Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A quitosana é um polissacarídeo natural originado da deacetilação da quitina. É solúvel em ácido devido à presença de grupos amino, livres ao longo da cadeia do polímero. Os fungos de classe Zygomycetes, em especial Rhizopus oryzae, apresenta em suas paredes celulares quitina e quitosana, podendo as mesmas estar ligadas através de proteínas e polifosfato ou outros componentes, respectivamente. O polifosfato é um biopolímero de ampla aplicabilidade na biotecnologia ambiental. A manipueira é o resultado do processo da mandioca prensada para produção de farinha e utilizada como fonte de carbono nos processos fermentativos. A milhocina é um subproduto da produção de amido de milho e considerada como fonte de nitrogênio. Investigações foram realizadas com Rhizopus oryzae em fermentação submersa para produção de biomassa e do complexo quitosana-polifosfato, através do cultivo em rejeito agroindustrial, manipueira suplementado com milhocina, utilizando um planejamento fatorial completo 23 sobre agitação de 150rpm por 96h. O ensaio com a maior quantidade de biomassa e quitosana foi selecionado para realizar uma cinética de crescimento para avaliar a produção de biomassa e do complexo quitosanapolifosfato. Neste sentido, foi utilizado frascos de Erlenmyers de 500mL de capacidade, contendo 100mL do meio formulado, sendo inoculados em 1mL da suspensão de 107 esporos por mL, incubados sob agitação orbital de 150rpm. As amostras foram coletadas a cada 12 horas até o período de 120h. Os resultados obtidos demonstraram um aumento máximo de biomassa com 48h de cultivo em pH 7,3, com produção máxima da quitosana por R. oryzae de 116mg/g de biomassa em 36h de cultivo. O polifosfato complexado à quitosana apresentou maior rendimento em 36h correspondendo a 13mg/mg de quitosana. Devido os resultados obtidos na produção de biomassa e o complexo de quitosanapolifosfato por Rhizopus oryzae, tornaram-se economicamente viáveis devido à utilização de rejeitos industriais para obtenção desses polímeros. / Chitosan is a natural polysaccharide originated from the deacetylation of chitin. It is soluble in acid because of the presence of amino groups, free along the polymer chain. The fungal class Zygomycetes, in particular Rhizopus oryzae, presents in its cell wall chitin and chitosan, and they may be linked through the polyphosphate or proteins and other components, respectively. The polyphosphate is a biopolymer with wide applicability in environmental biotechnology. Manipueira is the result of the process for production of pressed cassava flour and used as carbon source in fermentation processes. The corn steep liquor is a by-product of corn starch and regarded as nitrogen source. Investigations were carried out with Rhizopus oryzae in submerged fermentation for production of biomass and chitosan-polyphosphate complex, through cultivation in agro waste, cassava supplemented with corn steep liquor, using a full factorial design on 23 agitation at 150 rpm for 96h. The test with the greatest amount of biomass and chitosan was selected to perform a growth kinetics to evaluate the production of biomass and chitosan-polyphosphate complex. In this sense, was used bottles of 500ml capacity Erlenmyers containing 100mL of medium formulated being inoculated in 1-ml suspension of 107 spores per ml, incubated under orbital agitation at 150 rpm. Samples were collected every 12 hours until the period of 120h. The results showed a maximum increase of biomass with 48 hours of cultivation at pH 7.3, with maximum production of chitosan by R. oryzae 116mg / g biomass at 36h of cultivation. The polyphosphate complexed to chitosan had the highest yield in 36 h corresponding to 13mg/mg chitosan. Because the results in the production of biomass and chitosan-polyphosphate complex from Rhizopus oryzae, have become economically viable due to the use of industrial wastes to obtain these polymers.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RodrigoOA.pdf: 1265658 bytes, checksum: 99f4f1b083a5b39748d0fb4e05fcf79f (MD5) Previous issue date: 2009-02-06 / Chitin is an important structural component of the cellular wall of fungi and exoskeleton of many invertebrate plagues, such as insects and nematodes. In digestory systems of insects it forms a named matrix of peritrophic membrane. One of the most studied interaction models protein-carbohydrate is the model that involves chitin-binding proteins. Among the involved characterized domains already in this interaction if they detach the hevein domain (HD), from of Hevea brasiliensis (Rubber tree), the R&R consensus domain (R&R), found in cuticular proteins of insects, and the motif called in this study as conglicinin motif (CD), found in the cristallography structure of the β-conglicinin bounded with GlcNac. These three chitin-binding domains had been used to determine which of them could be involved in silico in the interaction of Canavalia ensiformis and Vigna unguiculata vicilins with chitin, as well as associate these results with the WD50 of these vicilins for Callosobruchus maculatus larvae. The technique of comparative modeling was used for construction of the model 3D of the vicilin of V. unguiculata, that was not found in the data bases. Using the ClustalW program it was gotten localization of these domains in the vicilins primary structure. The domains R&R and CD had been found with bigger homology in the vicilins primary sequences and had been target of interaction studies. Through program GRAMM models of interaction ( dockings ) of the vicilins with GlcNac had been gotten. The results had shown that, through analysis in silico, HD is not part of the vicilins structures, proving the result gotten with the alignment of the primary sequences; the R&R domain, although not to have structural similarity in the vicilins, probably it has a participation in the activity of interaction of these with GlcNac; whereas the CD domain participates directly in the interaction of the vicilins with GlcNac. These results in silico show that the amino acid number, the types and the amount of binding made for the CD motif with GlcNac seem to be directly associates to the deleterious power that these vicilins show for C. maculatus larvae. This can give an initial step in the briefing of as the vicilins interact with alive chitin in and exert its toxic power for insects that possess peritrophic membrane / A quitina (homopol?mero linear contendo res?duos de β-1,4-N-acetil-D-glicosamina (GlcNac) ? um importante componente estrutural da parede celular de fungos e exoesqueletos de muitos invertebrados pragas, tais como insetos e nemat?ides. Em sistemas digest?rios de insetos forma uma matriz denominada de membrana peritr?fica. Um dos mais estudados modelos de intera??o prote?na-carboidrato ? o modelo que envolve as prote?nas ligantes ? quitina. Dentre os motivos j? caracterizados envolvidos nesta intera??o se destacam o motivo heve?na (HD), obtida de Hevea brasiliensis (Seringueira), o motivo R&R consenso (R&R), encontrado em prote?nas cuticulares de insetos, e o motivo denominado neste estudo como motivo conglicinina (CD), encontrado na estrutura cristalogr?fica da β-conglicinina complexada com GlcNac. Estes tr?s motivos de liga??o ? quitina foram usados para determinar qual(is) deles poderia(m) estar envolvido(s) in silico na intera??o das vicilinas de Canavalia ensiformis e Vigna unguiculata com quitina, como tamb?m associar estes resultados com o WD50 destas vicilinas para larvas de Callosobruchus maculatus. A t?cnica de modelagem comparativa foi utilizada para constru??o do modelo 3D da vicilina de V. unguiculata, que n?o foi encontrada nos bancos de dados. Atrav?s do programa ClustalW obteve-se a localiza??o destes dom?nios na estrutura prim?ria das vicilinas. Os dom?nios R&R e CD foram encontrados com maior homologia nas seq??ncias prim?rias das vicilinas e foram alvos de estudos de intera??o. Atrav?s do programa GRAMM foram obtidos modelos de intera??o ( dockings ) das vicilinas com GlcNac. Os resultados mostraram que, atrav?s de an?lises in silico, o motivo HD n?o faz parte da estrutura das vicilinas, comprovando o resultado obtido com o alinhamento das seq??ncias prim?rias; o motivo R&R, apesar de n?o ter semelhan?a estrutural nas vicilinas, provavelmente tem uma participa??o na atividade de intera??o destas com GlcNac; enquanto que o motivo CD participa diretamente na intera??o das vicilinas com GlcNac. Estes resultados in silico mostram que o n?mero de amino?cidos, os tipos e a quantidade de liga??es feitas pelo motivo CD com GlcNac parecem estar diretamente associados ao poder delet?rio que essas vicilinas possuem para larvas de C. maculatus. Isso pode constutuir um passo inicial na elucida??o de como as vicilinas interagem com quitina in vivo e exercem seu poder t?xico para insetos que possuem membrana peritr?fica

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CleysyvanSM_DISSERT.pdf: 1173359 bytes, checksum: 82a094c436e4d9b81948c390ed5d9ed1 (MD5) Previous issue date: 2010-02-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Chitin-binding vicilins from legume seeds (Erythrina velutina. Canavalia ensiformes and Phaseolus vulgares) were isolated by ammonium sulfate followed by affinity chromatography on a chitin column. Effect of these vicilins on female adults of Ceratitis capitata was examined by bioassay and in a semi-field assay model. Mechanism of action of the vicilins was determined by in vivo digestibility and chitin affinity. Among the tested vicilins, E. velutina when added to diet caused strong effect on mortality at 10% dose. This insecticidal property was tested in a semi-field assay which showed the same effect observed in laboratory conditions, where doses of 10% and 15% were lethal to female adults of C. capitata. These deleterious effects were not only associated to the binding to chitin structures present in peritrophic membrane, but principally to its low digestibility in the C. capitata digestive tract. This fact was confirmed because chiting binding proteins as WGA and the other tested vicilins were not toxic to female adults of C. capitata due susceptibility of these proteins to digestive enzymes of the insects. By other side EvV was more resistant to digestive enzymes, causing deleterious effects on female adults of C. capitata. These results showed that EvV may be part of the pest management programs or an alternative in plant improvement program in the population control of this fruticulture pest / Vicilinas ligantes a quitina de sementes de Erythrina velutina, Canavalia ensiformis e Phaseoulus vulgaris foram isoladas atrav?s de procedimento que consistiu de precipita??o com sulfato de am?nio seguida de cromatografia de afinidade em coluna de quitina. O efeito dessas vicilinas sobre f?meas adultas de Ceratitis capitata foi examinada por bioensaios em condi??es de laborat?rio e por bioensaios em condi??es de semi-campo. O mecanismo de a??o dessas vicilinas foi determinado por um ensaio de digestibilidade in vivo e pela propriedade de liga??o a uma matriz de quitina. Entre as vicilinas testadas, a vicilina de E. velutina foi a ?nica letal, causando mortalidade de 100% quando adicionada ? dieta das moscas das frutas adultas na concentra??o de 10% (p/p). Este efeito inseticida da vicilina de E. velutina foi tamb?m testado em condi??es de semi-campo, onde concentra??es de 10 % e 15% (p/p) de vicilina adicionada ? dieta foram letais para f?meas adultas de C. capitata. Esse efeito delet?rio das prote?nas ligantes ? quitina n?o foi associado somente ? propriedade de liga??o ? quitina, visto que as outras vicilinas, al?m da lectina de g?rmen de trigo (WGA) foram t?xicas quando adicionadas ? dieta das moscas das frutas. Entretanto, a resist?ncia/susceptibilidade dessas prote?nas aos processos digest?rios desses insetos poderia explicar os diferentes efeitos observados. Das prote?nas ligantes ? quitina, apenas aquelas refrat?rias ? a??o das enzimas digestivas nos processos digest?rios teve a??o inseticida. Esses resultados mostraram que vicilina de E. velutina ? um bioinseticida com potencial de uso nos programas de controle de pragas diminuindo a popula??o de moscas das frutas no campo

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndersonFJF_DISSERT.pdf: 1523854 bytes, checksum: fcaa34d5302cf667d8de6933e27ac7c5 (MD5) Previous issue date: 2013-10-29 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Grains and legume seeds are foods that form the basis of the diets of many cultures around the world, winch contritbute to the daily nutrient requirements of humans. Vicilins (7S globulin) are storage proteins found in legume seeds, and may have an additional function constitutive defense of the embryo against pests and pathogens. In this work the vicilin from Anadenanthera macrocarpa - AmV (red-angico), was purified and partially characterized, its effect on development and larval survival and adult emergence of Callosobruchus maculatus was evaluated by determination of LD50, WD50 and ED50 in system bioassay. Purification of vicilin was initiated by the chitin affinity chromatography and then gel filtration (Superdex 75 Tricorn 10x300 mm) FPLC system followed by reverse phase chromatography (C8 phenomenex) on HPLC system. Bioassays WD50 and LD50 for larvae were 0.32% and 0.33% (w:w) respectively, since the ED50 for adults was 0.096%. The probable mechanism of action was evaluated by testing digestibility of AmV in vitro, and observed for the involvement of two fragments vicilins immunoreactive against polyclonal Anti-vicilin from Erythrina velutina (Anti-EvV) about of 22 and 13 kDa chitin binding. The AmV in its native form has been recognized by the anti-EvV, indicating that there is a conserved region in the vicilin and is probably corresponding to the chitin binding domains. These results point to a new vicilin chitin binding that can subsequently be used as a possible biopesticide protein source, in order to control insect pest C. maculatus and confirm literature findings that demonstrate vicilin in the presence of different kinds of ligands to conserved regions chitin not yet characterized / Sementes de leguminosas s?o alimentos que comp?em a base das dietas de diversas culturas ao redor do mundo, tendo uma importante contribui??o nas necessidades di?rias de nutrientes dos seres humanos. As globulinas 7S (vicilinas) s?o prote?nas de reserva encontradas em sementes de leguminosas, e podem apresentar uma fun??o adicional de defesa constitutiva do embri?o contra pragas e pat?genos. Neste trabalho uma vicilina de Anadenanthera macrocarpa - AmV (Angico-vermelho), foi purificada e parcialmente caracterizada. Seu efeito sobre o desenvolvimento, sobreviv?ncia larval e emerg?ncia dos adultos de Callosobruchus maculatus foram avaliados pela determina??o das LD50, WD50 e ED50 em sistema de bioensaio. A purifica??o da vicilina foi iniciada por cromatografia de afinidade ? quitina e posteriormente em cromatografia de gel filtra??o Superdex 75 Tricorn 10x300 mm no sistema de FPLC, seguida por cromatografia de fase reversa C8 phenomenex em sistema HPLC. Por SDS-PAGE, AmV dissociou-se em quatro subunidades principais com aproximadamente 73, 70, 43 e 41 kDa, e quando submetida ? eletroforese a 12% em condi??es nativas apresentou uma banda ?nica de caracter?stica eletrofor?tica ?cida. Nos bioensaios, a WD50 e a LD50 para as larvas foram de 0,32% e 0,33% (p:p) respectivamente, j? para os adultos a ED50 foi de 0,096%. O prov?vel mecanismo de a??o foi avaliado por ensaios de digestibilidade da AmV in vitro, sendo observado o envolvimento de dois fragmentos de vicilinas imunorreativos contra anticorpo policlonal Anti-vicilinas de Erythrina velutina (Anti- EvV), de aproximadamente 22 e 13 kDa ligantes ? quitina. A AmV na sua forma nativa foi reconhecida pelo anticorpo anti-EvV, indicando que existe uma provavel regi?o conservada nas vicilinas, que pode corresponder ? dom?nios de liga??o ? quitina. Estes resultados apontam para uma nova vicilina que pode vir a ser utilizada como um poss?vel bioinseticida de origem proteica, de maneira a controlar o inseto praga C. maculatus, bem como corroborar com achados da literatura que demonstram em vicilinas de diferentes esp?cies a exist?ncia de regi?es conservadas ligantes ? quitina ainda n?o caracterizados

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Mo-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos. No presente trabalho, novas propriedades estruturais da Mo-CBP3 sÃo descritas, revelando correlaÃÃo entre sua estabilidade estrutural e atividade antifÃngica. Em adiÃÃo, para melhor compreensÃo dos mecanismos pelos quais essa proteÃna exerce aÃÃo antifÃngica, sua habilidade de induzir a produÃÃo endÃgena de espÃcies reativas de oxigÃnio e de causar alteraÃÃes morfolÃgicas e ultraestruturais foi analisada, usando Fusarium solani como modelo. F. solani à uma espÃcie de fÃcil manuseio e desenvolvimento rÃpido, ideal para ensaios in vitro, e de relevÃncia, por se tratar de um fungo que ataca culturas economicamente importantes. Com foco na utilizaÃÃo segura da Mo-CBP3 como agente quÃmico contra fungos, seus efeitos citotÃxicos sobre cÃlulas eucariÃticas tambÃm foram investigados. Mo-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina de 18,0 kDa, de acordo com PAGE-SDS. Todavia, anÃlise por espectrometria de massas revelou que essa proteÃna consiste de mÃltiplas isoformas com massas moleculares variando entre 12,2 e 12,3 kDa. Mo-CBP3 à composta por duas cadeias polipeptÃdicas de 5,0 e 9,0 kDa, denominadas de cadeia A e cadeia B, respectivamente. A cadeia B contÃm a sequÃncia NH2-terminal representada por CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, enquanto que a cadeia A tem o resÃduo NH2-terminal bloqueado. cDNA codificador da cadeia B foi obtido com iniciadores sintetizados a partir de sua sequÃncia NH2-terminal. AnÃlises in silico das sequÃncias de nucleotÃdeos e de aminoÃcidos deduzida confirmaram a presenÃa de isoformas e massa molecular da Mo-CBP3 e identificaram sÃtios potenciais de O-glicosilaÃÃo e fosforilaÃÃo. AlÃm disso, similaridades entre Mo-CBP3 e outras proteÃnas de M. oleifera, bem como com albuminas 2S, foram detectadas. A estrutura secundaria da Mo-CBP3 à composta por 30,3% α-hÃlices, 16,3% folhas β, 22,3% voltas e 30,4% estruturas ao acaso. Na espectroscopia de fluorescÃncia, excitaÃÃes de uma soluÃÃo da Mo-CBP3 a 280 nm e 295 nm produziram emissÃo mÃxima a 303 e 309 nm, respectivamente. A estrutura da Mo-CBP3 à altamente estÃvel, se apresentando indiferente Ãs mudanÃas de temperatura e pH. Mo-CBP3 (0,05-0,1 mg/mL) se mostrou capaz de inibir a germinaÃÃo de conÃdios de vÃrios fungos fitopatogÃnicos, incluindo F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae e C. gloeosporioides. Similarmente, Mo-CBP3 (0,05 mg/mL) foi capaz de inibir o crescimento micelial de F. solani e apresentou tanto efeito fungistÃtico como fungicida, dependendo da concentraÃÃo usada. LigaÃÃo da Mo-CBP3 à superfÃcie de cÃlulas fÃngicas ocorre, pelo menos em parte, via interaÃÃo eletrostÃtica, jà que NaCl 0,15 M aboliu seu efeito inibitÃrio. Mo-CBP3 induziu a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio e causou perda de assimetria e deformaÃÃes em cÃlulas de F. solani. DesorganizaÃÃo do sistema de endomembranas, condensaÃÃo do citosol e aumento de vacuolizaÃÃo tambÃm foram observados. Mo-CBP3 nÃo mostrou atividade hemolÃtica e nem foi capaz de alterar a viabilidade das cÃlulas MCF-7 e Caco-2, sugerindo que essa proteÃna nÃo à tÃxica para cÃlulas humanas. Com base na alta estabilidade e no amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos em baixas concentraÃÃes e, tambÃm, na ausÃncia de citotoxicidade para cÃlulas humanas testadas, Mo-CBP3 tem grande potencial para desenvolvimento de novas drogas antifÃngicas ou na produÃÃo de plantas transgÃnicas mais resistentes a fungos. / Mo-CBP3 is a chitin-binding protein purified from Moringa oleifera seeds that displays broad inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In this work, we report new structural features of Mo-CBP3 that reveal a correlation between its structural stability and antifungal activity. In addition, to gain better insights into the mechanisms by which this protein acts as an antifungal agent, its ability to induce the endogenous production of reactive oxygen species and to trigger morphologic and ultrastructural alterations were analysed using Fusarium solani as a model. F. solani is an easy-to-handle and fast-developing species, making it ideal for in vitro assays, and it holds relevance as a phytopathogenic fungus that attacks economically important crop plants. To fully explore the biosafety of Mo-CBP3 as a chemical agent against fungi, its cytotoxic effects on eukaryotic cells were also investigated. Mo-CBP3 is a chitin-binding protein of 18.0 kDa, according to SDS-PAGE. However, by mass spectrometry analysis, it was observed that this protein consists of multiple isoforms with molecular masses ranging between 12.2 and 12.3 kDa. Mo-CBP3 is composed by two polypeptide chains of 5.0 and 9.0 kDa, named A and B chain, respectively. The B chain contains the following NH2-terminal sequence CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ while the A chain has a blocked NH2-terminal residue. cDNA encoding the B chain was obtained with primers of its NH2-terminal sequence. In silico analyses of nucleotide and deduced amino acid sequences confirmed the presence of isoforms and molecular mass of Mo-CBP3 and identified potential sites of O-glicosylation and phosphorilation. Moreover, similarities between Mo-CBP3 and other M. oleifera proteins as well as 2S albumins were detected. The secondary structure of Mo-CBP3 showed 30.3% α-helices, 16.3% β-sheets, 22.3% turns and 30.4% unordered forms. In the fluorescence spectroscopy, excitation of Mo-CBP3 solution at 280 nm and 295 nm gave emission maxima at 303 and 309 nm, respectively. The Mo-CBP3 structure is highly stable and retains its antifungal activity regardless of temperature and pH. Mo-CBP3 (0.05-0.1 mg/mL) was able to inhibit the conidia germination of several phytopathogenic fungi, including F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae and C. gloeosporioides. Similarly, Mo-CBP3 was inhibitory to the mycelial mass development of F. solani at 0.05 mg/mL and has both fungistatic and fungicidal effects, depending on the concentration used. Binding of Mo-CBP3 to the fungal cell surface is achieved, at least in part, via electrostatic interactions, as 150 mM NaCl abolished its inhibitory effect. Mo-CBP3 induced the production of reactive oxygen species and caused in F. solani cells a marked loss of asymmetry, deformations and deep wrinkles in comparison to control cells. Disorganisation of the endomembrane system and condensation and shrinkage of cytosol with increased vacuolation and the loss of normal structure and content were also observed. Mo-CBP3 did not show haemolytic activity and it was not capable to alter de viability of both MCF-7 and Caco-2 cells, suggesting that this protein is not toxic for human cells. Based on its high stability and broad-spectrum efficacy against important phytopathogenic fungi at low inhibitory concentrations and absence of cytotoxicity to human cells, Mo-CBP3 has great potential in the development of new antifungal drugs or in transgenic crops with enhanced resistance to fungi.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Mo-CBP4 à uma proteÃna ligante à quitina, com atividade anti-inflamatÃria e antinociceptiva, isolada de sementes de Moringa oleifera Lamarck, uma Ãrvore conhecida pelo seu valor medicinal. Este trabalho teve como objetivo a caracterizaÃÃo estrutural, farmacolÃgica e toxicolÃgica de Mo-CBP4, com foco na sua utilizaÃÃo como agente terapÃutico. Mo-CBP4 à um heterodÃmero de 11,8 kDa, composto por cadeias de 3,9 kDa e 8,4 kDa. O sequenciamento de Mo-CBP4 por degradaÃÃo de Edman e espectrometria de massas mostrou a presenÃa de muitos resÃduos de aminoÃcidos bÃsicos e alta similaridade com proteÃnas isoladas de sementes de M. oleifera. AnÃlises espectroscÃpicas utilizando dicroÃsmo circular demonstraram que Mo-CBP4 à composta por α-hÃlices (36%), folhas-β (15%), voltas (19%) e estruturas ao acaso (30%), com alta estabilidade estrutural frente a variaÃÃes de temperatura e pH. Mo-CBP4 (0,1, 1,0 e 10 mg/kg), por via endovenosa, mostrou atividade anti-inflamatÃria no modelo de peritonite induzida por carragenina em ratos, com inibiÃÃo (79%) da migraÃÃo de neutrÃfilos jà na menor dose. Atividade anti-inflamatÃria de Mo-CBP4 (40 mg/kg) tambÃm ocorreu por via oral em camundongos, usando o mesmo modelo citado, com significativa inibiÃÃo (48%) da migraÃÃo de neutrÃfilos. Tal atividade permaneceu mesmo apÃs aquecimento da proteÃna a 100 ÂC por 1 hora, porÃm, a prÃ-incubaÃÃo com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M foi capaz de reverter sua aÃÃo. Os nÃveis sÃricos de IL-1β e IL-10, apÃs induÃÃo de peritonite, sofreram alteraÃÃo com o prÃ-tratamento da proteÃna. Adicionalmente, Mo-CBP4 (10 mg/kg) mostrou atividade antinociceptiva, verificada atravÃs do teste da formalina (2,5%), quando administrada via intraperitoneal, inibindo apenas a dor perifÃrica. No modelo de hipernocicepÃÃo mecÃnica induzida por carragenina, animais tratados via oral com a proteÃna (20, 40 e 80 mg/kg), 1 hora antes do agente inflamatÃrio, mostraram-se mais resistentes à sensibilizaÃÃo apÃs 1, 3 e 5 horas, apresentando inibiÃÃo mÃxima na dose de 40 mg/kg, estando essa atividade relacionada com a reduÃÃo da migraÃÃo de neutrÃfilos. A hipernocicepÃÃo direta causada por PGE2 ou epinefrina nÃo sofreu alteraÃÃo com o prÃ-tratamento de Mo-CBP4. A proteÃna tambÃm nÃo causou comprometimento na atividade locomotora dos animais, quando submetidos ao teste do campo aberto. A administraÃÃo oral de Mo-CBP4 em dose Ãnica (2000 mg/kg) ou em doses repetidas (10, 40 e 100 mg/kg) nÃo resultou em efeitos tÃxicos ou adversos. Similarmente, avaliaÃÃo da citotoxicidade e genotoxicidade de Mo-CBP4, utilizando cÃlulas tumorais ou normais, mostrou ausÃncia de toxicidade. Os resultados obtidos sugerem que devido Ãs propriedades anti-inflamatÃria e antinociceptiva, alta estabilidade e aparente ausÃncia de toxicidade, Mo-CBP4 possui grande potencial como um futuro biofÃrmaco. / Mo-CBP4 is a chitin-binding protein that is associated with the antinociceptive and anti-inflammatory effects of Moringa oleifera seeds, a tree known for its medicinal value. The aim of this study was the structural, pharmacological and toxicological characterization of Mo-CBP4, focusing on its use as a therapeutic agent. Mo-CBP4 is a 11.8 kDa heterodimer, composed by 3.9 kDa and 8.4 kDa chains. Mo-CBP4 sequencing by Edman degradation and mass spectrometry showed the presence of many basic amino acid residues and high similarity with other proteins from M. oleifera seeds. Circular dichroism spectroscopy showed that the Mo-CBP4 contains 36% α-helix, 15% β-sheet, 19% turn and 30% unordered and high structural stability to temperature and pH variations. Mo-CBP4 (0.1, 1.0 and 10 mg/kg) by intravenous administration showed anti-inflammatory activity on the model of carrageenan-induced peritonitis in rats, with inhibition (79%) of neutrophil migration already at the lowest dose. Mo-CBP4 (40 mg/kg), when administered by oral route on mice, using the same mentioned model, also presented anti-inflammatory activity, causing a significant inhibition (48%) of neutrophil migration. Mo-CBP4 retained this activity even after heating at 100 ÂC or pre-incubation with 0.1 M N-acetyl-D-glucosamine, both for 1 hour. Serum levels of IL-1β and IL-10 after peritonitis induction changed in Mo-CBP4-pretreated mice. In addition, Mo-CBP4 (10 mg/kg), administered intraperitoneally, also showed antinociceptive activity by using the formalin (2.5%) test in mice model, inhibiting just the peripheral pain. In the carrageenan-induced mechanical hypernociception model, animals pretreated with oral Mo-CBP4 (20, 40 and 80 mg/kg), 1 hour prior to inflammatory agent use, proved to be more resistant to sensitization after 1, 3 and 5 hours, with maximal inhibition at a dose of 40 mg/kg, being this activity correlated with the reduction of neutrophil migration. Direct hypernociception caused by epinephrine or PGE2 was not affected with Mo-CBP4 pretreatment. Mo-CBP4 did not impair the locomotor activity of animals in the open field test. In general, no toxic signs or adverse effects were seen after oral administration of Mo-CBP4 at a single dose (2000 mg/kg) or after repeated doses (10, 40 and 100 mg/kg). Similarly, cytotoxicity and genotoxicity tests with Mo-CBP4, using tumour or normal cells, showed no toxicity. The results suggest that due to anti-inflammatory and antinociceptive properties, high stability and apparent lack of toxicity, Mo-CBP4 has great potential as a future biopharmaceutical drug.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Moringa oleifera Lam. à uma Ãrvore conhecida pelo seu valor medicinal, uma vez que extratos de todas as partes desta planta mostraram propriedades farmacolÃgicas reconhecidas pelo uso popular e corroboradas pela comunidade cientÃfica. Dentre as atividades farmacolÃgicas, destacam-se Ãquelas relacionadas a processos inflamatÃrios. Este trabalho teve como objetivo o isolamento e caracterizaÃÃo de uma proteÃna ligante à quitina de sementes de Moringa oleifera e avaliaÃÃo de suas atividades antinociceptiva e anti-inflamatÃria. As proteÃnas foram extraÃdas da farinha delipidada de sementes e o extrato total foi fracionado em albuminas e globulinas. A fraÃÃo albumÃnica foi submetida à cromatografia de afinidade em matriz de quitina. A fraÃÃo ligante à quitina eluÃda com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M foi submetida à cromatografia de troca iÃnica acoplada a um sistema de FPLC, rendendo cinco picos protÃicos. O material eluÃdo com tampÃo acetato de sÃdio 0,5 M, pH 5,2, contendo NaCl 0,6 M, denominado Mo-CBP4 (Mo â Moringa oleifera; âCBP â âchitin binding proteinâ), teve um rendimento final de 0,54% e foi escolhido para dar continuidade ao trabalho. Mo-CBP4 apresentou-se como duas bandas protÃicas de massas moleculares aparentes de 27,5 e 16,5 kDa, em condiÃÃes nÃo-redutoras, e de 9,8 kDa em condiÃÃes redutoras. Eletroforese bidimensional desta proteÃna revelou a presenÃa de dois spots (18,7 e 13,4 kDa), com mesmo ponto isoelÃtrico (pI de 10,55). Trata-se de uma glicoproteÃna com 2,85% de carboidratos, nÃo apresentando atividade hemaglutinante. Mo-CBP4 mostrou-se tÃo eficiente quanto o sulfato de alumÃnio e potÃssio na capacidade de coagular material em suspensÃo na Ãgua. A proteÃna em questÃo foi resistente à proteÃlise no teste de digestibilidade in vitro utilizando pepsina, tripsina e quimotripsina. Para avaliar os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatÃrio de Mo-CBP4, foi utilizado o modelo de contorÃÃes abdominais induzidas pela injeÃÃo de Ãcido acÃtico 0,8% (via i.p.) em camundongos. A proteÃna, nas doses de 1,0, 3,5 e 10 mg/kg, foi capaz de prevenir as contorÃÃes de maneira dose dependente, chegando a 98,9% de inibiÃÃo na dose de 10 mg/kg. Mo-CBP4 tambÃm apresentou atividade antinociceptiva por via oral (10 mg/kg), atingindo uma inibiÃÃo de 52,9% quando administrada 60 minutos antes da injeÃÃo de Ãcido acÃtico. Mo-CBP4 inibiu o aumento da permeabilidade vascular (89,1%) e a migraÃÃo leucocitÃria (60,9%) na dose de 10 mg/kg via i.p. A propriedade antinociceptiva parece ser independente do sÃtio de interaÃÃo ao carboidrato N-acetil-D-glucosamina, enquanto que a atividade anti-inflamatÃria mostrou um decrÃscimo quando a regiÃo de ligaÃÃo ao carboidrato foi bloqueada. Os resultados apresentados suportam cientificamente o uso popular da M. oleifera e mostram que uma proteÃna ligante à quitina, Mo-CBP4, està associada aos efeitos antinociceptivo e anti-inflamatÃrio das sementes / Moringa oleifera Lam. is a perennial multipurpose tree with a strong scientific evidence of its curative power and used in folk medicine to cure several inflammatory processes. This work aimed to isolate and characterize a chitin-binding protein from Moringa oleifera seeds, and evaluate its antinociceptive and anti-inflammatory effects. Chitin-binding proteins were obtained after application of albumin fraction from crude extract of M. oleifera seeds into a chitin column and the adsorbed fraction was applied in a Resource-S matrix attached to FPLC system. The fraction eluted with 50 mM sodium acetate buffer, pH 5.2, containing 0.6 M NaCl, named Mo-CBP4 was used for the experiment. Mo-CBP4 showed a single band on SDS-PAGE (molecular mass 9.8 kDa) in presence of reducing agent, however in the absence of 2-mercaptoethanol two bands corresponding to 27.5 and 16.5 kDa were observed. Bidimensional electrophoresis of this protein revealed the presence of two spots (18.7 and 13.4 kDa), with the same isoeletric point value corresponding to 10.55. Mo-CBP4 is a glycoprotein containing 2.85% neutral sugar, which failed to agglutinate untreated or trypsin-treated erythrocytes from rabbit or human origin. This protein showed coagulant activity, similar to aluminum and potassium sulfate, the coagulant most widely used in water treatment. Mo-CBP4 was subjected to in vitro digestion with pepsin, trypsin, or chymotrypsin and appeared to be markedly resistant to digestion. Acetic acid-induced abdominal constrictions, increase in vascular permeability and leukocyte migration tests were used for the antinociceptive and anti-inflammatory activities assessment. Mo-CBP4 (1.0, 3.5 and 10 mg/kg) into mice potently and significantly reduced the occurrence of abdominal writhing in a dose dependent manner by 18.9, 44.6% and 98.9%, respectively. In addition, the oral administration of the protein (10 mg/kg) resulted in 18% and 52.9% reductions in abdominal writhing when given 30 and 60 min prior to acetic acid administration, respectively. Mo-CBP4 also caused a significant and dose-dependent inhibition of peritoneal capillary permeability induced by acid acetic and significantly inhibited leukocyte accumulation in the peritoneal cavity. The effect antinociceptive appeared to be independent on the carbohydrate recognition site. However the anti-inflammatory activity was partially reversed when Mo-CBP4 was pre-incubated with specific carbohydrate ligand, showing that this effect is dependent on the carbohydrate recognition site

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It is related to high blood glucose levels that cause metabolic and cellular changes, making the tissue repair process difficult, with long and costly treatment. Chitosan has been investigated for its biological activity when in contact with tissue. However, further elucidation about the mechanisms of chitosan’s action on the wound healing is needed, as well as how its physico-chemical and handling characteristics can offer better performance for the treatment of diabetic wounds. This study aimed to develop and characterize a chitosan hydrogel, and evaluate its angiogenic potential and healing activity in skin wounds of experimentally-induced diabetic rats. To obtain 80, 85 and 90% deacetylation degree, a deacetylation protocol was conducted in basic medium and high temperature. After hydrogels preparation, they were evaluated for pH, viscosity, organoleptic properties, microbiological contamination, and antimicrobial activity for 60 days and stored at room temperature and under refrigeration. The angiogenic potential of each formulation was investigated by the chorioallantoic membrane assay of embryonated chicken eggs, determining the vascular area by fresh analysis and vascular density by histological evaluation. The healing activity of chitosan gels was determined by the treatment of skin wounds promoted at the dorsal region of experimentally-induced diabetic female rats, evaluated at the periods of three, 7 and 14 days postoperatively. The following parameters were investigated: wound contraction rate, microscopic changes in the epidermis and dermis by hematoxylin-eosin, angiogenic activity, and cell proliferation by immunohistochemistry. The methodology used to deacetylation of the chitosan was considered appropriate, and the degrees of deacetylation pretended were obtained. During the 60 days of evaluation, there was a significant change only in the viscosity of samples kept at room temperature and refrigeration was considered the best form of storage. The angiogenic activity of chitosan gels was positive with an increase in the area and vascular density of the chorioallantoic membrane. The higher the degree of deacetylation, the greater the angiogenic response observed, therefore, the 90% deacetylation hydrogel showed the best performance in this analysis. In the treatment of skin wounds in diabetic rats, the chitosan hydrogels increased the rate of contraction of the wounds, had greater angiogenesis indexes, cell proliferation and collagen production resulting in faster healing compared to the control group. Hydrogel higher’s degree of deacetylation seems to optimize the biological activity of the polymer. / O comprometimento da cicatrização de feridas cutâneas é uma das principais complicações decorrentes do diabetes e está relacionada aos elevados níveis de glicose sanguínea que causam alterações metabólicas e celulares tornando o processo cicatricial mais lento e o tratamento longo e dispendioso. A quitosana tem sido investigada quanto à sua atividade biológica quando em contato com tecidos vivos. No entanto, é necessária uma maior elucidação sobre seus mecanismos de ação sobre a cicatrização de feridas e como as suas características físico-químicas podem oferecer um melhor desempenho para o tratamento de feridas diabéticas. O presente estudo teve por objetivo desenvolver e caracterizar um hidrogel de quitosana em diferentes graus de desacetilação e avaliar seu potencial angiogênico e atividade cicatrizante no tratamento de feridas cutâneas de ratas diabéticas induzidas experimentalmente. Para a obtenção dos graus de desacetilação 80, 85 e 90% foi utilizado protocolo de desacetilação em meio básico e temperatura elevada. Após a confecção das formulações, os géis foram avaliados quanto ao pH, viscosidade, propriedades organolépticas, contaminação microbiológica e atividade antimicrobiana durante 60 dias, sendo armazenados à temperatura ambiente e sob refrigeração. O potencial angiogênico de cada formulação foi investigado por meio do ensaio da membrana córioalantoide de ovos embrionados de galinha, determinando-se a área vascular por análise a fresco e a densidade vascular pela avaliação histológica. A atividade cicatrizante dos géis de quitosana foi determinada pelo tratamento de feridas cutâneas promovidas na região dorsal de ratas diabéticas induzidas experimentalmente, sendo avaliados os períodos de três, sete e 14 dias de pós-operatório. Foram investigados os parâmetros: taxa de contração macroscópica das feridas, alterações microscópicas em epiderme e derme pela coloração de hematoxilina-eosina, atividade angiogênica e proliferação celular por imunoistoquímica. A metodologia utilizada para desacetilação da quitosana foi considerada adequada, sendo obtidos os graus de desacetilação desejados. Durante os 60 dias de avaliação, houve alteração significativa apenas na viscosidade das amostras mantidas em temperatura ambiente, sendo a refrigeração considerada melhor forma de armazenamento. A atividade angiogênica dos géis de quitosana foi positiva havendo aumento da área e da densidade vascular da membrana córioalantoide. Quanto maior o grau de desacetilação maior foi a resposta angiogênica do produto, sendo o gel de 90% de desacetilação o que apresentou melhor desempenho nesta análise. No tratamento das feridas cutâneas de ratas diabéticas, os géis de quitosana aumentaram a taxa de contração das feridas, apresentaram maiores índices de angiogênese, proliferação celular e produção de colágeno o que resultou em cicatrização mais rápida quando comparado ao grupo controle. O maior grau de desacetilação do gel parece otimizar a atividade biológica do polímero.

As principais propriedades físico-químicas da quitosana dependem da massa molar média, grau médio de acetilação (<span style=\"text-decoration: overline\">GA) e do parâmetro de acetilação (PA) que expressa o padrão de distribuição das unidades 2-acetamido-2-desoxi-D-glucopiranose (GlcNAc) e 2-amino-2-desoxi-D-glucopiranose ( GlcN) ao longo de suas cadeias. A distribuição alternada, randômica ou em blocos das unidades GlcN e GlcNAc ao longo das cadeias poliméricas está diretamente relacionada com as condições de preparação da quitosana, sendo que as reações executadas em condições homogêneas geram quitosanas em cujas cadeias há o predomínio da distribuição randômica, enquanto que nas quitosanas produzidas em condições heterogêneas a distribuição em blocos predomina. Neste trabalho &beta;-quitina extraída de gládios de lulas (Loligo sp) foi submetida a 3 etapas consecutivas do processo de desacetilação assistida por irradiação de ultrassom de alta intensidade (processo DAIUS), resultando em quitosana extensivamente desacetilada (<span style=\"text-decoration: overline\">GA &asymp; 2%) e de elevada massa molar média viscosimétrica (<span style=\"text-decoration: overline\">Mv &asymp; 354000 g/mol) comparada a quitosanas obtidas por outros métodos. Essa amostra, denominada amostra QSo, foi dissolvida em ácido acético aquoso e então submetida à reação de N-acetilação por 24 h à temperatura ambiente. A ocorrência de O-acetilação foi evitada pela adição de 1,2-propanodiol ao meio reacional e a variação da razão molar anidrido acético/grupos amino permitiu a obtenção de cinco amostras de quitosanas N-acetiladas, as quais foram caracterizadas por espectroscopia de RMN 1H, espectroscopia na região do infravermelho, difração de raios X, viscosimetria capilar, microscopia eletrônica de varredura e análise termogravimétrica. O parâmetro de acetilação (PA) das quitosanas N-acetiladas foi determinado a partir dos espectros de RMN 1H de modo a permitir a avaliação do tipo de distribuição de unidades 2-acetamido-2-desoxi-D-glucopiranose (GlcNAc) e 2-amino-2-desoxi-D-glucopiranose (GlcN) predominante nos produtos. As reações de N-acetilação foram executadas em duplicata gerando as amostras dos conjuntos 1 e 2, as quais apresentaram <span style=\"text-decoration: overline\">GA variando no intervalo 25%&lt; <span style=\"text-decoration: overline\">GA &lt;55%, sendo constatada variação linear de <span style=\"text-decoration: overline\">GA com a razão molar anidrido acético/grupos amino. As quitosanas N-acetiladas apresentaram parâmetro de acetilação variando com 0,9&lt;PA&lt;1,5, indicando o predomínio da distribuição randômica das unidades GlcNAc e GlcN. As quitosanas N-acetiladas apresentaram maior estabilidade térmica em comparação com a quitosana de partida (amostra QSo), devido a porcentagem de unidades GlcNAc nas cadeias dos polímeros que provocaram alterações na sua estrutura cristalina. Os ângulos de Bragg característicos de &beta;-quitina (amostra QTo) extraída de gládios de lulas foram identificados nos difratogramas das quitosanas N-acetiladas com 30%&lt; <span style=\"text-decoration: overline\">GA &lt;55%, o que sugere que essas amostras adquiriram características semelhantes a da &beta;-quitina. Outra evidência desse fato foi comprovada através da análise das micrografias das amostras de quitosana N-acetiladas, que revelaram que as características das superfícies das partículas das amostras mais acetiladas são semelhantes a da &beta;-quitina. / The main physichochemical properties of chitosan rely on its average molar mass, average degree of acetylation (<span style=\"text-decoration: overline\">GA) and the parameter of acetylation (PA), which expresses the distribution pattern of 2-deoxy-2-acetamido-D-glucopyranose (GlcNAc) and 2-deoxy-2-amino-D-glucopyranose (GlcN) units along its chains. The occurrence of alternated, random or block-like distribution of GlcN and GlcNAc along the polymer chains is directly related to preparation conditions of chitosan. When homogeneous conditions are applied chitosan chains exhibiting random distribution are produced, while the chitosan generated from heterogeneous reactions presents block-like distribution. In this work, &beta;-chitin extracted from squid pens (Loligo sp.) was submitted to three consecutive steps of ultrasound-assisted deacetylation process (USAD process), resulting in an extensively deactylated chitosan (DA=2%) with high viscosity average molar mass (<span style=\"text-decoration: overline\">Mv= 354,000 g/mol) compared to chitosan obtained by other methods. This chitosan, named sample CSo, was dissolved in aqueous acetic acid and then it was submitted to N-acetylation reaction for 24 hours at room temperature. The occurrence of O-acetylation was prevented by adding 1,2-propanediol to the reaction nedium and the variation of the molar ratio acetic anhydride/amino groups allowed the preparation of five N-acetylated chitosans, named as samples RCSon, which were characterized by 1H NMR spectroscopy, infrared spectroscopy, X-ray diffraction, viscometry, scanning electron microscopy and thermogravimetric analysis. The parameter of acetylation (PA) of N-acetylated chitosans was determined from the 1H NMR spectra, allowing the assessment to the distribution pattern of GlcNAc and GlcN units. The N-acetylation reactions were carried out in duplicate, generating two independent sets of N-acetylated chitosans whose average degree of acetylation ranged as 25% &lt; DA &lt; 55%, a linear increase of DA with increasing molar ratio acetic anhydride/amino groups being observed. The N-acetylated chitosans presented parameter of acetylation ranging as 0,9 &lt; PA &lt; 1,5, indicating the predominance of random distribution of GlcNAc and GlcN units. The N-acetylated chitosans showed higher thermal stability as compared to the parent chitosan (CSo sample), probably due to the changes in the degree of order resulting from the higher content of GlcNAc units present in former samples. The Bragg angles characteristic of beta-chitin (CTo sample) were identified in the XRD patterns of N-acetylated chitosans, suggesting that these samples acquired similar characteristics as beta-chitin. Further evidence of this fact was observed through the SEM analyses, which revealed that the characteristics of particle\'s surfaces of N-acetylated chitosans are similar to those of beta-chitin.