike the current dense gas technologies, the Continuous Anti-Solvent method breaks new ground because it is a single step and continuous process. Liposomes prepared with the Continuous Anti-Solvent method are spherical and multilamellar with diameters between 10 and 100µm.

Les aliments riches en acides gras polyinsaturés (AGPI) à longue chaîne (LC) de la série n-3 sont recommandés pour leurs effets bénéfiques sur la santé humaine et en particulier dans la prevention du développement des maladies métaboliques. Or, la biodisponibilité de ces AGPI et leur impact métabolique pourraient être modulés par la nature chimique des molécules qui les véhiculent dans les aliments (triacylglycérols, TG ou phospholipides, PL). De plus, ces AGPI sont sensibles à la peroxydation lipidique. S’ils ne sont pas protégés de l’oxydation, ils peuvent former des espèces réactives toxiques comme le 4-hydroxy-hexénal (4-HHE). Dans ce contexte, le but de notre étude a été d’évaluer l’impact de l’enrichissement de régimes hyperlipidiques en AGPI n-3 (i) portés par des TG ou des PL et (ii) sous forme non-oxydée ou oxydée, sur l’inflammation et le stress oxydant métaboliques et d’en comprendre certains mécanismes liés à l’absorption intestinale et la réactivité du 4-HHE. D’une part, notre étude a confirmé que la consommation d’AGPI-LC n-3 empêche l’induction du stress oxydant et de l’inflammation lors d’un régime hyperlipidique chez la souris. Cependant, par rapport aux TG, les PL vecteurs d’AGPI n-3 permettent de réduire la taille des adipocytes et de stimuler le système antioxydant. D’autre part, notre étude a montré que la consommation d’AGPI n-3 oxydés de manière modérée aboutit à une élévation des concentrations plasmatiques de 4-HHE et des marqueurs inflammatoires. De plus, une activation des voies inflammatoires ainsi que du stress du réticulum endoplasmique ont été détectées au niveau de l’intestin grêle. Nos résultats in vivo et in vitro sur cellules intestinales Caco-2/TC7 indiquent que cela peut être dû en partie à une absorption au niveau intestinal du 4-HHE, produit d’oxydations des AGPI n-3. Dans le contexte du développement des aliments contenant des AGPI-LC n-3, nos résultats contribuent à identifier les structures vectrices de ces acides gras les plus efficaces du point de vue métabolique. En santé publique et en pratique clinique, nos résultats constituent une nouvelle base de réflexion pour la mise en place de bonnes pratiques de production et de conservation des aliments et des compléments nutritionnels enrichis en AGPI-LC n-3 pour éviter leur oxydation et ses possibles effets délétères. / Dietary intake of n-3 long chain (LC) polyunsaturated fatty acids (PUFA) are recommended for their beneficial effects on human health, especially to prevent the development of metabolic diseases. However, the bioavailability of these PUFAs and their metabolic impact could be modulated by their chemical carriers (triacylglycerols, TG or phospholipids, PL). In addition, these PUFA are susceptible to lipid peroxidation. If they are not protected from oxidation, they can form toxic reactive species such as 4-hydroxy-hexenal (4-HHE). In this context, the aim of our study was to evaluate the impact of enriching high-fat diets with n-3 PUFA (i) bound to TG or PL and (ii) in unoxidized or oxidized form on the generation of inflammation and oxidative stress, and to understand some underlying mechanisms associated with intestinal absorption and reactivity of 4-HHE. On the one hand, our study confirmed in mice that the consumption of n-3 PUFA protects against oxidative stress and inflammation induced by high-fat diets. However, compared to TG, n-3 PUFA in the form of PL reduce the size of adipocytes and stimulate the antioxidant system. On the other hand, our study showed that the consumption of moderately oxidized n-3 PUFA results in increased plasma concentrations of 4-HHE and of inflammatory markers. In addition, activation of inflammatory pathways as well as endoplasmic reticulum stress were detected in the small intestine. Our results in vivo and in vitro, using intestinal Caco-2/TC7 cells, indicate that this can be partly due to the intestinal absorption of the end-product of n-3 PUFA oxidation, 4-HHE. In the context of the development of foods containing LC n-3 PUFA, our results contribute to identify the most effective PUFA carriers on a metabolic standpoint. Regarding public health and clinical practice, our results provide new basis for the set up of best practices regarding production and storage of food and supplements enriched with LC n-3 PUFA to avoid their lipid oxidation and its possible deleterious effects.

L'Annexine A5 (Anx5) est une protéine de la famille des annexines qui présente la propriété de s'organiser à la surface des bicouches lipidiques en trimères et en assemblages bidimensionnels (2D) de trimères. Ce travail de thèse concerne le développement d'applications biotechnologiques des assemblages 2D d'Anx5 ainsi qu'une étude des propriétés fonctionnelles de ces assemblages. Ces travaux ont été réalisés principalement à l'aide des méthodes de la microbalance à cristal de quartz avec mesure de dissipation (QCM-D) et de la microscopie à force atomique (AFM). <br />La première partie de cette thèse concerne le développement de plates-formes d'ancrage basées sur des assemblages 2D de protéines dérivées de l'Anx5. Des complexes covalents entre l'Anx5 et des peptides d'adhésion cellulaire pour la réalisation de plates-formes d'ancrage de cellules. Des protéines de fusion entre l'Anx5 et un fragment de la protéine A ont d'autre part servi au développement de plates-formes 2D pour l'immobilisation contrôlée d'anticorps et de protéines. <br />La seconde partie de cette thèse concerne l'étude des propriétés fonctionnelles des assemblages 2D d'Anx5. L'étude de l'interaction d'un anticorps anti-phospholipide avec les assemblages 2D d'Anx5 montre que cet anticorps ne perturbe pas l'organisation 2D de l'Anx5. La seconde étude concernant l'influence des assemblages 2D de l'Anx5 sur la dynamique des bicouches lipidiques établie une corrélation entre la formation de trimères et le ralentissement de la dynamique des membranes.<br />Ces travaux contribuent à notre compréhension des propriétés des assemblages 2D d'Anx5 et permettent d'envisager le développement de biocapteurs pour cellules ou molécules.

Les fluorocarbures ont un fort potentiel en médecine. Cependant, et en dépit du fait que certaines formulations employant des fluorocarbures sont utilisées en clinique, il n’existe que relativement peu d’études visant à déterminer les interactions entre un fluorocarbure et une membrane de phospholipides. Notre étude concentre à l’interface fluorocarbure/phospholipide, qui représente d’une part un modèle simplifié du surfactant pulmonaire natif dont le composant majoritaire est la dipalmitoylphosphatiylcholine (DPPC), et d’autre part la paroi de microbulles développées comme nouveaux agents théranostiques.Tout d’abord, nous montrons que les fluorocarbures abaissent considérablement la tension interfaciale d’équilibre d’une série de phospholipides et accélèrent fortement leur adsorption. Nous montrons que des oscillations périodiques appliquées à la bulle induisent une transition du film de DPPC vers un état d’organisation plus dense. L’application d’oscillations périodiques permet aussi à la DPPC d’expulser du film interfacial une protéine, l’albumine, dont la présence est souvent liée aux troubles dus au mauvais fonctionnement du surfactant pulmonaire. L’effet des fluorocarbures, qui accélère considérablement l’expulsion de l’albumine par la DPPC, est également étudié. D’autre part, nous avons obtenu des microbulles exceptionnellement stables grâce à une série homologue de phosphates perfluoroalkylés. Nous avons également réussi à former des microbulles couvertes par des nanoparticules magnétiques, tout en gardant les propriétés échogènes des bulles. De telles microbulles offrent un potentiel comme des agents de contraste bimodaux pour l’IRM et l’échosonographie. / Fluorocarbons have a great potential in medicine. However, and despite the fact that some formulations using fluorocarbons are used clinically, only a few studies are reported that aim to determining the interactions between a fluorocarbon and a membrane of phospholipids. Our work concentrated on the fluorocarbon/phospholipid interface, which represents, on one hand, a simplified model of the lung surfactant, the major component of which is dipalmitoylphosphatiylcholine (DPPC), and on the other hand, the shell of microbubbles developed as new theranostic agents. In a first part, we show that fluorocarbons significantly reduce the equilibrium interfacial tension of a series of phospholipids and greatly accelerate their adsorption rate. We also show that periodical oscillations applied to the bubble induce a transition of DPPC film to state with a denser organization. The application of periodical oscillations also allows DPPC to expel from the interfacial film a protein, albumin, whose presence is often associated with disorders caused by dysfunction of the lung surfactant. The impact of fluorocarbons, which considerably accelerate the expulsion from the interfacial film of albumin, is also studied. In a second part, we have obtained exceptionally stable microbubbles with a homologous series of perfluoroalkylated phosphates. We were also able to form microbubbles covered by magnetic nanoparticles, while preserving the echogenicity of the bubbles. Such microbubbles offer a potential as bimodal contrast agents for MRI and echography.

Présentement, la désorption ionisation laser assistée par la matrice (MALDI) est la méthode d’ionisation préférentielle pour étudier les lipides par l’imagerie par spectrométrie de masse (IMS). Bien qu’il existe les matrices spécifiques aux lipides, tel que la 1,5-DAN pour les phospholipides et la 2,5-DHB pour les triacylglycérols, il est toujours nécessaire d’augmenter la sensibilité de cette technique pour les échantillons atypiques ou certaines classes de lipides. Dans la première étude, nous avons amélioré la sensitivité pour les phospholipides sur les tubes de Malpighi de mouches prélevés par microdissection dans un tampon physiologique à base de sodium et potassium. Un protocole de lavage à deux étapes a était trouvé favorable : un premier rinçage dans le glycérol suivi d’un second rinçage dans l’acétate d’ammonium. Ce protocole permet de réduire au maximum la présence de sels sans délocalisation notoire des phospholipides. La détection et l’imagerie des phospholipides en ionisation négative et positive ont suggéré une distribution uniforme sur toute la longueur des tubes. Ces résultats ont été comparés à ceux obtenus sur des sections tissulaires minces de mouche entière acquis avec les deux polarités. Néanmoins, la structure tridimensionnelle complexe des tubes rénaux suggère que la microdissection est l’approche la plus favorable pour en étudier leur lipidome. Dans la deuxième étude, nous avons déterminé que l’addition de formate d’ammonium (AF) peut améliorer la détection des gangliosides par IMS dans le cerveau. Curieusement, il est nécessaire de rincer l’échantillon dans une solution d’AF avant l’addition de ce même sel suivit d’une conservation de l’échantillon dans un congélateur pendant 24 heures après la déposition de la matrice afin d’obtenir la meilleure augmentation de sensibilité. En moyenne, cette approche a permis d’augmenter l’intensité d’un facteur dix avec trois fois plus d’espèces de gangliosides détectées. De plus, malgré l’étape de lavage, nous n’avons pas observé la délocalisation des gangliosides puisqu’il est toujours possible d’obtenir les résultats d’IMS de qualité avec une résolution spatiale de 20 µm. Finalement, nous avons établi que le nitrate d’argent permet l’analyse des oléfines par IMS, en particulier du cholestérol. En optimisant le protocole de déposition par nébulisation, il est possible de générer une couche mince et homogène de nitrate d’argent ce qui rend la possibilité d’effectuer l’IMS à haute résolution spatiale, jusqu’à 10 µm, sans perte de qualité comparativement aux autres approches publiées. L’ensemble de ce travail démontre l’effet du sel sur la sélectivité et la sensibilité pour cibler les familles de lipides désirées, ce qui nécessite les études ultérieures sur le rôle de ces sels lors du processus de la désorption-ionisation. / Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry (MALDI IMS) is currently the ionization method of choice for elucidating the spatial distribution of lipids on thin tissue sections. Despite the discovery of lipid friendly matrices such as 1,5-DAN for phospholipids and 2,5-DHB for triacylglycerols, there is a continued need to improve sensitivity. In the first study, we improved the overall sensitivity for phospholipids of entire fly Malpighian tubules microdissected in PBS with a two-step wash in glycerol followed by ammonium acetate that removed the bulk of the salt with minimal species delocalization and tubule displacement. We were able to detect phospholipids in both positive and negative ion modes and revealed an even distribution of most phospholipids along the length of this organ. We compared the method to the results from whole body fly sections acquired in dual-polarity mode at the same spatial resolution and found it to be more suitable for studying the tubules because of the complex three-dimensional structure of this organ within the fly. In the second study, we observed a marked improvement in ganglioside signals on mouse brain tissue sections with ammonium salt addition. Specifically, when the sample was first desalted in a low concentration ammonium formate solution, spray-coated with the same salt, coated with matrix and finally left in the freezer overnight before data acquisition, we observed an average overall improvement in ganglioside signal intensity by ten-fold and the number of species detected by three-fold. This method also did not affect the spatial distribution of the gangliosides, as high spatial resolution IMS results acquired at 20 µm showed no species delocalization. Finally, we sought to determine if salts could be employed directly as matrices. In this work, we tested silver-based metal salts and discovered that spray depositing silver nitrate alone is a viable method for the IMS detection of olefins, particularly cholesterol. With the optimized dry spray parameter, the overall deposition is homogeneous and composed of microscopic salt crystals that allow for high spatial resolution IMS down to 10 µm while maintaining acceptable overall signal quality comparable to that of previously published protocols. Overall, this thesis demonstrates we can manipulate the local salt distribution to influence the sensitivity and selectivity to target specific lipid subfamilies, opening the door for future research to understanding the role salts play during the laser desorption/ionization process.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden fluoreszierende Sphingomyelin-Analoga zu Studium der sauren Sphingomyelinase (ASM) synthetisiert. Ausgehend von L-Serin wurde ein Sphingosin-Derivat mit natürlicher Stereochemie dargestellt. Anschließend wurde mittels Phosphorodichloridat-Chemie eine Aminoethylphosphat-Gruppe installiert. Zweifache Fluoreszenzmarkierung ergab Sonden mit der Fähigkeit zu Förster-Resonanzenergietransfer (FRET). Diese wurden als Substrate der ASM akzeptiert und erlaubten die Verfolgung der Enzymaktivität in vitro. Durch die Analyse der photophysikalischen Eigenschaften der Fluorophore wurde das allgemeine Konzept der Phasentrennungs-gestützten Signalverstärkung (PS) abgeleitet. Dieses Konzept wurde erfolgreich bestätigt durch die Synthese einer 30-mal leistungsfähigeren zweiten Generation der FRET-Sonde. Ein homogener Assay wurde entwickelt, der die Quantifizierung der ASM-Aktivität erlaubte. Unter Verwendung von gereinigter rekombinanter humaner ASM, HeLa-Zelllysaten oder Lysaten von murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) als Enzymquelle wurde ausschließlich unter den von der ASM bevorzugten Bedingungen eine vollständige und spezifische Hydrolyse der Sonde beobachtet. Des Weiteren erlaubte die Sonde die Detektion relativer Unterschiede der Aktivität der ASM in kultivierten MEFs mittels Fluoreszenzmikroskopie mit Zweiphotonenanregung (2PE). / Fluorescent sphingomyelin analogues have been synthesized to probe the acid sphingomyelinase (ASM). Starting from L-serine, a sphingosine with natural stereochemistry was synthesized. Subsequently, phosphorodichloridate chemistry was used to install an aminoethyl phosphate moiety. Dual fluorescent labeling afforded probes capable of Förster resonance energy transfer (FRET). They were recognized as substrates of ASM and allowed for monitoring of the enzyme’s activity in vitro. Through analysis of the fluorophores’ photophysical properties, the general concept of partition aided amplification of a FRET probe’s signal (PS) was developed. This concept was successfully confirmed by the synthesis of a second-generation probe with 30-fold improved response. A homogenous assay was developed, which allowed for a quantitation of ASM activity. Using either purified recombinant human ASM, or lysates of HeLa cells or mouse embryonic fibroblasts (MEFs) as an enzyme source, complete and specific cleavage was observed exclusively under conditions preferred by ASM. Furthermore, the probe enabled the detection of relative levels of ASM activity in cultivated MEFs using fluorescence microscopy with two-photon excitation (2PE).

Les membranes cellulaires naturelles sont des structures complexes et posent de nombreux problèmes lorsqu'elles sont étudiées dans leur forme native. Par conséquent, des systèmes modèles lipidiques plus simples sont souhaitables pour étudier les composants des membranes cellulaires et leur interaction avec les molécules biologiques. Immobiliser ces modèles lipidiques sur des surfaces solides métalliques, pour former des bicouches biomimétiques supportées (SLB pour Supported Lipid Bilayer en anglais), est encore plus avantageux grâce leur adaptabilité à de nombreuses techniques de caractérisation de surface, telles que la microscopie de force atomique (AFM), la spectroscopie de résonance des plasmons de surface (SPR), l’électrochimie et les spectroscopies vibrationnelles (IR, Raman). Former ces bicouches lipidiques supportées par fusion des vésicules a toujours été la technique la plus adaptée vue sa simplicité et son efficacité. Cependant, cette technique exige des conditions expérimentales critiques comme la nécessité de surfaces planes lisses et hydrophiles (mica, verre…), des vésicules à base de phospholipides zwitterioniques en phase fluide, une concentration élevée en lipides, et une longue durée d’incubation (>1h). Dans cette thèse, nous visons à développer une nouvelle méthode simple, rapide et polyvalente permettant de former une large gamme de bicouches biomimétiques supportées, de type zwitterionique et anionique, en phase gel et fluide sur un substrat d’or. Cette nouvelle approche consiste en l’utilisation des réactions d’appariement ionique générées par un système rédox confiné en surface pour induire l’assemblage de phospholipides et former la bicouche lipidique. Le premier objectif de cette thèse est d’étudier le comportement électrochimique d’une monocouche auto-assemblée de ferrocényldodécanethiolates (FcC12SAu) en présence de molécules amphiphiles avec des groupes anioniques de types carboxyle (sel d’acide gras) et phosphate (groupes qu’on trouve dans les phospholipides) et une simple chaîne hydrocarbonée. Dans le même contexte, nous viserons également l’utilisation des réactions d’appariement ionique pour induire l’assemblage des surfactants n-alkyl carboxylate et n-alkyl phosphate à l’interface SAM/électrolyte. Le second objectif de ce travail de thèse consiste en l’utilisation du système rédox confiné en surface pour déclencher par appariement ionique l’assemblage des phospholipides (molécules amphiphiles à double chaînes hydrocarbonées) pour former des bicouches biomimétiques supportées sur une surface d’or, à partir de vésicules unilamellaires, à température ambiante et en quelques minutes. La couverture de surface en ferrocènes et l’hydrophobicité/hydrophilicité de la surface seront altérées par la suite pour investiguer l’effet sur la formation des bicouches lipidiques supportées. / Natural cell membranes are complex structures and may present many problems when studied in their native form. It is therefore desirable to have simpler lipid bilayer systems to study the components of cell membranes and their interaction with biological molecules. Immobilizing these lipid membranes on metallic solid surfaces, to form Supported Lipid Bilayers (SLB), is more advantageous due to the integrity with a wide range of surface-sensitive characterization techniques, such as atomic force microscopy (AFM), surface plasmon resonance spectroscopy (SPR), electrochemistry and vibrational spectroscopies (IR, Raman). The preparation of SLBs by vesicle fusion has always been the most suitable technique due to its simplicity and efficiency, but it requires critical experimental conditions such as the need for smooth and hydrophilic flat surfaces (mica, glass...), vesicles based on zwitterionic phospholipids in fluid phase, high lipid concentration, and lengthy SLB preparation times (>1h). In this thesis, we aim to develop a new simple, fast, and versatile method to form a wide range of supported biomimetic bilayers using zwitterionic and anionic phospholipid vesicles in gel and fluid phase on a gold substrate. This new approach consists in the use of ionic pairing reactions generated by a surface-confined redox system to induce the assembly of phospholipids and form the lipid bilayer. The first part of this thesis focuses on studying the electrochemical behavior of a self-assembled monolayer of ferrocenyldodecanethiolates (FcC12SAu) in the presence of amphiphilic molecules containing a carboxyl (fatty acid salt) and phosphate anionic group and a single hydrocarbon chain. This part will also focus on the use of ion-pairing reactions to induce the assembly of n-alkyl carboxylate and n-alkyl phosphate surfactants at the SAM/electrolyte interface. The second and main objective of this thesis work was subsequently devoted to the use of the surface-confined redox system to trigger by ion-pairing the assembly of phospholipids (amphiphilic molecules with double hydrocarbon chains) to form biomimetic bilayers supported on a gold surface from unilamellar vesicles at room temperature and within minutes. The surface coverage of ferrocenes and the hydrophobicity/hydrophilicity of the surface will be altered later to investigate the effect on the formation of supported lipid bilayers.