Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctora en Farmacología / El estrés está definido como cualquier estímulo capaz de alterar la homeostasis del organismo, es una reacción fisiológica necesaria para la supervivencia y es la forma que posee el organismo para afrontar una situación agobiante y/o amenazadora. Frente a una situación de estrés, el organismo reacciona generando una respuesta simpaticomimética conocida como “respuesta de pelea o huida”, produciendo un aumento en la liberación de noradrenalina. Todos los organismos vivos son moldeables durante el embarazo y sus primeros momentos de vida. Esto les permite adaptarse al medio ambiente que los rodea sin regirse exclusivamente por su carga genética. El periodo de gestación es una etapa particularmente sensible a situaciones de estrés, pudiéndose generar modificaciones en el ambiente fetal lo que a su vez puede producir una adaptación permanente en el desarrollo postnatal, proceso conocido como programación fetal. Se han encontrado estrechas relaciones entre diversas enfermedades y el ambiente fetal, entre ellas encontramos relaciones entre bajo peso al nacer con un aumento en las muertes por enfermedades coronarias, intolerancia a la insulina y aumento en la presión arterial en la adultez. Nuestro objetivo fue determinar el efecto producido por tratamientos de estrés por frío crónico (4°C/3h/día) aplicado durante todo el periodo de gestación en ratas Sprague-Dawley sobre los transportadores de noradrenalina placentarios, los receptores β-adrenérgicos cardíacos y los cambios sobre la función cardiovascular y metabólica en la descendencia hembra. Se observó que el tratamiento de estrés por frío crónico generó un aumento en las concentraciones de noradrenalina y corticosterona en el plasma de las ratas gestantes junto con una disminución en la funcionalidad de los transportadores de noradrenalina placentarios. No se observaron cambios en el peso de las ratas gestantes, sin embargo se encontró un aumento en el peso de las crías estresadas durante la etapa prenatal. Además, se observó que en crías hembras de 20 días se generó un aumento en la razón de los receptores β1/β2-adrenérgicos cardíacos y que a los 60 días se registra una disminución en la afinidad de estos receptores y un aumento en las áreas y perímetros de los cardiomiocitos junto con un aumento en el peso de sus corazones. Con el objetivo de determinar si el aumento en área y perímetro de los cardiomiocitos afecta la funcionalidad del corazón se sometió a las crías hembras adultas a una sobrecarga adrenérgica crónica (administración de isoproterenol subcutáneo, 125 μg/kg de peso/10 días), encontrándose un aumento en la presencia de extrasístoles lo que generó un 40% de mortalidad en las crías hembras. Finalmente, para determinar los posibles efectos metabólicos del estrés prenatal se realizó un test de tolerancia a la glucosa (administración oral de 2 g de glucosa/kg de peso de una solución al 40%) encontrando resistencia a la insulina en las crías hembras adultas. Tomando en cuenta todo lo anteriormente mencionado, concluimos que la exposición a una situación crónica de estrés por frío durante el periodo de gestación produjo un aumento en las concentraciones de noradrenalina plasmática materna junto con una disminución en la funcionalidad de los transportadores de noradrenalina placentarios. Esto programaría a estos nuevos sujetos, causando una mayor sensibilidad frente a una sobrecarga adrenérgica crónica (40% muerte) junto con presencia de resistencia a la insulina en las crías hembras adultas / Stress is defined as any stimulus capable of altering the homeostasis of the organism, it is a physiological reaction necessary for survival and is the way that has the organism to face a threatening and/or overwhelming situation. Faced with a stressful situation, the organism reacts by generating a sympathomimetic response known as the “fight or flight response”, resulting in an increase in norepinephrine release. All living organisms are moldable during pregnancy and their first moments of life. This allows them to adapt to the environment around them not bound exclusively to their genetic charge. The gestation period is particularly sensitive to a stress situation capable of modifying the fetal environment, which can cause a permanent adaptation on the postnatal development; this is known as fetal programming. Close relationships between various diseases and fetal environment has been found. Among them there are relations between low birth weight with an increase in deaths from coronary diseases, insulin intolerance and increase in blood pressure in adulthood. Our objective was to determine the effect produced by chronic cold stress treatments (4°C/3h/day) applied during the entire period of pregnancy in Sprague-Dawley rats on placental norepinephrine transporters, cardiac β-adrenergic receptors and changes on cardiovascular and metabolic function in the female offspring. An increase in norepinephrine and corticosterone concentrations on plasma of stressed pregnant rats with a decrease in the functionality of placental norepinephrine transporters was observed. No changes were observed in the weight of pregnant rats, however an increase in the weight of pups was found prenatally. In addition, females of 20 days old of the stressed progeny, presented an increase in the ratio of the cardiac β1/β2-adrenergic receptors, and at 60 days old, a decrease in the affinity of these receptors was apparent. An increase in the cardiac cells areas and perimeters along with an increase in the weight of their hearts was also found at 60 days old. To determine what was happening with the functionality of these hearts, we exposed the adult females to a chronic adrenergic overload (administration of a daily subcutaneous isoproterenol injection with 125 μg/kg of weight/10 days). The chronic overload of adrenergic stimulation provoked an increase in the presence of premature beats causing death to 40% of the females pups. To determine possible programming of metabolic effects of prenatal stress, a tolerance glucose test (oral administration of 2g of glucose/kg of weight of a 40% solution) was performed. Results demonstrated that gestational stress programmed a metabolic disturbance that was expressed in the adult progeny, founding insulin resistance in adult females. Therefore, the increase in maternal plasma norepinephrine concentration provoked by the exposure to chronic cold stress during all gestation period caused a decrease in the functionality of the placental norepinephrine transporters. This would be the cause to program the fetus for an increased sensitivity to a chronic adrenergic overload (40% of death) together with the presence of insulin resistance in adult females / Conicyt; Fondecyt

La experiencia perceptual es una de las herramientas más importantes con que cuentan los organismos para adaptarse a su siempre cambiante entorno. Dentro de los sentidos desarrollados a lo largo de la evolución el sistema olfatorio es de los más antiguos y conservados a través de una gran diversidad de especies. Debido a recientes descubrimientos el sistema olfatorio ha tomado un rol importantísimo en el estudio de los mecanismos que dan cuenta no sólo de la olfacción, sino que de la percepción en general. Especial mención merecen, dentro de estos nuevos paradigmas, las llamadas dinámicas temporales. Bajo este concepto se agrupan una serie de ideas que sostienen que el tiempo es un elemento clave en la codificación de estímulos sensoriales. En el Bulbo Olfatorio (BO) las neuronas Mitrales/Penacho (MT) son un modelo muy interesante debido a que en ellas confluyen la actividad eléctrica del epitelio nasal, la modulación que de esta hace el propio BO y la influencia proveniente de estructuras del encéfalo superior. Las oscilaciones del Potencial de Campo Local (PCL) también son elementos que contribuyen a la percepción olfatoria. Esta señal, generada por poblaciones de neuronas, también posee patrones dinámicos y está estrechamente asociada a la descarga de las MT actuando como coordinador de múltiples elementos individuales. Ambos fenómenos, descargas MT y oscilaciones del PCL, se asocian con un tercer elemento también variable en el tiempo: el ciclo respiratorio. Mucha de la evidencia obtenida como respaldo para la existencia de dinámicas temporales en el sistema olfatorio proviene de estudios en invertebrados y peces, contándose con relativamente pocas experiencias en mamíferos. Esto es relevante puesto que el sistema olfatorio de mamíferos es más complejo. Tampoco existen muchos experimentos que contextualicen las descargas MT y las oscilaciones del PCL con el ciclo respiratorio, siendo que este determina de manera importante la temporalidad de la percepción olfatoria en mamíferos. Esta tesis se abocó al estudio de los patrones de respuesta de células MT y PCL frente a la estimulación con odorantes en ratas anestesiadas. La hipótesis propone que las características temporales de la actividad neuronal son parte de la representación de los estímulos en el BO. Su objetivo principal fue estudiar y caracterizar las propiedades temporales de la actividad individual (single-units) y colectiva (PCL) de ensambles neuronales en el bulbo olfatorio de ratas anestesiadas. No obstante lo planteado en la hipótesis, los registros obtenidos se analizaron en un contexto amplio, teniendo en cuenta parámetros clásicos de la respuesta neuronal, como tasa de descarga, en conjunto con algunas de las dinámicas temporales que presentan mayor evidencia de constituir elementos codificantes de la percepción. Los principales métodos utilizados fueron el registro electrofisiológico mediante tétrodos y los análisis a los que fueron obtenidos dichos registros. En una primera etapa se analizó la respuesta de las MT a la estimulación con especial énfasis en sus propiedades temporales y en el nivel de similitud de la respuesta de neuronas vecinas. En una fase posterior se examinó las descargas MT y oscilaciones del PCL a lo largo del ciclo respiratorio. Al analizar la temporalidad de la descarga se observó que las MT poseen un largo período refractario que permanece incluso durante la respuesta a odorantes. La oscilación individual de las MT es prácticamente nula. Lo mismo ocurre con la sincronía neuronal entre neuronas vecinas, la cual en valores muy pequeños. Interesantemente, al comparar la respuesta de pares de MT vecinas se demostró que cada una de las células posee un espectro de preferencia por odorantes individual que difiere del de neuronas vecinas a pesar de tener una inervación aferente idéntica. En una segunda etapa se evaluó de manera más completa la modulación que ejerce el ciclo respiratorio sobre la descarga MT y las oscilaciones del PCL. La descarga durante el ciclo fue sometida a una transformación vectorial para su análisis. Para cada MT se obtuvo el ángulo y la magnitud de la descarga durante el ciclo. Las MT descargan preferentemente durante la transición espiración/inspiración. La población MT como un todo no mostró variaciones significativas con la estimulación ni entre distintos odorantes. Tampoco hubo diferencias en la distribución de magnitudes significativas ni preferencia de fase. Individualmente las MT mostraron cambios en fase y/o magnitud dependientes de la identidad del estímulo. El PCL fue analizado diferencialmente para sus componentes Beta () y Gamma (). La actividad Gamma es significativamente mayor al inicio de la espiración. Beta es más frecuente en la mitad de la inspiración. Se observaron distintos patrones de respuestas a la estimulación. Estas consistieron principalmente en aumento de y disminución de . Al igual que para la descarga MT no se pudo observar cambio en el patrón oscilatorio en la respuesta del PCL como un todo, sino más bien variaciones individuales dependientes de la identidad del estímulo. No hubo dos sitios que se comportaran del mismo modo para todos los estímulos. Este trabajo muestra, en primera instancia, que la descarga MT es mucho más diversa y compleja de lo supuesto únicamente por sus aferencias glomerulares. Neuronas vecinas tienen una preferencia por odorantes muy disímil. La actividad oscilatoria y sincrónica es muy baja a este nivel lo que sugiere que no son mecanismos utilizados por el BO o por lo menos no a nivel de vecindad neuronal. Al analizar la modulación que ejerce la respiración sobre la actividad del BO se encontró que la población total se comporta relativamente indiferente a la estimulación. Sin embargo, al hacer un análisis individual se verifican cambios a nivel individual tanto para MT como para las oscilaciones del PCL. En su conjunto este trabajo muestra que la actividad neuronal a nivel de MT y PCL es más compleja que lo mostrado para otras regiones del BO y para otros organismos como invertebrados. Es posible que esa complejidad se utilice para codificar una percepción más diversa y robusta.

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La deposición excesiva de proteínas de matriz extracelular (MEC) se conoce como fibrosis y es una de las características de las enfermedades musculares degenerativas como la distrofia muscular de Duchenne (DMD). En esta enfermedad, la función muscular se pierde cuando las miofibras son reemplazadas por deposición de colágeno y otras proteínas de MEC. Entre los factores que desencadenan la fibrosis muscular se encuentran el Factor de Crecimiento Transformante tipo (TGF- ) y Angiotensina II (Ang II), éste último perteneciente al Sistema Renina-Angiotensina (RAS). Los principales efectos biológicos ejercidos por Ang II están mediados a través de los receptores tipo 1 y tipo 2 para Ang II denominados AT-1 y AT-2. El receptor AT-1 es responsable de mediar los efectos fibróticos dependientes de Ang II mientras que AT-2 participa como inductor de los efectos antifibróticos. En fibrosis de tejidos cardiaco, pulmonar y renal, TGF- 1 aumenta los niveles de AT-1 y AT-2, adicionando mayor complejidad a los mecanismos que regulan la fibrosis. Los efectos de TGF- 1 sobre los niveles de los receptores de Ang II en el músculo esquelético aún no se conocen. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de TGF- 1 sobre los niveles proteicos de los receptores AT-1 y AT-2 en mioblastos C2C12 y en músculo esquelético de ratón. Los resultados que se obtuvieron de los análisis in vitro en células musculares esqueléticas expuestas a TGF-b1, mostraron un aumento en los niveles proteicos de AT-2 de una manera dependiente de la dosis de TGF- 1 con un efecto máximo a las 48 h en paralelo a la inducción de fibrosis determinada por la acumulación de fibronectina y colágeno III. Sin embargo, los niveles proteicos de AT-1 no fueron afectados. Experimentos in vivo de inyección de TGF- 1 a músculo esquelético dañado de ratón, mostraron un aumento en los niveles del receptor AT-2, sin cambios en los niveles del receptor AT-1. Utilizando inhibidores farmacológicos de la actividad quinasa del receptor tipo I de TGF- y de la actividad p38 MAPK se pudo establecer que ambos eran requeridos para el aumento de los niveles proteicos de AT-2 inducido por TGF- 1, sugiriendo que el efecto es directamente mediado por los receptores de TGF- y por la vía MAPK p38. En un modelo murino de la distrofia muscular de Duchenne (ratones mdx), el cual presenta fibrosis y niveles aumentados de TGF- 1, se observó un aumento de los niveles proteicos del receptor AT-2 en diversos músculos esqueléticos comparados a los niveles observados en un ratón normal, sin embargo, los niveles del receptor AT-1 no se observó cambios. Durante la diferenciación de los mioblastos C2C12, proceso en el cual la vía de señalización de TGF- 1 se encuentra disminuida, los niveles proteicos de los receptores AT-1 y AT-2, disminuyó. Estos resultados sugieren que los niveles proteicos de AT-2, y no los de AT-1, son modulados por el factor profibrótico TGF- 1 en células musculares esqueléticas y en músculo esquelético, y que, durante la diferenciación, tanto AT-1 como AT-2 son modulados, sugiriendo así que estos receptores tienen un papel en el desarrollo y fisiopatología de la DMD / The excessive deposition of extracellular matrix (ECM) proteins is known as fibrosis and is a key hallmark of degenerative muscle diseases such as Duchenne muscular dystrophy (DMD). In this disease, muscle function is lost when myofibers are replaced by deposition of collagen and other ECM proteins. Among the factors that triggers muscle fibrosis are Transforming Growth Factor Type beta (TGF- ) and Angiotensin II (Ang II) from the Renin-Angiotensin System (RAS). Ang II exerts its biological effects mainly through two receptors, AT-1 and AT- 2, where AT-1 is responsible for Ang II fibrotic effects and AT-2 mediates antifibrotic effects. In cardiac, pulmonary and renal fibrotic tissues TGF- 1 increases AT-1 and AT-2 levels adding more complexity to the mechanisms that regulate fibrosis. The effects of TGF-b on the AngII receptor levels in skeletal muscle are not know. The aim of this work was to evaluate the effect of TGF- 1on protein levels of AT-1 and AT-2 receptors. The results were determined by western blot assays, and they show that TGF- 1 increases fibronectin and collagen III expression in C2C12 cells. We also determined that AT-2 protein levels were increased in a dose-dependent manner with a maximal effect at 48 h. However, levels of AT-1 remain unchanged. In vivo experiments in a mice damage skeletal muscle model injected with TGF- 1 shown an increase of AT-2 protein level and no changes were observed in AT-1 protein level. TGF- 1-dependent increase of AT-2 is abolished when cells were treated with a specific inhibitor of the TGF- receptor I kinase activity and with an inhibitor of p38 MAPK pathway, suggesting that the effect is directly mediated by TGF- receptors and p38 MAPK pathway. In a murine model of DMD (mdx mice), which presents fibrosis and augmented TGF- 1 levels, AT-1 and AT-2 receptors were evaluated in several muscles, AT-1 levels remain unchanged and AT-2 levels were augmented in dystrophic muscles. However, during differentiation, in which TGF- pathway is downregulated, C2C12 myoblasts, diminished the expression of AT-1 and AT-2 receptors. These results suggest that AT-2 protein levels, and not AT-1 levels, are differentially modulated by the profibrotic factor TGF- 1 in skeletal muscle cells and skeletal muscle, and during differentiation AT-1 and AT-2 are modulated, suggesting that these receptors have a role in the development and physiopathology of DMD. / FONDECYT

Doctor en Bioquímica / Tanto los niveles intracelulares de Ca2+ ([Ca2+]i) como el transporte de la glucosa son fundamentales para la fisiología del cardiomiocito, sin embargo, aún no se ha investigado la interrelación entre ambos eventos. En esta tesis se investigó si insulina regula los niveles [Ca2+]i en el cardiomiocito, el mecanismo que participa y su papel en el transporte de glucosa vía GLUT4. Con este objetivo, cultivos primarios de cardiomiocitos de rata se preincubaron con la sonda fluorescente para Ca2+ FLUO3-AM y se visualizaron los cambios en los niveles de Ca2+ por microscopia confocal. Las vías transduccionales que regulan los movimientos intracelulares de Ca2+ se intervinieron selectivamente con inhibidores químicos y herramientas genéticas. La captación de glucosa se evaluó utilizando [3H]-2-desoxiglucosa y los niveles de GLUT4 en la superficie celular se cuantificaron en cardiomiocitos no-permeabilizados transfectados con el plasmidio GLUT4-myc-eGFP. Los resultados mostraron que insulina indujo un rápido y transitorio aumento del [Ca2+]i en dos componentes. Los bloqueadores del canal L de Ca2+ nifedipino y del canal/receptor intracelular ryanodina sólo previnieron el primer componente componente. el segundo componente se redujo con: a) inhibidores selectivos del receptor de inositol-1,4,5-trifosfato: xestospongina C y 2 amino-etoxidifenilborato (2APB), b) disminución de la masa del receptor de IP3 vía siRNA y c) por transducción de un péptido inhibidor de señalización de las subunidades β de la proteína G (βark). La captación de glucosa inducida por insulina fue prevenida por el quelante del Ca2+ intracelular BAPTA-AM, 2 APB y βark, pero no por nifedipino ni ryanodina. De manera similar, la exposición del GLUT4-myc-eGFP en la membrana celular inducida por insulina fue inhibida por BAPTA-AM y xestospongina C, pero no por nifedipino. Sin embargo, este proceso también requirió la activación de PI3K y Akt para la segunda fase de liberación del [Ca2+]i y para la translocación del GLUT4. La transfección de un dominante negativo de PI3K inhibió parcialmente la exposición de GLUT4-myc-eGFP. En conclusión, insulina aumentó los niveles de [Ca2+]i vía IP3R en cultivos primarios de cardiomiocitos, regulando la captación de glucosa vía GLUT4. Esta nueva vía de señalización de insulina podría influenciar al metabolismo cardiaco en el miocardio adulto y estar modificada en condiciones metabólicas como son la obesidad, resistencia a insulina y diabetes / Intracellular calcium levels ([Ca2+]i) and glucose uptake are central to cardiomyocyte physiology, yet connections between them have not been studied. We investigated here whether insulin regulates [Ca2+]i in cultured cardiomyocytes, the participating mechanisms, and their influence on glucose uptake via glucose transporter 4 (GLUT4). Cultured neonatal rat cardiomyocytes were preloaded with the Ca2+ fluorescent dye FLUO3-AM and visualized by confocal microscopy. Ca2+ transport pathways were selectively targeted by chemical and molecular inhibition. Glucose uptake was assessed using [3H]2-deoxyglucose and surface GLUT4 levels were quantified in non-permeabilized cardiomyocytes transfected with GLUT4-myc-eGFP. Insulin stimulated a fast, two-component, transient increase in [Ca2+]i. Nifedipine and ryanodine prevented only the first component. The second one was reduced by inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3)-receptor selective inhibitors (xestospongin C, 2 amino-ethoxydiphenylborate), by type 2 IP3-receptor knockdown via siRNA, or by transfected G peptidic inhibitor ARKct. Insulin-stimulated glucose uptake was prevented by BAPTA-AM, 2-amino-ethoxydiphenylborate and ARK-ct, but not by nifedipine or ryanodine. Similarly, insulin-dependent exofacial exposure of GLUT4-myc-eGFP was inhibited by BAPTA-AM and xestospongin C but not by nifedipine. Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and Akt were also required for the second phase of Ca2+-release and GLUT4 translocation. Transfected dominant-negative PI3K inhibited the latter. In conclusion, in primary neonatal cardiomyocytes, insulin induces an important component of Ca2+ release via IP3-receptor. This component signals to glucose uptake via GLUT4, revealing a so far unrealized contribution of IP3-sensitive Ca2+ stores to insulin action. This pathway may influence cardiac metabolism in conditions yet to be explored in adult myocardium

Tesis para optar al grado de Magíster en Bioquímica. Área de especialización: Bioquímica Clínica / El cáncer ovárico representa la segunda causa de muerte de origen ginecológico, y el 80-90% corresponde a carcinoma ovárico epitelial (COE), del cual el 40% es de tipo seroso. Esta patología se caracteriza por presentar un transcurso silente, una detección tardía, responder pobremente a terapias, ser altamente angiogénico y de sobrevida muy baja. La etiología del COE no está clara y se postulan varias hipótesis al respecto. En carcinoma de páncreas, colon, tiroide papilar y medular, próstata y neuroblastoma, se ha reportado una sobreexpresión del receptor tirosina kinasa (trkA). En cuanto a su ligando, el factor de crecimiento nervioso (NGF) se ha reportado su participación directa e indirecta a través de su receptor trkA, en la angiogénesis, evento crucial para el desarrollo y progresión del tumor. El factor angiogénico más estudiado es el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y se ha encontrado una sobreexpresión de las isoformas 121, 165 y 189, las cuales aumentan por efecto de NGF en explantes de cáncer ovárico epitelial. Si bien, ya se sabe que el receptor trkA y su ligando NGF participan en la angiogénesis del ovario, no hay antecedentes claros que indiquen si el receptor trkA y su ligando NGF están involucrados en la génesis y progresión del COE. Por lo que nos planteamos la siguiente Hipótesis:trkA modifica su expresión durante la carcinogénesis ovárica constituyendo un nuevo marcador tumoral. Para desarrollar este estudio nos propusimos el siguiente Objetivo General: Evaluar los niveles del receptor trkA y de NGF, durante las distintas etapas de transición del epitelio ovárico (desde el tejido ovárico normal al cáncer ovárico epitelial) y si esta expresión se relaciona con la expresión de VEGF. Metodología: En 30 muestras de ovarios: ovarios inactivos (OV-I), tumores benignos (T.Ben), borderline (T.Bord) y COE grados I, II y III (n=5 para cada grupo), se evaluó la localización celular y niveles proteicos del receptor trkA total, trkA-p, NGF y VEGF mediante inmunohistoquímica (IHQ). Para la semicuantificación se sumaron los porcentajes de las intensidades 2 y 3 y se expresó como el porcentaje de células con tinción positiva en el epitelio. Además, en tejidos congelados se analizaron los niveles de mRNA del receptor trkA, NGF y VEGF por RT-PCR, los resultados por PCR fueron normalizados con el gen constituivo β – actina. Resultados: Se encontró un aumento discreto en los niveles de mRNA de NGF durante la progresión carcinogénica, y estos aumentos fueron significativos entre OV-I vs COE I, COE II COE III (p<0,05). En cuanto a la expresión proteica de NGF, también se encontró un aumento significativo entre OV-I vs COE II y COE III (p<0,01). Los productos de splicing alternativos que codifican para las isoformas de VEGF 121, 165 y 189 aumentaron significativamente durante la progresión carcinogénica. VEGF 121 aumentó significativamente entre OV-I vs COE I, II y III vs (p<0,001). VEGF 165 aumentó significativamente entre OV-I vs COE I, II y III (p<0,001), y para VEGF 189 entre OV-I vs COE I, COE II y III (p<0,01). En cuanto a la expresión proteica de VEGF, se encontró un aumento durante la progresión, el cual fue significativo entre OV-I vs COE I, II y III (p< 0,001). Se encontró un aumento gradual y significativo en los niveles de mRNA de trkA, a medida que se va perdiendo la diferenciación celular. Este aumento fue significativo entre T.Bord vs COE I, COE II y III (p<0,01), COE I vs COE III (p<0,001) y COE II vs COE III (p<0,01). En las muestras de ovario normal inactivo y tumores benignos no fue posible encontrar la expresión génica de trkA, en parte por la poca cantidad de epitelio que encontramos en estos grupos. En cuanto a la expresión proteica del receptor trkA total, se observó un aumento gradual y significativo durante la progresión; principalmente entre OV-I vs COE I, II y III (p<0,001). De igual forma, los niveles proteicos del receptor activo p-trkA, aumentaron significativamente durante la progresión del COE, entre COE I vs COE III (p<0,01). En los grupos de OV-I, T.Ben y T.Bord, no se encontró tinción positiva para p-trkA. Discusión: Tanto la expresión proteica del receptor trkA total y p-trkA, como los niveles de mRNA de trkA, aumentan durante la progresión carcinogénica, principalmente entre los COE, y dichos aumentos se elevan significativamente con la indiferenciación del tejido, lo que confirmaría su posible uso como marcador de progresión del COE y también como marcador de mal pronóstico, ya que la proteína p-trkA se detectó desde COE I en adelante y a nivel de mRNA no fue detectado en los grupos de ovario inactivo y tumor benigno, sólo a partir de los tumores borderline comienza a detectarse pero muy débilmente, a diferencia de lo que ocurre en COE donde su expresión génica como proteica es muy alta. Este aumento en la expresión proteica de trkA durante la progresión se correlaciona positiva y significativamente con la expresión proteica de NGF y VEGF. Estos últimos corresponden a factores proangiogénicos, importantes para el desarrollo, progresión y metástasis tumoral

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El bulbo olfatorio (BO) es el primer centro de integración de la actividad neuronal gatillada por la presencia de odorantes en el medio ambiente. Esta integración dentro del BO juega un rol importante en la detección y discriminación. Se ha propuesto que la actividad eléctrica oscilatoria del BO sustenta los procesos de discriminación y aprendizaje de odorantes. Sin embargo, toda la evidencia disponible apunta al efecto de los odorantes sobre la actividad del BO sin considerar el estado “basal” del BO en ausencia de odorantes. Los estímulos olfatorios inducen a una activación particular de las neuronas receptoras olfatorias, la cual modificará esta actividad basal del BO iniciando los procesos subyacentes a la detección, discriminación y percepción olfatoria. El objetivo de esta memoria fue caracterizar la actividad eléctrica oscilatoria del potencial de campo eléctrico local en ausencia de odorantes en las diferentes capas del BO. Se registro el potencial de campo eléctrico local simultaneamente con 2 tétrodos (n =10 ratas), uno fijo (capa mitral) y otro móvil (distintas capas del BO) y el ciclo respiratorio utilizando una termocupla. Mediante la transformación rápida de Fourier (FFT) se obtuvo la frecuencia y amplitud de la oscilacion predominante en forma independiente del ciclo respiratorio. Por otra parte, utilizando un espectrograma se determinó la frecuencia de la oscilación predominante en función del ciclo respiratorio. Encontramos que en ausencia de un estímulo olfatorio sólo un 30% de los registros (móviles y fijos) mostraron una actividad oscilatoria significativa correspondiente al rango de frecuencia gamma (30 – 100 Hz.), y que la potencia de esta oscilación aumenta a medida que el electrodo se mueve desde la capa glomerular a la capa granular. Más aún, esta oscilación es dependiente del ciclo respiratorio, mostrando un aumento de su potencia durante la fase inspiratoria del ciclo en ausencia de odorantes. Se concluye que hay una actividad oscilatoria gamma espontánea en al menos algunas regiones del BO en ausencia de odorantes. Más aún, estos resultados sugieren que la actividad eléctrica neuronal espontánea en el BO tiene una estructura temporal y X que depende del ciclo respiratorio, indicando que este ciclo es una parte intrínseca de la codificación olfatoria y que todo estímulo inducido debe ser integrado en esta actividad oscilatoria / Proyecto Milenio ICM P01-007 F

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Existen evidencias que el propanolol inhibe la potenciación sináptica de largo plazo en rebanadas de hipocampo, sugiriendo que este compuesto deprime la transducción de señales dependiente de la activación del receptor -adrenérgico. En la corteza occipital, se ha descrito también el fenómeno de la potenciación sináptica de largo plazo, caracterizado por un aumento progresivo en la actividad de las neuronas piramidales, el cual puede ser evocado por estimulación de alta frecuencia de la fibra neuronal. la potenciación sináptica occipital, al igual que en el hipocampo, depende principalmente de receptores NMDA, pero además se ha visto una importante acción de los receptores -adrenérgicos. Se estudió el efecto de la administración intraperitoneal de propanolol en la potenciación de largo plazo occipital de la rata. Ratas albinas de la cepa Sprague-Dawley de 150-300 g. fueron anestesiadas con uretano (1.5 g/Kg de peso vivo). La estimulación consistió en pulsos simples de onda cuadrada de 100 s de duración, 0.2 Hz y de intensidad creciente (entre 50 y 200 A), con el objeto de determinar la máxima amplitud asintótica de las respuestas evocadas contralaterales. La potenciación de largo plazo se indujo aplicando un tren tetanizante de ondas rectangulares monofásicas de 500 ms de duración, 312 Hz, y una intensidad 50% mayor que la necesaria para obtener respuestas basales. Los resultados muestran que propanolol (1, 25; 2,5 y 5,0 mg/kg i.p.), indujo una inhibición dosis-dependiente de la potenciación sináptica de largo plazo. Esta observación indica que propanolol es capaz de interferir a nivel cortical con el componente noradrenérgico mediado por receptores beta en la potenciación de largo plazo. Dado que la potenciación sináptica es el principal fenómeno que sustenta los mecanismos centrales involucrados en el desarrollo de la memoria y el aprendizaje, el presente estudio puede contribuir a futuras aplicaciones clínicas, en situaciones de estrés crónico y/o malnutrición perinatal donde ocurren cambios en la disponibilidad de noradrenalina central y/o en la densidad de sus receptores, en donde la activación de los receptores -adrenérgicos podría ser insuficiente comprometiendo procesos de memoria y aprendizaje. En este sentido, tal vez parte de los esfuerzos terapéuticos futuros para el tratamiento de estos desórdenes deberían estar dirigidos hacia la corrección farmacológica de los niveles endógenos de noradrenalina central con el objeto de paliar los déficits de aprendizaje y memoria que acompañan a estos cuadros crónicos

Memoria para la optar al Título Profesional de Bioquímico / Durante la atención selectiva, los sujetos voluntariamente centran sus recursos cognitivos en un estímulo específico mientras ignoran otros. Uno de los mecanismos propuestos como base biológica de la atención selectiva son los filtros de las respuestas sensoriales periféricas mediado por las estructuras superiores del cerebro, conocidos como mecanismos top-down. Uno de los requisitos para la modulación top-down es la presencia de las vías corticofugales. El sistema eferente auditivo en mamíferos es una red neuronal única que se origina en la corteza auditiva y que tiene proyecciones a células receptoras de la cóclea a través de las fibras olivococleares, las cuales han sido propuestas como la base neuroanatómica del filtro auditivo durante la atención a estímulos de diferentes modalidades. Sin embargo, hasta ahora no existe evidencia directa que las neuronas olivococleares estén involucradas en paradigmas de atención selectiva. El objetivo de este trabajo es estudiar el rol del receptor nicotínico α9/α10, principal receptor involucrado en la sinapsis entre las neuronas olivococleares mediales y las células ciliadas externas, en la conducta de atención selectiva a estímulos visuales en presencia de distractores auditivos. Para esto, se entrenaron ratones wild type y knock-out para la subunidad α9 del receptor nicotínico α9/α10 (KO-α9) en una prueba de discriminación visual de dos opciones. Se estudiaron las consecuencias conductuales de la presentación de diferentes tipos de distractores auditivos. También se realizaron pruebas de campo abierto y laberinto en cruz elevado para determinar si estos distractores auditivos produjeron cambios en la actividad locomotora y ansiedad. Además se evaluaron los efectos del ruido contralateral en las respuestas del nervio auditivo, como una medida de la fuerza del reflejo olivococlear. Los resultados de este trabajo muestran que los ratones KO-α9 tienen un reflejo olivococlear disminuido y una tendencia de peor desempeño en el paradigma de atención selectiva a estímulos visuales, por lo que se propone que una sinapsis olivococlear medial intacta es necesaria para reducir la sensibilidad coclear durante esta tarea. Además, ya que los ratones KO-α9 recorrieron una menor distancia en el laberinto en cruz elevado luego de la presencia de los distractores auditivos, se propone que la ausencia de una sinapsis olivococlear medial intacta provoca una disminución de la actividad locomotora. Esta tesis contribuye al entendimiento del rol de la sinapsis colinérgica entre las células ciliadas externas y las neuronas olivococleares mediales durante la atención selectiva a estímulos visuales / During selective attention, subjects voluntarily focus their cognitive resources on specific stimuli while ignoring others. One of the mechanisms proposed as a biological correlate of selective attention is the filtering of peripheral sensory responses mediated by higher brain structures, known as top-down mechanisms. Top-down filtering of peripheral responses needs the presence of corticofugal pathways. The efferent auditory system in mammals is a singular neural network that originates in the auditory cortex and projects to the receptor cells in the cochlea through olivocochlear (OC) fibers. The OC system has been proposed as the neuroanatomical basis of the peripheral auditory filter during attention to visual stimuli. However, to date, there is no direct evidence that OC neurons are involved in selective attention paradigms. The aim of this work is to study the behavioral role of α9/α10 nicotinic receptors, which are the main target of cholinergic synapses between medial olivocochlear neurons and outer hair cells, during selective attention to visual stimuli in the presence of auditory distractors. Methods: wild type and knock-out mice for α9 subunit of nicotinic receptor α9/α10 (KO-α9) were trained in a two-visual discrimination task. The behavioral consequences of the presentation of different types of auditory distractors in the visual attention task were studied. Open field tests and elevated plus maze were also performed to determine whether these auditory distractors produced changes in locomotor activity and anxiety. In addition the effects of contralateral noise were evaluated in auditory nerve responses, as a measure of the strength of the olivocochlear reflex. We found that the KO-α9 mice have a significant decrease in the olivocochlear reflex strength and a tendency to worse performance in the paradigm of selective attention to visual stimuli. These results suggest that intact medial olivocochlear synapses are necessary to reduce cochlear sensitivity during attention. Furthermore, since the KO-α9 mice traveled a shorter distance in the elevated plus maze after the presence of auditory distractors, it is proposed that the lack of an intact medial olivocochlear synapses causes a decrease in locomotor activity. This work contributes to the understanding of the role of cholinergic synapses between medial olivocochlear neurons and outer hair cells during selective attention to visual stimuli

Orientador: Valéria Marçal Felix de Lima / Resumo: A leishmaniose canina (CanL) é causada pelo parasito intracelular Leishmania infantum. Devido ao alto parasitismo na pele o cão é considerado o principal reservatório urbano da L. Infantum. A prostaglandina-E2 (PGE2) possui propriedades reguladoras potentes do sistema imunológico e pode se ligar aos receptores EP1, EP2 e EP4 que geram ativação celular ou EP3 que gera inibição de resposta celular. Na CanL o papel regulador da PGE2 ainda não foi estudado, por isso, os parâmetros foram avaliados em cultura de leucócitos esplênicos de cães com CanL. Avaliando o nível de PGE2, seus receptores, e seu efeito modulador sobre a PGE2 na atividade da arginase, NO2, citocinas IL-10, IL-17 e TNF-α e carga. Para isso utilizamos seus agonistas, antagonista e inibidor. Nossos resultados mostraram que a expressão do receptor EP2 diminuiu nos leucócitos esplênicos dos cães com CanL quando comparado aos cães saudáveis. Observamos que o NO2 diminuiu quando tratados com os agonistas dos receptores de PGE2 (EP1/EP2/EP3), antagonista dos receptores de PGE2 (AH-6809) e inibidor de COX-2 (NS-398). A concentração das citocinas TNF-α e a IL-17 diminuíram quando tratadas com agonista do receptor de PGE2 (EP2), e quando estimuladas com a PGE2. A carga parasitária diminuiu na cultura de leucócitos esplênicos de cães com CanL estimulados com PGE2. Concluímos que a infecção por Leishmania modula os receptores de PGE2 em cães, e que a ligação da PGE2 aos receptores pode ativar a capacidade microbicida das cé... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Doctor en Ciencias mención Biología Molecular, Celular y Neurociencias / Cell adhesion to the extracellular matrix (ECM) is key to the regulation of cellular processes such as proliferation, survival, and migration. Mesenchymal cell adhesion requires the formation of focal adhesions, defined as multiprotein complexes that allow cell binding to the ECM. Focal adhesions involve the congregation of more than 150 proteins, which include integrins, the main ECM receptors, and the Focal Adhesion Kinase (FAK), which has as a fundamental role in the turnover of focal adhesions. Formation and disassembly of focal adhesions are dynamically regulated during cell migration, and numerous studies show that increased expression or activity of focal adhesion proteins is associated with many human diseases. For example, increased levels and/or activities of FAK have been associated with oncogenic transformation in a variety of tissues and organs. Aside the roles commonly described for FAK in activating integrins, such as integrin β1 (ITGB1), and modulating integrin downstream signaling, this kinase has been shown to behave as an intracellular effector of multiple signaling pathways, including Neogenin-1 (NEO1). NEO1 is a transmembrane receptor involved in tissue growth during embryogenesis, although it is also broadly expressed in adulthood. More recently, overexpression of NEO1 has been observed in a wide variety of human cancers including those of the breast, pancreas, cervix, colon and medulloblastoma. Despite the latter, its role in tumorigenesis is still controversial and remains to be elucidated. In the context of neural development NEO1 promotes neuronal migration and axonal guidance through interaction with the extracellular Netrin (NTN) ligand family. Interestingly, NEO1 is strongly expressed in neuroblastoma (NB), a cancer derived from neural progenitors of the sympathoadrenal lineage. Therefore, it will be relevant xii determining if NEO1, by interacting with NTNs, could promote the migration and metastasis of NB cells, and if this phenomenon is mediated through the activation of FAK, thus promoting the intracellular activation of the ITGB1. It was shown that both the NEO1 receptor and its main NTN ligands family members, Netrin-1 (NTN1) and Netrin-4 (NTN4), are expressed in NB patient samples. We reveal that NEO1, in addition to promoting chemotactic migration in association with NTN4 in vitro, promotes metastasis in vivo, as demonstrated in the chicken embryo model. Recent data from the literature supports our results and allow us to suggest that the interaction between NTN4 and NEO1 might not be direct, but rather mediated by a signaling complex also made up by laminin g1 and ITGB1. NTN1, on the other hand, acts as a chemoattractant molecule and binds directly to NEO1. In addition, we show that FAK is an downstream effector of NEO1, and that the NTN1/ NEO1 signaling complex interacts with ITGB1, in the SK-N-SH NB cells. Thus, our results suggest that NTN1/ NEO1 promotes the activation of ITGB1 through FAK, most likely through the formation of a macromolecular complex, driving cell migration. All these results are consistent with our in vivo observations, which show that NEO1 promotes the metastasis of SK-N-SH cells in an immunodeficient mouse model. In summary, this thesis shows that NEO1 promotes the migration of NB cells and that its mechanism of action is via interaction with ITGB1, with FAK being an intracellular mediator of this signaling pathway. NEO1, by promoting cell migration, could play a key role in the process of NB metastasis. Therefore, the signaling complex xiii conformed by NTNs / NEO1 is proposed as a possible prognostic marker of the progression of NB.