Surtos associados às micobactérias de crescimento rápido (MCR) têm sido cada vez mais relatados em todo o mundo, inclusive no Brasil. Entre as MCR, o complexo M. abscessus é o mais patogênico e relacionado a multirresistência. Considerando a importância de investigar as cepas de MCR presentes em nosso Estado, este estudo teve como objetivos avaliar o perfil molecular e de suscetibilidade caracterizando os isolados de MCR encaminhados para o Centro de Referência em Micobactérias do Estado (Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública, IPB-LACEN/RS). Além disso, foram avaliados os mecanismos de resistência à FQ conferido pelos genes gyrA e gyrB. Foram encaminhadas para o IPB-LACEN/RS, entre 2007 a 2012, 74 isolados clínicos. No total, 43 isolados relacionados a surto e 31 isolados de MCR não relacionados a surtos foram analisados. Pela técnica de PRA-hsp65 foi possivel identificar 43 isolados como M. abscessus tipo 2, 21 isolados como M. fortuitum tipo 1 e 10 isolados como M. abscessus tipo 1. Através do sequenciamento parcial do gene rpoB, foi confirmada a identificação de M. abscessus tipo 2 como M. abscessus subsp. bolletii, M. abscessus tipo 1 como M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum tipo 1 como M. fortuitum subsp. fortuitum. Pela técnica de tipagem PFGE todos os isolados de M. abscessus subsp. bolletii apresentaram o mesmo perfil clonal o qual pertence ao clone BRA100, já descrito mundialmente. Os isolados de M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum subsp. fortuitum apresentaram perfis distintos de PFGE. O perfil de suscetibilidade aos antibióticos foi avaliado por microdiluição em caldo de acordo com CLSI (2011) e, todos os isolados foram sensíveis a amicacina e todos foram resistentes a doxiciclina e sulfametoxazol-trimetoprima. Para M. abscessus subsp. bolletii todos os isolados foram resistentes à ciprofloxacino, moxifloxacino e tobramicina e um padrão de susceptibilidade variável foi observado para cefoxitina (Sensível - 28%, Intermediário - 72%) e claritromicina (Sensível - 86%, Resistentes - 14%). Cabe mencionar que este é o primeiro relato de resistência a claritromicina para o clone BRA100. Para M. abscessus subsp. abscessus e M. fortuitum subsp. fortuitum todos os isolados foram resistentes a claritromicina; já para a cefoxitina e tobramicina um padrão de susceptibilidade variável foi observado. Todos os isolados de M. fortuitum subsp. fortuitum foram sensíveis à ciprofloxacino, em contraste aos isolados de M. abscessus subsp. abscessus que apresentaram 70% de resistência. Todas MCR, resistentes (ou intermediárias) para ciprofloxacino apresentaram uma Ala-83 em GyrA, em contraste com uma Ser-83 em todos os isolados de M. fortuitum subsp. fortuitum sensíveis a ciprofloxacino, mas com perfil de resistência variável a moxifloxacino. Nenhuma diferença foi encontrada em GyrB independentemente do perfil de sensibilidade de MCR. Em conclusão, nosso estudo relata a persistência de um único clone M. abscessus subsp. bolletii BRA100 relacionado aos surtos, altamente resistente, mesmo após a implementação nacional das medidas de controle de infecção para contenção de surtos por MNTs. Também foi possível correlacionar que mutações no aminoácido Ala-83 de GyrA estão diretamente relacionados com a resistência à ciprofloxacino em M. abscessus subsp. abscessus e M. abscessus subsp. bolletii. / Outbreaks associated with rapidly growing mycobacteria (RGM) have been increasingly reported worldwide, including in Brazil. Among RGM, the M. abscessus complex is consider the most pathogenic, besides being related to multidrug resistance. Considering the importance of investigating the RGM strains present in our state, this study aimed to characterize the molecular and susceptibility profile of RGM isolates referred to the Reference Center for Mycobacteria State (Instituto de Pesquisas Biológicas - Laboratório Central de Saúde Pública, IPB-LACEN/RS). Furthermore, the mechanisms of quinolone resistance conferred by gyrA and gyrB genes were evaluated. A total of 74 isolates was sent to IPB-LACEN/RS between 2007 and 2012. Forty-three of the analyzed isolates were related to outbreak and 31 isolates of RGM were unrelated to outbreaks. The technique of PRA- hsp65 identified 43 isolates as M. abscessus type 2, 21 isolates as M. fortuitum type 1 and 10 isolates as M. abscessus type 1. The partial sequencing of the rpoB gene confirmed the identification of M. abscessus type 2 as M. abscessus subsp. bolletii, M. abscessus type 1 as M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum type 1 and M. fortuitum subsp. fortuitum. PFGE typing technique showed the same clonal profile for all isolates of M. abscessus subsp. bolletii which belongs to clone BRA100, already described worldwide. Isolates of M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum subsp. fortuitum showed distinct PFGE profiles. The antibiotic susceptibility profile was evaluated by broth microdilution according to CLSI (2011), and all isolates were susceptible to amikacin and resistant to doxycycline and trimethoprimsulfamethoxazole. All isolates of M. abscessus subsp. bolletii were resistant to ciprofloxacin, moxifloxacin and tobramycin and presented variable susceptibility pattern to cefoxitin (Susceptible - 28%, Intermediate - 72%) and clarithromycin (Susceptible - 86%, Resistant - 14%). It is important to mention that this is the first report of clarithromycin resistance for clone BRA100. Strains of M. abscessus subsp. abscessus and M. fortuitum subsp. fortuitum were all resistant to clarithromycin, and presented a variable susceptibility profile to cefoxitin and tobramycin. All isolates of M. fortuitum subsp. fortuitum were susceptible to ciprofloxacin, in contrast to isolates of M. abscessus subsp. abscessus that showed a resistance rate of 70%. All RGM ciprofloxacin non-susceptible presented an Ala-83 in GyrA, contrasting to a Ser-83 in all isolates of M. fortuitum subsp. fortuitum susceptible to ciprofloxacin, however, with a variable resistance profile to moxifloxacin. No difference was found in GyrB, regardless of the RGM susceptible profile. In conclusion, our study reports the persistence of a single clone of M. abscessus subsp. bolletii BRA100 related to outbreak, highly resistant, even after national implementation of infection control measures to contain outbreaks by NTM. It was also possible to correlate that mutations in the amino acid Ala-83 of GyrA are directly related to ciprofloxacin and moxifloxacin resistance in M. abscessus subsp. abscessus and M. abscessus subsp. bolletii.

Este estudo foi elaborado com o objetivo de elucidar os mecanismos de resistência às quinolonas presentes em enterobactérias isoladas de pacientes de duas regiões metropolitanas brasileiras. Foram avaliadas possíveis alterações nas proteínas relacionadas com o sítio de ação das quinolonas, bem como a presença de plasmídeos e integrons que carregam determinantes gênicos que codificam resistência às quinolonas. A associação destes com mecanismos plasmideais de resistência aos antibióticos -lactâmicos também foi analisada. Foram avaliadas 257 enterobactérias resistentes ao ácido nalidíxico isoladas de pacientes hospitalizados e da comunidade no período de 2000 a 2005. Por PCR e seqüenciamento, foram analisadas as mutações presentes nos genes cromossômicos gyrA e parC e as estruturas gênicas associadas com determinantes plasmideais de resistência às quinolonas, Qnr, e aos -lactâmicos de amplo espectro. Foram determinados os perfis plasmideais e a transferabilidade dos plasmídeos que carrearam estes determinantes. A extração e a análise das proteínas de membrana externa foi realizada para avaliar uma possível perda ou diminuição da expressão de porinas, também relacionada com os mecanismos de resistência avaliados. Todas as amostras foram resistentes ao ácido nalidíxico, apresentando concentração inibitória mínima (CIM) superior a 16 g/mL, e em média, 70% apresentaram diminuição de sensibilidade às fluoroquinolonas testadas. De 257 enterobactérias resistentes ao ácido nalidíxico, em seis enterobactérias (2,3%), incluindo 3 E. coli, 2 K. pneumoniae e 1 C. freundii foi encontrado o gene qnrB. Cinco linhagens apresentaram suas seqüências idênticas ao gene qnrB2, e uma linhagem, C. freundii JF79, apresentou uma seqüência idêntica ao gene qnrB8. Em uma linhagem de E. cloacae foi detectado o gene qnrA1 (0,37%). Os genes qnrA e qnrB apresentaram-se localizados em plasmídeos que apresentaram de 55 a 180 kilobases. A análise da estrutura gênica indicou que os genes qnrA1 e qnrB2 estavam associados com um integron classe 1 e localizados entre o elemento ISCR1 e a segunda cópia do segmento conservado 3. Na coleção bacteriana avaliada, as principais mutações observadas foram nos códons 83 e 87 em gyrA, e nos códons 80 e 84 em parC. Todas as enterobactérias que exibiram unicamente mutações no gene gyrA apresentaram CIM 16 µg/mL para o ácido nalidíxico. A diferença encontrada nos valores da CIM de fluoroquinolonas em enterobactérias que apresentaram as mesmas substituições em GyrA e ParC foi explicada pela ausência ou diminuição da expressão de porinas. Em relação à produção de -lactamase de espectro ampliado (ESBL), sua presença foi comprovada em 24 (9,3%) enterobactérias. O seqüenciamento de blaCTX-M identificou 18 determinantes: CTX-M-2 (n=13), incluindo dois novos variantes, CTX-M-8 (n=2) e CTX-M-9 (n=3) mediados por plasmídeos de 48 a 180 kilobases, não conjugativos, em maioria. O gene blaSHV-5 foi detectado em seis enterobactérias. Todos os determinantes do grupo 2 apresentaram-se associados com um elemento ISCR1, enquanto que aqueles do grupo 9 estiveram relacionados com ISEcp1. Concluindo, o principal mecanismo de resistência às quinolonas detectado foi a presença de substituições em GyrA e ParC, apesar de outros mecanismos, como a diminuição da expressão de porinas estarem envolvidos nas enterobactérias avaliadas. A associação da produção de ESBL foi significativa devido ao encontro de uma grande diversidade de genótipos circulando na comunidade, com uma predominância de enterobactérias produtoras de CTX-M. Quanto aos determinantes Qnr descritos neste estudo, que notoriamente foram os primeiros relatos no Brasil, somente dois deles apresentaram-se relacionados com a produção de ESBL. / The aim of this study was to investigate the main mechanisms of quinolone resistance among enterobacterial isolates recovered from hospitalized patients and outpatients in Brazil. The modification of the quinolone targets with changes of DNA gyrase and of topoisomerase IV genes and the presence of determinants codifying plasmid- mediated quinolone and oxymino- cephalosporins resistance were investigated. Two hundred fifty seven non-duplicate nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates recovered from January 2000 to May 2005 were analysed. Mutations in the topoisomerases gyrA and parC genes and the genetic structures surrounding Qnr and CTX-M determinants were recognized by PCR and sequencing. Conjugation experiments were performed to determine whether the qnr- and blaCTX-M carrying plasmids were self transferable. Also, decrease in the level of porin expression related to quinolone resistance was assessed. All enterobacterial isolates were resistant to nalidixic-acid, showing minimal inhibitory concentrations (MIC) 16 g/mL and 70% of these isolates showed decreased susceptibility to fluoroquinolone. Six qnrB-positive (2.3%) out of 257 nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates, were identified, including 3 Escherichia coli, 2 Klebsiella pneumoniae and 1 Citrobacter freundii. Five isolates had an identical qnrB2 sequence and one isolate, C. freundii 79, possessed the qnrB8. A single Enterobacter cloacae carrying a plasmid encoding qnrA gene was identified (0.37%). All isolates were negative for the qnrS genes. Plasmid-mediated quinolone resistance ranged from 55- to 180-kb in size. Sequence analysis of the genetic structures surrounding of the qnrA and qnrB genes identified an ISCR1 element at the left-hand boundary and a partial copy of the 3-end segment of class 1 integrons. Concerning the changes of DNA gyrase and topoisomerase IV, the most common modification in the enterobacterial isolates analyzed were present at codons 83 and 87 in GyrA and in ParC at codons 80 and 84. All isolates that exhibited mutations in gyrA gene showed nalidixic-acid MIC 16 µg/mL. The finding of different MIC values to fluoroquinolones in enterobacterial isolates with the same GyrA and ParC modification was explained by a decreasing in the level of porin expression. Regarding -lactam resistance mechanisms, twenty four (9.3%) ESBL-producing enterobacterial isolates were detected. Sequencing of the CTX-M-encoding genes identified 18 determinants belonging to CTX-M-2 (n=13), CTX-M-8 (n=2) and CTX-M-9 (n=3) groups. CTX-M-2 group determinants included blaCTX-M-2 and the two novel variants. Plasmids harboring blaCTX-M genes ranged from 48- to 180- kb in size and were not transferable, in their majority. The blaSHV-5 genes were detected in all the 6 blaCTX-M negative isolates. All alleles belonging to the group 2 were associated with ISCR1 element, while all blaCTX-M-9 genes were related to ISEcp1 element. In conclusion, alterations in the targets of quinolones, GyrA and ParC was the main mechanism of quinolone resistance identified in this study, although a decreasing of the porins expression had been identified among nalidixic-acid resistant enterobacterial isolates. In the surveyed area, the prevalence of ESBL producers was important (9.3%), provided that this finding was related to a large diversity of genotypes circulating in the community, mainly CTX-M-producing isolates. This study constituted the first epidemiological survey of QnrA and QnrB determinants among Brazilian isolates. Interestingly, the qnrB2 gene was identified in non ESBL producers isolates and qnrS genes were not found.

Stenotrophomonas maltophilia é um bacilo Gram-negativo, não fermentador, considerado um microorganismo pouco virulento, relacionado principalmente a infecções associadas à assistência a saúde. A S. maltophilia apresenta um padrão de resistência intrínseca à maioria das classes de antibióticos. A droga de escolha para o tratamento das infecções por S. maltophilia é a sulfametoxazol/ trimetoprima (SMX/TMP). Entretanto, estudos atuais relatam o aumento da resistência a esse antibiótico, o que limita assim as opções para terapia efetiva. Outras opções de tratamento são o levofloxacino e a tigeciclina, porém, faltam estudos clínicos e in vitro dessas drogas. A proposta deste estudo foi avaliar os possíveis mecanismos de resistência a SMX/TMP e as quinolonas em isolados clínicos de pacientes internados no Instituto Central do Hospital das Clínicas e do Hospital A.C. Camargo. Foram avaliadas 106 amostras de S. maltophilia isoladas de pacientes adultos com infecção relacionada à assistência a saúde, internados no Instituto Central do Hospital das Clínicas da FMUSP e no Hospital de Câncer A.C Camargo durante o período de dezembro de 2008 a dezembro de 2010. A sensibilidade à SMX/TMP foi de 78,3%, para levofloxacino de 82% e 14,2% para cirpofloxacino, para minociclina de 100% e tigeciclina 91,6%. Foi realizado PCR para detecção dos genes sul1, sul2 e dfrA1 para avaliar a resistência à SMX/TMP, os genes int1 e iscr2 para avaliação da presença de elementos genéticos móveis e os genes gyrA, qnr, smeD, smeT e aac(6)-Ib-cr para avaliação da resistência as quinolonas. Quatorze amostras (13,2%) foram positivas para o gene sul1. Desses isolados, nove amostras apresentavam resistência ao SMX/TMP com CIM50 de 8 g/mL e CIM90 de 128 g/mL. Cinco amostras positivas para o gene sul1 foram sensíveis a SMX/TMP com CIM50 de 1 g/mL e CIM90 de 1 g/mL. A sequencia do integron1 da amostra com CIM >125 g/mL mostrou um tamanho aproximado de 4000 pb contendo os genes cassetes aac4 e aadA1 e a região qac/sul1. Uma amostra resistente a SMX/TMP foi positiva para o gene sul2 localizado na transposase-like ISCR 2. Observamos a presença de quatro novos qnr em cepas de S. maltophilia e a presença da enzima aac(6)-ib-cr em 4 amostras. 100% das cepas foram positivas para o gene do sistema de efluxo smeDEF e 12/38 amostras tiveram o gene smeT do sistema de efluxo smeDEF, ,porém não foi observada mutação nesse gene. Na sequencia de aminoácidos da girase A de 15 amostras resistentes a levofloxacino não observamos mutações relacionadas à resistência a quinolonas. As cepas resistentes a SMX/TMP apresentaram um padrão policlonal. Dezoito amostras resistentes ao levofloxacino apresentaram 14 perfis clonais, distribuídos em 10 clusters. S. maltophilia exibe múltiplos mecanismos de resistência, nesse estudo observamos um grande número de cepas com elementos genéticos móveis carregando o gene sul1 e outros genes de resistência. A S. maltophilia pode ser um importante reservatório de transmissão de genes de resistência / Stenotrophomonas maltophilia is a gram-negative, non-fermenter, considered a low virulent organism, mainly related to healthcare associated infections. S. maltophilia shows a pattern of intrinsic resistance to many classes of antibiotics. The drug of choice for the treatment of infections caused by S. maltophilia is SMX/TMP, however, current studies have reported increased resistance to this antibiotic, thus limiting the options for effective therapy. Among the treatment options appear tigecycline and levofloxacin, but clinical trials and studies in vitro to such drugs are lacking. The purpose of this study was to evaluate the possible mechanisms of resistance to SMX/TMP and quinolones in clinical isolates from patients admitted to the Institute\'s Central Clinical Hospital and the Hospital A.C Camargo. We evaluated 106 strains of S. maltophilia isolated from adult patients with healthcare associated infections, at the Instituto Central do Hospital das Clínicas and the Cancer Hospital AC Camargo in the period of December 2008 to December 2010. The sensitivity to SMX/TMP was 78.3%, 82% for levofloxacin, 14,2% for ciprofloxacin, minocycline 100% and for tigecycline 91.6%. PCR was performed for detection of gene sul1, sul2 and dfrA1 to evaluate the resistance to SMX/TMP, genes iscr2 int1 was performed to evaluate the presence of mobile genetic elements and genes gyrA, qnr, smeD , smeT and aac (6 \')-Ib-cr for evaluation of resistance to quinolones. Fourteen samples (13.2%) were positive for the gene sul1. In these isolates, nine samples showed resistance to SMX/TMP with MIC50 of 8 g/ml and MIC90 of 128 g/mL. Five strains were positive for sul1 gene and were susceptible to SMX/TMP with MIC50 of 1 g/ml and MIC90 of 1 g/mL. The sequence of the integron class 1 strain with an MIC> 125 g/mL showed an approximate size of 4000 bp containing the gene cassettes aadA1, aac4 and qac/sul1. A strain resistant to SMX/TMP was positive for the gene sul2 located on ISCR2 a transposase-like. We observed the presence of four new qnr in strains of S. maltophilia and the presence of the enzyme aac (6 \')-ib-cr in 4 samples. 100% of the strains were positive for the gene of the efflux system smeDEF and 12/38 samples had the gene smeT repressor of smeDEF efflux system, however there was no mutation in this gene. In the amino acid sequence of gyrase A of 15 strains resistant to levofloxacin did not observe mutations related to resistance to quinolones. Strains resistant to SMX/TMP had a polyclonal PFGE pattern. Eighteen strains resistant to levofloxacin showed 14 clonal profiles 14 divided into 10 clusters S. maltophilia displays multiple mechanisms of resistance. In this study, we observed a large number of strains with mobile genetic elements carrying the sul1 gene and other resistance genes. S. maltophilia is may be an important source for transmission of genes of resistance

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Denis Leandro Freitas.pdf: 2460536 bytes, checksum: 9c33d2a38cc2aba90b9f27c476e8d2c5 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Paraná / The urinary tract infections (UTI) have high incidence in the population, mainly affecting women, the elderly and pregnant women. In most cases an UTI is caused by Enterobacteriaceae, especially Escherichia coli. The main antimicrobials used in the treatment of UTIs, are the quinolones and fluoroquinolones. Since its discovery in the 60s, such antimicrobials were improved and increasing its spectrum of activity, but also the micro-organisms has evolved to develop resistance to these drugs. The resistance comes down to two mechanisms: changes in targets of quinolones or decreased concentration of the drug within the cell. Quinolones are antimicrobial agents that target two enzymes involved in transcription and replication of bacterial DNA, DNA Gyrase, consisting of two subunits GyrA and two GyrB products of the genes gyrA and gyrB respectively and Topoisomerase IV, also composed of two ParC and two ParE subunits, encoded from genes parC and parE. Mutations in these genes can confer high-level resistance to these antimicrobials. Other mechanisms involve genes carried in plasmids such as qnr's, responsible for the production of proteins that protect the target enzymes of quinolones. The gene aac (6 ')-Ib-cr also present in plasmids can alter the chemical structure of certain fluoroquinolones interfering efficiency. The association of resistance to quinolones and β-lactams due to the presence of Extended Spectrum β-lactamases (ESBL) has been widely reported in the literature. The main objective of this study was to evaluate the patterns of resistance to quinolones and fluoroquinolones in 55 samples of uropathogenic E. coli collected in Curitiba, PR, Brazil. The resistance to nalidixic acid, norfloxacin, ciprofloxacin and ofloxacin was observed in 69.1% of the samples. Molecular analysis of the resistant strains showed mutations in gyrA (codons 83 and 87) and parC (codon 80). Also investigated was the presence of genes qnr's and aac (6 ')-Ib-cr and their association with ESBLs. Two of the 55 samples were positive for aac (6 ')-Ib-cr. The presence of this gene in Brazil was first reported in 2012 in Belo Horizonte, MG. No samples were positive for the qnr's genes. These results show a high incidence of resistance to quinolones and the ability to horizontally spread of acquired resistance between the bacterial strains. / As infecções do trato urinário (ITU) apresentam grande ocorrência na população, afetando principalmente mulheres, idosos e gestantes. Na maioria dos casos uma ITU é causada por enterobactérias, especialmente Escherichia coli. A principal escolha no tratamento das ITUs são as quinolonas e fluorquinolonas. Desde sua descoberta na década de 60, tais antimicrobianos foram aperfeiçoados aumentando seu espectro de ação, porém os micro-organismos também evoluíram desenvolvendo resistência a tais fármacos. A resistência se resume a alterações nos alvos das quinolonas e ou a diminuição da concentração da droga no interior da célula. Quinolonas são antimicrobianos que têm como alvo duas enzimas envolvidas na replicação e transcrição do DNA bacteriano, a DNA Girase, formada por duas subunidades GyrA e duas GyrB, produtos dos genes gyrA e gyrB respectivamente e a Topoisomerase IV, também composta de duas subunidades ParC e duas ParE, codificadas a partir dos genes parC e parE. Mutações nesses genes podem conferir alto nível de resistência a estes antimicrobianos. Outros mecanismos envolvem genes transportados em plasmídeos, como os qnr’s, responsáveis pela produção de proteínas capazes de proteger as enzimas alvo das quinolonas. O gene aac(6’)-ib-cr, também presente em plasmídeos, é capaz de alterar a estrutura química de certas fluorquinolonas interferindo na sua eficiência. A associação de resistência a quinolonas e β-lactâmicos devido à presença de β-lactamases de espectro ampliado (ESBLs), tem sido amplamente relatada na literatura. O principal objetivo desse trabalho foi avaliar os padrões de resistência a quinolonas e fluorquinolonas em 55 amostras de E. coli uropatogênica coletadas em Curitiba, PR. A resistência ao ácido nalidíxico, a norfloxacina, ciprofloxacina e ofloxacina, foi observada em 69,1% das amostras. A análise molecular das cepas resistentes revelou mutações em gyrA (códons 83 e 87) e em parC (códon 80). Também foi pesquisada a presença dos genes qnr’s e aac(6’)-ib-cr e a associação destes com ESBLs. Duas das 55 amostras foram positivas para aac(6’)-ib-cr. A presença desse gene no Brasil foi relatada pela primeira vez em 2012, em Belo Horizonte, MG. Nenhuma amostra foi positiva para os genes qnr’s. Estes resultados mostram uma elevada incidência de resistência às quinolonas e a capacidade de transferência horizontal de resistência adquirida entre as cepas bacterianas.

Stenotrophomonas maltophilia é um bacilo Gram-negativo, não fermentador, considerado um microorganismo pouco virulento, relacionado principalmente a infecções associadas à assistência a saúde. A S. maltophilia apresenta um padrão de resistência intrínseca à maioria das classes de antibióticos. A droga de escolha para o tratamento das infecções por S. maltophilia é a sulfametoxazol/ trimetoprima (SMX/TMP). Entretanto, estudos atuais relatam o aumento da resistência a esse antibiótico, o que limita assim as opções para terapia efetiva. Outras opções de tratamento são o levofloxacino e a tigeciclina, porém, faltam estudos clínicos e in vitro dessas drogas. A proposta deste estudo foi avaliar os possíveis mecanismos de resistência a SMX/TMP e as quinolonas em isolados clínicos de pacientes internados no Instituto Central do Hospital das Clínicas e do Hospital A.C. Camargo. Foram avaliadas 106 amostras de S. maltophilia isoladas de pacientes adultos com infecção relacionada à assistência a saúde, internados no Instituto Central do Hospital das Clínicas da FMUSP e no Hospital de Câncer A.C Camargo durante o período de dezembro de 2008 a dezembro de 2010. A sensibilidade à SMX/TMP foi de 78,3%, para levofloxacino de 82% e 14,2% para cirpofloxacino, para minociclina de 100% e tigeciclina 91,6%. Foi realizado PCR para detecção dos genes sul1, sul2 e dfrA1 para avaliar a resistência à SMX/TMP, os genes int1 e iscr2 para avaliação da presença de elementos genéticos móveis e os genes gyrA, qnr, smeD, smeT e aac(6)-Ib-cr para avaliação da resistência as quinolonas. Quatorze amostras (13,2%) foram positivas para o gene sul1. Desses isolados, nove amostras apresentavam resistência ao SMX/TMP com CIM50 de 8 g/mL e CIM90 de 128 g/mL. Cinco amostras positivas para o gene sul1 foram sensíveis a SMX/TMP com CIM50 de 1 g/mL e CIM90 de 1 g/mL. A sequencia do integron1 da amostra com CIM >125 g/mL mostrou um tamanho aproximado de 4000 pb contendo os genes cassetes aac4 e aadA1 e a região qac/sul1. Uma amostra resistente a SMX/TMP foi positiva para o gene sul2 localizado na transposase-like ISCR 2. Observamos a presença de quatro novos qnr em cepas de S. maltophilia e a presença da enzima aac(6)-ib-cr em 4 amostras. 100% das cepas foram positivas para o gene do sistema de efluxo smeDEF e 12/38 amostras tiveram o gene smeT do sistema de efluxo smeDEF, ,porém não foi observada mutação nesse gene. Na sequencia de aminoácidos da girase A de 15 amostras resistentes a levofloxacino não observamos mutações relacionadas à resistência a quinolonas. As cepas resistentes a SMX/TMP apresentaram um padrão policlonal. Dezoito amostras resistentes ao levofloxacino apresentaram 14 perfis clonais, distribuídos em 10 clusters. S. maltophilia exibe múltiplos mecanismos de resistência, nesse estudo observamos um grande número de cepas com elementos genéticos móveis carregando o gene sul1 e outros genes de resistência. A S. maltophilia pode ser um importante reservatório de transmissão de genes de resistência / Stenotrophomonas maltophilia is a gram-negative, non-fermenter, considered a low virulent organism, mainly related to healthcare associated infections. S. maltophilia shows a pattern of intrinsic resistance to many classes of antibiotics. The drug of choice for the treatment of infections caused by S. maltophilia is SMX/TMP, however, current studies have reported increased resistance to this antibiotic, thus limiting the options for effective therapy. Among the treatment options appear tigecycline and levofloxacin, but clinical trials and studies in vitro to such drugs are lacking. The purpose of this study was to evaluate the possible mechanisms of resistance to SMX/TMP and quinolones in clinical isolates from patients admitted to the Institute\'s Central Clinical Hospital and the Hospital A.C Camargo. We evaluated 106 strains of S. maltophilia isolated from adult patients with healthcare associated infections, at the Instituto Central do Hospital das Clínicas and the Cancer Hospital AC Camargo in the period of December 2008 to December 2010. The sensitivity to SMX/TMP was 78.3%, 82% for levofloxacin, 14,2% for ciprofloxacin, minocycline 100% and for tigecycline 91.6%. PCR was performed for detection of gene sul1, sul2 and dfrA1 to evaluate the resistance to SMX/TMP, genes iscr2 int1 was performed to evaluate the presence of mobile genetic elements and genes gyrA, qnr, smeD , smeT and aac (6 \')-Ib-cr for evaluation of resistance to quinolones. Fourteen samples (13.2%) were positive for the gene sul1. In these isolates, nine samples showed resistance to SMX/TMP with MIC50 of 8 g/ml and MIC90 of 128 g/mL. Five strains were positive for sul1 gene and were susceptible to SMX/TMP with MIC50 of 1 g/ml and MIC90 of 1 g/mL. The sequence of the integron class 1 strain with an MIC> 125 g/mL showed an approximate size of 4000 bp containing the gene cassettes aadA1, aac4 and qac/sul1. A strain resistant to SMX/TMP was positive for the gene sul2 located on ISCR2 a transposase-like. We observed the presence of four new qnr in strains of S. maltophilia and the presence of the enzyme aac (6 \')-ib-cr in 4 samples. 100% of the strains were positive for the gene of the efflux system smeDEF and 12/38 samples had the gene smeT repressor of smeDEF efflux system, however there was no mutation in this gene. In the amino acid sequence of gyrase A of 15 strains resistant to levofloxacin did not observe mutations related to resistance to quinolones. Strains resistant to SMX/TMP had a polyclonal PFGE pattern. Eighteen strains resistant to levofloxacin showed 14 clonal profiles 14 divided into 10 clusters S. maltophilia displays multiple mechanisms of resistance. In this study, we observed a large number of strains with mobile genetic elements carrying the sul1 gene and other resistance genes. S. maltophilia is may be an important source for transmission of genes of resistance

Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico / Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Neste trabalho foram sintetizados os heterociclos 3-carbetoxi-4(1H)-quinolona 98a-98o contendo substituintes flúor, cloro, bromo, iodo, metil, metoxi e nitro nas posições 6 ou 7, em rendimentos de 72 a 87%. Estes foram sililados com N,O-bis(trimetilsilil)trifluoracetamida (BSTFA) sendo posteriormente submetidos à reação de acoplamento com 1-O-acetil-2,3,5-tri-O-benzoil-β-D-ribofuranose (49), sob catálise do ácido de Lewis trimetilsililtrifluormetanossulfonato (TMSO-Tf), obtendo-se os respectivos ribonucleosídeos 3-carbetoxi-1-(2,3,5-tri-O-benzoil-β-D-ribofuranosil)-4(1H)-quinolonas 99a-99o em rendimentos 65 a 89%. A reação de O-desbenzoilação dos nucleosídeos 99, utilizando-se solução metanólica de carbonato de sódio levou aos ribonucleosídeos inéditos 3-carbometoxi-1-β-D-ribofuranosil-4(1H)-quinolona correspondentes (100) em rendimentos de 70 a 77%. Os ribonucleosídeos quinolônicos 100 (6-F, Cl, Br, Me e 7-F) foram utilizados como precursores na obtenção de derivados nucleosídicos bromo-O-acetilados do tipo 90. Nestas reações os produtos resultantes da bromoacetilação de 100 (6-Cl, Br, Me) foram obtidos como mistura de regioisômeros 2(3)-Br, 3(2)-acetato, na proporção de (3:1), (5:1) e (3:1), respectivamente. As reações com os nucleosideos 100 (6-F e 7-F) levaram `a formação dos derivados 2,3,5-tri-O-acetilados. Contudo, a reação de bromoacetilação do ácido 6-metil-1-β-D-ribofuranosil-4(1H)-quinolona-3-carboxílico levou ao bromoacetato 90e como único produto, em rendimento de 65%. Estes derivados bromo-O-acetilados foram submetidos a reação de β-eliminação redutiva promovida por metais empregando-se duas metodologias. A primeira utilizando-se liga de zinco-cobre em DMF como solvente, e a segunda usando-se lítio metálico em THF sob ultra-som, porém estas reações não produziram os produtos olefínicos desejados. Contudo, a β-eliminação redutiva de 90e empregando-se liga de zinco-cobre sob ultra-som, levou ao 2`,3`-didesidrodidesoxinucleosídeo esperado. A reação de desproteção regiosseletiva de nucleosídeos 2,3,5-tri-O-benzoilados (99), empregando-se metóxido de sódio em THF, levou aos ribonucleosídeos inéditos 5-O-benzoilados 103a-103c, em bons rendimentos. Estes compostos foram utilizados em tentativas de obtenção de derivados 2,3-tiocarbonatos cíclicos e 2,3-bisxantatos, sem que tenham sido obtidos os produtos esperados. Na pesquisa em busca de novos heterociclos pirimidoquinolínicos, com potencial atividade antiviral, as quinolonas 98 foram reagidas com uréia ou tiouréia em solução etanólica de hidróxido de sódio. Porém, as condições reacionais empregadas não foram satisfatórias, ocorrendo apenas a hidrólise do grupamento éster da posicao C3 do anel quinolonico. O mesmo procedimento foi aplicado aos nucleosídeos quinolônicos 99, obtendo-se neste caso os ribonucleosídeos 100 nos quais todos os grupos éster dos nucleosídeos originais foram hidrolisados, em rendimentos de 59 a 76%, o que nos levou a estabelecer metodologia adequada de obtenção de nucleosideos ácidos do tipo 100. Estes nucleosídeos foram submetidos a teste de atividade biológica frente ao vírus HSV-1 obtendo-se, obtendo-se bons resultados de inibição viral a uma concentração de 50 M, destacando-se os nucleosídeos contendo substituintes cloro e metil na posição 6 do anel quinolônico, que apresentaram um percentual de inibição igual a 99%. Paralelamente, foram realizadas as reações de N-alquilação dos heterociclos quinolônicos 98 levando às quinolonas N-etiladas 108 em rendimentos de 74 a 84%. Posteriormente, estas foram submetidas a reação de hidrólise básica obtendo-se os ácidos carboxílicos N-etilados do tipo 109 em rendimentos de 62 a 80%. A quinolona 108f (6-OMe) foi submetida a reação com tiouréia na presença de carbonato de potássio levando à obtenção do heterociclo inétido 6-etil-9-metoxi-4-oxo-2-tiono-2,3,4,6-tetraidropirimido[5,4-c]quinolina 94 em 72% de rendimento. Para obtenção de novos heterociclos quinolônicos contendo substituintes triazólicos, foram sintetizados as aminoquinolonas 108o e 108p em rendimentos de 70 e 72%, respectivamente, por redução das nitroquinolonas 108g e 108n. Inicialmente, estas foram submetidas a reação de conversão na enamina desejada, que produziria posteriormente o núcleo triazólico. Entretanto, não se obteve em ambos os casos as enaminas em questão. Assim, foi sintetizado o aminoacrilato 104p, em 75% de rendimento, o qual foi entao reagido com diazomalonaldeído, levando à formação do núcleo triazólico, tendo no entanto ocorrido subsequente reação de condensação entre o grupo aldeídico do anel triazólico e o grupo amino do aminoacrilato 104p, obtendo-se como produto final a imina 119 em 75% de rendimento. Esta imina foi então submetida a reação de hidrólise ácida, obtendo-se o acrilato triazólico 118 em 65% de rendimento. / In the present work the 6 and 7 substituted 3-carboethoxy-4(1H)-quinolones 98a-98o (fluorine, chlorine, bromine, iodine, methyl, methoxy and nitro) were synthesized in 72-87% yields. These quinolones were silylated by using bis-(trimethyl)trifluoroacetamide (BSTFA). Glycosylation of these silylated heterocycles was accomplished by their treatment with 1-O-acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranose (49) in the presence of Trimethylsilyltrifluoromethanesulphonate ( TMSO-Tf), providing the desired ribonucleosides 3-carboethoxy-1-(2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranosyl)- 4(1H)-quinolones 99a-99o, in 65-89% yields. The de-O-benzoylation reaction of 99, using methanolic sodium carbonate solution led to the new 3-carbomethoxy-1- β-D-ribofuranosyl)- 4(1H)-quinolones 100 in 70-77% yields. The 6-F,Cl, Br, Me and 7-F-ribonucleosides 100 were used as precursors in the synthesis of their respective bromoacethylated derivatives 90. In these reactions, the bromoacetylation of 100 (6-Cl, Br and Me) yielded the corresponding mixture of regioisomeric bromoacetates 3(2)-Br, 2(3)-O-acetyl, being 2-O-acetyl-3-Br derivative the majoritary one ( 3:1, 5:1 and 3:1, respectively). This reaction when applied to 6-fluoro and 7-fluoro ribonucleosides 100a and 100f afforded the corresponding 2,3,5-tri-O-acetylated derivatives. However, the same reaction when using 6-methyl-1-β-D-ribofuranosyl-4(1H)-quinolone-3-carboxylic acid (100m) as the starting material produced the new 6-methyl-1-(2,5-di-O-acetyl-3-bromo-3-deoxy-β-D-ribofuranosyl-4(1H)quinolone-3-carboxylic acid (90e) as the only regioisomer in 65% yield. The β-Elimination reactions with these bromo-O-acetylated nucleosides were attempted by two methodologies. The first one using zinc-copper alloy in DMF and the second one using lithium in THF under ultrasound. These reactions failed to give the olefinec products. However, when the pure bromoacetate 90e was reacted with zinc-copper alloy, in DMF, under ultrasound, the desired 2`.3`-didesydrodidesoxy ribonucleoside was obtained. Regioselective deprotection of 2,3,5-tri-O-benzoylated nucleosides 99 by using sodium methoxide in THF led to the new 5-O-benzoylated ribonucleosides 103a-103c in good yields. These substances were employed in attempts to obtain 2,3-cyclic thiocarbonates or to obtain 2,3-bisxanthates, unsuccessfuly. In the search for new heterocyclic nucleosides having pyrimidoquinoline ring, with potential antiviral activity, the quinolones 98 were reacted with urea or thiourea in sodium hydroxide solution leding only to the product in which the ester moiety of the starting material was hydrolyzed The same procedure was applied to the nucleosides 99 affording the ribonucleosides 100 in which all the ester groups of the protected ribonucleosides XV were hydrolyzed (59-76% yields). Additional efforts to obtain new pyrimidoquinoline derivatives were done. The quinolones 98 were alkylated with ethyl bromide in DMF producing the corresponding N-ethylquinolones 108 in 74-84% yields. Subsequently basic hydrolysis of the esther group at C3 led to carboxylic acids derivatives XXI in 62-80% yields. The condensation of 108f (R=6-OMe) with thiourea in the presence of sodium carbonate resulted in the isolation of the new heterocycle 6-ethyl-9-methoxy-4-oxo-2-thione-2,3,4,6-tetrahydropyrimido[5,4-c]quinoline (94), in 72% yield. In the search of new quinolonic derivatives containing the tryazolic nucleous as substituint the aminoquinolones 108o and 108p were synthesized in 70 and 72% yields respectively, by reduction of the nitroquinolones 108g and 108n. In the first approach the amines were reacted with 1,3-dicaronylcompounds aiming to obtain the corresponding enamino esters, which would produce the tryazolic ring. However, this reaction failed to give the desired product. In order to overcome this problem, the aminoacrylate 104p was synthesized (75% yield), and subsequently reacted with diazomalonaldehyde forming the tryazolic moiety, followed by a condensation reaction leading to the iminoderivative (119), in 75% yield, which was hydrolyzed, under acid conditions, giving the tryazolic acrylate 118, in 65% yield.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franciane Gomig.pdf: 1491620 bytes, checksum: 9e4413251eb0f4e70622124b18ded1a5 (MD5) Previous issue date: 2013-04-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Urinary tract infections show a high incidence in the population, mainly in women, the elderly and pregnant women. The main etiological agent is E. coli, especially in Community infections. Antimicrobial therapy is performed extensively with the Quinolones and resistance emergence is striking and upward. It is known E. coli resistance mechanisms are related with QRDR (Quinolone Resistance Region Determining) mutations in gyrA and parC genes that are the drug targets. These genes encode respectively DNA Girase and Topoisomerase IV subunits responsible for DNA supercoiling and DNA decatenating. Another resistance mechanism that come from plasmids is qnr genes encoding a protein that can protect DNA girase and Topoisomerase IV. Another plasmidial gene is aac(6´)-Ib-cr encoding an aminoglycoside acetyltransferase that can inactivate ciprofloxacin and norfloxacin. This study analyzed 58 E. coli lactose negative samples from urine, in order to draw a profile of resistance in this population from the region of Ponta Grossa and analyze the resistance mechanisms involved. There was a high resistance rate of 48%, among which 79% were resistant to all quinolones tested: nalidixic acid, ciprofloxacin, norfloxacin and ofloxacin. There was also a direct relationship between the biotypes 971 and resistance in contrast to biotype 981 and sensitivity. Therefor Quinolones are not recommended in infection due to E. coli biotype 971. On molecular analysis on the multiresistant samples mutations with aminoacid substitution were found in three positions: the gyrA gene at codons 83 and 87 and in the parC gene at codon 80 in three strains and at codon 84 on a single strain. Mutations only at gyrA gene appeared for a sample resistant just to nalidixic acid. These facts are according to the theory of mutations accumulation causing increased resistance to quinolones. Plasmidial genes qnr and aac(6´)-Ib-cr were not found in these strains. / As infecções do trato urinário mostram uma elevada ocorrência na população, especialmente em mulheres, gestantes e idosos. O principal agente etiológico é a E. coli, principalmente nas infecções de origem comunitária. A terapia com antimicrobianos é realizada extensivamente com Quinolonas e o aparecimento de resistência é marcante e ascendente. Os principais mecanismos de resistência conhecidos em E. coli estão relacionados a mutações nas QRDR (Região Determinante de Resistênbcia a Quinolonas) dos genes gyrA e parC, codificadores de subunidades das enzimas DNA Girase e Topoisomerase IV, respectivamente. Essas enzimas, que são os alvos de ação das Quinolonas, são responsáveis pelo superespiralamento e decatenação do DNA. Os genes plasmidiais que também estão envolvidos nos mecanismos de resistência são os qnr que codificam proteínas protetoras das enzimas alvo e o aac(6´)-Ib-cr, que codifica uma enzima aminoglicosídio acetiltransferase capaz de inativar a ciprofloxacina e norfloxacina. Neste trabalho foram analisadas 58 amostras de E. coli lactose negativas provenientes de urina, a fim de se traçar um perfil de resistência nessa população da região de Ponta Grossa e analisar os mecanismos de resistência envolvidos. Observou-se uma elevada taxa de resistência de 48%, dentre as quais 79% foram resistentes a todas as quinolonas testadas: ácido nalidíxico, ciprofloxacina, norfloxacina e ofloxacina. Pode-se observar também uma relação direta entre os biótipos 971 e uma maior resistência e o biótipo 981 e uma maior sensibilidade, motivo pelo qual não seria recomendável o uso de Quinolonas para o tratamento de infecções causadas por E. coli biótipo 971. Pela análise molecular, para as amostras multirresistentes, foram encontradas mutações com substituição de aminoácido nos genes gyrA nos códons 83 e 87 e no gene parC uma única mutação, sendo essa no códon 80 para três cepas e no códon 84 para uma cepa. Mutações apenas no gene gyrA apareceram para amostras resistentes somente ao ácido nalidíxico. Esses dados estão de acordo com a teoria de que o acúmulo de mutações leva a um aumento da resistência às quinolonas. Os genes plasmidiais qnr e aac(6´)-Ib-cr não foram encontrados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Em diversos estados do Brasil, foram relatadas epidemias de infecções causadas por micobactérias de crescimento rápido (MCR) desde o ano 2000. A maioria dos casos foi principalmente associada ao clone BRA100 de Mycobacterium massiliense, recentemente renomeada para Mycobacterium abscessus subsp. bolletii, isolado de pacientes submetidos a procedimentos invasivos nos quais os instrumentos médicos não foram adequadamente esterilizados e/ou desinfetados. Sendo as quinolonas uma opção no tratamento de infecções por MCR e sugerida para esquemas terapêuticos para esses surtos, foram avaliadas nesse trabalho as atividades in vitro de quatro gerações de quinolonas para cepas clinicas e de referência de MCR através da microdiluição em caldo. Também foram analisadas as sequências peptídicas das regiões determinantes da resistência a quinolonas (RDRQ) das subunidades A e B da DNA gyrase (GyrA e GyrB) após o seqüenciamento de DNA seguido pela tradução da sequência de aminoácidos. Cinquenta e quatro cepas de M. abscessus subsp bolletii, incluindo o clone BRA100, isoladas em diferentes estados do Brasil, e 19 cepas de referência de MCR foram caracterizadas. Todas as 54 cepas clínicas de M. abscessus subsp. bolletii foram resistentes a todas as gerações de quinolonas e mostraram o mesmo resíduo nas RDRQ, incluindo Ala-83 em GyrA, Arg-447 e Asp-464 em GyrB, descritos como sendo responsáveis por gerar um baixo nível de resistência a quinolonas em micobactérias. Porém, outras espécies de MCR apresentaram diferentes susceptibilidade e padrões de mutações contrários aos classicamente já definidos, sugerindo que outros mecanismos de resistência, diferentes de mutações em gyrA e gyrB também possam estar envolvidos na alta resistência a quinolonas. / Several outbreaks of infections caused by rapidly growing mycobacteria (RGM) have been reported in many Brazilian states since 2000. Most of the cases were mainly associated to Mycobacterium massiliense, recently renamed as Mycobacterium abscessus subsp. bolletii, BRA100 clone recovered from patients who had undergone invasive procedures, in which medical instruments have not been properly sterilized and / or disinfected. Since quinolones have represented an option for the treatment of general RGM infections and suggested for therapeutic schemes for these outbreaks, we evaluated the in vitro activities of four generations of quinolones for clinical and reference RGM by broth microdilution, and analysis of peptide sequences of the quinolone resistance determining regions (QRDR) of GyrA and GyrB after DNA sequencing followed by amino acid translation. Fifty four isolates of M. abscessus subsp bolletii, including clone BRA100, recovered in different states of Brazil, and 19 reference strains of RGM species were characterized. All 54 M. abscessus subsp. bolletii isolates were resistant to all generations of quinolones and showed the same amino acids in the QRDR including the Ala-83 in GyrA, Arg-447 and Asp-464 in GyrB, described as responsible for an intrinsic low level of resistance to quinolones in mycobacteria. But other RGM species presented distinct susceptibilities to this class of antimicrobials and patterns of mutations contrary to what has been traditionally defined, suggesting that other mechanisms of resistance, different from gyrA or gyrB mutations, may also be involved in resistance to high levels of quinolones.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Em diversos estados do Brasil, foram relatadas epidemias de infecções causadas por micobactérias de crescimento rápido (MCR) desde o ano 2000. A maioria dos casos foi principalmente associada ao clone BRA100 de Mycobacterium massiliense, recentemente renomeada para Mycobacterium abscessus subsp. bolletii, isolado de pacientes submetidos a procedimentos invasivos nos quais os instrumentos médicos não foram adequadamente esterilizados e/ou desinfetados. Sendo as quinolonas uma opção no tratamento de infecções por MCR e sugerida para esquemas terapêuticos para esses surtos, foram avaliadas nesse trabalho as atividades in vitro de quatro gerações de quinolonas para cepas clinicas e de referência de MCR através da microdiluição em caldo. Também foram analisadas as sequências peptídicas das regiões determinantes da resistência a quinolonas (RDRQ) das subunidades A e B da DNA gyrase (GyrA e GyrB) após o seqüenciamento de DNA seguido pela tradução da sequência de aminoácidos. Cinquenta e quatro cepas de M. abscessus subsp bolletii, incluindo o clone BRA100, isoladas em diferentes estados do Brasil, e 19 cepas de referência de MCR foram caracterizadas. Todas as 54 cepas clínicas de M. abscessus subsp. bolletii foram resistentes a todas as gerações de quinolonas e mostraram o mesmo resíduo nas RDRQ, incluindo Ala-83 em GyrA, Arg-447 e Asp-464 em GyrB, descritos como sendo responsáveis por gerar um baixo nível de resistência a quinolonas em micobactérias. Porém, outras espécies de MCR apresentaram diferentes susceptibilidade e padrões de mutações contrários aos classicamente já definidos, sugerindo que outros mecanismos de resistência, diferentes de mutações em gyrA e gyrB também possam estar envolvidos na alta resistência a quinolonas. / Several outbreaks of infections caused by rapidly growing mycobacteria (RGM) have been reported in many Brazilian states since 2000. Most of the cases were mainly associated to Mycobacterium massiliense, recently renamed as Mycobacterium abscessus subsp. bolletii, BRA100 clone recovered from patients who had undergone invasive procedures, in which medical instruments have not been properly sterilized and / or disinfected. Since quinolones have represented an option for the treatment of general RGM infections and suggested for therapeutic schemes for these outbreaks, we evaluated the in vitro activities of four generations of quinolones for clinical and reference RGM by broth microdilution, and analysis of peptide sequences of the quinolone resistance determining regions (QRDR) of GyrA and GyrB after DNA sequencing followed by amino acid translation. Fifty four isolates of M. abscessus subsp bolletii, including clone BRA100, recovered in different states of Brazil, and 19 reference strains of RGM species were characterized. All 54 M. abscessus subsp. bolletii isolates were resistant to all generations of quinolones and showed the same amino acids in the QRDR including the Ala-83 in GyrA, Arg-447 and Asp-464 in GyrB, described as responsible for an intrinsic low level of resistance to quinolones in mycobacteria. But other RGM species presented distinct susceptibilities to this class of antimicrobials and patterns of mutations contrary to what has been traditionally defined, suggesting that other mechanisms of resistance, different from gyrA or gyrB mutations, may also be involved in resistance to high levels of quinolones.

La presencia de residuos de sustancias antimicrobianas en la leche puede ocasionar problemas desde el punto de vista de la salud pública (alergias, trastornos digestivos, resistencias a medicamentos, etc.), además de ser la causa de interferencias en procesos de fermentación de la industria láctea. Ante la posible falta de fiabilidad de los métodos para la detección de inhibidores en la leche de oveja, el escaso número de trabajos efectuados en esta especie y los inconvenientes que originan la presencia de sustancias inhibidoras, tanto en los consumidores como para los procesos tecnológicos, se planteó la necesidad de realizar un estudio sobre un método específico de cribado para la detección de inhibidores (EclipseÒ "100ov"), y la aplicación de una técnica multirresiduo (Sistema Microbiológico Multiplaca) para la identificación preliminar de residuos de antimicrobianos en la leche de oveja. El método EclipseÒ, es una técnica microbiológica de difusión en agar, en el que se encuentran esporas de Bacillus stearothermophilus var calidolactis C953, con un indicador ácido-base. La leche se coloca en los pocillos de la microplaca y tras la incubación, se procede a la interpretación del resultado. En el caso de que la leche no contenga residuos de inhibidores, se producirá el desarrollo del microorganismo y aparecerá un cambio en la coloración del indicador ácido-base presente en el medio, y el color azul inicial pasará a amarillo. Si existen inhibidores no se manifestará el cambio de coloración. El SMMP es un método microbiológico que detecta de una forma selectiva la presencia de residuos de diferentes grupos de antimicrobianos en la leche. La muestra es analizada a través de distintas placas: B. Stearothermophilus var. calidolactis C953 (betalactámicos), B. subtilis BGA a pH 8,0 (aminoglucósidos), M. luteus ATCC 9341 (macrólidos), E. coli ATCC 11303 (quinolonas), B. cereus ATCC 11778 (tetraciclinas) y B. subtilis BGA, a pH 7,0 (sulfonamidas). La presencia de residuos / Montero Alonso, A. (2004). Aplicación de métodos microbiológicos en la detección de residuos de antimicrobianos en la leche de oveja [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1977 / Palancia