Em Escherichia coli, a assimilação de sulfato e sua redução a sulfeto é mediada por um transportador do tipo ABC codificado pelos genes sbpcysWUA e várias enzimas codificadas por cysNCDGHIJ. Embora a importância deste sistema tenha sido largamente demonstrada em outros organismos, não existem relatos na literatura sobre a via na bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri). Neste trabalho, utilizando uma abordagem funcional baseada em análises de bioinformática, proteômica e gene repórter, mostramos que a via de sulfato está presente e ativa em X. citri. Ainda, a partir da expressão e produção em larga escala da proteína ligadora de sulfato Sbp, realizamos ensaios de biofísica que evidenciaram a interação da proteína com sulfato e o aumento da estabilidade térmica e estrutural, obtendo-se cristais. O trabalho apresenta as primeiras evidências da funcionalidade desta via em X. citri durante o crescimento in vitro e infecção in vivo e abre pespectivas de estudos para compreensão do papel deste íon na fisiologia do microrganismo. / In Escherichia coli, the capture and reduction of sulfate to sulfide is mediated by an ABC-type transporter encoded by genes sbpcysWUA and several enzymes encoded by cysNCDGHIJ. Although the importance of this system has been widely demonstrated in other organisms, there are no reports in the literature related to the way that sulfate is assimilated and reduced in plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri). In this work, using a functional approach based on bioinformatics analysis, proteomics and gene reporter, we show that the way is present and active in X. citri. Indeed, the sulfate binding protein was expressed and produced in large scale for biophysical assays demonstrating the interaction of the protein with sulfate and increased thermal stability and crystals was produced. The study presents the first evidence of the functionality of this pathway in X. citri during growth in vitro and in vivo infection and opens perspectives studies to understand the role of this ion in the physiology of the microorganism.

No presente estudo, avaliamos a resposta imune naturalmente adquirida ao Plasmodium vivax em indivíduos de áreas endêmicas de malária utilizando proteínas recombinantes baseadas em três antígenos de formas assexuadas sanguíneas do parasita: Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1), região C-terminal da Proteína 1 de Superfície do Merozoíta (MSP1 19) e Antígenos Variantes de P. vivax (VIR). Sete proteínas recombinantes correspondentes a quatro subfamílias VIR (A, B, C e E) foram incluídas neste estudo. Inicialmente, as diferentes proteínas recombinantes foram comparadas, por ELISA, quanto ao reconhecimento por anticorpos IgM, IgG e subclasses de IgG de 200 indivíduos infectados por P. vivax procedentes dos estados do Pará e Rondônia. As freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgM ou IgG anti-VIR durante a infecção foram de 29,6% e 26,0%, respectivamente. Não observamos predomínio de determinadas subclasses de IgG na resposta imune anti-VIR, com exceção da subfamília C que foi predominantemente reconhecida por anticorpos da subclasse IgG1. Em contraste, as freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG para as proteínas AMA-1 e MSP119 foram significativamente mais altas (57,0% e 90,5%, respectivamente). A resposta imune celular aos antígenos VIR foi avaliada por ensaios de proliferação in vitro com células mononucleares de indivíduos recentemente expostos ao P. vivax. Não observamos respostas proliferativas significativas a estes antígenos quando comparamos o grupo de indivíduos exposto ao P. vivax com o grupo não exposto. Posteriormente, avaliamos o padrão de reatividade cruzada entre anticorpos e células T contra as quatro subfamílias VIR através da imunização experimental de camundongos BALB/c com cada uma das proteínas na presença de adjuvante de Freund. Os títulos de anticorpos IgG dos animais imunizados contra cada proteína recombinante foram detectados por ELISA de inibição. Altos títulos de anticorpos específicos contra as proteínas VIR foram obtidos após a 2ª dose de imunização. Além disso, observamos que o esquema de imunização utilizado, constituído por duas doses seqüenciais de cada uma das proteínas recombinantes VIR, foi capaz de induzir anticorpos de reatividade contra as diferentes subfamílias VIR. Complementamos estes estudos avaliando a resposta proliferativa de células de nódulos linfáticos de camundongos imunizados e re-estimuladas in vitro com cada uma das proteínas VIR. Os resultados demonstraram que as proteínas VIR contêm epítopos específicos e de reatividade cruzada para células T. Estes dados sugerem fortemente a presença de epítopos comuns entre esses antígenos e mostram que o esquema de imunização utilizado pode servir como base para futuros estudos de indução de imunidade protetora contra malária vivax em primatas não humanos. / In the present study, we evaluated comparatively the acquired immune response to Plasmodium vivax in individuais from endemic areas of malaria using recombinant proteins based on three antigens from asexual blood stages of the parasite: Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1), C-terminal region of the Merozoite Surface Protein1 (MSP1 19), and Variant Antigens of P. vivax (VIR). Seven recombinant proteins corresponding to the four VIR subfamilies (A, B, C and E) were included in this study. Initially, the different recombinant proteins were compared by ELISA with regard to the recognition by IgM, IgG, and IgG subclass of antibodies from 200 individuais with patent infection from the States of Pará and Rondônia. The frequencies of individuais that presented IgM ar IgG antibodies anti-VIR during the infection were 29.6% or 26.0%, respectively. We did not observe predominance of any IgG subclass during immune response anti-VIR, except in the case of the C subfamily which was predominantly recognized by IgG1 subclass. In contrast, the frequencies of the individuais that presented IgG antibodies to AMA-1 e MSP119 were significantly higher (57.0% and 90.5%, respectively). The cellular immune response to VIR antigens was evaluated by in vitro proliferative assays in mononuclear cells of the individuais recently exposed to P. vivax. We did not observe significantly proliferative responses to these antigens when we compared malaria exposed and non exposed individuais. Subsequently, we evaluated the pattern of cross recognition between antibodies and T cell against four VIR subfamilies after experimental immunization of BALB/c mice with each one of the proteins emulsified with Complete Freund\'s adjuvant. The IgG antibody titers of the mice immunized against each one of the recombinant proteins were detected by inhibition ELISA. High specific titers against VIR proteins were obtained after the second immunizing dose. Most importantly, we observed that the immunization schedule constituted by two sequential doses of each one of the VIR recombinant proteins were able to induce cross-reactive antibodies against the different VIR subfamilies. These studies were complemented by lymphocyte proliferative response analysis of the immunized mice after an in vitro stimulation with each one of the VIR proteins. Our results demonstrated that the VIR proteins presented specific and cross-reactive epitopes recognized by T cells. These data strongly suggested of the commons epitopes are present and showed that this schedule of immunization may be used as basis for future studies aimed at inducing protective immunity against vivax malaria in non human primates.

Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Saulo Santesso Garrido / Banca: Flávio Henrique da Silva / Banca: Clovis Ryuichi Nakaie / Banca: Hérida Regina Nunes Salgado / Resumo: YacG é uma pequena proteína membro da família dos zinc-fingers, descoberta em E. coli. Sua função biológica está ligada a inibição da atividade de DNA girase e ao metabolismo do stress em procariotos. YacG atua na inibição da atividade de DNA girase por um mecanismo bipartido, a região do domínio zinc-finger atua impedindo a ligação do DNA à subunidade B e a região c-terminal liga-se a subunidade A. Embora a literatura cite YacG como sendo um inibidor de DNA girase, nada foi observado a respeito da atividade de inibição de YacG de E.coli e de outras linhagens de micro-organismos frente a outras DNA topoisomerases e não foi realizado nenhum trabalho envolvendo fragmentos peptídicos desta proteína, e tampouco ensaios de inibição do crescimento celular por estes. Sendo assim YacG de Klebsiella pneumoniae foi obtida por expressão heteróloga e uma série de peptídeos derivados desta foram sintetizados pelo método de fase sólida. Os peptídeo sintéticos foram projetados de forma a manter a região zinc-finger nativa (YacGAG1), substituídos os resíduos de cisteína por serina (YacGAG4), alanina (YacGAG5), histidina (YacGAG6 e YacGAG8) e também sintetizada a sua região c-terminal (YacGAG7). Os ensaios de inibição da atividade de DNA girase pelos peptídeos sintéticos e proteína, mostraram que YacG, YacGAG4, YacGAG5 e YacGAG7 conseguem inibir a atividade desta enzima, ao contrario do fragmento nativo YacGAG1. Por outro lado YacGAG1 conseguiu inibir a atividade de Topoisomerase IIα humana juntamente com os demais peptídeos YacGAG4, YacGAG5 e YacGAG7 e proteína YacG. Os ensaios aqui apresentados corroboram com os dados apresentados na literatura onde a região c-terminal por si só é capaz de inibir a atividade de DNA girase. Os ensaios de anisotropia de fluorescência demonstraram que a interação dos peptídicos sintéticos com DNA girase se dá pela interação destes com... / Abstract: YacG belongs to zinc-finger's protein family discovered in E. coli. Its biological function is connected to the catalytic inhibition of DNA gyrase and stress metabolism in prokaryotes. This protein inhibits DNA gyrase (gyrase) through a bipartite mechanism where the zinc-finger domain prevents the DNA ligation to the B subunit (GyrB) and the C-terminal bindings to the A subunit (GyrA). Although it is classified as a gyrase inhibitor neither the inhibition activity of YacG from E. coli and other microorganisms against other DNA topoisomerases nor the biological activity of fragments in cellular assays has been evaluated until present. In this study, YacG from Klebsiella pneumoniae was obtained by heterologous expression and derivative peptides from this protein were synthesized by the solid-phase method. The synthetic peptides were designed to keep the native region of zinc-finger (YacGAG1), to substitute cysteines to serines (YacGAG4), to alanine (YacGAG5), to histidine (YacGAG6 and YacGAG8) and also having only the C-terminal region (YacGAG7). The inhibition assays of gyrase by the peptides and the native protein revealed that YacG, YacGAG4, YacGAG4 e YacGAG7 inhibited this enzyme and the human topoisomerase IIα (htopoIIα). However, the same was not observed for the native fragment YacGAG1, which inhibited only the htopoIIα. The results are in agreement with literature showing that solely the C-terminal region is able to inhibit the gyrase. The assays of fluorescence anisotropy indicated that these synthetic peptides interact with GyrA. Besides inhibiting the gyrase and the htopoIIα, these peptides also revealed bacteriostatic activity against gram-negative and gram-positive bacteria. A computational study by applying a molecular dynamics protocol highlighted the importance of residues I47, R46 and W40 from YacG in the process of molecular recognition and interaction with GyrB. The results... / Doutor

No presente estudo, avaliamos a resposta imune naturalmente adquirida ao Plasmodium vivax em indivíduos de áreas endêmicas de malária utilizando proteínas recombinantes baseadas em três antígenos de formas assexuadas sanguíneas do parasita: Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1), região C-terminal da Proteína 1 de Superfície do Merozoíta (MSP1 19) e Antígenos Variantes de P. vivax (VIR). Sete proteínas recombinantes correspondentes a quatro subfamílias VIR (A, B, C e E) foram incluídas neste estudo. Inicialmente, as diferentes proteínas recombinantes foram comparadas, por ELISA, quanto ao reconhecimento por anticorpos IgM, IgG e subclasses de IgG de 200 indivíduos infectados por P. vivax procedentes dos estados do Pará e Rondônia. As freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgM ou IgG anti-VIR durante a infecção foram de 29,6% e 26,0%, respectivamente. Não observamos predomínio de determinadas subclasses de IgG na resposta imune anti-VIR, com exceção da subfamília C que foi predominantemente reconhecida por anticorpos da subclasse IgG1. Em contraste, as freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG para as proteínas AMA-1 e MSP119 foram significativamente mais altas (57,0% e 90,5%, respectivamente). A resposta imune celular aos antígenos VIR foi avaliada por ensaios de proliferação in vitro com células mononucleares de indivíduos recentemente expostos ao P. vivax. Não observamos respostas proliferativas significativas a estes antígenos quando comparamos o grupo de indivíduos exposto ao P. vivax com o grupo não exposto. Posteriormente, avaliamos o padrão de reatividade cruzada entre anticorpos e células T contra as quatro subfamílias VIR através da imunização experimental de camundongos BALB/c com cada uma das proteínas na presença de adjuvante de Freund. Os títulos de anticorpos IgG dos animais imunizados contra cada proteína recombinante foram detectados por ELISA de inibição. Altos títulos de anticorpos específicos contra as proteínas VIR foram obtidos após a 2ª dose de imunização. Além disso, observamos que o esquema de imunização utilizado, constituído por duas doses seqüenciais de cada uma das proteínas recombinantes VIR, foi capaz de induzir anticorpos de reatividade contra as diferentes subfamílias VIR. Complementamos estes estudos avaliando a resposta proliferativa de células de nódulos linfáticos de camundongos imunizados e re-estimuladas in vitro com cada uma das proteínas VIR. Os resultados demonstraram que as proteínas VIR contêm epítopos específicos e de reatividade cruzada para células T. Estes dados sugerem fortemente a presença de epítopos comuns entre esses antígenos e mostram que o esquema de imunização utilizado pode servir como base para futuros estudos de indução de imunidade protetora contra malária vivax em primatas não humanos. / In the present study, we evaluated comparatively the acquired immune response to Plasmodium vivax in individuais from endemic areas of malaria using recombinant proteins based on three antigens from asexual blood stages of the parasite: Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1), C-terminal region of the Merozoite Surface Protein1 (MSP1 19), and Variant Antigens of P. vivax (VIR). Seven recombinant proteins corresponding to the four VIR subfamilies (A, B, C and E) were included in this study. Initially, the different recombinant proteins were compared by ELISA with regard to the recognition by IgM, IgG, and IgG subclass of antibodies from 200 individuais with patent infection from the States of Pará and Rondônia. The frequencies of individuais that presented IgM ar IgG antibodies anti-VIR during the infection were 29.6% or 26.0%, respectively. We did not observe predominance of any IgG subclass during immune response anti-VIR, except in the case of the C subfamily which was predominantly recognized by IgG1 subclass. In contrast, the frequencies of the individuais that presented IgG antibodies to AMA-1 e MSP119 were significantly higher (57.0% and 90.5%, respectively). The cellular immune response to VIR antigens was evaluated by in vitro proliferative assays in mononuclear cells of the individuais recently exposed to P. vivax. We did not observe significantly proliferative responses to these antigens when we compared malaria exposed and non exposed individuais. Subsequently, we evaluated the pattern of cross recognition between antibodies and T cell against four VIR subfamilies after experimental immunization of BALB/c mice with each one of the proteins emulsified with Complete Freund\'s adjuvant. The IgG antibody titers of the mice immunized against each one of the recombinant proteins were detected by inhibition ELISA. High specific titers against VIR proteins were obtained after the second immunizing dose. Most importantly, we observed that the immunization schedule constituted by two sequential doses of each one of the VIR recombinant proteins were able to induce cross-reactive antibodies against the different VIR subfamilies. These studies were complemented by lymphocyte proliferative response analysis of the immunized mice after an in vitro stimulation with each one of the VIR proteins. Our results demonstrated that the VIR proteins presented specific and cross-reactive epitopes recognized by T cells. These data strongly suggested of the commons epitopes are present and showed that this schedule of immunization may be used as basis for future studies aimed at inducing protective immunity against vivax malaria in non human primates.

Trabalho realizado no LEPAE-Laboratory for Process, Environmental and Energy Engineering - Department of Chemical Engineering - Faculty of Engineering, Univerty of Oporto / Tese de Doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 2012

Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Henrique da Silva / Banca: Luiz Carlos Bertucci Barbosa / Resumo: O sistema ParE-ParD é um sistema Toxina-Antitoxina (TA) do tipo II (composto por duas proteínas) encontrado no plasmídeo RK2 de uma gama de bactérias. A antitoxina ParD (9kDa) é capaz de neutralizar a citotoxicidade da toxina ParE, pela formação de um complexo estável, e também é eficaz na auto-repressão do operon parDE. A toxina (12kDa) apresenta atividade citotóxica no processo de replicação do DNA por interferir diretamente na ação da DNA girase. Estudos prévios sugeriram que a região C-terminal da antitoxina é responsável pelo processo de interação com ParE. Embora esta toxina possa ser encontrada em um grande número de microrganismos, ainda apresenta mecanismos de citotoxicidade e funções celulares a serem elucidadas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a tentativa de expressão das duas proteínas ParE e ParD, bem como o design e a síntese de peptídeos análogos da antitoxina, para a realização de estudos de interação molecular, a fim de encontrar uma estrutura mínima de ParD capaz de inativar a função toxica de ParE. Com base nas informações estruturais, obtidas por modelagem e dinâmica molecular, quatro sequências peptídicas análogas de ParD foram projetadas e sintetizadas pela metodologia da fase sólida. As sequências foram analisadas e purificadas por cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizadas por espectrometria de massas. Os estudos de interação foram realizados através de ensaios de cromatografia de afinidade e supressão de fluorescência. ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The ParE-ParD system is a toxin-antitoxin (TA) type II module (composed of two proteins) of the plasmid RK2 of a range of bacteria. The ParD antitoxin (9 kDa) is able to neutralize the cytotoxicity of the ParE toxin by forming a stable complex and is effective in the auto repression of the parDE operon. The toxin (12 kDa) exhibits cytotoxic activity by blocking DNA replication, acting directly in the DNA gyrase action. Previous studies have been suggest that the C-terminal region of the antitoxin is responsible for the interaction process with ParE. Although this toxin can be find in a large number of microorganisms, still have cytotoxicity mechanisms and cellular functions to be elucidate. In this context, this work aimed at the expression of ParE and ParD proteins, as well as the design and synthesis of antitoxin analog peptides, to perform molecular interaction studies in order to find a minimum ParD structure able to inactivate the toxic function of ParE. Based on the structural information obtained by modeling and molecular dynamics, four analogous peptide sequences of ParD were designed and synthesized by the solid phase methodology. The peptide sequences were analyzed and purified by high performance liquid chromatography and characterized by mass spectrometry. Interaction studies were performed by affinity chromatography and fluorescence suppression assays. The intrinsic fluorescence of ParEAC2 was suppressed by ParD analogs (ParDTB1, ParDTB3, ParDTB5 and ParDTB6) add... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-08-29T17:59:17Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Flábio Ribeiro de Araújo.pdf: 1589352 bytes, checksum: eef290e5cf5f5ad0b3942824ce7c94fd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-29T17:59:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Flábio Ribeiro de Araújo.pdf: 1589352 bytes, checksum: eef290e5cf5f5ad0b3942824ce7c94fd (MD5) / FUNDECT;CNPq / A anaplasmose é uma importante enfermidade de bovinos de áreas tropicais e subtropicais do mundo, causada pela riquétsia intra-eritrocítica Anaplasma marginale. A vacinação tem sido a forma mais econômica e eficiente de controlar a anaplasmose bovina. No entanto, os métodos de imunização tradicionais, que utilizam organismos provenientes de eritrócitos infectados, apresentam limitações em seu uso, razão pela qual, estudos para o descobrimento de novos imunógenos são necessários. Nos últimos anos, esses estudos têm se concentrado nas proteínas de membrana da riquétsia, sobretudo MSP1a e MSP2, as quais mostraram-se promissoras em ensaios de proteção com as proteínas nativas, utilizadas isoladamente. Este trabalho teve como objetivo geral testar a imunoproteção induzida pelas proteínas de membrana MSP1a e MSP2 recombinantes de A. marginale, associadas com adjuvante CpG ODN 2006, frente a desafio heterólogo e avaliar a resposta imune gerada pela imunização. Para tanto, diversas etapas experimentais foram executadas, desde a clonagem e expressão dos genes que codificam as duas proteínas, padronização dos testes de diagnóstico usados no estudo, imunização e desafio dos animais experimentais e acompanhamento das respostas imunes humoral e celular. Os ELISAS indiretos baseados em MSP1a e MSP2 recombinantes apresentaram sensibilidades de 99,0% e especificidades de 100% (para ambos os testes). A PCR para o gene msp5 da riquétsia detectou infecções ainda no período pré-patente, antes da conversão sorológica. Os bovinos da raça Aberdeen Angus foram imunizados três vezes com 200 μg de MSP2 e/ou MSP1a recombinantes (produzidas a partir do isolado Pernambuco – Zona da Mata), associadas com CpG ODN 2006 e alúmen. Posteriormente, foram desafiados com 3 x 107 eritrócitos infectados do isolado heterólogo de A. marginale (Mossoró - Rio Grande do Norte). Os animais experimentais apresentaram quadro clínico de anaplasmose (redução do volume globular, febre e riquetsemias detectáveis por distensões sangüíneas coradas). Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos imunizados e os controles (que receberam CpG ODN 2006 e alúmen ou alúmen isoladamente) quanto ao percentual de redução do volume globular, riquetsemias máximas e temperaturas retais máximas, indicando que as imunizações não foram protetoras. A despeito da significativa produção de IgG total contra MSP1a e MSP2, detectada no dia do desafio, os animais imunizados apresentaram produção significativa de 14 IgG2 apenas contra MSP1a. Não foi possível detectar resposta proliferativa de células mononucleares de sangue periférico, tanto no momento do desafio quanto após o pico das riquetsemias. Possivelmente, a ausência de proteção deveu-se a uma deficiente ou ausente estimulação de imunidade celular nos bovinos imunizados.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T00:21:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289632.pdf: 1916144 bytes, checksum: 67af3bb6cca1c4c3c30dc049f92d0a4b (MD5) / O vírus da mionecrose infecciosa (IMNV) causa uma doença progressiva em camarões de cultivo com substanciais perdas econômicas no Brasil e na Indonésia. Métodos imunológicos simples e rápidos para a detecção do IMNV ainda não são disponíveis devido à falta de anticorpos monoclonais (AcMo) contra o vírus. Neste trabalho, dois fragmentos do gene da proteína do capsídeo do IMNV, abrangendo os aminoácidos 105-297 (IMNV105-297) e 300-527 (IMNV300-527), foram clonados e expressos em Escherichia coli. Ambas sequências nucleotídicas e aminoacídicas deduzidas de IMNV105-297 e IMNV300-527 apresentaram elevada identidade com sequências de IMNV isolados no Brasil (99%) e na Indonésia (98%). Dentre os hibridomas que foram obtidos, seis AcMo anti-rIMNV105-297 (1.1D, 1.3H, 3.3G, 3.9G, 4.6C, 5.4H) e dez AcMo anti-rIMNV300-527 (1.3G, 1.3H, 1.8C, 2.9C, 2.9E, 3.3A, 9.7F, 9.8D, 9.8H, 11.2D) foram selecionados para se avaliar suas reatividades contra a proteína do capsídeo viral presente em lisado de camarões infectados por IMNV. Nos ensaios de imunodot-blot, cinco AcMo anti-rIMNV105-297 e oito AcMo anti-rIMNV300-527 apresentaram distintas sensibilidades contra lisados de tecido muscular infectado por IMNV, bem como contra rMNV105-297 ou rIMNV300-527. Dentre esses, três AcMo anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C, 5.4H) e cinco AcMo anti-rIMNV300-527 (1.3H, 1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) demonstraram alta especificidade contra a proteína nativa do IMNV nos ensaios de Western-blot, visto que reconheceram somente uma proteína de 100 kDa - massa esperada para a proteína do capsídeo do IMNV. Nas imunohistoquímicas, dois AcMo anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C) e quatro AcMo anti-rIMNV300-527 (1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) ligaram-se a inclusões virais presentes em fibrose muscular e em áreas de necrose coagulativa. Concluindo, esses seis AcMo foram sensíveis e específicos em todos os imunoensaios realizados e poderão ser utilizados em testes de imunodiagnóstico de rotina para prevenção e controle da disseminação do IMNV. / Infectious myonecrosis virus (IMNV) has been causing a progressive disease in farm-reared shrimp with substantial economical loses in northeastern Brazil and Indonesia. Simple and rapid immunological methods for IMNV detection are not yet available due to the lack of monoclonal antibodies (MAbs) against the virus. In this report, two fragments of the IMNV major capsid protein gene, comprising amino acids 105-297 (IMNV105-297) and 300-527 (IMNV300-527), were cloned and expressed in Escherichia coli. Both nucleotide and deduced amino acid sequences of IMNV105-297 and IMNV300-527 displayed high identity to IMNV isolated from Brazil (99%) and Indonesia (98%). Among several clones secreting antibodies against the IMNV recombinant proteins, six MAbs anti-rIMNV105-297 (1.1D, 1.3H, 3.3G, 3.9G, 4.6C, 5.4H) and ten MAbs anti-rIMNV300-527 (1.3G, 1.3H, 1.8C, 2.9C, 2.9E, 3.3A, 9.7F, 9.8D, 9.8H, 11.2D) were selected to evaluate their reactivity against the native IMNV capsid protein from IMNV-infected shrimp. In immunodot-blot, five MAbs anti-rIMNV105-297 and eight MAbs anti-rIMNV300-527 presented distinct levels of sensitivities against IMNV-infected muscle tissue homogenate and against rIMNV105-297 or rIMNV300-527. From those, three MAbs anti-IMNV105-297 (1.3H, 4.6C, 5.4H) and five MAbs anti-IMNV300-527 (1.3H, 1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) demonstrated high specificity against the native IMNV protein in Western-blot, since they only recognized a 100 kDa protein - the predicted mass of IMNV capsid protein. In immunohistochemistry, two MAbs anti-rIMNV105-297 (1.3H, 4.6C) and four MAbs anti-rIMNV300-527 (1.8C, 2.9E, 3.3A, 11.2D) bound to viral inclusions present in muscle fibrosis and coagulative necrosis areas. In conclusion, these six MAbs were sensitive and specific in all immunoassays performed herein, and can be used in routine immunodiagnostic tests to prevent and control IMNV dissemination.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-12-15T13:55:31Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2791905 bytes, checksum: 2d2f70d34d0c7441ea3eddfe80eafd1b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-15T13:55:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2791905 bytes, checksum: 2d2f70d34d0c7441ea3eddfe80eafd1b (MD5) Previous issue date: 2009-02-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A proteína do capsídeo do circovirus suíno 2 (PCV2), codificada pela ORF2, é uma proteína estrutural, sendo altamente imunogênica. Anti-soro produzido a partir dessa proteína recombinante purificada, em coelhos, poderá apresentar as mesmas propriedades daquele produzido a partir de partículas virais purificadas e ser de relevância como ferramenta diagnóstica. O objeto do presente estudo foi padronizar uma técnica de imunoistoquímica, a partir da produção de um soro hiperimune anti-PCV2 em coelhos, utilizando como antígeno a proteína recombinante purificada do capsídeo do PCV2 (Cap PCV2). A proteína foi expressada em Escherichia coli BL21 e purificada por cromatografia de afinidade. Inoculações desta proteína foram realizadas em coelhos e os soros foram colhidos para avaliações por Western blotting, ELISA, imunocitoquímica e imunoistoquímica. Obteve-se sucesso na purificação da proteína recombinante e na produção do soro hiperimune em coelhos. A afinidade de ligação do anticorpo produzido ao antígeno (proteína recombinante) foi demonstrada pela técnica de Western blotting e ELISA e foi considerada eficiente e sensível. As técnicas de imunocitoquímica e imunoistoquímica apresentaram resultados considerados satisfatórios. O anticorpo produzido contra a proteína codificada pela ORF2 mostrou ter boa afinidade de ligação, podendo ser empregado como ferramenta diagnóstica. / The porcine circovirus 2 (PCV2) capsid protein, encoded by ORF2, is a structural protein and highly immunogenic. An antiserum produced from the purified recombinant protein in rabbits, may present the same properties as that produced from purified viral particles and may be of relevance as a diagnostic tool. The aim of this study was the immunohistochemistry technique standardartization from the production of an anti-PCV2 hyperimmune serum in rabbits using as antigen the purified recombinant protein from the capsidal of PCV2 (Cap PCV2). The protein was expressed in BL21 Escherichia coli and purified by affinity chromatography. Inoculations of this protein were performed in rabbits and the sera were collected for evaluation by Western blotting, ELISA, immunocytochemistry and immunohistochemistry. The recombinant protein purification and hyperimmune serum production in rabbits was achieved successfully. The antibody-binding affinity to the antigen (recombinant protein) was demonstrated by Western blotting and ELISA techniques and were considered efficient and sensitive. The immunocytochemistry and immunohistochemistry techniques results were considered satisfactory. The antibody produced against the protein encoded by ORF2 showed can be used as a diagnostic tool.

Made available in DSpace on 2016-03-15T14:19:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ana_argondizzo_ioc_dout_2013.pdf: 5655459 bytes, checksum: cd149a98d06f5e286a7d42e766c75ad0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Streptococcus pneumoniae é um patógeno colonizador da nasofaringe de humanos sendo responsável pela maioria das pneumonias adquiridas na comunidade, além de causar diversas doenças não-invasivas e invasivas. As vacinas disponíveis atualmente são sorotipo específicas, além disso as conjugadas apresentam limitado espectro de ação e alto custo de produção, ao passo que as polissacarídicas apresentam baixa imunogenicidade em crianças menores de dois anos de idade e adultos maiores de 65 anos, grupos os quais se encontram em alto risco de adquirirem doenças pneumocócicas. Assim, a utilização de proteínas recombinantes, associadas à virulência, é uma alternativa para a composição de vacinas. Neste trabalho, empregando a vacinologia reversa, selecionamos 20 genes que codificam proteínas com predição para localização na superfície celular. Dentre os candidatos selecionados amplificamos, clonamos e expressamos 19 genes e purificamos 10 proteínas recombinantes na forma solúvel. A expressão e localização das proteínas na superfície dos pneumococos foram confirmadas por meio de citometria de fluxo e imunofluorescência indireta. Além disso, observamos que 4 das 10 proteínas de pneumococos foram capazes de interagir com proteínas de matriz extracelular, embora os anticorpos policlonais gerados contra as proteínas recombinantes não tenham sido capazes de inibir a adesão da bactéria às células eucarióticas A549. A antigenicidade das proteínas recombinantes de pneumococo foi avaliada frente a soros de pacientes com meningite pneumocócica e observamos que duas proteínas foram reconhecidas por mais de 50% dos soros avaliados A presença e o grau de identidade dos genes selecionados em amostras de pneumococos de origem clínica foram avaliados por PCR e sequenciamento. Verificamos que a maioria dos genes está presente nas 51 amostras utilizadas neste estudo e demonstraram um alto grau de conservação nucleotídico e proteico entre as amostras de pneumococos, bem como em S. pseudopneumoniae, S. mitis e S. oralis, espécies que são altamente relacionadas geneticamente com os pneumococos. Assim, propomos que as proteínas 02232 (CbpE), 00080 (proteína ligadora de ATP/ABC transportadora), 00333 (componente permeásico/proteína ABC transportadora) e 01065 (histidina quinase) podem ser consideradas importantes alvos vacinais por serem expressas e expostas à superfície bacteriana e terem demonstrado interação com proteínas de matriz extracelular, podendo indicar algum papel destas proteínas no processo de adesão da bactéria às células do hospedeiro. Por outro lado não descartamos a possível importância das proteínas 02072 (PiuA) e 02009 (proteína hipotética) no processo de infecção de pneumococo, em virtude de essas proteínas terem sido reconhecidas por mais de 41% dos soros de pacientes / Streptococcus pneumoniae is a colonizer of the human nasopharynx, which acc ounts for most of the community-acquired pneumonia cases and can cause non-invasive and invasive diseases. C urrently available vaccines are serotype–specific; conjugate vaccines show a limited spectrum of action and high producti on costs, while the polysaccharide vaccine have low immunogenicity in children under t wo years of age and adults over 65, groups which are at high risk of acquiring pneumoco ccal disease . To overcome these problems, the use of recombinant proteins, associat ed with virulence, is an alternative to compose vaccines. In this work, 20 proteins with po sitive prediction for extracellular localization were selected by reverse vaccinology. A total of 19 genes were amplified, cloned and expressed. Ten proteins were purified in a solu ble form. The expression of the selected proteins on the pneumococci cell surface was confir med by flow cytometry and immunofluorescence. Data showed that 4 proteins were able to interact with extracellular matrix proteins. However, polyclonal antibodies aga inst the recombinant proteins were not able to inhibit the pneumococci adhesion to A549 eu karyotic cells. The protein antigenicity was evaluated by immunoblotting using antisera from patients with pneumococci meningitis and two proteins were recognized in more than 50% o f the serum samples. In order to evaluate the identity degree of the selected genes, PCR assays were carried out. Most of the genes were present in all clinical isolates and sho wed a high degree of nucleotide and amino acid conservation between pneumococci samples, as w ell as in S. pseudopneumoniae , S. mitis and S. oralis species. Thus, we propose that proteins 02232 (Cbp E), 00080 (ABC transporter, ATP-binding protein), 00333 (ABC-type antimicrobial peptide transport system, permease component) and 01065 (sensor histidine kinase, puta tive) can be considered important vaccine targets since they were expressed and exposed to th e bacterial surface and demonstrate interaction with extracellular matrix proteins, whi ch may indicate a role of these proteins in the process of adhesion of the bacteria to host cel ls. However, proteins 02072 (PiuA) and 02009 (hypothetical protein) should also be conside red for they were recognized by over 41% of sera from patients and could be important in the pneumococcal infection.