ROCHA, F. R. Análise molecular da prevalência dos genes beta-lactamases blaCTX-M, blaSHV e blaTEM em Klebsiella pneumoniae isoladas de pacientes com diagnóstico de infecção hospitalar na Santa Casa de Misericórdia de Sobral, Ceará. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2015. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-29T12:47:17Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_frrocha.pdf: 1459850 bytes, checksum: 6a734a21f99b3793158529da7ea38c47 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-29T12:49:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_frrocha.pdf: 1459850 bytes, checksum: 6a734a21f99b3793158529da7ea38c47 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T12:49:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_frrocha.pdf: 1459850 bytes, checksum: 6a734a21f99b3793158529da7ea38c47 (MD5) Previous issue date: 2015 / Klebsiella pneumoniae is a Gram-negative bacillus responsible for a significant portion of urinary tract infections, respiratory, and bloodstream of adults in hospitals, besides infections in neonates in intensive care units. Its importance has increased due the emergence of extended-spectrum beta-lactamase-producing strains (ESBLs). These enzymes mediate resistance to oxyimino-β-lactams. In K. pneumoniae, most of the identified ESBLs are of the TEM, SHV, and CTX-M types. In addition, carbapenem-hydrolyzing beta-lactamases of KPC and GES types has been detected in these isolates. Outbreaks of nosocomial infections caused by multidrug-resistant K. pneumoniae clones have been described in various regions of the country. However, this is the first report of the genetic characterization of ESBL-producing K. pneumoniae in the state of Ceará, Brazil. This study aimed firstly to detect the main genes responsible for ESBL production in K. pneumoniae strains obtained from patients who developed nosocomial infections in a tertiary support hospital in the northern region of the Ceará state, from November 2013 to August 2014 and, secondly, to analyze the genetic similarity of these isolates. Thirty-six clinical isolates of ESBL-producing K. pneumoniae were evaluated. The detection of blaCTX-M groups 1 and 2, blaSHV-like, blaTEM-like, blaKPC-like, and blaGES-like genes was performed by PCR. Molecular typing of isolates was performed by pulsed-field gel electrophoresis PFGE. Groups 1 or 2 blaCTX-M and blaSHV-like genes were detected in 100% of the isolates and blaTEM-like genes in 55.6%. In addition, 55.6% of CTX-M-producers also produced SHV and TEM. No blaKPC-like and blaGES-like genes were detected. Molecular typing by PFGE showed great diversity between the isolates, although two isolates collected in different wards showed the same banding profile and had the same bla genes and so were considered to belong to a single strain. Detection of blaCTX-M genes in 100% of the isolates suggests that CTX-M enzymes are the major ESBLs responsible for the beta-lactam resistance phenotypes of the studied isolates. Data presented in this study call attention to an endemic resistance problem caused by multiclonal strains of multidrug-resistant K. pneumoniae whose control passes essentially the improvement of antimicrobial prescription policies and the implementation of prevention and control programs the spread of these pathogens in the studied hospital. / Klebsiella pneumoniae é um bacilo gram-negativo responsável por uma parcela significativa de infecções do trato urinário, respiratório e corrente sanguínea de adultos em hospitais, além de infecções em recém-nascidos em unidades de terapia intensiva. Sua importância tem aumentado devido ao surgimento de cepas produtoras de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL). Estas enzimas medeiam resistência aos oxyimino-β-lactâmicos. Em K. pneumoniae, a maioria das ESBL identificadas são dos tipos TEM, SHV e CTX-M. Em adição, β-lactamases que hidrolisam carbapenêmicos dos tipos KPC e GES tem sido detectadas nestes isolados. Surtos de infecção hospitalar causados por clones de K. pneumoniae multiressistentes tem sido descritos em várias regiões do país. No entanto, este é o primeiro relato de caracterização genética de isolados de K. pneumoniae produtores de ESBL no estado do Ceará, Brasil. Este estudo teve como objetivo, em primeiro lugar, detectar os principais genes responsáveis pela produção de ESBL em cepas de K. pneumoniae obtidas a partir de pacientes que desenvolveram infecções hospitalares em um hospital de cuidados terciários na região norte do estado do Ceará, de novembro de 2013 a agosto de 2014 e, em segundo lugar, analisar a similaridade genética destes isolados. Trinta e seis isolados clínicos de K. pneumoniae produtores de ESBL foram avaliados. A detecção dos genes blaCTX-M dos grupos 1 e 2, blaSHV-like, blaTEM-like, blaKPC-like e blaGES-like foi realizada por PCR. A tipagem molecular dos isolados foi realizada por Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE). Os genes blaCTX-M dos grupos 1 ou 2 e blaSHV-like foram detectados em 100% dos isolados e os genes blaTEM-like em 55,6%. Em adição, 55,6% dos produtores de CTX-M também produziram SHV e TEM. Nenhum gene blaKPC-like e blaGES-like foi detectado. A tipagem molecular por PFGE mostrou grande diversidade entre os isolados, contudo dois isolados coletados em diferentes clínicas mostraram o mesmo perfil de bandas e tinham os mesmos genes bla e, então, foram considerados como pertencentes a uma única cepa. A detecção dos genes blaCTX-M em 100% dos isolados sugere que as enzimas CTX-M são as principais ESBL responsáveis pelo fenótipo de resistência aos beta-lactâmicos nos isolados estudados. Dados apresentados neste estudo chamam atenção para um problema de resistência endêmico causado por cepas multiclonais de K. pneumoniae multirresistentes cujo controle passa essencialmente pelo aprimoramento das políticas de prescrição de antimicrobianos e pela implantação de programas de prevenção e controle da disseminação destes patógenos no hospital pesquisado.

SILVA, F. E. R. Detecções de vírus respiratórios e Streptococcus pneumoniae em crianças com pneumonia após a inclusão da vacina pneumocócica 10-valente conjugada no cartão vacinal infantil. 2014. 77 f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Carolinda Oliveira (ppgmm@ufc.br) on 2017-06-07T12:21:05Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Francisco Eliclécio Rodrigues da Silva.pdf: 1306976 bytes, checksum: de135ab336986077f41f11fe48c12d5c (MD5) / Rejected by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com), reason: Corrigir nome do arquivo on 2017-06-07T13:58:03Z (GMT) / Submitted by Carolinda Oliveira (ppgmm@ufc.br) on 2017-06-07T14:05:22Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_fersilva.pdf: 1054354 bytes, checksum: 52e1c18030e481f1c8e536930f47f528 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-06-07T14:10:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_fersilva.pdf: 1054354 bytes, checksum: 52e1c18030e481f1c8e536930f47f528 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T14:10:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_fersilva.pdf: 1054354 bytes, checksum: 52e1c18030e481f1c8e536930f47f528 (MD5) Previous issue date: 2014-12-22 / Pneumonia is responsible for approximately 1.6 million annual deaths in children of age five and below worldwide. A group of virus and bacteria is associated with the etiology of this infection being commonly reported the association between them. As strategy of reducing child mortality from this condition, in 2010 it was incorporated the 10-valent pneumococcal vaccine to the child immunization calendar. The objective of this study is to determine the rate of detection of several respiratory viruses and Streptococcus pneumoniae, including its serotypes, in children with pneumonia after the introduction of the 10-valent pneumococcal vaccine in the child immunization calendar. For this, samples of nasopharyngeal aspirates were analyzed in rapid antigen detection by indirect immunofluorescence for Respiratory Syncytial Virus, adenovirus, Influenza A and B and Parainfluenza 1, 2 and 3. After the isolation of S. pneumoniae, it was used the multiplex PCR for its serotyping. 781 samples were analyzed. The detection of the respiratory viruses and S. pneumoniae ranged during the years 2011, 2012 and 2013, in which, at the end, 441 (56,47%) of the samples were negative for both microorganisms, 199 (25,48%) were positive for at least one virus, being the RSV the most detected, 184 (23,56%) were positive for S. pneumoniae and 43 (5,51%) were positive for coinfection (the simultaneous detection of the pneumococcus and the RSV, 60,47%, was the most frequent). There was a percentage reduction of the detection of pneumococcus over the years studied, with the predominance of vaccinal serotypes (69/54,33%). However, despite the decrease of detection of S. pneumoniae, whether they are present or not in the vaccine, there seems to be a growing number of circulating strains of pneumococcus not included in the vaccine, this fact is more evident in the year 2013. As the profile of prevalent serotypes of S. pneumoniae differs from one region to another and the immunity is serotype-specific, it is necessary a continuous surveillance for the knowledgement of the circulation of serotypes that are not included in the vaccine and to ensure that the future vaccines target the appropriate serotypes. / A pneumonia é responsável por aproximadamente 1,6 milhões de óbitos anuais em crianças com idade inferior a cinco anos no mundo. Um grupo de vírus e bactérias está associado à etiologia dessa infecção sendo comumente relatadas associações entre eles. Como estratégia de redução da mortalidade infantil por essa afecção foi incorporada, em 2010 no Brasil, a vacina pnemocócica conjugada 10 valente no calendário vacinal infantil. Este estudo teve como objetivo determinar a taxa de detecção de diversos vírus respiratórios e Streptococcus pneumoniae, inclusive seus sorotipos, em crianças com pneumonia após a introdução da vacina pneumocócica 10 valente conjugada no calendário vacinal infantil. Para isso foram analisadas amostras de aspirados de nasofaringe na detecção rápida de antígenos através de imunofluorescência indireta para o Vírus Sincicial Respiratório, Adenovírus, Influenza A e B e Parainfluenza 1, 2 e 3. Após o isolamento de S. pneumoniae foi utilizado PCR multiplex para sua sorotipagem. Foram analisadas 781 amostras. A detecção dos vírus respiratórios e S. pneumoniae variou durante os anos de 2011, 2012 e 2013, tendo no final 441 (56,47%) amostras negativas para ambos os microorganismos, 199 (25,48%) positivas para pelo menos um vírus, sendo o VSR o mais detectado, 184 (23,56%) positivas para S. pneumoniae e 43 (5,51%) tiverem detecção mista (sendo a detecção concomitante do pneumococo com o VSR , 60,47%, a mais frequente). Houve uma redução no percentual de detecção do pneumococo ao longo dos anos estudados, com predominância dos sorotipos vacinais (69/54,33%). No entanto, apesar da queda no número de S.pneumoniae detectados, estejam eles presentes ou não na vacina, parece haver um número crescente de cepas circulantes do pneumococo não incluída na vacina, fato este mais evidente no ano de 2013. Sendo o perfil dos sorotipos de S. pneumoniae diferente de uma região para outra e a imunidade sorotipo-específica é necessária uma vigilância contínua para o conhecimento dos sorotipos circulantes para assegurar que futuras vacinas sejam voltadas para os sorotipos adequados.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: K. pneumoniae e um importante patogeno no ambiente hospitalar. Os antimicrobianos da classe dos carbapenens tem sido amplamente utilizados para o tratamento das infeccoes causadas por amostras de K. pneumoniae produtoras de β-lactamases de amplo espectro. As metalo-β-Iactamases (MβL) sao enzimas bacterianas com habilidade de hidrolisar os carbapenens e, embora, ainda sejam raras, amostras de K. pneumoniae produtoras de MβL tem sido reportadas com uma frequencia cada vez maior. Objetivo: Avaliar os mecanismos de resistencia a carbapenens em amostras de K. pneumoniae. Metodologia: Nove amostras de K. pneumoniae isoladas ate o momento na cidade de São Paulo foram avaliadas. A relacao genetica entre estas amostras foi estudada utilizando-se a tecnica de PFGE. Os testes de sensibilidade aos antimicrobianos foram realizados pela tecnica de diluicao em agar, segundo as padronizacoes do NCCLS. A tecnica da reacao em cadeia da polimerase (PCR) foi utilizada para determinar a presenca dos genes responsaveis pela codificacao das MβL, assim como para 0 contexto genetico que abriga estes genes. A deteccao de outros mecanismos de resistencia, como alteracoes da permeabilidade da membrana externa e a presenca de efluxo, tambem foi realizada em todas as amostras. Resultados: Todas as amostras foram altamente resistentes a ceftazidima (MIC, 128 µg/ml), apresentando tambem resistencia a imipenem (MIC, 128 µg/ml) e a meropenem (MIC, 64 µg/ml). Dentre as nove amostras de K. pneumoniae, todas apresentaram produto de amplificacao de PCR positivo para o gene blaIMP-1. A resistencia aos carbapenens tambem foi correlacionada a ausencia de uma proteina de membrana externa de aproximadamente 36 kDa. A diminuicao da expressao...(au) / Background: The increasing prevalence of multi-drug resistant Klebsiella pneumoniae (KPN) isolates is an emerging problem worldwide. Integrons are common among these bacteria and play an important role in the development, capture and expression of resistance genes. Methods: The genetic context around the blaIMP-1 gene was evaluated in 8 clonally related KPN isolates, recovered from a hospital from the city of Sao Paulo (SP), Brazil. The integron was revealed by a walking sequencing strategy. The plasmid obtained from the index isolate was electroporated into Escherichia coli XL1 Blue. Selection of recipient cells was performed in 5 µg/ml ceftazidime plates. Plasmid size was calculated based on the size of the plasmid restriction fragments. The amplicon of the dfr gene was cloned in TOPO vector and transformed into E. coli host. Trimethoprim MICs were performed by NCCLS agar dilution. Results: PCR and sequence analysis revealed that the strain carried two different class 1 integrons, a copy of the previously described In86 and a new integron, named In87. In86 carried blaIMP-1 in the first position, followed by aacA30 and aadA1 genes. The second integron, In87, carried a single gene cassette closely related to dfr22. The product of dfr23 showed 99% of amino-acid homology with DFR22 (one amino-acid substitution, Ser121-Tyr). Further characterization of the isolates revealed that In86 was likely to be located in a non-transferable 30 Kb plasmid. Conclusions: IMP-1 producing Acinetobacter spp. recently isolated in SP was the likely source of In86 acquisition since they carry an identical integron to those encountered in the studied KPN isolates. The presence of trimethoprim resistance gene cassettes in class 1 integrons which normally harbor sul1 gene at the 3’CS is most likely driven by the use of trimethoprimsulfamethoxazole combination. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O gênero Klebsiella faz parte da família Enterobacteriaceae e pode ser encontrado no meio ambiente e nas mucosas de seres humanos e animais. Atualmente, o gênero é composto de cinco espécies, das quais a K. pneumoniae, e mais raramente, a K. oxytoca, são causadoras de infecções. As infecções por K. pneumoniae acometem primordialmente indivíduos hospitalizados, geralmente fragilizados por outras condições, que acabam, na maioria das vezes, desenvolvendo infecções do trato urinário, lesões supurativas, bacteremias e septicemia. Além disso, a K. pneumoniae encontra-se entre as espécies mais comumente implicadas em infecções por microorganismos resistentes a antibióticos, sendo, depois de Escherichia coli, a causa mais comum de septicemia por Gramnegativos. O primeiro estágio da infecção hospitalar por K. pneumoniae consiste na colonização do trato gastrointestinal. A translocação bacteriana (TB), definida como a passagem de bactérias viáveis através da mucosa intestinal, é um processo endógeno que se coloca como hipótese para a ocorrência dessas infecções. A colonização intestinal demanda que as bactérias estejam firmemente estabelecidas na superfície da mucosa para resistir aos movimentos peristálticos do intestino. A proteína CF29K, descrita em uma amostra clínica de K. pneumoniae, é uma adesina não fimbrial que demonstrou mediar uma adesão do tipo difuso em células cultivadas de origem intestinal. Praticamente, não há relatos sobre o papel desta adesina no potencial patogênico de K. pneumoniae. Tampouco há demonstração da capacidade de K. pneumoniae translocar por via intestinal em modelo animal imunologicamente competente e que não apresente lesão da barreira mucosa. O objetivo geral deste trabalho foi estudar o envolvimento da adesina afimbrial CF29K no processo de translocação de K. pneumoniae por via intestinal. O ensaio de TB realizado em modelo in vivo, mostrou que a K. pneumoniae CF504, protótipo de CF29K, é capaz de translocar para linfonodos do mesentério, fígado e baço. Este achado reveste-se de grande consistência na medida em que o modelo de TB empregado não expõe o animal a fatores que levam ao dano da barreira intestinal. A supressão da expressão da adesina CF29K, obtida por mutagênese específica do gene cf29A, da amostra K. pneumoniae CF504, não interferiu na sua capacidade de aderir a células Caco-2, sugerindo que outra(s) adesina(s) também deva desempenhar este papel na amostra selvagem. Da mesma forma, a ausência de CF29K não resultou em menor eficiência de translocação por via intestinal. Além disso, o estudo de 27 amostras clínicas de K. pneumoniae não detectou o gene cf29A em nenhum dos isolados. No entanto, o teste de TB realizado com 15 dessas amostras resultou positivo. Concluise, portanto, que a translocação bacteriana por via intestinal é um processo que independe da adesina CF29K e que deve refletir um possível mecanismo de patogenicidade de K. pneumoniae envolvido, seja na instalação da infecção per se, seja no agravamento de quadros infecciosos sistêmicos já instalados. / Klebsiella is a member of the family Enterobacteriaceae and can be isolated from the environment and from the mucosal surfaces of human beings and animals. There are five known species of Klebsiella, being K. pneumoniae and K. oxytoca the most associated with infections. Mainly hospitalized patients are infected and can present urinary tract infections, supurative lesions, bacteremia, and septicemia. K. pneumoniae strains presenting high resistance to antibiotics are the most common Gram negatives causing septicemia after Escherichia coli. Colonization of the intestinal tract is the first stage in the nosocomial infections by K. pneumoniae. Being so, bacterial translocation (BT), defined as the passage of viable bacteria through the intestinal barrier, is an endogenous process that applies as a hypotheses for the occurrence of those infections. Intestinal colonization demands a firm interaction between the bacteria and the mucosal surface so they can resist to the intestinal peristalses. The CF29K protein discovered in a clinical isolate of K. pneumoniae, is an afimbrial adhesin responsible for diffuse adhesion to intestinal cells in vitro. There is no acknowledge on the role of this adhesin to the pathogenesis of K. pneumoniae, neither on the ability of these bacteria to translocate through the intact intestinal barrier of immunological competent animal models. The aim of this study was to evaluate the involvement of the adhesin CF29K in the BT process. It was shown that CF504, the prototype K. pneumoniae strain for CF29K, is able to translocate trough the intestinal barrier of rats, being recovered from mesenteric lymph nodes, liver, and spleen, after two hours of inoculation. This fact gains importance since the BT assay used causes no physical damage to the intestinal mucosa. The suppression of the CF29K protein expression obtained by site-direct mutagenesis of the cf29A gene of the prototype strain did not change its ability to adherer to Caco-2 cells, suggesting that there might be other (s) adhesin(s) also involved in this interaction. Nevertheless, the absence of CF29K did not abolish the BT capacity of the strain. Besides, the study of 27 clinical isolates of K. pneumoniae did not detect the presence of cf29A gene in any strain. Even so, the BT test carried out with 15 of those isolates resulted positive. We conclude that BT across the intestinal mucosa is a process not related to the adhesin CF29K. We propose that BT may reflect a possible mechanism of pathogenicity of K. pneumoniae involved either in the installation of the infection, or in the worsening of already installed systemic infection. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

LARANJEIRA, Bruno Jaegger. Resistência antimicrobiana, genotipagem capsular e deteção de genes de resistência de Streptococcus pneumoniae isolados de crianças não vacinadas usuárias de creches em Fortaleza. 2014. 95 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-15T11:20:19Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_bjlaranjeira.pdf: 5609827 bytes, checksum: 2006edd7762a610c0d9005923ea51ce0 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-15T12:39:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_bjlaranjeira.pdf: 5609827 bytes, checksum: 2006edd7762a610c0d9005923ea51ce0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-15T12:39:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_bjlaranjeira.pdf: 5609827 bytes, checksum: 2006edd7762a610c0d9005923ea51ce0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Streptococcus ( S. ) pneumoniae is considered the principal causative agent of mor bidity and mortality in children younger than five years of ag e. All pneumococcal diseases are initiated by establishing a S. pneumoniae colonization in nasopharynx. The main risk factor for colonization is crowding, as in children attending day care. During the last decades, the increasing amount of resistant S. pneumoniae strains to β -lactams and other classes of antimicrobials has modified the treatment of pneumo coccal infection. At present, nearly 13 serotypes respond for more than 85% of invasive iso lates. The 10-valent pneumococcal polysaccharide-conjugated vaccine (PCV-10) has rece ntly been included in the national vaccination schedule. The aims of this study were t o determine the prevalence, antimicrobial resistance and genotypes of S. pneumoniae isolated of carriage children attending day care centers in Fortaleza, Brazil, as well as to assess the potential coverage of the PCV-10. Between January and December of 2011, isolates from carrier children were recovered by nasopharyngeal swabs. Susceptibility to penicillin, amoxicillin, erythromycin, sulfamethoxazole-trimethoprim, clindamycin, were de termined by e-test method. Detection of penicillin resistance genes was performed by PCR as say. Capsular genotyping of carriage isolates was performed by multiplex PCR assay. S. pneumoniae were isolated in 165 (87.3 %) of 291 samples of children attending day care cente rs. Of the 162 isolates from carriage was found a resistance rate of 27.8% for penicillin, 75 .3% to trimethoprim / sulfamethoxazole, 13.6% to erythromycin and 10.5% to clindamycin. No resistance was detected to ceftriaxone and amoxicillin. The percentage of S. pneumoniae isolates at least one mutation in the penicillin resistance genes was 68.2%. Capsular Gen otypes was indentified in 115 isolates, of 129 tested. Genotypes most common were 6A/6B, 14, 1 5B/15C, 19F and 23F, with serotypes 6A/6B, 14, 19F and 23F more associated with resista nce. The estimated coverage for VPC-10 was 74.4%. This study showed that the rate of S. pneumoniae carriers is high, as well as resistance to antibiotics penicillin and sulfametho xazole / trimethoprim, and the potential cover of VPC-10 is raised against S. pneumoniae genotypes identified isolated from children attending day care centers in Fortaleza. / O Streptococcus (S.) pneumoniae é considerado como o principal agente causador de morbidade e mortalidade em crianças menores de cinco anos de idade. As doenças pneumocócicas começam com o estabelecimento da colonização do S. pneumoniae na nasofaringe. O principal fator de risco para colonização é o confinamento, como em crianças que frequentam creches. Nas últimas décadas, o aumento do número de cepas de S. pneumoniae resistentes à antibióticos β-lactâmicos e a outras classes de antimicrobianos tem dificultado o tratamento da infecção pneumocócica. Atualmente cerca de 13 sorotipos de S. pneumoniae respondem por mais de 85% dos isolados invasivos. A vacina pneumocócica polissacarídica conjugada 10-valente (VPC-10) foi recentemente incluída no calendário de vacinação nacional. Os objetivos desse estudo foram determinar a prevalência, a resistência antimicrobiana, os genótipos de S. pneumoniae que colonizam a nasofaringe de crianças usuárias de creches em Fortaleza, Brasil, bem como para avaliar a cobertura potencial da VPC-10. Entre janeiro e dezembro de 2011, os isolados de crianças portadores foram recuperados a partir de swabs de nasofaringe. Foram determinadas as sensibilidades para penicilina, ceftriaxona, sulfametoxazol/trimetoprim, amoxilina, clindamicina e eritromicina, das cepas isoladas utilizando-se o método de e-test.. A detecção dos genes de resistência à penicilina foi realizada por PCR. A genotipagem capsular dos isolados de portadores foi realizada pela técnica de multiplex PCR. Foram isolados S. pneumoniae em 165 (56,7%) das 291 crianças saudáveis usuárias de creches. Dos 162 isolados de portadores, submetidos à determinação da concentração inibitória mínima, foi encontrada uma taxa resistência de 27,8% para penicilina, 75,3% para sulfametoxazol/trimetoprim, 13,6% para eritromicina e 10,5% para clindamicina. Não foi detectada resistência à ceftriaxona e à amoxicilina. A porcentagem de isolados de S. pneumoniae com mutação em pelo menos um dos genes que determinam resistência à penicilina foi de 68,2%. Os genótipos capsulares de 115 isolados foram identificados em 129 viáveis. Os genótipos mais comuns foram 6A/6B, 14, 15B/15C, 19F e 23F, com os sorotipos 6A/6B, 14, 19F e 23F mais associados com a resistência. A cobertura estimada para VPC-10 foi de 74.4%. O presente estudo verificou que a taxa de portadores de S. pneumoniae é alta, assim como a resistência aos antimicrobianos penicilina e sulfametoxazol/trimetoprima, e que a cobertura potencial da VPC-10 é elevada frente aos genótipos de S. pneumoniae identificados, isolados de crianças usuárias de creches em Fortaleza.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-02-09T03:17:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 336847.pdf: 2261623 bytes, checksum: 5220583fc8a657b02f17b72e42ab63bc (MD5) Previous issue date: 2015 / A pneumonia pode ser causada por diversos microrganismos e classificada de forma abrangente, havendo poucos e frágeis estudos clínicos e epidemiológicos sobre pneumonias adquiridas na comunidade (PACs). Os patógenos mais frequentes nas PACs são Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae (em pneumonias típicas) e Mycoplasma pneumoniae (em pneumonias atípicas). Assim, o objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia para detecção molecular dessas bactérias em amostras de orofaringe, avaliar sua prevalência e o perfil clínico-epidemiológico de pacientes com PAC em um hospital na cidade de Blumenau/SC. Para tanto, além da técnica de PCR padronizada in house, foram realizadas culturas de raspado de orofaringe e pesquisa de anticorpos específicos para detecção de M. pneumoniae. A reação de PCR realizada com os iniciadores desenhados neste estudo para M. pneumoniae apresentou sensibilidade 10x maior que a reação mais citada na literatura, e a sensibilidade das reações para S. pneumoniae e H. influenzae foi 0,1ng de DNA/reação. Dos 58 pacientes incluídos no estudo, H. influenzae e S. pneumoniae foram detectados respectivamente em 41,38% e 15,52% das amostras. M. pneumoniae não foi detectado em nenhuma amostra analisada por métodos de cultura, PCR e sorologia com anticorpos específicos IgM. Todavia não se exclui a circulação dessa bactéria na região devido à presença de anticorpos IgG específicos. A maioria dos pacientes com PAC avaliados apresentou idade =65 anos e pelo menos uma comorbidade. A maioria dos pacientes apresentou quatro ou mais sinais e sintomas, destes os mais prevalentes foram dispneia, tosse, secreção purulenta e crepitações. Evidenciou-se, neste estudo, a baixa aderência dos clínicos às Diretrizes Brasileiras para diagnóstico, estratificação e tratamento dos pacientes com suspeita de PAC, pois os exames complementares para diagnóstico e avaliação de risco dos casos e o antibiótico escolhido para grande parte dos pacientes não estava de acordo com a determinação das diretrizes. Sugere-se a replicação desta pesquisa, pois os resultados foram de encontro àqueles apresentados na literatura relacionada ao entendimento de PAC, acompanhamento dos ciclos epidêmicos de M. pneumoniae na região e conhecimento da real prevalência dos patógenos típicos, uma vez que o H. influenzae foi o patógeno mais detectado.<br> / Abstract : Pneumonia can be caused by different microorganisms and classified through comprehensive forms, but there are few and fragile clinical and epidemiological studies of community-acquired pneumonia (CAPs). The most common pathogens in CAPs are Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae (in typical pneumonia) and Mycoplasma pneumoniae (in atypical pneumonia). Therefore, the aim of this study was to standardize a methodology for molecular detection of these bacteria in the oropharynx samples, and to evaluate their prevalence and the clinical and epidemiological profile of patients with CAP in a hospital in Blumenau/SC. Thus, besides the standard technique PCR in-house, oropharyngeal swab cultures and search for specific antibodies for detection of M. pneumoniae were performed. The PCR reaction performed with primers designed in this study for M. pneumoniae showed sensitivity greater than 10-fold the most cited in the literature reaction and the sensitivity of the reactions to S. pneumoniae and H. influenzae was 0.1 ng DNA / reaction. Out of the 58 patients included in the study, H. influenzae and S. pneumoniae were detected respectively in 41.38% and 15.52% of the samples. M. pneumoniae was not detected in any sample analyzed by culture methods, PCR and serology with IgM specific antibodies. Nevertheless it is not possible to exclude the circulation of this bacterium in the region due to the presence of specific IgG antibodies. Most CAP patients evaluated were 65 years or older and had at least one comorbidity. Most of the patients had four or more signs and symptoms, the most prevalent ones were dyspnea, cough, purulent secretion and crackles. It is evident in this study the low adherence of the practitioners to Brazilian Guidelines for the diagnosis, stratification and treatment of patients with suspected CAP, as the laboratory tests for diagnosis and case risk assessment and also the antibiotic selected for most patients were not determined according to the guidelines. Replication of this research is indicated for a better understanding of the CAP, support of epidemic cycles of M. pneumoniae in the region and knowledge of the real prevalence of the typical pathogens.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:22:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-15. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:29:05Z : No. of bitstreams: 1 000851662_20160515.pdf: 427931 bytes, checksum: 4ef8d142c5c5234191158ab7c2efea52 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-05-16T14:18:42Z: 000851662_20160515.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-16T14:19:23Z : No. of bitstreams: 1 000851662.pdf: 1696866 bytes, checksum: d81719395199b25212968ab82e23a88e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A fagocitose de células apoptóticas é um processo dinâmico importante para a homeostase dos tecidos após injúria. Os macrófagos além de atuarem na remoção de células apoptóticas, também colaboram na defesa contra microrganismos. Existem ao menos duas populações de macrófagos classificadas como macrófagos M1 (pró-inflamatórios) e macrófagos M2 (anti-inflamatórios). Estes leucócitos diferem quanto ao fenótipo e funções efetoras dependendo, primordialmente, do microambiente e dos microrganismos com que interagem no tecido. Em uma situação de injúria pulmonar estéril (inalação de agentes tóxicos), há acúmulo de células apoptóticas sem a presença de agente microbiano. Por outro lado, durante uma infecção pulmonar bacteriana, ocorre intensa migração de células para o local da infecção na tentativa de conter a proliferação bacteriana, resultando em intenso acúmulo de células apoptóticas infectadas neste tecido. Portanto, nesse trabalho foi avaliado, in vitro e in vivo, o efeito da fagocitose de células apoptóticas infectadas (AC-Sp) ou estéreis (AC) na polarização de macrófagos M1/M2, bem como suas funções efetoras, e o efeito da PGE2 nesse contexto de eferocitose. Macrófagos M0 co-cultivados com AC ou AC-Sp apresentam um fenótipo intermediário entre M1 e M2, com secreção de altos níveis de IL-6, TNF-α, PGE2, TGF-β e NO e a expressão de genes relacionados ao perfil M1, iNOS, e ao perfil M2, Arginase 1. Além disso, macrófagos M0 cultivados com AC ou AC-Sp, apresentam supressão da função microbicida quando desafiados com S. pneumoniae. A presença de PGE2 dirige a polarização de macrófagos M0 a um perfil M2 e a presença de inibidores de COX promove a reversão do fenótipo de polarização destes macrófagos. Os resultados in vivo demonstram que a instilação de AC ou AC-Sp promove distintos microambientes no pulmão destes animais, que influenciam na resolução da infecção..... / The phagocytosis of apoptotic cells is dynamic and crucial for homeostasis after injury. Macrophages act on the clearance of apoptotic cells and collaborate with defense against microorganisms. There are at least two distinct macrophage populations classified as M1 macrophages (pro-inflammatory) and M2 macrophages (anti-inflammatory). Both cells differ on the state of polarization and effectors function depending primarily on the microenvironment and microorganisms that interact into the tissue. In a situation of sterile lung injury (inhalation of toxic agents), there are accumulation of apoptotic cells without the presence of pathogen. On the other hand, during a bacterial pulmonary infection there is intense cell migration to the infection site in an attempt to impair bacterial growth, resulting in a large accumulation of infected-apoptotic cells in the tissue. Therefore, this study has evaluated in vitro and in vivo, the effect of the phagocytosis of infected-apoptotic cells (AC-Sp) or sterile cells (AC) on the polarization of M1/M2 macrophages, as well as in their effector functions and the effect of PGE2 in the context of efferocytosis. M0 macrophages co-cultured with AC or AC-Sp show an intermediate phenotype between M1 and M2 with high secretion levels of IL-6, TNF-α, PGE2, NO and TGF-β, and gene expression profile related to M1, iNOS, and M2, arginase 1. Furthermore, M0 macrophages cultured with AC or AC-Sp show strong suppression of the macrophage microbicidal function when challenged with S. pneumonia. The presence of PGE2 drives the polarization of M0 macrophages to a M2 profile, and in the presence of COX inhibitors, it reverses the polarization of this macrophage phenotype. The in vivo results demonstrate that the instillation of AC or AC-Sp promotes distinct microenvironments in the lungs of these animals, which influence the resolution of the infection. All these results suggest that the presence of AC or AC-Sp promotes, ...

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-15T19:46:55Z No. of bitstreams: 1 2018_LauraFernandesGonçalves.pdf: 1541641 bytes, checksum: 343bb09af189640ebaaa4ef409e26ac4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-27T18:10:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_LauraFernandesGonçalves.pdf: 1541641 bytes, checksum: 343bb09af189640ebaaa4ef409e26ac4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-27T18:10:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_LauraFernandesGonçalves.pdf: 1541641 bytes, checksum: 343bb09af189640ebaaa4ef409e26ac4 (MD5) Previous issue date: 2018-08-15 / Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Hospital da Universidade de Brasília (FAHUB). / Klebsiella pneumoniae é considerada um dos patógenos mais importantes causadores de infecções entre indivíduos imunocomprometidos. Os problemas clínicos causados pelo bacilo podem levar a graves complicações, incluindo infecções do trato urinário, septicemia, pneumonia e morte. Apesar de estarem primariamente associadas às infecções oportunistas, existem linhagens de K. pneumoniae hipervirulentas (hvKp) que possuem uma grande quantidade de fatores de virulência que atuam estrategicamente as capacitando de se multiplicar, proteger do sistema imune do hospedeiro e causar patogenias em hospedeiros sem imunocomprometimento. Os fatores de transcrição denominados receptores ativados por proliferadores de peroxissoma γ (PPAR-γ) tem sido amplamente estudados por seu papel na imunoregulação e estabelecimento de infecções bacterianas já que esses receptores são expressos por uma grande quantidade de células do sistema imune e apresentam um papel duplo promovendo a inibição de moléculas pró-inflamatórias e auxiliando no clearence bacteriano, mas também desencadeando apoptose em diversas células do sistema imune, diminuindo a migração e adesão de neutrófilos. Portanto, nesse trabalho, tivemos por objetivo avaliar o papel do PPAR-γ na capacidade de colonização de células epiteliais da linhagem HEp-2 por três isolados hipervirulentos de K. pneumoniae (HvKp) obtidos de um paciente com bacteremia no Hospital Universitário de Brasília. Caracterizamos os três isolados como geneticamente idênticos, multirresistentes, KPC e pertencentes ao clone ST11. Os isolados também apresentaram produção forte de biofilme em superfícies abióticas bem como a capacidade de sobreviver em sangue e em soro por 30 minutos. As células infectadas com os isolados hipermucoides apresentaram expressão de PPAR-γ 24 e 48 horas após a infecção. Os isolados mostraram-se capazes de sobreviver no interior de células Hep-2 3,6 e 24 horas após a infecção. Também apresentaram maior capacidade de sobrevivência nas células quando PPAR-γ estava presente do que quando este foi inibido por GW9662. Foi observado também que os isolados são citotóxicos para as células diminuindo a viabilidade celular nos tempos de 3 e 6 horas após a infecção e recuperação da viabilidade 24 horas após a infecção. Também, observou-se a produção de óxido nítrico após a infecção e constatou-se que esta ocorre mais acentuadamente 24 e 48 horas pós-infecção e que ocorre um aumento na produção de NO quando PPAR-γ encontra-se inibido. Dessa forma, os isolados mostraram-se resistentes aos efeitos microbicidas da célula. / Klebsiella pneumoniae is considered one of the most important pathogens causing infections among immunocompromised individuals. Clinical problems caused by this bacillus can lead to severe complications, including urinary tract infections, septicemia, pneumonia, and death. Although they are primarily associated with opportunistic infections, there are hypervirulent K. pneumoniae (hvKp) strains that have a large number of virulence factors that act strategically to enable them to multiply, protect from the host's immune system and cause pathogenies in hosts without immunocompromising. Transcription factors called peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR-γ) have been extensively studied for their role in immunoregulation and establishment of bacterial infections since these receptors are expressed by a large number of immune system cells and have a double role promoting the inhibition of proinflammatory molecules and assisting in bacterial clearence, but also triggering apoptosis in several cells of the immune system, decreasing neutrophil migration and adhesion. Therefore, the objective of this study was to evaluate the role of PPAR-γ in the ability to colonize epithelial cells of the Hep-2 lineage by three hypermucoid isolates of K. pneumoniae (HvKp) obtained from a patient with bacteremia at the Hospital Universitário de Brasília. In this work, we characterize the three isolates as genetically identical, multiresistant, KPC and belonging to clone ST11. The isolates also showed strong biofilm production on abiotic surfaces as well as the ability to survive in blood and serum for 30 minutes. Cells infected with the hypermucoid isolates showed PPAR-γ expression 24 and 48 hours post-infection. Isolates were able to survive within HEp-2 cells 3,6 and 24 hours post-infection. They also showed greater survival ability in the cells when PPAR-γ was present than when it was inhibited by GW9662. It was also observed that the isolates are cytotoxic to the cells reducing cell viability 3 and 6 hours post infection and viability recovery 24 hours post infection. The production of nitric oxide after infection has also been verified and it has been observed that this occurs more markedly 24 and 48 hours post infection and that an increase in NO production occurs when PPAR-γ is inhibited. Thus, the isolates were resistant to the microbicidal effects of the cell.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-30Bitstream added on 2014-06-13T20:16:20Z : No. of bitstreams: 1 nobrega_db_me_botfmvz.pdf: 839809 bytes, checksum: cf66e109eac48d5e6d7140e6607bfbf2 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho objetivou o isolamento de Klebsiella pneumoniae do ambiente de sala de ordenha e do ambiente dos animais, incluindo a sala de pré-ordenha, piquetes e, em algumas propriedades os galpões de free stall, do reto e membros posteriores dos animais, do leite do tanque de refrigeração e do leite dos tetos positivos ao teste do Califórnia Mastitis Test (CMT), pesquisar cepas produtoras de β-lactamases de espectro ampliado (ESβL) e, a partir da identificação clonal, verificar a semelhança entre as cepas. Em 28 (2,14%) amostras de leite coletadas dos animais foi detectada a presença de Klebsiella pneumoniae como patógeno responsável pela infecção intramamária (IMI). A partir de swabs ambientais, da pele dos animais e do leite oriundo do tanque de expansão das dez propriedades, foram isoladas 79 cepas de K. pneumoniae. Os resultados da prova de detecção fenotípica da produção de enzimas do tipo ESβL foram positivos em oito (7,47%) das cepas bacterianas isoladas. No Brasil ainda não há relatos de coliformes produtores destas enzimas oriundos de animais de produção, e no presente estudo uma das cepas foi isolada do tanque de expansão, representando um potencial perigo à saúde pública. Pelo resultado da PFGE, observou-se grande diversidade genética da bactéria dentro da propriedade e entre as propriedades. Demonstrou-se que patógenos ambientais multirresistentes estão presentes em rebanhos bovinos leiteiros, não apenas isolados de quadros de infecção intramamária como também de galpões de free stall, membros posteriores dos animais, sala de ordenha e tanque de expansão. Confirmou-se também, a alta variabilidade genética da K. pneumoniae em rebanhos bovinos leiteiros mesmo dentro de um mesmo rebanho, e a importância da PFGE como recurso na epidemiologia molecular / The present study aimed the isolation of Klebsiella pneumoniae from the milk parlor and the animal’s environment, including the pre milking room, paddocks and, in some properties the free stall, animal’s rectum and hind limbs, bulk tank milk and from all teats positive to the California Mastitis Test (CMT), search for strains producers of extended spectrum β-lactamases (ESβL) and, by the clonal identification, verify if similarities between the strains ocurred. In 2.14% (28) of the milk samples collected from the animals it was detected the presence of Klebsiella pneumoniae as the pathogen responsible for the intramammary infection (IMI). From environmental swabs and bulk milk tank of the ten properties, it was isolated 79 strains of K. pneumoniae. The results of phenotypic detection of the ESβL enzymes production were positive in eight (7.47%) bacterial strains isolated. It is important to know that, in Brazil there are no reports of coliforms producers of these enzymes isolated from livestock animals, and in the present study one of the strains was isolated from the bulk tank milk, representing a potential hazard to public health. The results of PFGE showed high genetic diversity of the bacteria within and between the dairy farms. It was demonstrated that environmental multidrug resistant pathogens are present in dairy herds, isolated from intramammary infections cases, free stall parlors, animal’s hindlimbs, milking parlor and bulk tank milk. This study also confirmed the high genetic diversity of K. pneumoniae in dairy herds within the same herd, and the importance of PFGE as a molecular epidemiology tool. Keywords: environment, extended-spectrum β-lactamases (ESβL), Klebsiella pneumoniae, mastitis, milk, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)

Orientador: Prof. Dr. Felipe F. Tuon / Co-orientadora: Drª. Sueli M. Nakatani / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 27/06/2014 / Inclui referências / Área de concentração: Doenças infecciosas / Resumo: A disseminação de micro-organismos resistentes, produtores de KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) é um problema de saúde pública emergente. A disseminação rápida e a crescente lista de patógenos em qual o gene blaKPC é devida a presença do gene em um elemento móvel, denominado transposon, Tn4401. Este estudo teve como objetivo avaliar as características dos isolados suspeitos de produção de carbapenemase KPC e realizar a caracterização epidemiológica, fenotípica e genotípica dos isolados enviados de outubro de 2009 a maio de 2012. De um total de 1028 isolados analisados, foram encontrados 770 positivos para KPC (75%) e 258 foram negativas (25%). A maioria das amostras recebidas foram de swab de vigilância 334 (32%), seguidas de amostras de urina 232 (22%), amostras respiratórias 134 (13%), sangue 99 (10%) dentre outras menos prevalentes. Para a determinação dos perfis clonais foi utilizada a técnica do repPCR e para a determinação da variante KPC foi realizado sequenciamento do gene da enzima. Foi avaliado também o valor da técnica fenotípica do teste de Hodge modificado em comparação com o padrão ouro PCR em tempo real. A tipagem molecular da enzima KPC foi compatível com a variante KPC-2, uma variante frequentemente reportada nas Américas. A análise dos perfis clonais pelo Diversilab mostrou 8 perfis clonais com 2 predominantes para o micro-organismo Klebsiella pneumoniae, 7 perfis clonais para Enterobacter spp com um predominante. Não foi observada clonalidade para os isolados de Escherichia coli, sugerindo que esta pode ter recebido o transposon Tn4401 por conjugação. A sensibilidade e especificidade do teste de Hodge modificado para a detecção de KPC utilizando ertapenem e meropenem como substratos foram 99,61% e 97,83% respectivamente. Este estudo mostrou que a técnica do teste de Hodge é sensível e específica e pode ser utilizada para a detecção de KPC quando esta enzima é endêmica e outras carbapenemases não são prevalentes por ser acessível a qualquer laboratório e de fácil realização pelos laboratórios clínicos. Palavras chave: KPC, carbapenêmicos, epidemiologia. / Abstract: The spread of carbapenem-resistant microorganisms harboring KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) carbapenemase is an emerging public health threat. The rapid spread and growing list of pathogens in which gene blaKPC is reported is due to its carriage in a mobile element, a transposon, called Tn4401. This study aims to evaluate the characteristics of isolates suspected of harboring KPC carbapenemase and perform molecular and phenotypic characterization of these bacterial isolates. The period of analysis was from October 2009 to May 2012.An amount of 1028 isolates analyzed, 770 were KPC producing (75%) and 258 were not KPC producing (25%). Isolates was recovered mostly of vigilance swabs 334 (32%), followed by urinary samples 232 (22%), respiratory tract 134 (13%) and blood 99 (10%) among others less prevalent. We used repPCR for determination of clonal profiles, sequence the enzyme gene for detection of KPC's variant. We also evaluate the value of phenotypic technique modified Hodge test by comparing it to the gold standard technique PCR. Molecular typing of KPC enzyme was compatible with KPC-2 gene, a variant frequently reported in Americas. Cluster analysis from Diversilab fingerprints showed 8 clonal profiles with 2 predominant for Klebsiella pneumoniae, 7 clonal profiles for Enterobacter spp with one predominant. No clonal similarity was observed in Escherichia coli, suggesting that it may have received transposon Tn4401 through conjugation. The sensitivity and specificity of modified Hodge test for the detection of KPC, when using ertapenem and meropenem, were respectively 99.61% and 97.83%. This study showed that MHT technique is highly sensitive for detecting KPC producers when this enzyme is endemic, and has its value for being affordable and easy to perform by clinical laboratories. Keywords: KPC, carbapenem, epidemiology