Espécies do gênero Paracoccidioides spp são fungos patogênicos, termodimórficos, agentes etiológicos de doença endêmica em diversas regiões da América Latina. O indivíduo infectado desenvolve uma resposta específica que, quando associada à alta produção de TNF-? e IFN-?, favorece a resistência ao fungo. Componentes de alguns fungos patogênicos foram caracterizados, por técnicas de knockdown gênico, como importantes para a virulência fúngica. Nosso grupo identificou paracoccina (PCN) como um componente de leveduras de P. brasiliensis; trata-se de uma proteína com um domínio enzimático, dotado de atividade quitinase e um domínio lectínico, ligante de GlcNAc. PCN é dotada das seguintes propriedades: (a) contribui para o crescimento do fungo; (b) promove a adesão da levedura à matriz extracelular, por ligar-se à laminina; (c) interage com N-glicanas de TLR2 e TLR4 e promove ativação celular; (d) estimula macrófagos a produzirem mediadores pró-inflamatórios como IL- 12, TNF-? e NO; (e) promove a polarização M1 de macrófagos; (f) induz atividade fungicida em neutrófilos, bem como formação de NETs e supressão da apoptose, eventos que se mostraram dependentes da síntese de novo de proteínas pelos neutrófilos estimulados. Dada a relevância das atividades biológicas de PCN, promovemos recentemente o silenciamento do gene que codifica essa proteína, através de metodologia que usa RNA anti-sense e transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT). Uma vez PCN silenciada, a levedura perdeu a capacidade de fazer a transição para micélio e diminuiu a resistência à atividade fungicida de macrófagos. A infecção de camundongos com as cepas silenciadas, em comparação com as WT, causou doença de menor gravidade, com carga fúngica reduzida e baixa taxa de mortalidade. Essas observações sugerem de que PCN funcione como um fator de virulência em P. brasiliensis, que afeta a patogênese da infecção. Neste trabalho, ampliamos as ferramentas moleculares de manipulação do fungo e viabilizamos a superexpressão de PCN em leveduras de P. brasiliensis, tendo como objetivos estudar seu papel na virulência e na patogênese da infecção, bem como determinar os mecanismos responsáveis por tais atividades. A inoculação de leveduras que superexpressam PCN (ov-PCN) em camundongos causou doença pulmonar muito grave, em comparação à doença leve e moderada causada por leveduras silenciadas em PCN e leveduras WT, respectivamente. Nesse sentido, nossos esforços se dedicaram à busca dos mecanismos dos mecanismos através dos quais PCN influencia o curso da infecção experimental. Na tentativa de identificar o papel exercido pelo domínio quitinase da PCN, coletamos o sobrenadante de culturas de leveduras ov-PCN e WT. Partículas de quitina presentes nesses sobrenadantes foram purificadas por afinidade à lectina WGA (wheat germ agglutinin). Através de medida da área das partículas capturadas, através de microscopia eletrônica e aplicação do programa ImageJ, verificamos que a superexpressão de PCN resultou em clivagem mais eficiente da quitina da parede de leveduras, uma vez que apenas partículas muito pequenas (mediana das medidas = 2 nm2) foram detectadas, enquanto as áreas das partículas de quitina obtidas de leveduras selvagens (WT) forneceram mediana 3 vezes maior (6 nm2). As partículas de quitina foram então utilizadas para estimular macrófagos a produzirem citocinas. As obtidas de ov-PCN estimularam preponderantemente a secreção da citocina antiinflamatória IL-10, enquanto os macrófagos estimulados com partículas de leveduras WT produziram mais TNF-? e IL-1?, ambas de efeito pró-inflamatório. Esses resultados permitiram a identificação de um mecanismo importante para que a superexpressão de PCN se associe à ocorrência de doença pulmonar muito grave: o microambiente anti-inflamatório criado pelo estímulo de macrófagos por PCN leva ao desenvolvimento de resposta imune não protetora do tipo Th2 e lesões mais graves. Um segundo mecanismo foi identificado ao compararmos a resistência de leveduras ov-PCN e WT às respostas efetoras de macrófagos. A superexpressão de PCN associou-se à maior internalização das leveduras e maior resistência à atividade fungicida exercida por macrófagos. O estudo demonstra que diferentes níveis da expressão de uma quitinase (como PCN) levam à resistência a atividades antifúngicas de macrófagos e a diferentes graus de clivagem de quitina. A clivagem, por sua vez, pode alterar a estrutura da parede celular fúngica e a geração de fragmentos de quitina, cujos tamanhos e concentrações influenciam a produção de citocinas pelos macrófagos. Sob a ação de citocinas pró- ou antiinflamatórias liberadas pelos macrófagos e, consequentemente, a montagem de respostas adaptativas pode ser decisiva para haver suscetibilidade ou resistência à infecção por P. brasiliensis. Este trabalho proporciona um importante avanço no conhecimento do papel de quitinases na resposta anti-fúngica do hospedeiro. / Species of the genus Paracoccidioides spp are thermodymorphic fungi that cause a systemic disease, which is endemic in several regions of the Latin America. The infected individual develops a specific response that, when associated with the high production of TNF-? and IFN- ?, favors resistance to the fungus. Components of some pathogenic fungi were characterized by gene knockdown techniques as important the for fungal virulence. Our group has identified a component of P. brasiliensis, named Paracoccin (PCN); it is a bifunctional protein with an enzymatic domain, endowed with chitinase activity and a lectin domain, which binds GlcNAc and chitin, a GlcNAc polymers. PCN has the following properties: (a) contributes to the fungus growth; (b) promotes the yeast adhesion to the extracellular matrix, by binding to laminina glycans; (c) interacts with TLR2 and TLR4 N-glycans, which triggers cell activation; (d) stimulates macrophages to produce proinflammatory mediators, such as IL-12, TNF-? and NO; (e) promotes the M1 polarization of macrophages; (f) induces the neutrophils fungicidal activity, NETs formation, and suppression of neutrophils apoptosis, which are depending events on the de novo protein synthesis by neutrophils. Given the relevant biological activities exerted by PCN, we have performed recently the silencing of the gene that codes for this protein through a system that uses RNA anti-sense and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT). Once having the PCN gene silenced, yeast lost the ability of doing the transition to mycelium and decreased its resistance to macrophages fungicidal activities. Mice infection with PCN-silenced yeasts, compared to the infected with WT yeasts, exhibited a milder pulmonary disease with reduced fungal burden and low mortality rate. These observations suggest that PCN acts as a P. brasiliensis virulence factor that affects the pathogenesis of the fungal infection. In the present study, we expanded the molecular tools for the fungus manipulation and enabled the overexpression of PCN in P. brasiliensis yeasts, aiming to elucidate the PCN role in the fungus virulence and the infection pathogenesis, as well as determining the responsible mechanisms for the PCN activities. Inoculation of the PCN overexpressing yeasts (ov-PCN) into mice caused a very severe lung disease, compared to the mild and moderate diseases caused by PCN-silenced and WT yeasts, respectively. Then our efforts became dedicated to the search of mechanisms through which PCN influences the course of the experimental fungal disease. In an attempt to identify the role of the PCN chitinase domain, we harvested the supernatant of the ov-PCN and WT yeasts cultures. Chitin particles contained in the supernatants have been captured by affinity to the immobilized WGA (wheat germ agglutinin) lectin. By measuring through electron microscopy and application of the ImageJ program the area of the isolated chitin particles, we verified that the overexpression of PCN resulted in a more efficient cleavage of whole chitin molecules contained in the yeast cell wall, since only very small particles (median of the measurements = 2 nm2) were detected, while the the chitin particles areas obtained from WT-yeasts provided a median 3 fold higher (6 nm2). Then, the preparations of chitin particles were taken to stimulate macrophages to produce cytokines. The particles obtained from ov-PCN have stimulated preponderantly the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10, whereas the macrophages stimulated with WT yeast particles have produced higher concentrations of TNF-? and IL-1?, which are known proinflammatory cytokines. These results allowed the identification of an important mechanism for the association of PCN overexpression to the occurrence of very severe pulmonary disease: the anti-inflammatory microenvironment created by the macrophages stimulation with PCN leads to the development of a non-protective Th2-type immune response and the more severe pulmonary injury. A second mechanism was identified as implicated in the severity of the lung disease associated to PCN overexpression. We compared the sensitivity of ov-PCN and WT yeasts to macrophages effector functions. PCN overexpressing yeasts were better internalized by macrophages and more resistant to the fungicidal activity of these cells, events that contributes for the high pulmonary fungal load verified in mice infected with ov-PCN yeasts. The study demonstrates that different levels of a chitinase (PCN) expression and enzymatic activity lead yeasts to change their sensitivity to macrophages antifungal activities as well as to different grades of chitin cleavage. The cleavage, in its turn, leads to changes in the structure of the fungal cell wall and generation of chitin fragments, whose sizes and concentrations influence the cytokines production by macrophages. Under the influence of pro-inflammatory or anti-inflammatory cytokines released by macrophages, the mounted adaptative responses can be decisive in conferring susceptibility or resistance to the P. brasiliensis infection. This study provides an important advance in the knowledge on the role of a chitinase in the host antifungal response.

Espécies do gênero Paracoccidioides spp são fungos patogênicos, termodimórficos, agentes etiológicos de doença endêmica em diversas regiões da América Latina. O indivíduo infectado desenvolve uma resposta específica que, quando associada à alta produção de TNF-? e IFN-?, favorece a resistência ao fungo. Componentes de alguns fungos patogênicos foram caracterizados, por técnicas de knockdown gênico, como importantes para a virulência fúngica. Nosso grupo identificou paracoccina (PCN) como um componente de leveduras de P. brasiliensis; trata-se de uma proteína com um domínio enzimático, dotado de atividade quitinase e um domínio lectínico, ligante de GlcNAc. PCN é dotada das seguintes propriedades: (a) contribui para o crescimento do fungo; (b) promove a adesão da levedura à matriz extracelular, por ligar-se à laminina; (c) interage com N-glicanas de TLR2 e TLR4 e promove ativação celular; (d) estimula macrófagos a produzirem mediadores pró-inflamatórios como IL- 12, TNF-? e NO; (e) promove a polarização M1 de macrófagos; (f) induz atividade fungicida em neutrófilos, bem como formação de NETs e supressão da apoptose, eventos que se mostraram dependentes da síntese de novo de proteínas pelos neutrófilos estimulados. Dada a relevância das atividades biológicas de PCN, promovemos recentemente o silenciamento do gene que codifica essa proteína, através de metodologia que usa RNA anti-sense e transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT). Uma vez PCN silenciada, a levedura perdeu a capacidade de fazer a transição para micélio e diminuiu a resistência à atividade fungicida de macrófagos. A infecção de camundongos com as cepas silenciadas, em comparação com as WT, causou doença de menor gravidade, com carga fúngica reduzida e baixa taxa de mortalidade. Essas observações sugerem de que PCN funcione como um fator de virulência em P. brasiliensis, que afeta a patogênese da infecção. Neste trabalho, ampliamos as ferramentas moleculares de manipulação do fungo e viabilizamos a superexpressão de PCN em leveduras de P. brasiliensis, tendo como objetivos estudar seu papel na virulência e na patogênese da infecção, bem como determinar os mecanismos responsáveis por tais atividades. A inoculação de leveduras que superexpressam PCN (ov-PCN) em camundongos causou doença pulmonar muito grave, em comparação à doença leve e moderada causada por leveduras silenciadas em PCN e leveduras WT, respectivamente. Nesse sentido, nossos esforços se dedicaram à busca dos mecanismos dos mecanismos através dos quais PCN influencia o curso da infecção experimental. Na tentativa de identificar o papel exercido pelo domínio quitinase da PCN, coletamos o sobrenadante de culturas de leveduras ov-PCN e WT. Partículas de quitina presentes nesses sobrenadantes foram purificadas por afinidade à lectina WGA (wheat germ agglutinin). Através de medida da área das partículas capturadas, através de microscopia eletrônica e aplicação do programa ImageJ, verificamos que a superexpressão de PCN resultou em clivagem mais eficiente da quitina da parede de leveduras, uma vez que apenas partículas muito pequenas (mediana das medidas = 2 nm2) foram detectadas, enquanto as áreas das partículas de quitina obtidas de leveduras selvagens (WT) forneceram mediana 3 vezes maior (6 nm2). As partículas de quitina foram então utilizadas para estimular macrófagos a produzirem citocinas. As obtidas de ov-PCN estimularam preponderantemente a secreção da citocina antiinflamatória IL-10, enquanto os macrófagos estimulados com partículas de leveduras WT produziram mais TNF-? e IL-1?, ambas de efeito pró-inflamatório. Esses resultados permitiram a identificação de um mecanismo importante para que a superexpressão de PCN se associe à ocorrência de doença pulmonar muito grave: o microambiente anti-inflamatório criado pelo estímulo de macrófagos por PCN leva ao desenvolvimento de resposta imune não protetora do tipo Th2 e lesões mais graves. Um segundo mecanismo foi identificado ao compararmos a resistência de leveduras ov-PCN e WT às respostas efetoras de macrófagos. A superexpressão de PCN associou-se à maior internalização das leveduras e maior resistência à atividade fungicida exercida por macrófagos. O estudo demonstra que diferentes níveis da expressão de uma quitinase (como PCN) levam à resistência a atividades antifúngicas de macrófagos e a diferentes graus de clivagem de quitina. A clivagem, por sua vez, pode alterar a estrutura da parede celular fúngica e a geração de fragmentos de quitina, cujos tamanhos e concentrações influenciam a produção de citocinas pelos macrófagos. Sob a ação de citocinas pró- ou antiinflamatórias liberadas pelos macrófagos e, consequentemente, a montagem de respostas adaptativas pode ser decisiva para haver suscetibilidade ou resistência à infecção por P. brasiliensis. Este trabalho proporciona um importante avanço no conhecimento do papel de quitinases na resposta anti-fúngica do hospedeiro. / Species of the genus Paracoccidioides spp are thermodymorphic fungi that cause a systemic disease, which is endemic in several regions of the Latin America. The infected individual develops a specific response that, when associated with the high production of TNF-? and IFN- ?, favors resistance to the fungus. Components of some pathogenic fungi were characterized by gene knockdown techniques as important the for fungal virulence. Our group has identified a component of P. brasiliensis, named Paracoccin (PCN); it is a bifunctional protein with an enzymatic domain, endowed with chitinase activity and a lectin domain, which binds GlcNAc and chitin, a GlcNAc polymers. PCN has the following properties: (a) contributes to the fungus growth; (b) promotes the yeast adhesion to the extracellular matrix, by binding to laminina glycans; (c) interacts with TLR2 and TLR4 N-glycans, which triggers cell activation; (d) stimulates macrophages to produce proinflammatory mediators, such as IL-12, TNF-? and NO; (e) promotes the M1 polarization of macrophages; (f) induces the neutrophils fungicidal activity, NETs formation, and suppression of neutrophils apoptosis, which are depending events on the de novo protein synthesis by neutrophils. Given the relevant biological activities exerted by PCN, we have performed recently the silencing of the gene that codes for this protein through a system that uses RNA anti-sense and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT). Once having the PCN gene silenced, yeast lost the ability of doing the transition to mycelium and decreased its resistance to macrophages fungicidal activities. Mice infection with PCN-silenced yeasts, compared to the infected with WT yeasts, exhibited a milder pulmonary disease with reduced fungal burden and low mortality rate. These observations suggest that PCN acts as a P. brasiliensis virulence factor that affects the pathogenesis of the fungal infection. In the present study, we expanded the molecular tools for the fungus manipulation and enabled the overexpression of PCN in P. brasiliensis yeasts, aiming to elucidate the PCN role in the fungus virulence and the infection pathogenesis, as well as determining the responsible mechanisms for the PCN activities. Inoculation of the PCN overexpressing yeasts (ov-PCN) into mice caused a very severe lung disease, compared to the mild and moderate diseases caused by PCN-silenced and WT yeasts, respectively. Then our efforts became dedicated to the search of mechanisms through which PCN influences the course of the experimental fungal disease. In an attempt to identify the role of the PCN chitinase domain, we harvested the supernatant of the ov-PCN and WT yeasts cultures. Chitin particles contained in the supernatants have been captured by affinity to the immobilized WGA (wheat germ agglutinin) lectin. By measuring through electron microscopy and application of the ImageJ program the area of the isolated chitin particles, we verified that the overexpression of PCN resulted in a more efficient cleavage of whole chitin molecules contained in the yeast cell wall, since only very small particles (median of the measurements = 2 nm2) were detected, while the the chitin particles areas obtained from WT-yeasts provided a median 3 fold higher (6 nm2). Then, the preparations of chitin particles were taken to stimulate macrophages to produce cytokines. The particles obtained from ov-PCN have stimulated preponderantly the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10, whereas the macrophages stimulated with WT yeast particles have produced higher concentrations of TNF-? and IL-1?, which are known proinflammatory cytokines. These results allowed the identification of an important mechanism for the association of PCN overexpression to the occurrence of very severe pulmonary disease: the anti-inflammatory microenvironment created by the macrophages stimulation with PCN leads to the development of a non-protective Th2-type immune response and the more severe pulmonary injury. A second mechanism was identified as implicated in the severity of the lung disease associated to PCN overexpression. We compared the sensitivity of ov-PCN and WT yeasts to macrophages effector functions. PCN overexpressing yeasts were better internalized by macrophages and more resistant to the fungicidal activity of these cells, events that contributes for the high pulmonary fungal load verified in mice infected with ov-PCN yeasts. The study demonstrates that different levels of a chitinase (PCN) expression and enzymatic activity lead yeasts to change their sensitivity to macrophages antifungal activities as well as to different grades of chitin cleavage. The cleavage, in its turn, leads to changes in the structure of the fungal cell wall and generation of chitin fragments, whose sizes and concentrations influence the cytokines production by macrophages. Under the influence of pro-inflammatory or anti-inflammatory cytokines released by macrophages, the mounted adaptative responses can be decisive in conferring susceptibility or resistance to the P. brasiliensis infection. This study provides an important advance in the knowledge on the role of a chitinase in the host antifungal response.

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Esta é uma importante cultura para Brasil, principalmente no estado do Pará, no entanto sua produção tem diminuído devido à doença conhecida como podridão da raiz (Fusariose) causada pelo fungo Fusarium solani f. sp. Piperis. Neste trabalho, o cDNA da PnPR-4 foi usado para a produção da proteína recombinante, chamada de PnPR-4. O quadro de leitura aberta (ORF) da PnPR-4, foi amplificado por meio de ensaio de PCR e, em seguida a ORF foi ligada ao vetor de expressão pET-29(a) e introduzido, por eletroporação, em E. coli Rosetta (DE3). Nas células transformadas, a produção da proteína de interesse foi induzida por IPTG 1mM à 37°C por 5h. Após a produção, a atividade enzimática da proteina recombinante PnPR-4 foi avaliada pela detecção da atividade enzimática de quitinase em gel de poliacrilamida após eletroforese. A atividade foi avaliada em pH: 5.0 e pH:7.8 para demonstra a estabilidade da proteína recombinante. A massa molecular da PnPR-4 foi de 13.5 kDa, estando de acordo com outras PR-4 produzidas pelo sistema de expressão heterologa em sistema bacteriano. No ensaio de atividade enzimática, a PnPR-4 apresentou atividade quitinolitica, tanto em pH:5.0 ou pH:7.8. Esta é uma característica de chitinases de plantas, atividade em uma ampla faixa de pHs. Onde, a atividade ótima ocorre entre pH: 3.0 e 5.0. Na proteína recombianante, o pH ótimo foi 5.0, no entato ela teve atividade em pH 7.8, demonstrando a estabilidade da enzima. Estes resultados mostram que o sistema bacteriano de expressão heteróloga é eficaz para a produção da proteína recombinante PnPR-4, que é uma enzima com atividade quitinolitica e altamente estável. Assim, a PnPR-4 é uma nova enzima que pode ser usado em biotecnologia vegetal no combate contra fungos patogênicos da planta. / Pathogenesis-related (PR) proteins are plant proteins that are induced in response to pathogen attack. PR proteins are grouped into 17 independent families, PR-1 to PR-17. Antifungal and enzymatic activities have been described for some of these proteins. Among them, the PR-4 family comprises class I and II of plant chitinases. cDNA clone that encode a PR-4 of the class II, designated as PnPR-4, was previously isolated, in others studies, from Piper nigrum L. (black pepper). This is an important crop for Brazil, mainly in Pará state, however its production has decreased because root rot (Fusariose) disease caused by fungus Fusarium solani f. sp. Piperis. In this study, PnPR-4 cDNA clone was used for production of the recombinant protein, named PnPR-4, by bacterial expression system. Open Read Frame (ORF) of the PnPR-4 protein, was amplified from the cDNA clone by PCR assays, then ORF was linked in the expression vector pET-29(a) and introduced, by eletroporation, into E. coli Rosetta (DE3). The production of target protein, in transformed cells, was induced by 1 mM IPTG, at 37°C for 5h. After production, enzymatic activity of recombinant PnPR-4 was evaluated by Detection of Chitinase Activity after Gel Electrophoresis Polyacrylamide. Activity was evaluated in pH: 5.0 and pH: 7.8 for showing the stability of the recombinant protein. Molecular mass of Recombinant protein, PnPR-4, was 13.5kDa, according with others PR-4 produced by heterologous expression in bacterial system. In assay of enzymatic activity, PnPR-4 presented chitinolytic activity, both in pH: 5.0 or 7.8. This is a characteristic of plant quitinases, activity in a broad range of pHs. Where, optimal activity occurs between pH: 3.0 and 5.0. For PnPR-4, the optimal pH was 5.0, however in pH: 7.8 the recombinant protein had activity, demonstrating the stability of enzyme. These results showing that bacterial system of heterologous expression is effective for production of the recombinant protein PnPR-4, that it is an enzyme with chitinolytic activity and highly stable. Thus, PnPR-4, is now, a new enzyme which can be used in plant biotechnology in the combat against plant's pathogenic fungi.

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento. / The present Tesis aimed: (1) to determine an efficient method of genetic transformation by particle bombardment to obtain transgenic plants of Brazilian barley cultivars and (2) to identify a gene coding for chitinase that could confer resistance to barley against the pathogen Bipolaris sorokiniana. Calli cultures derived from immature scutella of Brazilian barley cultivars MN-599 e MN-698 (American Beverage Company, AMBEV) were bombarded with tungsten particles and analyzed for gusA reporter gene expression by GUS histochemical assay, embryogenic structures induction and plant regeneration. Physical and biological biolistic conditions analyzed included two promoter regions regulating the gusA gene, two particle bombardment devices, different helium pressures, distances between target tissues and the initial position of particles, number of shots and use of osmotic pre- and post-treatment of tissues. In the present work there were observed high numbers of blue spots per callus, embryogenic calli and somatic embryos induction with a frequency until 58.3% and the regeneration of 60 plants, being 43 from bombarded calli. The best conditions were obtained with the employment of the Adh promoter and its first intron (pNGI plasmid), Particle Inflow Gun (PIG) device, 14.8 cm of distance, 2 shots per plate and osmotic treatment of tissues with 0.2 M mannitol and 0.2 M sorbitol during 4-5 hours prior to and 17-19 hours after bombardments. Leaves from 3 out of 43 regenerated plants showed positive GUS activity in histochemical assays. The use of primers defined from chitinase genes described in literature resulted in the amplification of two fragments with approximately 700 and 500 bp from genomic DNA of MN-599 e MN-698 barley cultivars and one fragment, with approximately 500 bp, from Trichoderma sp. strain A4c genomic DNA. These fragments were purified from agarose gel and manual and automatically sequenced. Fragments of 700 and 500 bp from cv. MN-599 were identified as chitinase genes of barley and fragment of 500 bp Trichoderma sp. A4c presented no homology with chitinase sequences deposited in the EMBL/GenBank. The use of new primers representing conserved chitinase sequences of Metarhizium anisopliae resulted in the amplification of three fragments from genomic DNA of Trichoderma sp. strain A4b. These fragments should be purified and sequenced

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento. / The present Tesis aimed: (1) to determine an efficient method of genetic transformation by particle bombardment to obtain transgenic plants of Brazilian barley cultivars and (2) to identify a gene coding for chitinase that could confer resistance to barley against the pathogen Bipolaris sorokiniana. Calli cultures derived from immature scutella of Brazilian barley cultivars MN-599 e MN-698 (American Beverage Company, AMBEV) were bombarded with tungsten particles and analyzed for gusA reporter gene expression by GUS histochemical assay, embryogenic structures induction and plant regeneration. Physical and biological biolistic conditions analyzed included two promoter regions regulating the gusA gene, two particle bombardment devices, different helium pressures, distances between target tissues and the initial position of particles, number of shots and use of osmotic pre- and post-treatment of tissues. In the present work there were observed high numbers of blue spots per callus, embryogenic calli and somatic embryos induction with a frequency until 58.3% and the regeneration of 60 plants, being 43 from bombarded calli. The best conditions were obtained with the employment of the Adh promoter and its first intron (pNGI plasmid), Particle Inflow Gun (PIG) device, 14.8 cm of distance, 2 shots per plate and osmotic treatment of tissues with 0.2 M mannitol and 0.2 M sorbitol during 4-5 hours prior to and 17-19 hours after bombardments. Leaves from 3 out of 43 regenerated plants showed positive GUS activity in histochemical assays. The use of primers defined from chitinase genes described in literature resulted in the amplification of two fragments with approximately 700 and 500 bp from genomic DNA of MN-599 e MN-698 barley cultivars and one fragment, with approximately 500 bp, from Trichoderma sp. strain A4c genomic DNA. These fragments were purified from agarose gel and manual and automatically sequenced. Fragments of 700 and 500 bp from cv. MN-599 were identified as chitinase genes of barley and fragment of 500 bp Trichoderma sp. A4c presented no homology with chitinase sequences deposited in the EMBL/GenBank. The use of new primers representing conserved chitinase sequences of Metarhizium anisopliae resulted in the amplification of three fragments from genomic DNA of Trichoderma sp. strain A4b. These fragments should be purified and sequenced

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento. / The present Tesis aimed: (1) to determine an efficient method of genetic transformation by particle bombardment to obtain transgenic plants of Brazilian barley cultivars and (2) to identify a gene coding for chitinase that could confer resistance to barley against the pathogen Bipolaris sorokiniana. Calli cultures derived from immature scutella of Brazilian barley cultivars MN-599 e MN-698 (American Beverage Company, AMBEV) were bombarded with tungsten particles and analyzed for gusA reporter gene expression by GUS histochemical assay, embryogenic structures induction and plant regeneration. Physical and biological biolistic conditions analyzed included two promoter regions regulating the gusA gene, two particle bombardment devices, different helium pressures, distances between target tissues and the initial position of particles, number of shots and use of osmotic pre- and post-treatment of tissues. In the present work there were observed high numbers of blue spots per callus, embryogenic calli and somatic embryos induction with a frequency until 58.3% and the regeneration of 60 plants, being 43 from bombarded calli. The best conditions were obtained with the employment of the Adh promoter and its first intron (pNGI plasmid), Particle Inflow Gun (PIG) device, 14.8 cm of distance, 2 shots per plate and osmotic treatment of tissues with 0.2 M mannitol and 0.2 M sorbitol during 4-5 hours prior to and 17-19 hours after bombardments. Leaves from 3 out of 43 regenerated plants showed positive GUS activity in histochemical assays. The use of primers defined from chitinase genes described in literature resulted in the amplification of two fragments with approximately 700 and 500 bp from genomic DNA of MN-599 e MN-698 barley cultivars and one fragment, with approximately 500 bp, from Trichoderma sp. strain A4c genomic DNA. These fragments were purified from agarose gel and manual and automatically sequenced. Fragments of 700 and 500 bp from cv. MN-599 were identified as chitinase genes of barley and fragment of 500 bp Trichoderma sp. A4c presented no homology with chitinase sequences deposited in the EMBL/GenBank. The use of new primers representing conserved chitinase sequences of Metarhizium anisopliae resulted in the amplification of three fragments from genomic DNA of Trichoderma sp. strain A4b. These fragments should be purified and sequenced

Agricultores e técnicos envolvidos na citricultura orgânica procuram desenvolver sistemas de produção com maior atividade microbiana no solo. Dessa maneira, esperam obter benefícios dos processos que ocorrem no solo, entre eles, o controle natural de pragas e doenças. Porém, são poucos os estudos sobre a influência desse tipo de manejo sobre a microbiota do solo, em especial sobre os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) e o patógeno Phytophthora parasitica. Os objetivos dessa tese foram: avaliar a colonização micorrízica e conhecer a diversidade de FMAs nos sistemas de produção convencional e orgânico de citros; avaliar a aplicação de benomyl e da radiação γ na obtenção de testemunhas não micorrizadas para estudo de interação de comunidade de FMAs nativos e P. parasitica; verificar a capacidade indutora de resistência local e sistêmica dos FMAs nativos a P. parasitica; estudar atividade da quitinase no sistema radicular de limão 'Cravo' colonizado por fungos micorrízicos nativos. Foram realizadas amostragens em dois sistemas de produção de citros em São Paulo, um convencional e um orgânico. A riqueza e a diversidade de espécies de FMAs foram maiores no manejo orgânico. No entanto, a porcentagem de colonização micorrízica nas plantas no campo não variou com o tipo de manejo. Em casa de vegetação, experimentos com plantas de limão 'Cravo' (Citrus limonia) mostraram que a radiação γ foi mais adequada que a aplicação de benomyl na obtenção de testemunhas não micorrizadas para estudo de interação P. parasitica- FMAs nativos de agroecossistemas de produção de laranja. Também em casa de vegetação, foi realizado um experimento com raiz dividida de plantas de limão 'Cravo'. Não foi possível avaliar a capacidade indutora de resistência dos fungos micorrízicos arbusculares nativos porque não houve desenvolvimento da podridão de raízes nas plantas de limão 'Cravo' após a infestação com P. parasitica. Discute-se a interação de patógenos de raiz do solo natural e os FMAs nativos porque o solo natural dos sistemas de produção convencional e orgânico promoveram diferentes respostas de crescimento local e sistêmico das raízes das plantas micorrizadas. A atividade de quitinase foi igual nas raízes de plantas micorrizadas e não micorrrizadas cultivadas em solos dos sistemas de produção convencional e orgânico. Porém, a associação micorrízica aumentou localmente a proteína total nas raízes das plantas. / Farmers and technicians involved with organic citriculture try to develop systems with high microbial activity in soil. In this way, they expect to obtain benefits from processes that occur in soil, as natural control of pests and diseases. However, there are few studies about the influence of this type of management on soil microbiota, specially on the arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and the pathogen Phytophthora parasitica. The objectives of this thesis were: to evaluate mycorrhizal colonization and diversity of AMF in citrus conventional and organic farming; to evaluate benomyl application and γ radiation to obtain non-mycorrhizal controls for study of interaction between indigenous AMF and P. parasitica; to verify local and systemic capacity of indigenous AMF to induce resistance against P. parasitica; to study chitinase activity in roots of 'Rangpur' lime colonized by indigenous AMF. Samplings were carried out in two citrus systems in São Paulo, one conventional and one organic farming. The richness and the diversity of AMF species were higher in the organic farming. In greenhouse, experiments with 'Rangpur' lime (Citrus limonia) showed that γ radiation was better than benomyl to obtain non-mycorrhizal control for studies of interaction between P. parasitica-indigenous AMF from orange agroecosystems. In greenhouse also, a split root experiment with 'Rangpur' lime was carried out. It was not possible to evaluate the indigenous AMF capacity to induce resistance because no root rot developed in 'Rangpur' lime plants after inoculation with P. parasitica. We discuss the interaction between root pathogens in natural soil and indigenous AMF because natural soil from conventional e organic farming promoted different local and systemic root growth responses in mycorrhizal plants. Chitinase activity was similar in roots of mycorrhizal and non-mycorrhizal plants grown in conventional and organic farming soils. However, mycorhizal association increased local protein content in roots.

P. americana e T. molitor são capazes de secretar β-1,3-glucanases no tubo digestivo, pelas glândulas salivares e pelo epitélio do ventrículo, respectivamente. As laminarinases majoritárias de P. americana (LIQ1, 42kDa; LAM_P, 45kDa), A. flavolineata (LAM_A, 45kDa) e T. molitor (LAM_T, 50kDa) foram purificadas até a homogeneidade. Essas enzimas têm diferentes especificidades, padrões de ação e resíduos envolvidos em catálise, fazendo parte dos E.C. 3.2.1.6 - endo-β-1,3(4)-glucanase (LIQ1), E.C. 3.2.1.39 - endo-β-1,3-glucanase (LAM_P) ou E.C. 3.2.1.58 - exo-β-1,3-glucanase (LAM_A e LAMT). O papel dessas enzimas é digerir β-glucanas de fungos e de cereais. LAM_P e LAMA são inibidas por laminarina, pela formação de complexos enzima-substrato não-produtivos. LIQ1, LAM_P e LAM_A são enzimas processivas, com diferentes graus de ataque múltiplo e produzem série distintas de oligossacarídeos. LAM_A possui um sítio acessório de ligação para laminarina, o qual pode estar envolvido no mecanismo de processividade. Quitinases digestivas de insetos podem ser diferentes das descritas até o momento. A. flavolineata e T. molitor possuem sistemas celulásicos completos. Os três insetos apresentam proteínas de baixo peso molecular capazes de ligar-se a celulose ou a pachyman. O ancestral dos hexapoda provavelmente possuía β-1,3 e β-1,3(4) glucanases digestivas associadas a um hábito detritívoro. / P. americana salivary glands and T. molitor midgut epithelium actively secrete laminarinases into the midgut. The major laminarinases from P. americana (LIQ1, 42kDa and LAM_P, 45kDa), A. flavolineata (LAM_A, 45kDa) and T molitor (LAM_T, 50kDa) were purified until homogeneity. These enzymes have different specificities, action patterns and activesite catalytic groups, and correspond to E.C.s 3.2.1.6 - endo-β-1,3(4)-glucanase (LIQ1), 3.2.1.39 - endo-β-1,3-glucanase (LAM_P) or 3.2.1.58 -exo-β-1,3-glucanase (LAM_A and LAM_T). Their physiological role is fungai and cereal β-glucan digestion. LAM_P and LAM_A are inhibited by excess substrate (non-productive enzyme-substrate complexes). LIQ1, LAM_P and LAMA have different multiple attack degrees and produce different oligosaccharides. LAM_A has a second substrate binding site, probably involved with processivity. T. molitor digestive chitinase is different from other insect chitinases. A. flavolineata and T. molitor can hydrolyse cristalline cellulose efficiently. The three studied insects have cellulose or pachyman-binding proteins with low molecular weights. Hexapoda ancestors probably had digestive β-1,3 and β-1,3(4)-glucanases and a detritivore habit.

Bactérias quitinolíticas são autóctones do ecossistema marinho e tem um importante papel no processo de degradação de quitina. Relativamente pouco é conhecido sobre a diversidade e potencial enzimático de bactérias quitinolíticas isoladas de ambientes tropicais costeiros. Amostras de água do mar e de plâncton foram coletadas no Canal de São Sebastião, Baixada Santista e Ubatuba. As bactérias quitinolíticas foram enumeradas e isoladas em meio mínimo contendo quitina coloidal e caracterizadas através de métodos fenotípicos e genotípicos. As maiores contagens de bactérias quitinolíticas foram observadas em amostras de água do mar e plâncton coletadas na Baixada Santista. A diversidade de bactérias quitinolíticas e o potencial de produção de quitinases foram influenciados pelo nível de contaminação fecal presente no ecossistema marinho. Uma maior diversidade foi encontrada em ambiente com médio e baixo impacto antropogênico, mas bactérias quitinolíticas isoladas de ambiente com alta atividade antropogênica mostraram os maiores valores de produção de quitinases. / Chitinolytic bacteria are autochthonous in marine ecosystems and have an important role in chitin degradation process. A very little is know about the diversity and enzymatic potential of chitinolytic bacteria isolated from coastal tropical environments. Seawater and plankton samples were collected at Canal de São Sebastião, Baixada Santista and Ubatuba. Chitinolytic bacteria were counted and isolated in minimal media containing colloidal chitin and characterized using phenotypic and genotypic methods. Highest counts of chitinolytic bacteria were observed in seawater and plankton samples collected at Baixada Santista. The diversity of chitinolytic bacteria and the potential of chitinases production were influenced by the level of fecal contamination present in the marine ecosystem. Highest diversity was found in environment with medium and low anthropogenic impact, but chitinolytic bacteria isolated from environment with high anthropogenic influences showed highest chitinases production.

Plants respond to insect and pathogen attack by inducing and accumulating a large set of defense proteins. Colonization of sugarcane stalk by opportunistic fungi, such as Fusarium verticillioides and Colletotrichum falcatum, usually occurs after Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Cambridae) caterpillars attack increasing the damage caused by the borer. Two homologous of BARWIN protein were identified in sugarcane, SUGARWIN1 and SUGARWIN2. Their gene expression is induced in response to wound and Diatraea saccharalis damage. However, the recombinant SUGARWIN protein does not affect insect development; but promotes significant morphological and physiological changes in Fusarium verticillioides and Colletotrichum falcatum, which lead to fungal cell death via apoptosis, indicating that SUGARWINs may work as a first layer of defense against the fungi infection. In this study, we deepen our understanding of the role of SUGARWINs in plant defense and the molecular mechanisms by which these proteins affect fungi by elucidating their molecular targets. Our results show that SUGARWINs play an important role in plant defense against opportunistic pathogens. We demonstrated that SUGARWINs are induced by C. falcatum, and the induction of SUGARWINs can vary among sugarcane varieties. The sugarcane variety exhibiting the highest level of SUGARWIN induction exhibited a considerable reduction in C. falcatum infection. Furthermore, SUGARWIN1 exhibited ribonuclease and chitinase activity, whereas SUGARWIN2 exhibited only chitinase activity. This variable enzymatic specificity seems to be the result of divergent amino acid composition within the substrate-binding site. Additionally, plants attacked by insects and pathogens display profound physiological, morphological and chemical changes or adaptations, which may result in organism attraction or avoidance. In this study, we also aimed to understand the insect-fungi association in sugarcane and the role of fungal volatile compounds in this association. Our results have shown that D. saccharalis positively influences C. falcatum infection on sugarcane, inducing a fast growing when compared to C. falcatum treatment without D. saccharalis attack. In addition, both fungi, C. falcatum and F. verticillioides, have been shown a double effect on D. saccharalis caterpillar, they promoted a strong attraction for insects due volatile organic compound emission and positively influenced D. saccharalis feeding and weight gain in diets supplemented with fungi. Fungal volatile organic compounds from C. falcatum and F. verticillioides were identified and quantified; acoradiene and acorenol were specifically induced by the fungi. These data suggest a synergistic interaction, mediated by organic volatile compounds, between D. saccharalis and the fungi C. falcatum and F. verticillioides in sugarcane. / As plantas respondem ao ataque de insetos e patógenos induzindo e acumulando um grande conjunto de proteínas de defesa. A colonização do caule de cana por fungos oportunistas, como Fusarium verticillioides e Colletotrichum falcatum, geralmente ocorre após o ataque de lagartas de Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Cambridae), resultando no aumento do dano causado pelo inseto. Dois homólogos da proteína BARWIN foram identificados em cana-de-açúcar, SUGARWIN1 e SUGARWIN2. A expressão desses genes é induzida em resposta ao ferimento mecânico e ao ataque de Diatraea saccharalis, entretanto, a proteína não afeta o desenvolvimento do inseto, mas promove alterações morfológicas e fisiológicas significativas em Fusarium verticillioides e Colletotrichum falcatum, causando a morte destes fungos por apoptose. Esses dados indicam que as SUGARWINs podem funcionar como uma defesa inicial contra a infecção fúngica. Neste estudo, aprofundamos nosso entendimento do papel das SUGARWINs na defesa de plantas e os mecanismos moleculares pelos quais essas proteínas afetam os fungos, elucidando seus alvos moleculares. Nossos resultados mostraram que as SUGARWINs desempenham um papel importante na defesa da planta contra patógenos oportunistas. Foi demonstrado que essas proteínas também são induzidas por C. falcatum em cana-de-açúcar, e sua indução pode variar entre as variedades de cana-de-açúcar. A variedade de cana-de-açúcar que apresentou o maior nível de indução de SUGARWINs apresentou uma redução considerável na infecção por C. falcatum. Além disso, SUGARWIN1 exibiu atividade de ribonuclease e quitinase, enquanto que SUGARWIN2 exibiu apenas atividade de quitinase. Esta especificidade enzimática parece ser o resultado da composição divergente de aminoácidos no sítio de ligação do substrato. Além disso, as plantas atacadas por insetos e patógenos exibem profundas alterações fisiológicas, morfológicas e químicas ou adaptações, que podem resultar em atração ou repelência do organismo, dessa forma, estudamos também a associação inseto-fungos na cana-de-açúcar, e o papel dos compostos voláteis fúngicos nessa associação. Nossos resultados mostraram que D. saccharalis influencia positivamente a infecção por C. falcatum em cana-de-açúcar, induzindo crescimento rápido do fungo quando comparado ao tratamento com C. falcatum sem ataque de D. saccharalis. Além disso, ambos os fungos, C. falcatum e F. verticillioides, mostraram um efeito duplo sobre lagartas de D. saccharalis, promovendo uma forte atração desses insetos devido à emissão de compostos orgânicos voláteis e influenciando positivamente a alimentação de D. saccharalis e ganho de peso em dietas suplementadas com fungos. Os compostos orgânicos voláteis fúngicos de C. falcatum e F. verticillioides foram identificados e quantificados; acoradieno e acorenol foram especificamente induzidos pelos fungos. Estes dados sugerem uma interação sinergistica, mediada por compostos orgânicos voláteis, entre D. saccharalis e os fungos C. falcatum e F. verticillioides em cana-de-açúcar.