Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / De nouveaux catalyseurs peuvent être générés par la construction de peptides, incorporant des acides aminés naturels et conformationnellement restreints, dans l’objectif de mimer les aspects structuraux des sites actifs d’enzymes. Le travail présenté dans ce mémoire consiste en la synthèse et en la caractérisation d’un nouveau peptide cyclique, le cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1), dans lequel deux résidus d’acide aspartique sont situés entre deux résidus d’acide aminé indolizidinone (IAA). Ce peptide cyclique est conçu de façon à placer les groupes carboxyliques des résidus d’acide aspartique à proximité grâce aux restrictions de la chaîne peptidique causées par les IAA. Avec ces caractéristiques, le cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1) est proposé comme mimétique des protéases aspartiques. Les protéases aspartiques constituent une classe d’enzymes qui ont pour fonction d’hydrolyser les liaisons amides des peptides et des protéines. Leur site actif contient deux résidus d’acide aspartique dont les chaînes latérales sont situées à proximité. Un seul groupe carboxylate est protoné dans la forme active de l’enzyme. Le mécanisme d’hydrolyse pour ces molécules procède soit par une attaque nucléophile par un des groupes carboxylates soit par l’attaque d’une molécule d’eau assistée par les groupes carboxyles comme acide général/base générale. Dans le cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1), la relation spatiale entre les deux groupes carboxyliques des résidus d’acide aspartique pourrait promouvoir l’hydrolyse de liaisons esters ou amides selon le mécanisme base générale/acide général ou nucléophile. Deux conformations de même énergie ont été trouvées pour le cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1) en utilisant la recherche conformationnelle de Monte Carlo. La première conformation possède les caractéristiques d’un feuillet plissé β antiparallèle situé entre deux IAA placés aux positions i + 1 et i + 2 de repliements β de type II’. Dans la seconde, les résidus IAA sont placés aux positions i et i + 1 d’un repliement tordu. Le peptide cyclique 1 a été préparé en solution avec un rendement de 11 % ainsi que sur support solide avec un rendement de 25 % en utilisant la résine PAB-BHA. La conformation du cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1) a été déterminée avec l’aide des constantes de couplage scalaires en RMN de ^1H, des couplages dipolaires du spectre NOESY et avec les gradients de déplacement chimiques des protons amides en fonction de la température (Δδ/ΔT). Les résultats de l’analyse conformationnelle soutiennent l’une des conformations trouvées par la modélisation moléculaire et non la seconde. Les constantes de couplage vicinales entre les protons en α et les deux protons diastéréotopiques en β des résidus Asp indiquent que les groupes carboxyliques sont positionnés au-dessus du cycle. De plus, le titrage potentiométrique dans l’eau du cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1) donne des valeurs anormales de pKa pour les deux acides carboxyliques. Par contre, les expériences préliminaires consistant à déterminer l’activité catalytique du cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1) montrent que le peptide cyclique est peu efficace pour accélérer l’hydrolyse de l’acétate de 2,4-dinitrophényle. En détaillant la synthèse et la caractérisation du cyclo[IAA-Asp-IAA-Asp] (1), ce travail de recherche discute du mérite de l’utilisation d’acides aminés naturels et conformationnellement restreints pour la construction de peptides pouvant mimer les sites actifs d’enzymes.

La chymosine, enzyme utilisée dans l´industrie fromagère pour coaguler le lait, est traditionnellement extraite à partir du quatrième estomac de veaux non sevrés. La préparation ainsi obtenue dénommée présure a été depuis un certain nombre d´années substituée par divers coagulants d´origine microbienne et de plantes car la production de cette enzyme seule n´était plus capable de répondre à la demande mondiale du fait notamment de l´augmentation de la production fromagère. La chymosine est cependant toujours considérée comme étant la meilleure enzyme pour coaguler le lait dans l´industrie fromagère. Ainsi, les techniques d´ingénierie génétique ont été utilisées pour produire de la chymosine bovine recombinante. C´est en utilisant ces techniques que nous proposons d´établir un procédé de production de chymosine bovine recombinante permettant l'innovation technologique et contribuant au maintien et au développement d'entreprises agro-alimentaires brésiliennes et des pays du Marché Economique du « Cone Sul » (MercoSul).<br />Nous avons ainsi cloné les séquences codant la préprochymosine A et la préprochymosine B à l'aide des techniques classiques de biologie moléculaire. Nous avons observé la présence de mutations dans la partie du propeptide de la prochymosine A et dans la partie mature de la prochymosine B. Cette dernière mutation, S79N, se situe dans la partie du tampon (résidus 72 à 86) qui constitue une anse externe mobile recouvrant le sillon du site actif. La conformation de ce tampon est caractéristique de la chymosine et serait en partie responsable pour sa grande spécificité. Nous avons modélisé cette mutation, qui semble entraîner des changements dans le réseau de liaisons hydrogène du tampon. Les séquences obtenues ont ainsi été introduites dans différents vecteurs d´expression puis clonées chez Escherichia coli et Pichia pastoris. L'expression des protéines a été suivie à l'aide d'anticorps spécifiques et au moyen de tests d'activité. Les différentes protéines sont toutes actives et ont été purifiées à l'homogénéité. Nous avons alors étudié leurs propriétés cinétiques à l'aide de différents substrats. Les chymosines B et BS79N ont un optimum de pH qui les différencie de la chymosine A. Le mutant B S79N a des propriétés cinétiques améliorées avec l´hexapeptide synthétique. La mutation S79N n´entraîne toutefois qu´une petite augmentation de la constante d´efficacité concernant les hydrolyses de la caséine Κ et du lait, bien que ses vitesses de réactions catalytiques soient supérieures à celles de la chymosine B. Ces résultats sont expliqués par les modifications dans le réseau de liaisons hydrogène du tampon, et par le fait que le nombre d'interactions entre le substrat et l'enzyme est une fonction de la masse moléculaire et de la nature du substrat.

Les phospholipases A2 constituent une superfamille de protéines comprenant au moins onze phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) et douze phospholipases A2 intracellulaires. Ces protéines catalysent l'hydrolyse des phospholipides en position sn-2, libérant un acide gras et un lysophospholipide. Elles contrôlent ainsi la production d'une variété de médiateurs lipidiques qui sont importants pour de multiples fonctions cellulaires dans différents contextes physiologiques ou physiopathologiques (maladies inflammatoires et cancer). La sPLA2 de groupe X a été clonée au laboratoire en 1997 et possède des propriétés moléculaires uniques. Son ARN messager est présent dans différents tissus, mais semble peu régulé par des stimuli proinflammatoires. L'enzyme est unique dans sa capacité à libérer des médiateurs lipidiques à partir des phospholipides cellulaires ou des lipoprotéines et possède aussi des propriétés antimicrobiennes variées. Un élément clé de la régulation fonctionnelle de la sPLA2 de groupe X est vraisemblablement lié à la présence d'un propeptide dans sa partie N-terminale. Le lieu de la maturation protéolytique de la sPLA2 de groupe X (dans la cellule avant sécrétion ou à l'extérieur après sécrétion du proenzyme), les protéases impliquées et la régulation de cette maturation dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques sont inconnus. Le travail de cette thèse a permis de mieux comprendre comment peut s'effectuer la maturation de la sPLA2 de groupe X et quels sont ses rôles physiologiques et physiopathologiques. Concernant la maturation, nos études in vitro sur protéines purifiées et en cellules transfectées (HEK293) ont permis de montrer qu'une protéase de type furine contribue de façon majeure à l'activation de l'enzyme, vraisemblablement au cours de sa sécrétion. Nos travaux suggèrent aussi qu'une maturation est possible par d'autres protéases et dans le milieu extracellulaire comme par exemple dans les cellules LOVO. Nous avons aussi tenté de mettre en évidence cette maturation dans des tissus murins dans certaines conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous avons notamment trouvé que la sPLA2-X était la sPLA2 majeure présente dans l'acrosome des spermatozoïdes. Enfin nous avons observé un polymorphisme présent dans le propeptide de la sPLA2 humaine qui conduit à la formation d'une protéine inactive et rapidement dégradée. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons montré que la forme active de la sPLA2 de groupe X, mais pas son proenzyme était capable i) de stimuler la prolifération cellulaire dans un contexte de cancer colorectal, ii) d'exercer une action toxique contre le parasite de la malaria P.falciparum lors de l'infection de globules rouges humains, et iii) de contrôler la réaction acrosomique des spermatozoïdes de souris, avec un impact important sur le taux de fécondité dans des tests de fécondation in vitro.

Les microarrays, assemblages organisés d'entités chimiques, biologiques ou cellulaires sont en pleine expansion, car ils présentent un potentiel élevé en recherche fondamentale et appliquée. La mise en œuvre de la technologie microarray repose sur trois méthodes essentielles : la chimie de surface pour la fonctionnalisation des supports, l'utilisation de technologies de précision micrométrique pour fabriquer les microarrays et la détection. Parmi toutes les applications, les microarrays visant à détecter l'activité enzymatique ont connus un développement rapide car ils permettent de tester l'efficacité d'un grand nombre de substrats ou d'inhibiteurs en parallèle. Les protéases, enzymes indispensables aux organismes vivants, et cibles thérapeutiques reconnues, sont des modèles biologiques de choix pour les études d'activité enzymatique sur microarray. La synthèse chimique sur puce n'est en revanche pas très développée.<br />La technologie développée au sein du laboratoire nous permet de former sur quelques cm2 des microarrays de centaines de microgouttes constituant chacune un microréacteur indépendant. Le but de cette thèse est d'appliquer pour la première fois cette technologie à la synthèse chimique et à l'étude de l'activité protéolytique, avant de combiner de manière novatrice les deux approches pour réaliser un criblage.<br />L'application de ces microarrays en synthèse chimique a été utilisée avec succès pour la synthèse d'une banque de molécules chimiques et pour la recherche combinatoire de nouveaux fluorophores. En ce qui concerne l'enzymologie, l'observation de la protéolyse a été validée en utilisant trois types de substrats fluorogènes, dans un premier temps avec la papaïne, puis avec une métalloprotéase, et enfin avec la protéase virale NS3 du virus de l'hépatite C. Finalement, l'utilisation séquentielle de la synthèse chimique et de la biochimie sur un même microarray, qui constitue une approche inédite, a été dédiée à la recherche de nouveaux inhibiteurs de la protéase virale NS3. Ce criblage a conduit à la découverte de molécules potentiellement intéressantes comme agents antiviraux.

Medicago truncatula est une Légumineuse établissant une interaction symbiotique avec une bactérie tellurique de la famille des Rhizobiacées, Sinorhizobium meliloti. Cette interaction induit l'organogénèse racinaire d'un nouvel organe, la nodosité dans laquelle s'établit un microenvironnement propice à la différenciation de S. meliloti en bactéroïde fixateur du diazote atmosphérique. Ce dernier réduit ainsi le N2 atmosphérique en ammonium, assimilé ensuite par la plante hôte. Cette réduction étant très endergonique M. truncatula fournit aux bactéroïdes des substrats carbonés issus de la photosynthèse. Cependant, cette interaction n'est pas pérenne, du fait de la mise en place d'un processus de sénescence ; processus conduisant à la lyse des bactéroïdes et des cellules hôtes végétales. Cependant, à l'heure actuelle, ce processus de rupture symbiotique reste largement méconnu. Afin de mieux caractériser ce processus de sénescence, nous avons développé de nouveaux outils cytologiques permettant par microscopie confocale de suivre in vivo la viabilité, mais également le fonctionnement des bactéroïdes au sein de la cellule hôte végétale. Ces nouvelles approches cytologiques pourraient ainsi offrir de nouvelles perspectives pour une caractérisation plus précise du déroulement du processus de sénescence nodositaire. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons également cherché à déterminer l'implication de deux cystéines protéases dans la mise en place du processus de sénescence nodositaire. Une des caractéristiques de ce processus de sénescence est une hausse de l'activité protéolytique, notamment des activités cystéine protéases. L'analyse transcriptomique par cDNA-AFLP du processus de sénescence nodositaire (Van de Velde et al. 2006) a pu mettre en évidence 508 gènes différentiellement exprimés dont deux cystéines protéases, MtCP6 et MtVPE. L'analyse spatio-temporelle de MtCP6 et MtVPE, par fusion transcriptionnelle avec le gène rapporteur GUS, a permis de mettre en évidence l'induction de ces deux gènes lors du processus de sénescence nodositaire aussi bien développementale qu'induit par un traitement abiotique ou lors d'une interaction symbiotique non efficace. De plus, nous avons pu démontrer, par génétique inverse, que la diminution de l'expression de ces deux protéases retarde la mise en place du processus de sénescence, alors que leur expression précoce conduit à la promouvoir. Enfin, l'étude par microscopie confocale de la localisation subcellulaire de ces protéases par fusion traductionnelle avec la GFP, démontre leur adressage aux bactéroïdes. Nos données tendent donc à démontrer le rôle clef de MtCP6 et de MtVPE dans le processus de sénescence nodositaire, où ces protéases pourraient participer directement au déclenchement d'une dégradation des bactéroïdes.

Les cancers broncho-pulmonaires à petites cellules (CBPPC), tumeurs endocrines représentant 20% des cancers pulmonaires, sont fortement associés au tabagisme. Ils sont très agressifs en raison de leur progression rapide et de la présence de métastases souvent présentes au moment du diagnostic. Moins de 10% des patients sont opérables et la plupart des échantillons de tumeurs sont recueillis par endoscopie bronchique ou par médiastinoscopie. Dans ce travail de thèse, nous avons montré que l’expression du TFPI-2, un gène suppresseur de tumeur, était diminué dans 65% des cas de CBPPC. Afin d’étudier l’impact du TFPI-2 sur la progression tumorale, nous avons préalablement développé un modèle orthotopique murin de CBPPC qui mime le développement de ce type de cancer pulmonaire. Des cellules NCI-H209, n’exprimant pas le TFPI-2, ont été préalablement transfectées pour exprimer la luciférase et la croissance tumorale a été suivie par imagerie de bioluminescence. L’expression du TFPI-2 a ensuite été restaurée dans ces cellules et nous avons montré que la croissance tumorale était alors réduite. Cet effet peut s’expliquer par une diminution de la prolifération des cellules exprimant le TFPI-2, associée à un arrêt du cycle cellulaire en phase G1/S dû à l’expression de p15 et de p27 et à une induction de l’apoptose. Nous avons aussi démontré que lorsque le TFPI-2 est surexprimé, les transcrits et les protéines MMP-1 et -3 sont diminuées, tout comme la phosphorylation des protéines de la voie des MAP Kinases impliquées dans l’induction des transcrits de ces MMP. Cette corrélation entre l’expression du TFPI-2 et la diminution de celle de la MMP-1 a été retrouvée dans 35% des échantillons de CBPPC humains. Ces résultats suggèrent que l’inactivation du TFPI-2 dans les CBPPC peut favoriser le développement de ce cancer. Enfin, nous avons également démontré, pour la première fois que le TFPI-2 peut aussi inhiber la kallicréine 12, une protéase à sérine potentiellement anti-angiogénique. L’ensemble de ces données suggèrent que le TFPI-2 peut être un potentiel biomédicament capable de limiter la progression des carcinomes pulmonaires à petites cellules. / Small Cell Lung Cancer (SCLC) is the most common neuroendocrine tumour of the lung (15% of cases) and is strongly associated with smoking. It is characterised by tumours that grow rapidly with early metastases. Less than 10% of patients with SCLC have a resectable tumour, thus surgical specimens are scarce and most tumour samples come from small biopsies obtained during bronchial endoscopy or mediastinoscopy. In this study, low levels of TFPI-2 expression were found in 65% of patients with SCLC. To study the impact of TFPI-2 in tumour progression, we first developed a clinically relevant animal model that resembles various stages of human SCLC. NCI-H209 cells, not expressing TFPI-2, were genetically modified to express firefly luciferase and the growth of the tumour was sensitively followed by bioluminescence imaging. TFPI-2 was then overexpressed in these cells and we showed that TFPI-2 inhibited lung tumour growth. Such inhibition could be explained in vitro by a decrease in tumour cell proliferation, blockade of G1/S phase cell cycle transition due to p15 and p27 expression, and an increase in apoptosis shown in NCI-H209 cells expressing TFPI-2. We also demonstrated that TFPI-2 upregulation in NCI-H209 cells decreased MMP expression, particularly by downregulating MMP-1 and MMP-3. Moreover, TFPI-2 inhibited phosphorylation of the MAPK signalling pathway proteins involved in the induction of MMP transcripts, among which MMP-1 was predominant in SCLC tissues and was inversely expressed with TFPI-2 in 35% of cases. These results suggest that downregulation of TFPI-2 expression could favour the development of SCLC. Finally, we also demonstrated for the first time that TFPI-2 could inhibit the kallikrein 12, an anti-angiogenic serine proteinase. Altogether, these results suggest that TFPI-2 could be a new potent therapeutic agent to control SCLC tumour progression in SCLC.

Lors de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), la différenciation fibroblastique s’accompagne d’une accumulation excessive des composants de la matrice extracellulaire ainsi qu’à un dérèglement de la balance protéases / antiprotéases. Nous avons étudié le rôle des cathepsines à cystéine dans la myofibrogenèse et leur contribution potentielle à la physiopathologie de la fibrose pulmonaire chez l’Homme. Pour cela, le profil d’expression des cathepsines ainsi que de leurs inhibiteurs naturels a été évalué dans un modèle cellulaire expérimental, puis dans des myofibroblastes primaires et enfin dans des liquides de lavage broncho-Alvéolaires (LBA) de patients atteints de FPI. Nos résultats montrent que lors de la FPI la cystatine C (inhibiteur naturel des protéases à cystéine) régule les activités protéolytiques des cathepsines extracellulaires et pourrait ainsi contribuer à l’accumulation de collagènes. Elle serait un biomarqueur potentiel de la FPI. D’autre part la cathepsine B participe à la différentiation fibroblastique et son inhibition retarde la myofibrogenèse. / During idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), fibroblast differentiation is accompanied by an excessive accumulation of extracellular matrix components as well as an imbalance between proteases and theirs inhibitors. We evaluated the role of human cysteine cathepsins in myofibrogenesis and their potential contribution to the pathogenesis of IPF. Expression of cathepsins and their natural inhibitors have been studied in an experimental cell model, but also in primary myofibroblasts and in bronchoalveolar lavage fluids (BALF) of patients suffering from IPF. Our results show that cystatin C (a natural inhibitor of cysteine proteases) regulates the extracellular proteolytic activities of cathepsins and could contribute to the accumulation of collagens. Cystatin C could also be a potential biomarker of IPF. On the other hand, cathepsin B participates in fibroblast differentiation and its inhibition delays myofibrogenesis.

La fibrose kystique (FK) est caractérisée par une inflammation pulmonaire chronique. Cette dernière est définie entre autres par une augmentation importante de la production de mucus. Celui-ci s'accumule dans les bronches empêchant ainsi l'éventuel passage de l'air. De plus, le mucus forme une barrière protectrice pour les bactéries qui va causer l'inflammation des poumons. La protéase human airway trypsin-like (HAT) a été retrouvée dans les expectorations de patients atteints d'asthme et bronchite chronique, pathologies similaires à la FK. Elle semble jouer un rôle dans l'inflammation car elle augmente entre autres la production de MUC5AC, protéine composant majoritairement le mucus. Le but de cette étude était de synthétiser la HAT dans une conformation active dans un système eucaryote pour étudier ses propriétés biochimiques, enzymatiques ainsi que son potentiel pro-inflammatoire dans la lignée cellulaire pulmonaire Calu-3. L'ADNc codant pour la partie soluble de la HAT a été inséré dans le vecteur pMT-BiP V5-His. Cet ADN recombinant fut ensuite transfecté dans les cellules de Drosophile Schneider 2 (S2). La HAT recombinante a par la suite été purifiée et son activité protéolytique testée avec un substrat fluorogénique. Ses propriétés biochimiques et enzymatiques ont été étudiées ainsi que son effet sur la production d'IL-8 et sa détection dans les expectorations de patients. La HAT purifiée était «enzymatiquement» pure, donc l'effet protéolytique observé avec le substrat fluorogénique est dû à la protéase. Les analyses de ses propriétés biochimiques montrent que l'activité protéolytique de la HAT est inhibée par un pH acide (<6.5), certains inhibiteurs synthétiques (l'aprotinine, la leupeptine et le PEFABLOC) et endogène (i.e: alpha-2 anti-plasmine (a2-AP)) de protéases à sérine. D'un autre côté, les essais enzymatiques révèlent que la HAT a une préférence pour les substrats ayant une arginine en P4, P3 et Pl plutôt que ceux ayant un glutamate en P4, P2 et P1'. Finalement, l'étude sur l'implication physiologique de l'enzyme démontre que la protéase ne semble pas avoir d'effet ou au plus peu d'effet sur la production d' IL-8. [Symboles non conformes]

L’identification de marqueurs pronostiques et prédictifs du cancer du sein est un facteur important pour une meilleure compréhension du processus évolutif et le développement de thérapies ciblées. Les récepteurs des oestrogènes (RE) représentent ainsi à la fois un marqueur pronostique mais aussi prédictif du traitement par le tamoxifène ou les anti-aromatases. Cependant, un certain nombre de patientes vont évoluer en dépit de traitements anti-hormonaux adaptés. L’objectif de notre travail, a été d’évaluer la méthode de mesure des RE, l’apport des protéases dans la distinction de profils tumoraux pronostiques et prédictifs. Nous avons démontré l’influence du mode de mesure des RE et en particulier de l’expression quantitative sur l’interprétation pronostique et sur une meilleure détermination du bénéfice du traitement en fonction du niveau d’expression des RE. Nous avons montré l’intérêt de l’évaluation des protéases tissulaires uPA, PAI-I et cathépsine-D, pour caractériser l’hétérogénéité des tumeurs en complément des RE. Particulièrement, chez les patientes RE+, des taux élevés de cathépsine-D et de PAI-1 étaient un indicateur de mauvais pronostic. Nous avons développé un nomogramme combinant RE et le statut ganglionnaire à 3 types de protéases : PAI-1, cathépsine-D et la thymidine kinase, pour déterminer la probabilité de survie à 2 et 5 ans. De plus, ces protéases évaluées dans les tumeurs infectées par l’Epstein-Barr virus (EBV), témoignaient de tumeurs biologiquement agressives avec des taux plus élevés de thymidine kinase. Notre travail a contribué à améliorer l’identification de profils des tumeurs en fonction des RE et des protéases et de caractériser les tumeurs viro-induites. / The identification of prognostic and predictive markers is important for a better understanding of the evolutionary process and the development of targeted therapies. Thus estrogen receptors (ER) represent both an important prognostic marker but also predictive of therapies using tamoxifen or aromatase inhibitors. However, a number of patients will evolve despite hormonotherapy. The objective of our work was to evaluate the method for measuring ER, the contribution of proteases in the distinction of prognostic and predictive tumor profiles. In our work, we demonstrated the influence of the mode of measure of ER and in particular its quantitative expression on the prognostic interpretation and a better determination of benefit of treatment depending on the level of expression of ER. We show the interest of the evaluation of tissue proteases uPA, PAI-I and cathepsin-D, to characterize the heterogeneity of tumors in addition to ER. Specifically, in ER + patients, high levels of cathepsin-D and PAI-1 are an indicator of poor prognosis. We developed a nomogram combining ER and nodal status, to 3 types of proteases: PAI-1, cathepsin-D and thymidine kinase, to determine the probability of survival at 2 and 5 years. In addition, these proteases are evaluated in tumors infected with the Epstein-Barr virus (EBV) and shows high rates of thymidine kinase in EBV + BC, reflecting biologically aggressive tumors. Our work has helped to improve the identification of profiles of tumors according to ER and proteases and characterize virus-associated tumors.

Résumé: Chaque année, les épidémies saisonnières d’influenza causent de 3 à 5 millions de cas sévères de maladie, entraînant entre 250 000 et 500 000 décès mondialement. Seulement deux classes d’antiviraux sont actuellement commercialisées pour traiter cette infection respiratoire : les inhibiteurs de la neuraminidase, tels que l’oseltamivir (Tamiflu) et les inhibiteurs du canal ionique M2 (adamantanes). Toutefois, leur utilisation est limitée par l’apparition rapide de résistance virale. Il est donc d’un grand intérêt de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de l’influenza. Le virus influenza dépend de l’activation de sa protéine de surface hémagglutinine (HA) pour être infectieux. L’activation a lieu par clivage protéolytique au sein d’une séquence d’acides aminés conservée. Ce clivage doit être effectué par une enzyme de l’hôte, étant donné que le génome du virus ne code pour aucune protéase. Pour les virus infectant l’humain, plusieurs études ont montré le potentiel de protéases à sérine transmembranaires de type II (TTSP) à promouvoir la réplication virale : TMPRSS2, TMPRSS4, HAT, MSPL, Desc1 et matriptase, identifiée récemment par notre équipe (Beaulieu, Gravel et al., 2013), activent l’HA des virus influenza A (principalement H1N1 et H3N2). Toutefois, il existe peu d’information sur le clivage de l’HA des virus influenza B, et seulement TMPRSS2 et HAT ont été identifiées comme étant capables d’activer ce type de virus. Les travaux de ce projet de maîtrise visaient à identifier d’autres TTSP pouvant activer l’HA de l’influenza B. L’efficacité de clivage par la matriptase, hepsine, HAT et Desc1 a été étudiée et comparée entre ces TTSP. Ces quatre protéases s’avèrent capables de cliver l’HA de l’influenza B in vitro. Cependant, seul le clivage par matriptase, hepsine et HAT promeut la réplication virale. De plus, ces TTSP peuvent aussi supporter la réplication de virus influenza A. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de TTSP, développé en collaboration avec notre laboratoire, permet de bloquer significativement la réplication virale dans les cellules épithéliales bronchiques humaines Calu-3. Cet inhibiteur se lie de façon covalente et lentement réversible au site actif de la TTSP par un mécanisme slow tight-binding. Puisque cet inhibiteur cible une composante de la cellule hôte, et non une protéine virale, il n’entraîne pas le développement de résistance après 15 passages des virus en présence de l’inhibiteur dans les cellules Calu-3. L’inhibition des TTSP activatrices d’HA dans le système respiratoire humain représente donc une nouvelle stratégie thérapeutique pouvant mener au développement d’antiviraux efficaces contre l’influenza. / Abstract: Seasonal influenza epidemics cause between 3 and 5 millions severe cases of disease, leading to 250 000 to 500 000 deaths worldwide. Only two classes of drugs are currently available to treat influenza infections: neuraminidase inhibitors, such as oseltamivir (Tamiflu) and M2 channel inhibitors (adamantanes). However, the use of these antivirals is restricted by rapid emergence of viral resistance. It is therefore of great interest to develop new therapeutic strategies for the treatment of influenza disease. The influenza virus requires activation of its surface protein hemagglutinin (HA) to become infectious. This activation is achieved by proteolytic cleavage in a highly conserved amino acid sequence of the protein. Host cell proteases are responsible for this cleavage since the viral genome doesn’t encode any protease. For viruses that infect humans, many studies have shown the potential of type II transmembrane serine proteases (TTSP) to promote viral replication: TMPRSS2, TMPRSS4, HAT, MSPL, Desc1 and matriptase, recently identified by our team (Beaulieu, Gravel et al., 2013), activate HA of influenza A viruses (mainly H1N1 and H3N2). However, little is known about cleavage of influenza B virus HA, and only TMPRSS2 and HAT have been identified as being capable of activating this type of virus. This project aimed to identify other TTSPs able to activate influenza B HA. Cleavage efficacies of matriptase, hepsin, HAT and Desc1 were studied and compared. These four proteases were shown to be able to cleave influenza B HA using in vitro assays. However, only cleavage by matriptase, hepsin and HAT promoted viral replication. Moreover, these TTSPs also supported the replication of influenza A viruses. Thus, the use of a slow, tight-binding inhibitor (developed in collaboration with our laboratory) that binds to the TTSP active site, forming a covalent and reversible bond, significantly blocked viral replication in human bronchial epithelial Calu-3 cells. Since this inhibitor targets a host cell component, instead of a viral protein, viruses did not develop resistance after 15 passages in presence of the inhibitor in Calu-3 cells. Thus, inhibition of HA-activating TTSPs in the human respiratory tract represents a novel therapeutic strategy against influenza.