Rearranjos subteloméricos submicroscópicos são uma causa importante de malformações congênitas múltiplas e retardo mental. Recentemente, os mecanismos de origem de rearranjos subteloméricos começaram a ser investigados. O seqüenciamento dos pontos de quebra de rearranjos cromossômicos em 1p36 revelou predomínio por mecanismos de reparo não exclusivos. Rearranjos constitucionais em 1p36 são as alterações subteloméricas mais comuns e incluem deleções terminais simples, cromossomos derivados, deleções intersticiais e rearranjos complexos. Estes rearranjos resultam em um padrão específico de malformações e distúrbios do desenvolvimento neuropsicomotor que caracterizam a síndrome de monossomia 1p36. Os genes causativos ainda não foram identificados e a expressão fenotípica pode ser em função da haploinsuficiência de genes contíguos ou pelo mecanismo de efeito de posição. Obesidade e hiperfagia são características descritas em ~15% dos casos. Investigamos por MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) a presença de rearranjos no segmento cromossômico 1p36 em um grupo de 154 pacientes com obesidade e hiperfagia e testes genéticos negativos para a síndrome de Prader-Willi (PWS), e outro grupo de 83 pacientes encaminhados para estudos cromossômicos por diversos motivos. A estratégia de MLPA utilizada permitiu identificar em nove pacientes diferentes tipos de rearranjos na região subtelomérica 1p36. Para investigar os mecanismos de quebra, reparo e estabilização cromossômica envolvidos em rearranjos subteloméricos, linhagens celulares de seis pacientes contendo rearranjos constitucionais em 1p36 foram desenvolvidas. A clonagem e seqüenciamento das junções dos pontos de quebra de um rearranjo complexo e três translocações não recíprocas identificaram similaridades nas junções que sugerem o reparo por NHEJ (Nonhomologous end-joining) como o mais provável mecanismo de origem destes rearranjos. Duas deleções terminais aparentemente simples também foram investigadas e o refinamento dos pontos de quebra identificou dois intervalos genômicos distintos contendo duplicações segmentares específicas de 1p36 com 90-98% de homologia. Estas duplicações segmentares podem ter estimulado ou sido usadas como substratos no mecanismo de reparo do DNA. Nossos achados reforçam a associação da monossomia 1p36 com obesidade e hiperfagia e sugerem que estas características estejam freqüentemente associadas com fenótipos atípicos/leves e deleções submicroscópicas com 2-3 Mb de extensão. Sugerimos o uso de MLPA como um método alternativo rápido de diagnóstico para detectar e caracterizar rearranjos em 1p36. / Subtelomeric abnormalities are an important cause of mental retardation and birth defects. The mechanisms involved in the formation of subtelomeric rearrangements are now beginning to be elucidated. Breakpoint sequencing analysis of 1p36 rearrangements has revealed prevalence of different nonexclusive recombination-repair mechanisms. Rearrangements of 1p36 are the most frequently detected subtelomeric abnormalities and include different-sized simple terminal deletions, derivative chromosomes, interstitial deletions and complex rearrangements. These rearrangements have been reported to result in the specific pattern of malformation and neurodevelopmental disabilities that characterizes monosomy 1p36 syndrome. Thus far, no genes have been conclusively determined to be causative. Besides, it is still not known if a mechanism of haploinsufficiency or position effect that influences phenotype expression in this commonest terminal deletion syndrome. Obesity and hyperphagia have been reported to occur in ~15% of cases. We have used multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) to screen for monosomy 1p36 in a group of 154 hyperphagic and obese, PWS negative patients and in a separate group of 83 patients sent to investigate a variety of other conditions. The MLPA strategy used allowed the identification of a diversity of rearrangements in nine subjects. In order to gain further insights into the mechanisms of chromosome breakage, repair, and stabilization mediating subtelomeric rearrangements in humans, we have used cell lines containing constitutional rearrangements of 1p36 of six patients. Cloning of the breakpoint junctions in a complex rearrangement and three non-reciprocal translocations revealed similarities at the junctions that suggest NHEJ as the most likely mechanism of DNA repair that generated these rearrangements. Additionally, two apparently pure terminal deletions were also investigated and the refinement of the breakpoint regions identified two distinct genomic intervals ~25-kb apart, each containing a series of 1p36 specific segmental duplications with 90-98% identity. These segmental duplications might have been stimulated or used as substrate for a recombination-repair mechanism. Our work reinforces the association between monosomy 1p36 and obesity and hyperphagia, and further suggests that these features might be usually associated with an atypical/mild phenotype in addition to a submicroscopic deletion of ~2 to 3 Mb in size. We suggest the use of MLPA as an alternative method for high-throughput detection and delineation of rearrangements at 1p36.

INTRODUÇÃO: A resposta ao tratamento no carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECCP) varia significantemente em diferentes casos e muitos pacientes não respondem ao tratamento e são expostos aos seus efeitos. A cisplatina é o quimioterápico mais utilizado no tratamento de CECCP e a quimioradioterapia é o método terapêutico usado nos carcinomas localmente avançado. Neste trabalho foram estudados possíveis marcadores de resposta a quimioradioterapia e sobrevida em pacientes portadores de CECCP, dentre eles a osteopontina (OPN) que tem sido associada à agressividade tumoral em vários cânceres e também tem sido relacionada a sobrevida, formam estudados também alguns polimorfismos em genes que estão relacionados com a cisplatina, seja na detoxificação deste fármaco, Glutationas S transferase (GSTP1, GSTT1 e GSTM1), seja no reparo dos danos causados no DNA pela via de excisão de nucleotídeos (XPD -751 e ERCC 118). CASUÍSTICA E MÉTODOS: Amostras de 69 pacientes localmente avançados submetidos à quimioterapia adjuvante ou exclusiva com cisplatina tiveram a sua OPN dosada pelo imunoensaio elisa em coletas realizadas antes e depois do término do tratamento. Para a análise dos polimorfismos, amostras de 95 pacientes localmente avançados tratados com quimioradioterapia com cisplatina exclusiva foram analisadas por PCR RFLP. RESULTADOS: Com relação à OPN, dos 69 pacientes estudados, a concentração da OPN antes do início da quimioradioterapia no grupo como um todo, foi de 102,5 ng/mL com uma mediana de 82,1 ng/mL. O correspondente valor da OPN após o tratamento n=46 foi de 104,0 ng/mL e mediana de 92,9 ng/mL. A OPN se mostrou mais elevada nos pacientes com maior tamanho tumoral, p=0,009 (ANOVA). Em análises correlacionado reposta ao tratamento e concentração de OPN, observamos que os pacientes que obtiveram resposta completa apresentaram menores níveis de OPN do que aqueles que não responderam ao tratamento. Quando realizamos uma análise multivariada notamos correlação entre baixa OPN antes do tratamento e uma melhor sobrevida global. Na análise dos polimorfismos (n=95), observamos que para os genes de reparo de DNA, XPD e ERCC, o genótipo mais freqüente foi C/T (n=43) e A/A (n=44), respectivamente. Para a GSTP1 a maior freqüência foi de A/G (47,4%) e para a GSTT1 e M1, vimos que a maioria dos pacientes, 83,2% mostrou ter GSTT1 funcional, enquanto 58,9% tiveram GSTM1 não funcional. Neste grupo de pacientes, não notamos nenhuma associação significante entre os genótipos dos pacientes e a resposta a quimioradioterapia, assim como não foi possível uma correlação entre a sobrevida global e os genótipos. CONCLUSÃO: Em síntese, a OPN após o término do tratamento pareceu estar associada com a resposta ao tratamento e com uma melhor sobrevida no grupo estudado e em relação aos polimorfismos, um aumento do número de amostras possa talvez mostrar alguma associação com resposta ao tratamento e a sobrevida global em pacientes com CECCP localmente avançados. / INTRODUCTION: The response to treatment in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) varies significantly in different cases and many patients do not respond to treatment and are exposed collateral effects. Cisplatin is a chemotherapeutic used to treat HNSCC and chemoradioterapy is the major strategy used in locally advanced carcinomas. In this work, we studied potential markers for chemoradioterapy response and survival in HNSCC patients, such as osteopontin (OPN), which has been associated with tumor aggressiveness and survival. Furthermore, it was studied some genetic polymorphisms related to cisplatin detoxification (glutathione - S transferase, subtypes GSTP1, GSTT1 and GSTM1), as well genes involved in the repair of DNA damage by nucleotide excision (ERCC and XPD -751 - 118). METHODS: Plasmatic OPN levels, before and end of treatment, were measured in 69 patients with locally advanced tumors submitted to adjuvant chemotherapy with cisplatin only by ELISA. For polymorphism analysis, samples from 95 patients with locally advanced tumors treated with cisplatin alone were analyzed by PCR - RFLP. RESULTS: The OPN levels before the chemoradioterapy in the group (n=69) was 102.5 ng/mL with a median of 82.1 ng/mL. The corresponding value of OPN after treatment (n= 46) was 104.0 ng/mL and a median of 92.9 ng/mL. The OPN was higher in patients with larger tumor size, p = 0.009 (ANOVA). In tests correlated to treatment response and concentration of OPN, we observed that patients who achieved complete response had lower levels of OPN than those who did not respond to treatment. The multivariate analysis revealed that lower OPN levels before treatment significant a better overall survival. In the analysis of the polymorphisms (n = 95) the frequency of genotype for the DNA repair genes (XPD and ERCC), was C / T (n = 43) and A / A (n = 44), respectively. The most frequent genotype for GSTP1 was A/ G (47.4%), in 83.2% of the patients, the GSTT1 was functional, while in 58.9% of patients presented GSTM1 non-functional. In this group of patients, there was no any significant association between the genotypes and chemoradiotherapy response nor overall survival. CONCLUSION: In summary, plasmatic OPN levels after treatment cisplatin seemed to be associated with treatment response and better survival. However, larger sample size would be demonstrating some association with treatment response and overall survival in patients with locally advanced HNSCC.

O reparo de lesões genômicas tem papel critico na supressão da transformação maligna. Para melanomas, tipo de câncer de pele, lesões causadas por UV são responsáveis pela aquisição do fenótipo maligno. A via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) exerce função importante na correção destas lesões, sendo na proteína XPC um dos seus principais agentes atuantes no reconhecimento das lesões. Enquanto mutações em XPC predispõem à Xeroderma Pigmentosum, modulações na função de XPC podem exercer papel critico na aquisição de mutações UV em melanomas esporádicos. A modulação pode ocorrer por ação transcricional, interação proteica ou também por fatores genéticos que possam interferir com sua expressão e/ou atividade. Para entender o papel da transcrição na modulação do reparo exercido por XPC, verificou-se o papel de p53 neste contexto. Comparando-se linhagens com diferentes status funcionais de p53 frente a lesões UVB, os resultados indicaram seu papel quanto a diferenças na sensibilidade à exposição, expressão de proteínas de reparo e cinética de reparo de lesões CPD. Além disso, caracterizou-se a expressão de proteínas envolvidas com apoptose e a ativação de caspase 3/7, além da expressão de espécies reativas de oxigênio produzidas após UVB, as quais sugeriram um efeito pró-sobrevivência após neutralização destas moléculas. Com relação à modulação de XPC quanto a seu principal partner, hHR23B, procurou-se verificar seu papel na biologia de melanomas. Análise da expressão de hHR23B em amostras de tecido de séries névicas, melanomas primários e metástases, demonstrou grande heterogeneidade de marcação principalmente em nevus e melanomas primários. Dados apresentados demonstraram que hHR23B esta relacionado à estabilidade e acúmulo de XPC, consequentemente alterando a eficiência de reparo de DNA para lesões UVB. O silenciamento de hHR23B modulou a morte celular após UVB de maneira a diminuir sua taxa, porém a longo prazo, tal sobrevivência não foi evidenciada. O silenciamento de hHR23B também afetou a sensibilidade à alguns agentes quimioterápicos. Para os possíveis efeitos genéticos na modulação de XPC, verificou-se o papel de polimorfismos genéticos existentes no gene. Análise de expressão alelo-específica do polimorfismo K939Q não sugeriu diferenças na expressão relacionadas a estas variantes polimórficas. Por fim, verificou-se o papel que p53 e NER poderiam exercer sobre a resposta à cisplatina. Usando as mesmas linhagens utilizadas para a resposta à UVB, verificou-se que, ao contrário, células possuindo atividade funcional de p53 apresentavam maior sensibilidade ao quimioterápico. Esta sensibilidade não se mostrou relacionada diretamente a expressão de proteínas de reparo como XPC e ERCC1, embora XPC tenha demonstrado estar relacionado à sensibilidade quando do uso de siRNA. Além disso, a restauração da atividade de p53 seja por uso de vetores virais ou através de inibidores de HDM-2 como Nutlin-3, demonstraram-se eficazes no intuito de aumentar a sensibilidade ao quimioterápico. Em conjunto, os resultados apresentados evidenciam o papel de diferentes fatores que possam modular a atividade de reparo de DNA frente à UVB e quimioterápicos, principalmente no que se refere ao eixo p53-hHR23B-XPC, pontuando-os como peças importantes na compreensão da biologia de melanomas em processos de carcinogênese, progressão e quimiorresistência / The repair of genomic lesions plays a critical role in the suppression of malignant transformation. For melanoma, a type of skin cancer, lesions caused by UV are responsible for the acquisition of the malignant phenotype. The nucleotide excision repair (NER) pathway has an important role in the repair of these lesions and XPC protein in one of its main active agents in lesion recognition. While mutations in XPC predispose to Xeroderma Pigmentosum, modulations in XPC function may play critical role in the acquisition of UV mutations in sporadic melanomas. The modulation may occur either by transcriptional activity, protein interaction or also by genetic factors that may interfere with their expression and / or activity. To understand the role of the transcription in modulating the DNA repair exerted by XPC, we verified the role of p53 in this context. Comparing cells lines with different p53 functional status after UVB injury, the results indicated its role regarding the differences in sensitivity, expression of repair proteins and DNA repair kinetics of CPD lesions. Moreover, we characterized the expression of proteins involved in apoptosis and the activation of caspase 3/7, besides the analysis of the expression of reactive oxygen species produced after UVB exposure. Such molecules suggested a pró-survival effect after UVB exposure due to results observed after neutralization. Regarding the modulation of XPC by its main partner, hHR23B, we verified its role in the biology of melanoma. HHR23B expression analysis in tissue samples series of nevus, primary melanoma and metastases showed critical heterogeneity stainning, especially in nevi and primary melanomas samples. Results indicated that hHR23B play a role in XPC stability and accumulation, altering the efficiency of DNA repair to UVB injury. Knocking-down of hHR23B by siRNA modulated cell death after UVB by decreasing its rate, but the long-term survival has not been demonstrated so. The knocking-down of hHR23B also affected sensitivity to some chemotherapeutic agents. Regarding the possible genetic effects in the XPC modulation, we verified the role of existing genetic polymorphisms inside the gene. Analysis of allele-specific expression of K939Q polymorphism did not suggest differences in expression related to these polymorphic variants. Finally, it was tested that the role p53 and NER may have on the response to cisplatin. Using the same cell lines used for the response to UVB, it was found that, in contrast, cells having functional activity of p53 showed greater sensitivity to chemotherapy. This sensitivity was not directly related to expression of DNA repair proteins such as XPC and ERCC1, although XPC has shown to be related to the sensitivity when using siRNA. In addition, the restoration of p53 activity by use of viral vectors or by HDM-2 inhibitors, such as nutlin-3, proved to be effective in order to increase the sensitivity to chemotherapy. Overall, the results demonstrate the role of different factors that may modulate the activity of DNA repair against UVB and chemotherapy, especially with regard to p53-hHR23B-XPC axis, selecting them as major players in the understanding of the melanoma biology regarding the processes of carcinogenesis, progression and chemoresistance

Alguns trabalhos sobre a resposta do tecido ósseo ao Cianocrilato podem ser encontrados na literatura, embora nenhum deles avalie a resposta histológica, micro-tomográfica e biomolecular na fixação de enxertos ósseos onlay com o N-Butil-2-Cianocrilato (IndermilTM). O objetivo do estudo proposto foi comparar o processo de incorporação, remodelação, revascularização e manutenção do volume de enxertos fixados com parafuso ou adesivo, além de mapear os eventos biomoleculares nos quais os enxertos ósseos onlay possam estar envolvidos. Oitenta e oito coelhos adultos foram envolvidos nesse estudo. Dois blocos ósseos provenientes da calvária dos coelhos foram transplantados para a mandíbula, em que de cada lado do leito receptor o osso autógeno foi fixado com parafuso de osteossíntese de forma aposicional, lag screw, cianoacrilato ou parafuso e cianoacrilato. O sacrifício dos animais ocorreu após 3, 7, 20 e 40 dias do procedimento cirúrgico inicial, quando então os animais foram submetidos às análises micro-tomográficas, histológicas e biomoleculares. Cortes histológicos das áreas enxertadas foram preparados para se avaliar o reparo dos enxertos ósseos no sítio receptor. Os resultados biomoleculares mostraram que o método de fixação utilizando o composto N-Butil-2-Cianocrilato (NB-Cn) apresentou um maior potencial anti-inflamatório, revascularizador e de formação óssea, bem como, uma menor reabsorção óssea. Na avaliação histológica, observou-se que embora o NB-Cn tenha impedido a formação de novo osso na área onde foi aplicado, a estabilidade promovida pela cola permitiu que a revascularização e incorporação do enxerto ocorresse de forma semelhante aos demais grupos. Esses resultados indicam que o NB-Cn se comportou de forma semelhante ao parafuso como material de osteossínte. / Some experimental studies on the bone tissue responses to cyanoacrylate can be found in the literature, none of them evaluate the histological response, micro-tomographic and biomolecular on fixation of onlay bone grafts with N-butyl-2-cyanoacrylate (IndermilTM). The aim of the proposed study was to compare the process of incorporation, remodeling, and volume maintenance of grafts set with screw or adhesive and map biomolecular events in which onlay bone grafts may be involved. Eighty-eight adult rabbits were submitted to calvaria onlay bone graft on both sides of the mandible. The grafts were fixated on each side of mandible by a fixation screw appositionally, lag screw, cyanoacrilate or both. The animals were sacrificed on 3rd, 7th, 20th and 40th day after the initial surgical procedure, then they were subjected to micro-computed tomography, histological and biomolecular analysis. Histological sections of the grafted areas were prepared to evaluate the healing of bone grafts in the receptor site. The biomolecular analysis showed that fixation method using N-butyl-2-cyanoacrylate (NB-Cn) presented a greater potential on anti-inflammatory, revascularization and bone formation properties, as well as reduced bone resorption. Histological evaluation observed that although the NB-Cn has prevented the formation of new bone in the area where it was applied, the stability achieved by Nb-Cn allowed revascularization and graft incorporation just like other groups. These results indicate that NB- Cn behaved similarly to the screw as osteosynthesys material.

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T06:26:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DaSilva_MarceloSantos_D.pdf: 9189361 bytes, checksum: 79ecad917f6be7c8b200b549dafc493e (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A leishmaniose é um espectro de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. Durante a infecção, os parasitos usam diferentes estratégias para sobreviver as defesas do hospedeiro, incluindo superar a exposição intensa a espécies reativas de oxigênio (ROS), principais responsáveis por causar danos no DNA, sobretudo nos telômeros, induzindo instabilidade genômica, senescência e morte celular. Telômeros são estruturas nos terminais dos cromossomos compostos por sequências de DNA repetitivas e proteínas, cuja função é proteger as extremidades dos cromossomos, evitando fusões terminais e degradação nucleolítica. Neste trabalho nós induzimos estresse oxidativo agudo em formas promastigotas de L. amazonensis através do tratamento com 2 mM de peróxido de hidrogênio (H2O2) por 1h, o qual foi capaz de aumentar os níveis de ROS intracelular, como demonstrado pela reação utilizando CM-H2DCFDA. Além disso, o estresse oxidativo induziu danos no DNA, como mostrado por análise quantitativa de 8-oxodG e núcleos positivos para o ensaio TUNEL. Observamos também, através de parâmetros qualitativos e quantitativos (Southern blot, telomere-PCR e flow-FISH), que o estresse oxidativo, assim como em mamíferos, induziu encurtamento dos telômeros. Analisando a co-localização e interação proteína:DNA por FISH-IIF e ensaios ChIP, foi possível demostrar que o estresse oxidativo causou erosão da extremidade 3¿G overhang, fazendo com que a proteína LaRPA-1 perdesse seu sítio de interação nos telômeros. Além disso, pudemos observar uma maior afinidade de LaRPA-1 para com a fita telomérica rica em C, nesse caso uma região de simples-fita gerada dentro da dupla fita telomérica, provavelmente como consequência do reparo de DNA, sugerindo a participação de LaRPA-1 na resposta a danos oxidativos. Por análise de curvas de crescimento e incorporação de EdU, foi possível observar que o estresse oxidativo induziu diminuição acentuada no número de parasitos em cultura, enquanto os sobreviventes continuaram proliferando e replicando DNA. Observamos também que o estresse oxidativo agudo provocou arrest de ciclo celular na fase G2/M em parte da população em crescimento exponencial. Em conjunto, esses resultados sugerem a presença de um sistema muito eficiente de resposta a danos oxidativos no DNA telomérico, que permite que os parasitos sobrevivam e repliquem DNA mesmo após um estresse agudo / Abstract: Leishmaniasis is a spectrum of diseases caused by parasites of the genus Leishmania that affects million people around the world. During infection, parasites use different strategies to survive host defenses including overcoming exposure to Reactive Oxygen Species (ROS), mainly responsible for causing DNA damage, especially at telomeres which frequently results in genome instability, senescence and cell death. Telomeres are chromosomes end termini structures composed by repetitive DNA coupled with proteins whose function is to protect chromosome ends and avoid end-fusion and nucleolytic degradation. In this work, we induced acute oxidative stress in promastigote forms of Leishmania amazonensis by treating parasites with 2mM hydrogen peroxide (H2O2) for 1 hour, which was able to increase intracellular ROS levels, as demonstrated by CM-H2DCFDA reaction. In addition, oxidative stress induced DNA damage, as confirmed by quantitative analysis of 8-oxodG and TUNEL-positive nuclei. We have also observed using qualitative and quantitative parameters (Southern blot, telomere-PCR and flow-FISH) that oxidative stress, as in mammals, induced telomere shortening. Analysing the protein:DNA co-localization and interaction by FISH-IIF and ChIP assays, it was possible to show that oxidative stress is able to induce erosion of the 3¿G overhang, inducing a displacement of LaRPA-1 from its telomeric interaction site. In addition, we observed an increase in the affinity between LaRPA-1 and the telomeric C-rich strand, in this case, a single-strand region inside the double-strand telomeric DNA generated probably as a consequence of DNA repair, suggesting the participation of LaRPA-1 in oxidative DNA damage response. Analysis of growth curves and EdU incorporation showed that oxidative stress induced a decrease in the number of parasites in culture, while the survivors continued proliferating and replicating DNA. Moreover, as result of acute oxidative stress, part of the parasites in exponential growth shows a G2/M cell cycle arrest. Taken together, these results suggest the presence of a very efficient oxidative damage response in the telomeres that allows parasites to survive and to replicate DNA even after acute stress / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A proposta deste estudo foi comparar a eficácia de tratamento da aplicação tópica de hidrocortisona, do ultra-som terapêutico e da fonoforese no processo de reparo do tendão de Aquiles (tendo calcaneus) de ratos, após tenotomia. O grupo controle foi definido como tenotomizados com simulação da aplicação sônica e tendões não tenotomizados. Os dois grupos tratados com ultra-som terapêutico foram no modo pulsado. A irradiação do ultra-som terapêutico foi realizada na freqüência de 1 MHz e uma intensidade de 0.5 Watts por centímetro ao quadrado (SATA), por cinco minutos cada sessão. No 13° dia de pós-operatório, os tendões foram removidos e analisados por meio da microscopia de luz polarizada, com o propósito de investigar e medir a organização das fibras de colágeno, por meio da birrefringência. Os resultados demonstraram que o grupo tratado com a aplicação tópica de hidrocortisona apresentou valores estatísticos similares ao grupo que recebeu simulação sônica, indicando que não houve penetração da hidrocortisona e que as moléculas de colágeno responderam a estimulação ultra-sônica. Tal fato acontece provavelmente originado pelo efeito piezoelétrico que o ultra-som causa no tecido. O tratamento com fonoforese demonstrou ser o método mais eficiente, devido a maior birrefringência, revelando melhor organização e agregação das fibras de colágeno. Esses achados permitem concluir que o ultra-som terapêutico estimula a aceleração do processo de reparo tecidual e induz a penetração transcutânea da hidrocortisona a 10% numa concentração terapêutica / The purpose of this study was to compare the treatment efficacy of topic hydrocortisone appliance, therapeutic ultrasound and phonophoresis on the rats’ Achilles tendon (tendo calcaneus) repair process after tenotomy. The control group was designed in tenotomized with sham sonic application and non-tenotomized tendons. The two treated groups with therapeutic ultrasound was made in a pulsed mode. The irradiation of therapeutic ultrasound was performed at a frequency of 1 MHz and an intensity of 0.5 Watts for square centimeter (SATA), for five minutes each session. On the 13 th postoperative day, the tendons were removed and analyzed using the polarized light microscopy, with the purpose to detect and measure the organization of collagen fibers through birefringence. The results showed that the treated group with the hydrocortisone topic appliance showed similar statistician values of group that received sham sonic treatment, indicating that not have delivery transdermal and that the molecule of collagen respond to the ultrasonic stimulation. This fact occurs probably by piezoelectric effect originated by ultrasound on the tissue. The treatment with phonophoresis demonstrated being the method more efficient, due the high birefringence, revealing the best organization and aggregation of collagen fibers. These findings allow conclude that the therapeutic ultrasound stimulate the acceleration of tissue repair process and induce the transdermal delivery of hydrocortisone 10% in a therapeutic concentration

As BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) são membros da superfamília de proteínas TGF-β (Transforming Growth Factor β ), regulam o crescimento e diferenciação de vários tipos celulares em diversos tecidos, e algumas delas desempenham um papel crítico na diferenciação de células de origem mesenquimal em osteoblastos. Particularmente, rhBMP2 e rhBMP7, promovem osteoindução tanto \"in vitro\" como \"in vivo,\" sendo, ambas as proteínas utilizadas terapeuticamente em Ortopedia/Odontologia para reparo ósseo. A expressão diferencial de genes durante a osteodiferenciação de células C2C12 induzida por rhBMP2 e rhBMP7, foi analisada através de microarranjos de DNA, selecionando 31 genes, dos quais 24 foram validados por qPCR, 13 dos quais são relacionados à transcrição, quatro associados a algumas vias de sinalização celular e sete associados à matriz extracelular. Análise funcional destes genes permitirá conhecer, com maiores detalhes, os eventos moleculares que ocorrem durante a diferenciação osteoblástica de células C2C12 induzida por rhBMPs. Em paralelo, foi perseguida a super-expressão de rhBMP2 e rhBMP7 em células HEK293T, demonstrando-se a atividade de rhBMP7, induzindo osteodiferenciação \"in vitro\" e formação de osso \"in vivo\", demonstrando a viabilidade do objetivo de se produzir estas proteínas para futura aplicação como biofármacos no Brasil. / The BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) are members of the TGF-β (Transforming Growth Factor β) superfamily of proteins, regulate growth and differentiation of various cell types in various tissues, and some play a critical role in differentiation of mesenchymal cells into osteoblasts. Particularly, rhBMP2 and rhBMP7, promote osteoinduction \"in vitro\" and \"in vivo\" and both proteins are used therapeutically in Orthopedics and Dentistry. The differential expression of genes during osteodifferentiation induced by rhBMP2 and rhBMP7 in C2C12 cells was analyzed through DNA microarrays, allowing the selection of 31 genes, of which 24 were validated by qPCR, 13 of which are related to transcription, four associated with cell signaling pathways and seven are associated with the extracellular matrix. Subsequent functional analysis of these genes should reveal more details on the molecular events which take place during C2C12 cells osteoblastic differentiation induced by rhBMPs In paralel, rhBMPs 2 and 7 were overexpressed in HEK293T cells and BMP7 activity to induce osteodifferentiation \"in vitro\" and bone formation \"in vivo\" was demonstrated, reinforcing the viability of our objective to produce these proteins for future application as biopharmaceuticals in Brazil.

A leptospirose é uma zoonose de importância mundial, e é causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, pertencente à ordem Spirochaetales. Os seres humanos são hospedeiros acidentais e os surtos de leptospirose ocorrem em grandes centros urbanos após enchentes contaminadas por urina de ratos. Existem poucas informações a respeito de como Leptospira spp lida com situações de estresse induzidas pelo hospedeiro e pelo ambiente. O ferro é um íon essencial para a maioria dos seres vivos. A regulação de genes envolvidos por seu aporte e estoque na célula bacteriana é mediada por proteínas da família de reguladores transcricionais, Fur (ferric uptake regulator). L. interrogans sorovar Copenhageni possui quatro ortólogos para Fur, que foram alvo de estudo deste trabalho. A caracterização destes genes foi realizada através de estudos evolutivos, determinação do seu padrão de expressão em modelo animal e análise de modelagem estrutural. Durante o andamento do mestrado, ensaios paralelos revelaram resultados promissores na análise de expressão de genes relacionados ao sistema SOS, um mecanismo de resposta bacteriano a danos no material genético. Assim sendo, o estudo de caracterização de expressão em modelo animal suscetível e resistente à doença foi ampliado. Ensaios de qRT-PCR de cDNAs provenientes de pulmão, rim e fígado permitiram a identificação de dois genes que foram expressos quase que constitutivamente ao longo de toda a infecção em todos os órgãos e organismos estudados: fur979 e recA. Os demais foram requeridos em dias específicos da infecção. Quanto aos componentes do sistema SOS, observamos padrão de expressão específico para o rim, no quinto dia após a infecção. Para os estudos evolutivos de Fur foi gerada uma árvore filogenética que revelou o agrupamento de duas sequências da família Fur de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni em ramos fechados com sequências muito similares a proteína Fur e Zur de Escherichia coli. Os outros dois ortólogos agruparam com as proteínas correspondentes nas demais espécies de Leptospira. Uma destas sequências apresentou padrão evolutivo específico dentre as espécies patogênicas. A modelagem da estrutura terciária, confirmou o padrão evolutivo obtido em nossa inferência filogenética. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by pathogenic bacteria from the genus Leptospira, order Spirochetales. Human beings are accidental hosts, and leptospirosis outbreaks occur in large urban centers after contact with contaminated waterby rodent urine. There are few informations concerning the mechanisms employed by Leptospira sppto deal with the stress induced by the host and the environment Iron is an essential ion to most of living beings. The regulation of genes involved in its uptake and maintenance in the bacterial cell is mediated by the transcriptional regulator family proteins, Fur (ferric uptake regulators). L. interrogans serovar Copenhageni possesses four orthologues for Fur, which were the focus of this work. The characterization of Leptospira Fur genes was done through evolutive studies, determination of their expression pattern on animal model and structural modeling analysis. In parallel, some experiments presented promising results for the expression analysis of genes related to the SOS system, a bacterial response mechanism to DNA damage. Therefore, the gene expression characterization on susceptible and resistant animal model was amplified. qRT-PCR experiments of cDNA from lung, kidney and liver allowed the identification of two genes expressed almost constitutively during the infection in all organs and organisms : fur979 and recA. The others were required in specific days of the infection. Curiously, the SOS system components showed specific expression pattern in the fifth day after inoculation, in kidney. For the Fur evolutive studies, a phylogenetic tree was inferred, revealing the clustering of two Fur family sequences from Leptospira interrogans serovar Copenhageni in closed branches with very similar sequences to Fur and Zur proteins from Escherichia coli. The other two orthologues clustered with corresponding proteins in the other Leptospira species. One of these sequences presented a specific evolutive pattern among pathogenic species. The tertiary structure modeling confirmed the evolutive pattern obtained in our phylogenetic inference.

Objetivo: Avaliar por meio de análises radiográfica e histológica os efeitos da associação do laser de diodo e do fator de crescimento de fibroblastos no tratamento de dentes de ratos reimplantados tardiamente. Método: Cinquenta ratos (Rattus norvegicus albinus, Wistar) tiveram seus incisivos superiores direitos extraídos, a papila dental removida, e por via retrógrada, o preparo e preenchimento dos canais radiculares com pasta de hidróxido de cálcio. Em seguida, os espécimes foram aleatoriamente divididos em cinco grupos: C+ (controle positivo)- reimplante imediato; C- (controle negativo)- reimplante tardio, mantidos em meio ambiente seco por sessenta minutos, sem tratamento adicional; LA (laser de alta potência)-reimplante tardio associado ao tratamento prévio da superfície radicular com irradiação por varredura com laser diodo de alta potência (810nm, modo contínuo, fibra óptica de 600&#956;m, 1,5W input, 30s); FGF (Fator de crescimento de fibroblastos)- reimplante tardio associado à aplicação do fator de crescimento de fibroblastos 50 &#956;g na concentração de 0,2% FGF-2 em gel de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) a 3% sobre a superfície radicular lingual e no interior do alvéolo dental de cada espécime; LA+FGF (Laser de alta potência e FGF)- reimplante tardio, com tratamento prévio da superfície radicular com laser diodo nos mesmos parâmetros do grupo LA, associado à aplicação do FGF-2 da mesma forma que no grupo FGF. A eutanásia dos animais ocorreu após sessenta dias. Os espécimes foram radiografados digitalmente e processados para análise descritiva dos eventos histológicos e análise da porcentagem de fibras colágenas do tipo I por meio do método Picrosirius Red. Resultados: Na análise radiográfica, o grupo LA+FGF apresentou o menor número e porcentagem de áreas reabsorvidas (p<0,05). Com a análise dos eventos histológicos por meio de escores, o grupo LA apresentou as menores médias de reabsorção substitutiva e inflamatória e anquilose, seguido pelo grupo LA+FGF e não diferindo estatisticamente do grupo controle positivo. O grupo LA+FGF apresentou o melhor reparo periodontal entre os grupos experimentais, com a maior quantidade de fibras colágenas espessas, (p<0,05). Conclusões: A irradiação da superfície radicular com laser de diodo de alta potência associada ou não ao FGF-2 reduziu a incidência de reabsorções radiculares externas e anquilose. A aplicação do FGF-2 favoreceu o reparo do ligamento periodontal, embora a reinserção das fibras não tenha ocorrido em todos os espécimes. / Aim: The aim of this study was to evaluate, by radiographic and histological analyses, the effects of high-power diode laser irradiation and fibroblast growth factor (FGF) in the treatment of delayed replanted rat teeth. Methods: Fifty rats ratos (Rattus norvegicus albinus, Wistar) had their maxillary right incisors extracted, the dental papilla removed, and by a retrograde way, the root canals were prepared and filled with calcium hydroxide paste. Subsequently, the specimens were randomly assigned to five groups: C+ (positive control)- immediate replantation; C- (negative control)- delayed replantation, left on the bench for sixty minutes, without additional treatment; LA (Diode laser high potency)- delayed replantation and root surface treatment scanning irradiation with a high-power diode laser (810nm, continuous mode, optic fiber 600&#956;m, 1.5W input, 30s); FGF (Fibroblast Growth Factor) - delayed replantation and topical application of 50&#956;g 0,2% FGF-2 gel in 3% hydroxylpropyl methylcellulose matrix (HPMC) over the lingual root surface and into dental alveolus of each specimen; LA+FGF (Diode laser high potency + Fibroblast Growth Factor)- delayed replantation and root surface treatment irradiation with a diode laser using the same parameters as those used for LA group, associated to topical application of FGF-2 in the same way as FGF group. The rats were euthanized after sixty days of replantation. The specimens were digitally radiographed and processed for descriptive histological events analysis and percentage analysis of type I collagen fibers by the Picrosírius red method. Results: By radiographic analysis, the minnor number and percentage of resorpted areas were seen in LA+FGF group (p<0.05). In the histological analysis through scores, the LA group showed lower means of replacement and inflammatory resorption and ankylosis and followed by LA+FGF group and they were not statistically different of positive control group. The LA+FGF group showed the best periodontal healing of all experimental groups, with the greater number of thick collagen fibers stained (p<0,05). Conclusions: The irradiation of root surface treatment with high-power diode laser associated or not to FGF-2 reduced the occurrence of external root resorption and ankylosis. The FGF-2 application favored the periodontal ligament healing, but the fibers reinsertion not occurred in all the specimens.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2018-06-18T19:03:08Z No. of bitstreams: 1 Fernando Gredinare Foster.pdf: 984670 bytes, checksum: afea175c4e00ac9803bd6bdda1570d7d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-18T19:03:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernando Gredinare Foster.pdf: 984670 bytes, checksum: afea175c4e00ac9803bd6bdda1570d7d (MD5) Previous issue date: 2016-12-17 / The bone defects are caused by several factors and the repair process can be slow, where inflammatory and proliferative phases of remodeling of this tissue are extremely important for the quality of the repair. There are several therapies where the main is the surgery and in this case, the use of bone substitutes can be indicated. However the repair process may require assistance. Thus, the use of activated charcoal as bone substitute when the implementation of low-power laser to aid bone repair can be an alternative to these problems. The aim of this study was to verify the use of activated carbon felt as bone substitute and the interaction with the laser in the process of bone repair in rat tibias, assessing biochemical, histological and biomechanical changes. Material and methods: male wistar rats, 35 were used between 150 g to 200 g, with 3 months of age. The animals were anesthetized with ketamine hydrochloride and Association (90mg/Kg and 10mg/Kg, IP). Once anesthetized, the animals were put on surgical table, the skin was dissected and were made monocortical bone defects in the central region of the right tibia of mice. Immediately after surgery the rats were randomized and divided into the following groups: control (CTL), untreated Injury (NT), Lesion treated with activated carbon felt (AF), Lesion treated with lasertherapy (L6J) and Lesion treated with association of activated carbon felt and laser 830nm, 6J-100mW (AF+L). After 28 days the animals were euthanized with overdose of the same anesthetic, blood was collected and the tibia was taken for biochemical, histological and biomechanical analysis. Committee of ethics: AN00462014-UNINOVE. Results: the NT group reduction in bending forces and histological changes related to disorganization of the tissue. The group showed no L improve mechanical properties, whereas AF increase the strain in compare to CTL. AF+L group presented better flexion forces, related with improvement of histological aspects, however increased the alkaline phosphatase levels. Conclusion: the use of activated carbon felt seems to improve the bone repair induced in this study. The laser association with activated carbon felt showed improvement of biomechanical properties and still the histological results have a better aspect. / Lesões ósseas são difíceis de serem tratadas e dependendo do grau da lesão, a intervenção cirúrgica é um dos tratamentos utilizados. Neste caso, o uso de substitutos ósseos pode ser necessário. A terapia com laser de baixa potência tqmbém é indicada como terapia auxiliar, pela sua importante ação analgésica e de reparo. Porém, pouco se sabe a respeito da interação entre biomateriais e laserterapia. O objetivo deste trabalho foi verificar o uso do feltro ativado como substituto ósseo e a interação com a laserterapia de baixa potência no processo de reparo ósseo em tíbias de ratos, analisando aspectos histológicos, bioquímicos e biomecânicos. Material e Métodos: Foram utilizados 35 ratos wistar, entre 150g à 200g, com 3 meses de idade. Depois de anestesiados, os animais foram colocados em mesa cirúrgica, a pele foi dissecada e o defeito ósseo monocortical foi confeccionado na região central da tíbia direita dos animais. Imediatamente após a cirurgia os ratos foram randomizados e organizados nos seguintes grupos: Controle (CTL), Lesão não tratado (NT), Lesão tratado com feltro ativado (AF), Lesão tratado com Laser (L6J) e Lesão tratado com associação do feltro ativado e laser 830nm, 6J – 100mW (AF+L). Após 28 dias os animais foram eutanasiados, o sangue foi coletado e a tíbia removida para análises histológicas e biomecânicas. Resultados: O grupo NT apresentou redução do reparo ósseo traduzido pela baixa organização histológica e redução da resistência mecânica. O grupo AF apresentou aumento da capacidade de deformação enquanto que o grupo L apresentou melhor organização histológica. O grupo AF+L apresentou melhora na resistência mecânica. Concluímos que o laser associado ao uso do feltro de carbono ativado auxiliou o reparo ósseo no modelo de lesão em tíbia de ratos.