Under vissa omständigheter kan bakterier kan ta sig in i blodbanan där de kan orsaka allvarliga infektioner (bakteriemi). Metoden som används för identifiering och resistensbestämning av bakterier i blododlingar kräver minst 16 timmars inkubation. Fram tills en resistensbestämning utförts kan empirisk antibiotikabehandling användas, men med ökande resistensutbredning blir det alltmer osäkert om denna behandling är verksam. Nyligen har en lappdiffusionsmetod för resistensbestämning direkt från blododling validerats, som kan läsas av efter 4, 6 och/eller 8 timmars inkubation. Det finns även publicerade arbeten där flödescytometriassisterad resistensbestämning används, men då krävs att bakterierna finns i tillräckligt hög koncentration, befinner sig i tillväxtfas och finns som renkultur. Syftet med examensarbetet var att optimera hantering av blododlingsflaskor så att bakterier från blododlingsflaskorna kunde isoleras med tillräcklig kvalitet och koncentration för att kunna utföra resistensbestämning med flödescytometri. Upprening av bakterierna utfördes med olika tvättbuffertar och sedan utfördes resistensbestämning med flödescytometri och  referensmetoden buljongspädning. Resultaten från uppreningen visade att sterilt vatten och Tween20 gynnade bakteriernas återhämtningsförmåga mest. Resistensbestämning utfördes med Klebsiella pneumoniae ATCC700603,  K. pneumoniae CCUG56233 och K. pneumoniae ATCC13882, som tvättats med sterilt vatten och Tween20. För CCUG56233 skiljde 1 spädningssteg i koncentrationsskalan mellan metoderna. ATCC-isolaten erhöll likartade MIC-värden (minimum inhibitory concentration) vid alla analyser men där fanns en skillnad på 2 spädningssteg mellan buljongspädning och analys med flödescytometri. Detta kan förklaras av skillnaden i inkubationstid mellan metoderna. Slutsatsen som kan dras är därför att resultaten från de två metoderna vid resistensbestämning är likartade och att sterilt vatten är mest lämpligt att använda vid upprening av bakterier. Fler undersökningar bör dock utföras.

O treinamento aeróbio moderado tem sido reconhecido como um importante estimulador do sistema imune, no entanto o efeito deste na infecção bacteriana não tem sido extensivamente estudado. Nosso objetivo foi avaliar se o exercício aeróbio moderado prévio à infecção por S. pneumoniae influencia a resposta inflamatória pulmonar. Camundongos BALB/C foram divididos em 4 grupos: Controle (animais sedentários; não infectados); S. pneumoniae (animais sedentários e posteriormente infectados); Exercício (animais treinados; não infectados); Exercício + S. pneumoniae (animais treinados e posteriormente infectados). Os animais foram submetidos a um programa de treinamento físico aeróbio durante 4 semanas, e 72 horas após a última sessão de exercício, os animais receberam instilação nasal de S. pneumoniae (linhagem M10) e foram avaliados 12 horas (fase aguda) ou 10 dias (fase tardia) após a instilação. Na fase aguda, o grupo S. pneumoniae apresentou um aumento de: resistência e elastância do sistema respiratório, número total de células, neutrófilos, linfócitos e macrófagos no lavado broncoalveolar (BAL), células polimorfonucleares no parênquima pulmonar e TNF-alfa e IL-1beta no homogenato pulmonar. O exercício físico atenuou significantemente esses parâmentros. Além disso, o exercício físico resultou em aumento da expressão de enzimas antioxidantes no pulmão (CuZnSOD and MnSOD). Na fase tardia, o grupo Exercício + S. pneumoniae apresentou redução no número total de células e macrófagos no BAL, células polimorfonucleares no parênquima pulmonar e IL-6 no homogenato pulmonar comparado ao grupo S. pneumoniae. Nossos resultados sugerem um efeito protetor do exercício aeróbio moderado contra a infecção bacteriana pulmonar. Esse efeito é provavelmente secundário ao efeito do exercício no balanço oxidante-antioxidante / Moderate aerobic exercise training has been recognized as an important stimulator of the immune system, but its effect on bacterial infection has not been extensively studied. Our aim was to determine whether moderate aerobic exercise training prior to S. pneumoniae infection influences pulmonary inflammatory responses. BALB/c mice were divided into 4 groups: Control (sedentary without infection); S. pneumoniae (sedentary with infection); Exercise (aerobic training without infection); Exercise + S. pneumoniae (aerobic training with infection). Animals underwent aerobic exercise training for 4 weeks. 72 h after last exercise training, animals received a challenge with S. pneumoniae (strain M10) and were evaluated either 12 h (acute phase) or 10 days (late phase) after instillation. In acute phase, S. pneumoniae group had an increase in respiratory system resistance and elastance; number of total cells, neutrophils, lymphocytes and macrophages in bronchoalveolar lavage fluid (BAL); polymorphonuclear cells in lung parenchyma; and levels of TNF-alfa and IL-1beta in lung homogenates. Exercise training significantly attenuated the increase in all of these parameters. In addition, exercise induced an increase in expression of antioxidant enzymes (CuZnSOD and MnSOD) in lungs. In late phase, Exercise + S. pneumoniae group exhibited a reduction in number of total cells and macrophages in BAL, in polymorphonuclear cells in lung parenchyma and in levels of IL-6 in lung homogenates compared to S. pneumoniae group. Our results suggest a protective effect of moderate exercise training against respiratory infection with S. pneumoniae. This effect is most likely secondary to an effect of exercise on oxidant-antioxidant balance

A resposta inflamatória aguda é uma importante defesa contra o Streptococcus pneumoniae, mas a persistência na inflamação pode causar danos aos tecidos. Duas linhagens de camundongos geneticamente selecionadas para resposta inflamatória aguda mínima (AIRmin) e máxima (AIRmax) foram avaliadas frente a um desafio respiratório invasivo com pneumococo. O desafio induziu a morte de 100% dos camundongos AIRmin, e apenas 36,4% dos camundongos AIRmax. A caracterização da resposta imune inata mostrou que ambas as linhagens de camundongos responderam ao desafio com secreção de citocinas pro-inflamatórias. Entretanto, apenas os camundongos AIRmax controlaram a inflamação. Diferenças significativas quanto à expressão de metaloproteases de matriz sugerem o papel destas proteínas no controle da infecção. Além disso, os camundongos AIRmin apresentaram um aumento no número de macrófagos expressando o receptor de manose CD206, após o desafio. Uma menor resistência de macrófagos e neutrófilos dos camundongos AIRmin à morte celular programada, após o desafio, também foi observada. / Acute inflammatory response is an important defense against Streptococcus pneumoniae, but persistence of inflammation may result in tissue damage. The susceptibility against an invasive respiratory pneumococcal challenge was evaluated in two outbred mice strains, genetically selected for maximum (AIRmax) and minimum (AIRmin) acute inflammatory responses. The challenge induced the death of 100% of the AIRmin mice and only 36.4% of the AIRmax mice. Characterization of the innate immune responses showed that both mice strains responded to the challenge with the secretion of inflammatory cytokines. However, only the AIRmax mice controlled the inflammation. Significant differences on the expression of matrix metalloproteinases suggest a role of these proteins in the control of the infection. Moreover, the AIRmin mice presented an increase in the number of macrophages expressing the CD206 mannose receptor after the challenge. A reduced resistance of macrophages and neutrophils from AIRmin mice to programmed cell death, after the challenge, was also observed.

As meningites bacterianas constituem um sério problema de Saúde Pública em todo mundo, por sua incidência, sua letalidade e pela frequência das sequelas que os sobreviventes apresentam. Os agentes etiológicos Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis e Streptococcus pneumoniae são responsáveis por cerca de 60 a 80 por cento dos casos. O presente estudo tem como objetivo conhecer o comportamento epidemiológico das meningites por H.influenzae, S. pneumoniae e por bacilos Gram-negativo, especialmente as enterobactérias 1 no Município de São Paulo no pertodo 1960- 77. O levantamento foi realizado por uma equipe formada por professores do Departamento de Medicina Social da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, por médicos sanitaristas e por acadêmicos de medicina. Os dados, colhidos diretamente do prontuário dos pacientes, foram anotados em uma ficha pré-codificada. A meningite por H.influenzae somente foi confirmada quando se identificava o agente na cultura. A confirmação da meningite por S.pneumoniae se dava pela bacterioscopia e/ou pela cultura do líquor. As meningites por bacilo Gram-negativo foram subdivididas em 3 grupos. No primeiro, incluíram-se os casos em que a bacterioscopia e/ou cultura revelaram a presença de um bacilo Gram-negativo sem, contudo, haver a especificação do agente. No segundo, classificaram-se os casos em que, na cultura, foi isolada uma bactéria do gênero Salmonella. O último grupo correspondeu áquele em que se identificou a presença de uma outra enterobactéria. Os subdistritos ou distritos do Municipio de São Paulo foram agrupados de 3 maneiras. As duas primeiras corresponderam às 3 ou 6 áreas homogêneas especificadas pela Fundação SEADE. A última se baseou na distibuição da população economicamente ativa segundo sua participação nos diferentes setores da economia. A população dos subdistritos e distritos do Município de São Paulo segundo faixa etária para os anos compreendidos no estudo foi estimada pelo método geométrico modificado. No período estudado foram confirmados 900 casos de meningite por H.influenzae com um coeficiente médio de 0,89 por 100000 habitantes. Os menores de 5 anos contribuíram com 91,2 por cento dos casos, dos quais 63 por cento eram em menores de um ano. O coeficiente médio para menores de um ano foi de 23,3 por 100000 habitantes. As zonas central, intermediária e periférica não apresentaram incidências significantemente diferentes. Os coeficientes de morbidade padronizados segundo idade foram 0,8, 0,8 e 0,9 para as zonas central, intermediária e periférica, respectivamente. A letalidade média no período de 1960-77 foi de 31 por cento . As crianças menores de um ano apresentaram a maior taxa de letalidade, 40 por cento . No período 1960-77 foram confirmados 1951 casos de meningite por S.pneumoniae com um coeficiente médio de 1,9 por 100000 habitantes. As crianças menores de 5 anos contribuíram com 52 por cento dos casos dos quais 38.5 por cento eram menores de um ano. Os coeficientes médio por 100000 habitantes, para os menores de um ano, foram 37,1 e 29,7 para 1960-69 e 1970-77, respectivamente. A incidência por 100000 habitantes na zona periférica (2,2) na primeira década foi, praticamente, o dobro da zona central, (1,2). Os coeficientes padronizados segundo idade foram 1,6, 1,5 e 2,0 para as zonas central, intermediária e periférica, respectivamente. No período seguinte estes valores foram 1,4, 1,5 e 2,0. A letalidade média no período foi de 44 por cento . Ela foi inversamente proporcional ao número de leucócitos no llquor de entrada. A letalidade na faixa etária menores de um ano foi de 60 por cento no período estudado. No período estudado foram identificados 290 casos de meningite por Salmonella dos quais 10 por cento o foram na primeira década. O coeficiente médio por 100000 habitantes foi de 0,3. A S.typhimurium foi a espécie mais frequente com 112 casos. Os menores de um ano contribuíram com 91 por cento dos casos, dos quais 52 por cento ocorreram no primeiro trimestre de vida. A incidência média por zona não mostrou diferencas estatisticamente significantes. A letalidade média foi de 87 por cento . Os menores de um ano apresentaram um valor ainda maior, 89 por cento . No período estudado foram identificados 211 casos de meningite por outras enterobactérias com um coeficiente médio de 0,2. A primeira década contribuiu com 32 por cento dos casos. Os gêneros Escherichia e Enterobacter foram os mais frequentes sendo responsáveis por 71 por cento dos casos. Os menores de um ano contribuiram com 57 por cento dos casos, com coeficiente de 4.0 e 4.5 para os períodos 1960-69 e 1970-77 respectivamente. A letalidade média foi de 65 por cento sendo o grupo etário maior de 60 anos o de maior letalidade. A incidência por zona não diferiu significantemente. A meningite por bacilo Gram-negativo apresentou um comportamento epidemiológico distinto da meningite por H.influenzae e das enterobactérias, revelando ser composto por uma miscelânea de agentes. No período de estudo foram identificados 25455 casos de meningite bacteriana, com coeficiente médio de 25 por 100000 habitantes. O coeficiente passaria a ser de 36 por 100000 habitantes se acrecentássemos as meningites bacterianas de etiologia indeterminada. Este índice representou 1 caso para 2782 habitantes. A meningite por N.meningitidis ocupou o primeiro lugar, com 84 por cento dos casos e um coeficiente médio de 21 por 100000. Na primeira década ocorreram 2657 casos, com um coeficiente médio de 5,4 por 100000 habitantes. As três principais etiologias foram responsáveis por 89 por cento dos casos. No octênio seguinte a meningite por meningococo foi responsável por 90 por cento dos casos. No ano de 1974, acme da epidemia de meningite meningocócica, foram identificados 18069 casos de meningite representando um coeficiente de 264 por 100000. Este valor representaria que 1 em cada 379 habitantes foi acometido pela doença naquele ano. / Bacterial meningitis is an intectious disease of major public health throughout the world because of its high incidence and case fatality rates and the permanent sequelae that are seen in the survivors. Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis and Streptococcus pneumoniae are the etiologic agents responsible for 60 to 80 per cent of cases. The purpose of this study is to better understand the epidemiology of meningitis caused by H. influenzae, S. pneumoniae and gram-negative bacilli, especially, the Enterobacteriaceae, in the city of São Paulo during the period 1960-77. The survey was performed by a group of professors from the Department of Social Medicine of the \"Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo\", public health physicians and medical students. Data were obtained directly from the patient\'s records and registered on a pre-coded form. Cases of H.influenzae meningitis were confirmed by culture while S.pneumoniae cases were confirmed by gram stain and/or culture of the cerebrospinal fluid (CSP). The cases of gram negative bacillary meningitis were divided into three groups. The first included the cases that were diagnosed by gram stain and culture; the second, the cases where salmonella species were isolated in the culture: and the third, the cases where the presence of other Enterobacteriaceae were identified. The districts of the city of São Paulo were grouped in three ways: two corresponding to the homogenous areas specified by the \"Fundação SEADE\", and the third one based on the distribution of the economically active population according to its participation in the different branches of economic activity. The population of São Paulo by districts included in the study was estimated by the modified geometric method. During the study, 900 cases ot H. influenzae meningitis were confirmed, giving an average rate ot 0.89 cases per 100,000 population. Children <5 years old represented 91 per cent ot the cases, 63 per cent of them being less than one year old . The average rate for children <1 year old was 23.3 cases per 10O,OOO population. The average case fatality rate for the period 1960-77 was 31 per cent . The hightest case fatality rate ocurred in children <1 year old and was 40 per cent . The central, intermediate and peripheria zones didn\'t show significant different rates of incidence. The age standartized morbidity rates for these zones were, respectively, 0.8, 0.8 and 0.9. During 1960-77, 1,951 cases of S.pneumoniae meningitis were confirmed, giving an average rate of 1.9 per 100,000 population. Children <5 years old accounted for 52.4 per cent ot cases and 38.5 per cent were <l year old. The average rates for children <1 year of age were 37.1 and 29.7 per 100,000 population, for the periods of 1960-69 and 1970- 77, respectively. The incidence rate for the peripheria zone -2.2 per 100000 population- pratically doubled the rate for the central area- 1.2 per 100000 population- in the 1960\'s. The age standardized rates were 1.6, 1.5 and 2.0 tor central, intermediate, and peripheric zones, respectively. In the 1970\'s these rates were 1.4, 1.5 and 2.0. The average case fatality rate for the period was 46.9 per cent , which inversely proportional to the number ot CSF leucocytes at first examination. For children <1 year old, the case tatality rate was 60 per cent during the same period. Two hundred ninety cases of Salmonella meningitis were indentitied during the study, 10 per cent of them during the first decade. The average rate was 0.3 cases per 100,000 population. S. typhimurium was the most frequently isolated species, with 112 cases. Children <1 year old represented 91 per cent of the cases and 52 per cent ot these ocurred in children <3 months of age. The averages rates of incidence in the different zones didn\'t show statistically significant differences. The average case fatality rate was 87 per cent children <1 year old had a rate of 89 per cent . During the study period, 211 cases of meningites by other Enterobacteriaceae were indentified , giving an average rate of 0.2 per 100,000. Almost one-third of these cases ocurred in the first decade of the study period. The genus Escherichia and the genus Enterobacter were the most frequent, being responsible for 32 per cent of the cases. For children under one year 1 the rates were 4.0 and 4.5 for the periods of 1960-69 and 1970-77, respectively, representing 57 per cent of the total of cases. The average case fatality rate was 65 per cent , the hightest being among persons >60 years old. The rates of incidence by zone didn\'t show significant differences. The epidemiology of gram-negative bacillary meningitis was distinct from that of H.influenzae meningitis and meningitis due to the Enterobacteriaceae, giving evidence of being composed by a mixture of agents. In the same period, 25,455 cases of bacterial meningitis were identified, giving an average rate of 25 cases per 100,000 population. This rate would be 36.0 per 100,000 if we added the cases ot bacterial meningitis of unknown etiology. This represents one case per 2,782 inhabitants. N. meningitidis meningitis was the most frequent etiologic agent representing 84 per cent of the total, giving an average rate of 21 per 100,000. From 1960-69, 2,657 cases ocurred, giving an average rate of 5,4. The three principal etiologies were responsible for 89 per cent of cases. During the next eight years, 90 per cent of cases of meningitis were meningococcal. In year of 19/4, during the peak of the meningoccocal meningitis epidemic, 18,069 cases of meningitis were identified, representing a rate of 264 per 100,000. Put another way, 1 in 379 inhabitants developed menngitis.

Fatores de risco clássicos descritos como associados ao desenvolvimento da aterosclerose nem sempre conseguem explicar uma variabilidade da evolução da doença entre um indivíduo e outro. Evidências consistentes mostram que a inflamação exerce papel crucial na patogenia da aterosclerose. Recentemente, a infecção por alguns agentes, principalmente a C. pneumoniae, tem sido progressivamente aventada como possível fator colaborador no processo de aterogênese. O Mycoplasma pneumoniae, bactéria que utiliza colesterol para sua proliferação, foi descrito no interior de placas gordurosas humanas, conjuntamente com a C.pneumoniae. Objetivo - O presente estudo tem como objetivo verificar se antígenos dos agentes infecciosos M. pneumoniae e C. pneumoniae estão presentes na parede das artérias aortas normais dos coelhos, animal que tem sido freqüentemente utilizado no estudo da aterosclerose, e se a introdução de dieta rica em colesterol leva a proliferação desses microorganismos concomitante com o desenvolvimento da placa aterosclerótica e de inflamação. Material e Métodos - Foram estudados 39 coelhos da raça Nova Zelândia, divididos em três grupos conforme a alimentação: Grupo A - dieta normal , Grupo B - dieta com 1% de colesterol por 8 semanas e Grupo C - dieta com 1% de colesterol por 12 semanas. O colesterol total e frações foram dosados bioquimicamente, após sacrifício dos animais. Avaliou-se macroscopicamente a quantidade de placas de gordura na superfície da aorta através da coloração pelo Sudan IV e microscopicamente dois segmentos transversais: um torácico e um abdominal os quais foram submetidos a reações de Imunohistoquímica para antígenos infecciosos. Resultados - Antígenos da C. pneumoniae e M. pneumoniae estiveram presentes em todos os animais estudados, porém em quantidades progressivamente maiores nos grupos A, B e C. Houve forte correlação positiva entre a quantidade de antígenos infecciosos e espessura da camada íntima, inflamação e quantidade de gordura, à histologia tanto no segmento torácico quanto no abdominal. Houve correlação negativa entre perímetro do vaso e tamanho das placas no segmento torácico, cujas placas apresentaram maior porcentagem de fibrose comparadas com o segmento abdominal, indicando que as placas dessa região apresentam mais características evolutivas para placa estável, ou seja, remodelamento negativo do vaso e capa de fibrose. A intensidade da inflamação tanto na adventícia quanto na íntima se correlacionou positivamente à quantidade de ambos os patógenos reforçando a hipótese de que esses patógenos estão influenciando no desencadeamento da inflamação e desenvolvimento de aterosclerose. Os níveis plasmáticos de colesterol total e suas frações também se correlacionaram positivamente com os agentes infecciosos. Em conclusão - A alimentação rica em colesterol levou a aumento da intensidade de antígenos de Mycoplasma pneumoniae e C. pneumoniae presentes na íntima da aorta de coelhos, em correlação com aumento da espessura intimal e inflamação na parede do vaso, favorecendo de forma intensa a hipótese de que esses agentes têm papel importante na aterogênese. A presença desses microorganismos em pequena quantidade nos animais controles reforça a idéia de que esses microorganismos são habitantes usuais de mamíferos e que fatores de risco tais como o colesterol induzem sua proliferação e o desenvolvimento da aterosclerose / Classical risk factors described to be associated with the development of atherosclerosis do not completely explain the variability of the disease occurring among the individuals. Consistent evidences show that inflammation exerts a fundamental role in the pathogenesis and severity of atherosclerosis. Recentently, some infectious agents, specially the Chlamydophila pneumoniae (C.pneumoniae), have progressively been claimed as possible factor acting in the progression of atherosclerosis. Mycoplasma pneumoniae (M.pneumoniae), a bacterium that needs cholesterol for proliferation, has been described in human fat plaques, in conjunction with C.pneumoniae. Objective - The present study has the objective of analyzing if M. pneumoniae and C. pneumoniae antigens are present at the rabbit aorta arterial walls, as the rabbit is an animal model frequently used in studies of atherosclerosis; and if the cholesterol enriched diet may cause proliferation of these microorganisms concomitantly with the development of atherosclerotic plaques and inflammation. Material and Methods - 39 aortas from New Zealand rabbits divided in three groups according to the diet were studied: Group A -normal dieta, Group B - 1% cholesterol enriched diet for 8 weeks and Group C - 1% cholesterol enriched diet for 12 weeks. The serum levels of total and fractions of cholesterol were biochemically measured after animals killed. A macroscopic study of the percentage area occupied by fat at the intimal aorta surface was performed, using the Sudan IV stain. A microscopic study was performed in two transversal segments: a thoracic and an abdominal one, which were submitted to immunohistochemistry for detection of these infectious agents. Results - C. pneumoniae and M. pneumoniae Ags were present in all studied animals, however in progressively higher amounts in groups A, B and C. There was a strong positive correlation between microscopic amounts of infectious antigens and intimal thickness, inflammation and intraplaque fat, both at the thoracic and abdominal segments. There was a negative correlation between vessel perimeter and plaque area at the thoracic segment, where the plaques presented higher percentage of fibrosis compared with the abdominal segment, suggesting that the thoracic region plaques have characteristics for progression to estabilization: negative remodeling of the vessel and fibrous cap. The quantity of Inflammation at both intima and adventitia correlated positively with these infectious agents, re-inforcing the hypothesis that infectious antigens are inducing inflammation and development of atherosclerosis. Serum levels of total cholesterol and their fractions also positively correlated with the amount of infectious antigens. In conclusion - A rich cholesterol diet caused an increase of M. pneumoniae and C.pneumoniae antigens at intima of rabbit aortas, in strong positive correlation with intimal thickness and inflammation of the aorta wall, favoring the hypothesis that these infectious agents have important role in atherogenesis. The presence of small amount of these microorganisms\' antigens at the controls re-inforces the Idea that these microorganisms are usual inhabitants of mammals and that the risk factors such as cholesterol induce their proliferation and acceleration of atherosclerogenesis.

A Proteína Transportadora de Poliaminas (PotD) é um antígeno importante para a virulência de Streptococcus pneumoniae in vivo, capaz de proteger camundongos imunizados contra infecção sistêmica, além de reduzir a colonização da nasofaringe dos animais. Porém, visando ampliar a cobertura vacinal, a combinação com outros antígenos da bactéria se faz necessária. Este trabalho teve como objetivo aprofundar o estudo sobre a resposta imune gerada contra a proteína PotD, sozinha ou em fusão com duas outras proteínas pneumocócicas: o derivado de Pneumolisina, PdT, e a proteína de superfície de pneumococo A (PspA). Para tanto, os genes potD, pdT e pspA foram clonados e expressos, sozinhos ou fusionados, gerando as proteínas híbridas rPotD-PdT e rPspA-PotD. As proteínas recombinantes e os híbridos foram utilizados na imunização subcutânea de camundongos BALB/c, gerando elevados níveis de anticorpos. O soro dos animais imunizados foi capaz de reconhecer e se ligar à superfície de diferentes isolados de pneumococos, e de ampliar a fagocitose da bactéria por células peritoneais murinas in vitro. Em todos os ensaios, os híbridos se mostraram mais eficazes do que as proteínas isoladas, induzindo anticorpos capazes de potencializar a fagocitose dos pneumococos. A resposta imune celular foi caracterizada pela produção de INF-&#947;, IL-2 e IL-17 pelos esplenócitos, e um aumento na produção de NO pelos fagócitos peritoneais dos animais imunizados. Apesar dos resultados promissores in vitro, a proteína rPotD-PdT não foi capaz de induzir proteção em nenhum dos modelos avaliados; em contraste, a fusão rPspAPotD foi capaz de proteger os camundongos contra sepse por dois isolados virulentos de pneumococo, além de reduzir a colonização na nasofaringe. Por fim, demonstramos que a adição das poliaminas transportadas por PotD, espermidina e putrescina, à cultura de pneumococos interfere na formação de biofilme in vitro. Cnsiderando o importante papel da formação de biofilmes na colonização, este resultado sugere um possível mecanismo de ação da PotD durante a colonização por pneumococo. Em conjunto, os resultados deste estudo sugerem que a utilização de uma formulação híbrida, rPspA-PotD, compreende uma estratégia vacinal promissora, capaz de proteger contra colonização e sepse pneumocócica, pela produção de anticorpos opsonizantes e ativação de citocinas protetoras, como IL-17. / Polyamine Transporter D (PotD) is an important antigen for Streptococcus pneumoniae virulence in vivo, protecting immunized mice against systemic infection and reducing the bacterial load in the nasopharynx of immunized animals. However, in order to extend vaccine coverage, the combination of PotD with other antigens of the bacterium is required. The present study aimed at expanding the investigation of the immune response generated against PotD alone or fused with two other pneumococcal proteins: the Pneumolysin derivative, PdT and Pneumococcal Surface Protein A (PspA). Therefore, the potD, pdt and pspA genes were cloned and expressed, either alone or in fusion, generating the hybrid proteins rPotD-PdT and rPspA-PotD. The recombinant proteins and hybrids were used for subcutaneous immunization of BALB/c mice, generating high levels of antibodies. Sera from immunized animals were able to recognize and bind onto the surface of different pneumococcal strains, and to enhance phagocytosis of the bacterium in vitro. In all tests, the hybrids were more effective than the isolated proteins. The cellular immune response was characterized by the production of INF-&#947;, IL-2 and IL-17 by splenocytes and increased production of NO by peritoneal cells of the immunized animals. Despite promising results in vitro, rPotD-PdT protein was not able to induce protection in any of the tested challenge models. In contrast, rPspA-PotD fusion was able to protect mice against sepsis with two virulent isolates of pneumococcus and led to reduction in bacterial loads in the nasopharynx of challenged animals. Finally, we demonstrate that the addition of exogenous polyamines, spermidine, and putrescine, in the pneumococcal culture interfered with biofilm formation in vitro. Considering the important role of biofilm formation for successful colonization, this result suggests a possible mechanism of action of PotD during colonization by pneumococcus. Taken together, the results suggest that the use of the hybrid rPspA-PotD comprises a promising vaccine strategy, able to protect against colonization and pneumococcal sepsis, through the production of opsonizing antibodies and activation of protective cytokines, such as IL-17.

La diffusion des bactéries multirésistantes aux antibiotiques associée à une diminution du nombre de nouveaux antibiotiques représente un véritable enjeu de santé publique. De nos jours, un vieil antibiotique, la colistine, connait un récent regain d’intérêt, constituant parfois la seule alternative thérapeutique. La colistine est, alors, qualifiée d’antibiotique de « dernier recours ». Cependant, il a été constaté l’apparition de souches résistantes à la colistine. L’objectif principal de ce travail de thèse a été d’étudier le(s) mécanisme(s) de résistance à la colistine chez K. pneumoniae. Afin de mener à bien notre projet, nous nous sommes intéressés à deux aspects de la problématique. Dans un premier temps, nous avons cherché à mieux comprendre ce mécanisme, en associant une étude génotypique à une étude phénotypique. Et dans un second temps, nous avons cherché des alternatives thérapeutiques, en évaluant différentes associations antibiotiques / The global spread of multidrug-resistant Gram-negative bacteria associated with a decrease in the number of new antibiotic therapies is a major public health issue. Colistin is often referred to as the "last-resort" antibiotic, used as the only therapeutic alternative for MDR Gram-negative bacteria infection, which explains the current renewal of interest in this antimicrobial agent. However, the appearance of colistin-resistant bacterial strains has been already observed. The main objective of this PhD work was to study the colistin resistance mechanism (s) in K. pneumoniae by looking at two aspects of the problem. Firstly, we sought to better understand this mechanism, associating a genotypic study with a phenotypic study. Next, we looked for therapeutic alternatives, by evaluating different antibiotic combinations

S. pneumoniae coloniza a nasofaringe e é um dos principais agente de otite média, pneumonia, bacteremia e meningite com altas taxas de morbidade e mortalidade. Estima-se que 1,6 milhões de pessoas morram de doença pneumocócica por ano, a maioria crianças menores de cinco anos de idade, principalmente em países em desenvolvimento. A cápsula polissarídica antifagocitária é o principal fator de virulência deste microrganismo e determina os 93 sorotipos conhecidos, sendo o alvo de vacinas pneumocócicas. No presente trabalho foi padronizada a tipagem molecular por Multiplex PCR de S. pneumoniae, que compreende 30 pares de iniciadores agrupados em seis reações sequenciais. Foram tipadas 270 cepas de pneumococo isoladas entre janeiro de 2005 a setembro de 2011, proveniente de líquor (13%), sangue (76%) e líquido pleural (11%) de 232 pacientes atendidos no Hospital Universitário da USP. Além disso, a caraterização dessas amostras quanto ao perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e à diversidade foi realizada, segundo o CLSI 2011 e a genotipagem molecular pelas técnicas de Multilocus Sequencie Typing Scheme (MLST) e Pulsed Field Eletrophoresis Gel (PFGE), respectivamente. A tipagem por Multiplex PCR detectou 24 sorotipos/sorogrupos diferentes, que foram: 14 (22%), 5 (12%), 12F/A (11%), 6A/B/C (10%), 7F/A (5%), 1 (4%), 3 (4%), 10A (4%), 19A (4%), 18 A/B/C/F (3%), 4 (3%), 8 (3%), 23F (3%), 19F (3%) e outros (9%) (9V/A, 9N/L, 15A, 22F, 11A/D, 31, 38, 34, 16F, 17F e não tipável). Este método apresentou 100% de especificidade e 98% de sensibilidade para determinação de sorogrupos e 66% para sorotipos. Os sorotipos 14, 6B, 5 e 19F foram significativamente mais comuns em criança até dois anos, já entre adultos, os sorotipos 5 e 12F foram os predominantes. O perfil de sensibilidade em infecções não meníngeas foi de 99% de sensibilidade e 1% de resistência intermediária para penicilina e ceftriaxona. Para infecções meníngeas os resultados mostraram 73% de sensibilidade e 27% de resistência para penicilina e 88% de sensibilidade e 12% de resistência intermediária para ceftriaxona. A resistência aos beta-lactâmicos está ligada principalmente ao sorotipo 14 que foi o sorotipo mais isolado com 52 cepas e dessas foram realizados MLST e PFGE. No MLST encontramos 51 cepas pertencentes ao clone Spain9V-3 (ST 156) que é predominante na região sul e sudeste do Brasil e uma cepa com um tipo de sequência ainda não depositada. Pela técnica de PFGE foram detectados três clusters e quatro amostras não relacionadas, o cluster A foi predominante com 41(79%) cepas com 81,7% de similaridade entre elas. A técnica de Multiplex PCR demonstrou ser excelente ferramenta para a detecção dos sorotipos/sorogrupos de S. pneumoniae. Não foi detectada resistência plena à penicilina e ceftriaxona em infecções não meníngeas consolidando a importância do uso da penicilina no tratamento da doença pneumocócica não meníngea. Houve grande similaridade genética entre cepas de S. pneumoniae sorotipo 14. / S.pneumoniae colonizes the nasopharynx and is a major agent of otitis media, pneumonia, bacteremia and meningitis with high morbidity and mortality. It is estimated that 1.6 million people die of pneumococcal disease every year, mostly children under five years old, mainly in developing countries. The antiphagocytic polissarídica capsule is the main virulence factor of this organism and determine the 93 serotypes known for being the target of pneumococcal vaccines. In the present study was standardized molecular typing by Multiplex PCR molecular typing, which comprises 30 primer pairs grouped into six sequential reactions. We performed antimicrobial susceptibility profile, according to the CLSI 2011 and the most frequent serotype was made by molecular genotyping techniques Multilocus Sequence Typing (MLST) and pulsed-field gel Eletrophoresis (PFGE). We studied 270 pneumococcal strains isolated from 2005 to September 2011, from CSF (13%), blood (76%) and pleural fluid (11%) of 232 patients attended at University Hospital of USP. Typing by Multiplex PCR detected 24 serotypes / serogroups different, which were: 14 (22%), 5 (12%), 12F / A (11%), 6A/B/C (10%), 7F / A (5 %), 1 (4%), 3 (4%), 10A (4%), 19A (4%), 18 A / B / C / F (3%), 4 (3%), 8 (3% ), 23F (3%), 19F (3%) and others (9%) (9V / A, 9N / L, 15A, 22F, 11A / D, 31, 38, 34, 16F, 17F and nontypable). This method showed 100% specificity and 98% sensitivity for the determination of 66% for serogroups and serotypes. Serotypes significantly more common in children under two years were: 14, 6B, 5 and 19F among adults serotypes 5 e12F were predominant. The sensitivity profile in non-meningeal infections was 99% sensitivity and 1% penicillin intermediate resistance to ceftriaxone. For meningeal infections the results showed 73% sensitivity and 27% resistance to penicillin and 88% sensitivity and 12% intermediate resistance to ceftriaxone. Resistance to beta-lactams is linked mainly to serotype 14 was the serotype most isolated, and of these 52 strains were performed MLST and PFGE. MLST found in 51 strains belonging to clone Spain9V-3 (ST 156) which is prevalent in south and southeastern Brazil and a strain with a type of sequence is not deposited. The technique of PFGE found three clusters and four non-related samples, cluster A predominated with 41 (79%) strains with 81.7% similarity between them. Multiplex PCR technique proved to be an excellent tool for the detection of serotypes/serogroups of S. pneumoniae. We did not detect full resistance to penicillin and ceftriaxone in non-meningeal infections showing the importance of use of penicillin in the treatment of pneumococcal non-meningeal disease. There was great genetic similarity among strains of S. pneumoniae serotype 14.

Au cours des dernières décennies, une augmentation non négligeable du phénomène de résistance aux antibiotiques des bactéries a été observée. Ces bactéries possèdent plusieurs mécanismes de résistance parmi lesquels l’utilisation de transporteurs de type MDR (MultiDrug Resistance) dont certains appartiennent à la famille des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette). Les transporteurs ABC sont des protéines membranaires et ubiquitaires qui possèdent une topologie commune avec deux domaines transmembranaires et deux domaines cytoplasmiques. Les transporteurs ABC de type exportateur permettent le transport de molécules à l’extérieur de la cellule en utilisant l’énergie fournie par l’hydrolyse de l’ATP. PatA-PatB est un transporteur ABC de Streptococcus pneumoniae, un pathogène humain responsable de pneumonies et de méningites. Cette protéine est impliquée dans la résistance de ce pathogène à des antibiotiques de types fluoroquinolones. Pour étudier son mécanisme moléculaire, nous avons optimisé la surexpression fonctionnelle de ce transporteur chez Escherichia coli. Ainsi, nous avons pu caractériser son activité de transport de drogues et son activité d’hydrolyse de nucléotides. Ces expériences ont révélé que PatA-PatB a la particularité d’utiliser préférentiellement le GTP comme source d’énergie, contrairement aux autres membres de cette famille. Afin d’identifier l’origine de cette propriété au niveau moléculaire, des expériences de mutagénèse dirigée ont été effectuées et nous avons ainsi identifié deux simples mutants qui transportent les drogues aussi bien avec du GTP que de l’ATP / The excessive use of antibiotics during the past decades led to the amplification of multidrug resistance in pathogenic bacteria. Bacteria have developed several mechanisms of antibiotic resistance. One of them involves the antibiotic efflux by MDR (MultiDrug Resistance) transporters, some of which belong to the ABC (ATP-Binding Cassette) transporter family. ABC transporter are ubiquitous membrane proteins with a conserved topology comprising four domains : two «TransMembrane Domain» and two cytoplasmic domains named « Nucleotide-Binding Domain ». ABC exporters expel drugs outside the bacteria using the energy of ATP hydrolysis. PatA-PatB is an ABC transporter from Streptococcus pneumoniae, a human pathogen bacterium responsible for pneumonia and meningitis. This protein is involved in S. pneumoniae resistance against fluoroquinolone antibiotics. To study the molecular mechanism, we optimized the functional expression of this transporter in Escherichia coli. Then, we characterized its drug transport activity and its nucleotide hydrolysis activity. These experiments showed that PatA-PatB, in contrast to other members of the ABC superfamily, preferentially uses GTP as energy supply. To identify the origin of this property at a molecular level, mutagenesis experiments were performed and we identified two mutants capable of an even drug transport with ATP and GTP

Doenças invasivas causadas por S. pneumoniae provocam cerca de 1,5 milhões de mortes anuais de crianças no mundo. Testes imunocromatográficos rápidos (dipsticks) são alternativa a métodos diagnósticos tradicionais, devido à fácil execução e baixo custo. Neste estudo foram desenvolvidos dipsticks para diagnóstico de S. pneumoniae utilizando: anticorpos de captura - monoclonais anti-pneumolisina recombinante (Ply) - AcMs D9-43 e E10-24, reativos contra 21 sorotipos prevalentes de S. pneumoniae; anticorpos de detecção (conjugados com diferentes partículas coloidais coloridas - corante têxtil, microesferas e nanopartículas de ouro) - Igs anti-Ply e anti-vacina pneumocócica celular (em desenvolvimento no Instituto Butantan) (anti-WCPV). Dipsticks com anti-Ply ou anti-WCPV conjugados com ouro ou microesferas coloidais detectaram a bactéria em todos os sorotipos prevalentes avaliados, entre 104 e 105 UFC/ml e pneumolisina nativa, em sobrenadantes de cultivo de S. pneumoniae, até uma concentração estimada 19,3 ng/ml e 9.7 ng/ml, respectivamente. Os resultados foram visualizados em aproximadamente 10 min. / Invasive diseases caused by S. pneumoniae are responsible for about 1.5 million child deaths per year worldwide. Rapid Immunochromatographic tests (dipsticks) are alternative to traditional diagnostic methods due to easy execution and low cost. In this study, dipsticks have been developed for diagnosis of S. pneumoniae using: capture antibodies - monoclonal anti- recombinant pneumolysin (Ply), MAbs D9 -43 and E10 - 24, reactive against 21 prevalent serotypes of S. pneumoniae; detection antibodies (conjugated with different colored colloidal particles - textile dye; microspheres and gold nanoparticles) - anti-Ply and anti whole cell pneumococcal vaccine (in developing in the Butantan Institute) (anti- WCPV). Dipsticks with anti-Ply or anti-WCPV conjugated with colloidal gold or microspheres detected the bacterium in all the evaluated prevalent serotypes, between 104 e 105 CFU/ml, and native pneumolysin in culture supernatants of S. pneumoniae to an estimated concentration 19.3 ng/ml and 9.7 ng/ml, respectively. The results could be visualized in around 10 min.