A esquistossomose representa um grande problema de saúde pública em regiões tropicais, negligenciado pelas empresas farmacêuticas. Três genes foram selecionados a partir do transcriptoma do S. mansoni para serem caracterizados molecularmente e testados como vacinas. O gene da Carboxipeptidase apresentou altos níveis de transcrição no estágio de cercária e uma variável expressão protéica nos estágios intra-hospedeiros. A proteína recombinante renaturada apresentou baixa atividade. O gene da Esfingomielinase apresentou alto nível transcricional em ovos, sendo expresso em todos os estágios exceto em esquistossômulos de 7 dias e fêmeas. O gene da Fosfatase Alcalina apresentou elevada transcrição em cercária, mas a expressão da proteína se eleva somente no estágio de esquistossômulo. A imunização de camundongos com cada uma das três proteínas recombinantes expressas em E. coli não levou à redução da carga parasitária após desafio. Estes resultados demonstram que diversas características de um antígeno são necessárias para que este seja um bom candidato vacinal. / Schistosomiasis is a major public health problem in tropical areas and neglected by most of the pharmaceutical companies. Three genes were selected from S. mansoni transcriptome to be molecularly characterized and tested as vaccines. The Carboxypeptidase gene showed high transcription levels in cercariae stage and a variable protein expression in intra-host stages. The refolded recombinant protein showed limited activity. The Sphingomyelinase gene showed the highest level of transcriptional activity in the egg stage and the protein is expressed in all stages but 7-day old schistosomula and females. The Alkaline Phosphatase gene showed a high transcriptional activity in cercariae stage with most of the mRNA being translated into protein as soon as it penetrates its definitive host. Immunization of mice with each of the three proteins did not show reduction in worm burden recovery after challenge. These results demonstrate that several characteristics of an antigen are important for it to be considered a good vaccine candidate.

Esquistossomose é uma doença crônica e debilitante. Schistosoma representa a única classe de trematódeos com vida dióica. Um contínuo pareamento com o macho é essencial para a maturação sexual do sexo feminino. Fêmeas adultas provenientes de infecções uni-sexuadas são subdesenvolvidas, apresentam atrofia do tamanho e um sistema reprodutivo imaturo. Para estudar os mecanismos envolvidos no pareamento de vermes adultos foram utilizadas duas plataformas de microarranjos distintas: uma composta por 4 mil sondas de cDNA dupla fita produzida pelo nosso grupo de pesquisas e outra composta por 44 mil sondas de oligonucleotideos desenhadas pelo nosso grupo e produzida pela empresa Agilent Technologies. Com a plataforma de 4 mil sondas detectamos 113 transcritos diferencialmente expressos em fêmeas adultas mantidas separadas de seus respectivos pares durante 24 horas de cultivo in vitro quando comparadas com fêmeas adultas pareadas; para 10 destes genes obtivemos uma confirmação adicional da expressão diferencial por transcrição reversa fita específica seguida de PCR em Tempo Real. Observamos também os efeitos do pareamento no perfil de expressão gênica de machos adultos mantidos separados de seus respectivos pares durante 24 horas de cultivo in vitro; foram encontrados 152 transcritos diferencialmente expressos. Com a plataforma de 44 mil sondas foi detectada a expressão de 5.798 genes transcricionalmente ativos em verme adulto, em um conjunto de 19.907 genes únicos representados nesta plataforma. A análise do conjunto de genes \"no match\" mostrou que em 156 genes ocorria expressão senso e anti-senso; para 6 destes transcritos obtivemos uma confirmação adicional da expressão nas duas fitas por transcrição reversa fita específica seguida de PCR em Tempo Real. Adicionalmente foram identificados 2717 transcritos diferencialmente expressos em fêmeas separadas de seus respectivos pares durante 13 dias de cultivo in vitro, quando comparadas com fêmeas mantidas pareadas. Para as análises com machos separados durante 13 dias foram encontrados 243 transcritos diferencialmente expressos. Por fim, realizamos estudos com o objetivo de observar os genes que podem estar correlacionados com o contato físico do pareamento (macho e fêmea) e genes que podem ser regulados pela possível difusão de proteínas e hormônios secretados no meio, para os quais a mudança do nível de expressão não dependa da necessidade de contato entre o macho e a fêmea. Sabe-se que o contato direto da fêmea com o macho é necessário para manter a atividade reprodutiva feminina e observamos que o re-pareamento pode restabelecer o perfil de expressão gênica de fêmeas ou machos separados. Além disso, observamos que fêmeas separadas e depois mantidas na presença do macho, porém sem re-pareamento, apresentam uma expressão gênica diferente das fêmeas separadas e depois mantidas na ausência de machos, sugerindo que algum fator secretado pelo macho no meio regula a expressão. Este trabalho representa uma importante contribuição no entendimento da relação macho-fêmea em nível molecular. / Schistosomiasis is a chronic and debilitating disease. Schistosoma represents the only class of trematodes with a dioecious life. A continuous pairing with the male is essential for female sexual maturation. Adult females from uni-sexual infections are underdeveloped, have body atrophy and an immature reproductive system. To study the mechanisms involved in pairing of adult worms two microarray platforms were used: one comprised by 4000 cDNA probes and printed by our research group and another comprised by 44 000 oligonucleotide probes designed by our group and printed by Agilent Technologies Company. With the 4000-probes platform we detected 113 transcripts differentially expressed in adult females kept separated from their mates during 24 hours in vitro when compared with paired adult females; for 10 of these genes we obtained additional confirmation of differential expression by Real Time RT-PCR. We also observed the effects of pairing on the gene expression profile of adult males kept separate from their mates during 24 hours in vitro, where we found 152 differentially expressed transcripts. With the 44 000-probes platform we detected the expression of 5798 genes in adult worms, out of a set of 19 907 unique genes represented on this platform. Analysis of the \"no match\" genes showed that 156 have transcription from the sense and anti-sense strands; for 6 of them we obtained additional confirmation of expression by strand specific Real Time RT-PCR. Additionally, we identified 2717 differentially expressed transcripts in females separated from their mates during 13 days in vitro when compared to females that remained paired. In the analysis of males separated for 13 days we found 243 differentially expressed transcripts. Finally, we performed a study aimed at observing genes which might be correlated to physical contact pairing (male and female) and compared to genes that might be regulated by the possible diffusion of secreted proteins and hormones in the medium, for which the change of expression level does not depend on physical contact between male and female. It is known that direct female-male contact is needed to keep the female reproductively activity and we observed that repairing can restore the gene expression profile of females or males that were kept separated. Furthermore, we observed that females separated and then maintained in the presence of male, but without re-pairing, have a different gene expression from the separated females kept without males, suggesting that some male secreted factors might be involved in gene regulation. This work represents an important contribution to the understanding of male-female relation at the molecular level

Lok Chui-Lin. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2005. / Includes bibliographical references (leaves 142-157). / Abstracts in English and Chinese. / Statement --- p.I / Acknowledgement --- p.II / Abstract --- p.IV / Chinese Abstract (摘要） --- p.VI / Abbreviation --- p.VIII / Table of Contents --- p.XIII / List of Tables --- p.XVII / List of Figures --- p.XVIII / Chapter Chapter One : --- Literature Review --- p.1 / Chapter 1.1 --- The Schistosoma Species --- p.1 / Chapter 1.1.1 --- The Schistosoma Gene Discovery --- p.3 / Chapter 1.1.2 --- Schistosome Transcriptome --- p.4 / Chapter 1.2 --- Schistosomiasis --- p.4 / Chapter 1.2.1 --- Immunopathology of Schistosomiasis --- p.5 / Chapter 1.2.2 --- Diagnosis of Schistosomiasis --- p.7 / Chapter 1.2.3 --- Treatment and Control for Schistosomiasis --- p.7 / Chapter 1.2.4 --- Vaccine Development for Schistosomiasis --- p.8 / Chapter 1.3 --- "The Species, Schistosoma japonicum" --- p.9 / Chapter 1.3.1 --- The Life Cycle of Schistosoma japonicum --- p.10 / Chapter 1.3.1.1 --- "The Egg, Miracidium Phase of the Life Cycle" --- p.12 / Chapter 1.3.1.2 --- Developmental Cycle within Mollusc Host --- p.12 / Chapter 1.3.1.3 --- The Cercaria Phase of Life Cycle --- p.13 / Chapter 1.3.1.4 --- Adult Schistosome in Definitive Host --- p.14 / Chapter 1.4 --- Invasion by Schistosome Cercariae --- p.15 / Chapter 1.5 --- "The Anti-inflammatory Protein, Sml6" --- p.16 / Chapter 1.5.1 --- Discovery of Sm 16 --- p.16 / Chapter 1.5.2 --- Cloning and Expression of Gene-encoding Sm 16 --- p.17 / Chapter 1.5.3 --- Potential Anti-inflammatory Therapy using Sm 16 --- p.18 / Chapter 1.6 --- Innate Immunity and Adaptive Immunity --- p.18 / Chapter 1.6.1 --- Macrophage --- p.18 / Chapter 1.6.2 --- Major Histocompatiblity Complex (MHC) --- p.20 / Chapter 1.6.3 --- Adaptive Immunity to Parasites --- p.20 / Chapter 1.7 --- Inflammation --- p.21 / Chapter 1.7.1 --- Cells of the Inflammatory Process --- p.23 / Chapter 1.7.2 --- Cytokines --- p.24 / Chapter 1.7.2.1 --- Interleukin-1 (IL-1) System --- p.26 / Chapter 1.7.2.2 --- Interferon (IFN) System --- p.27 / Chapter 1.7.3 --- Anti-inflammatory Therapy --- p.28 / Chapter 1.8 --- Aim of Study --- p.29 / Chapter Chapter Two : --- Materials and Methods --- p.30 / Chapter 2.1 --- Materials --- p.30 / Chapter 2.1.1 --- "Cell Lines, Mouse Strain and Bacterial Strains" --- p.30 / Chapter 2.1.2 --- Plasmids --- p.31 / Chapter 2.1.3 --- Chemicals --- p.31 / Chapter 2.1.4 --- "Kits, Nucleic Acids and Reagents" --- p.34 / Chapter 2.1.5 --- Antibodies and Immunoglobins --- p.35 / Chapter 2.1.6 --- Cell Culture Reagents --- p.35 / Chapter 2.1.7 --- Solutions --- p.36 / Chapter 2.1.8 --- Solutions of Reaction Kits --- p.39 / Chapter 2.1.9 --- Enzymes --- p.41 / Chapter 2.1.10 --- Major Equipments and Materials --- p.41 / Chapter 2.1.11 --- Primers --- p.43 / Chapter 2.1.11.1 --- Sequencing and Sj 16 Gene-coding Specific Primers --- p.43 / Chapter 2.1.11.2 --- Primers for Cytokines --- p.43 / Chapter 2.2 --- Methods --- p.45 / Chapter 2.2.1 --- Amplification of Sjl6 cDNA from Schistosoma japonicum Cercariae --- p.45 / Chapter 2.2.1.1 --- Isolation of Cercariae total RNA by Guanidinium Thiocyanate - Cesium Chloride Ultracentrifugation --- p.45 / Chapter 2.2.1.2 --- Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) --- p.46 / Chapter 2.2.1.2.1 --- Reverse Transcription (RT) --- p.46 / Chapter 2.2.1.2.2 --- Polymerase Chain Reaction (PCR) --- p.46 / Chapter 2.2.2 --- Cloning and Subcloning of Sj 16 --- p.47 / Chapter 2.2.2.1 --- Preparation of DH5a Competent Cells --- p.47 / Chapter 2.2.2.2 --- Purification of Plasmid DNA --- p.48 / Chapter 2.2.2.3 --- Restriction Enzyme Digestion of DNA --- p.49 / Chapter 2.2.2.4 --- Purification of DNA Fragments from Agarose Gel --- p.50 / Chapter 2.2.2.5 --- Ligation of Purified DNA Fragments --- p.51 / Chapter 2.2.2.6 --- Transformation of Recombinant Plasmid --- p.52 / Chapter 2.2.2.7 --- Selection of Transformed Clones --- p.52 / Chapter 2.2.2.7.1 --- Screening by X-gal and IPTG : a-complementation --- p.52 / Chapter 2.2.2.7.2 --- Screening by Polymerase Chain Reaction --- p.53 / Chapter 2.2.2.8 --- Cycle Sequencing --- p.53 / Chapter 2.2.3 --- Expression of the rSj 16 in Eukaryotic System --- p.55 / Chapter 2.2.3.1 --- Transfection of pSecTag2B/Sj 16 Plasmid into Animal Cells --- p.55 / Chapter 2.2.3.2 --- PCR Screening of Transfected Cells --- p.56 / Chapter 2.2.3.3 --- Analysis of mRNA Transcript by RT-PCR --- p.56 / Chapter 2.2.3.4 --- Concentration of the Condition Medium --- p.57 / Chapter 2.2.3.5 --- Western Blot analysis of rSjl6 Expression --- p.58 / Chapter 2.2.4 --- Expression of rSjl6 in Bacterial System --- p.59 / Chapter 2.2.4.1 --- Transformation of pET30a+/Sjl6 Plasmid into BL21 --- p.59 / Chapter 2.2.4.2 --- Optimization of rSj 16 Expression --- p.60 / Chapter 2.2.4.3 --- Solubility of the rSjl6 --- p.60 / Chapter 2.2.4.4 --- Estimation of rSj 16 Concentration --- p.62 / Chapter 2.2.4.5 --- Western Blot Analysis of rSj 16 --- p.62 / Chapter 2.2.5 --- Recombinant Protein Purification --- p.63 / Chapter 2.2.5.1 --- Affinity Chromatography of Recombinant Protein --- p.63 / Chapter 2.2.5.2 --- Dialysis of Eluted Recombinant Protein in PBS --- p.64 / Chapter 2.2.5.3 --- Estimation of Recombinant Protein Concentration --- p.65 / Chapter 2.2.6 --- Demonstrate the Anti-inflammatory Activity of rSj 16 --- p.65 / Chapter 2.2.6.1 --- Thioglycollate Induced Macrophage Recruitment --- p.65 / Chapter 2.2.6.2 --- Cytospin and Hemacolor Staining of PECs --- p.66 / Chapter 2.2.6.3 --- FACS Analysis of PECs --- p.67 / Chapter 2.2.6.4 --- Isolation of total RNA by TRIZOL Reagent --- p.67 / Chapter 2.2.7 --- Immunogenicity and Antigenicity of rSjl6 --- p.68 / Chapter 2.2.7.1 --- Western Blot of rSjl6 with Schistosoma japonicum infected rabbit serum --- p.69 / Chapter 2.2.7.2 --- Preparation of Anti-Sj 16 Serum --- p.69 / Chapter 2.2.7.3 --- Western Blot of rSjl6 with immunized mice serum --- p.70 / Chapter 2.2.8 --- FACS analysis of MHC (I) Expression --- p.71 / Chapter 2.2.9 --- Anti-proliferative Assay using BrdU Kit --- p.72 / Chapter Chapter Three : --- Results --- p.73 / Chapter 3.1 --- Amplification of Sj 16 cDNA from Schistosoma japonicum Cercariae total RNA --- p.73 / Chapter 3.2 --- Construction of pBluescript II SK(-) / Sjl6 --- p.75 / Chapter 3.3 --- Analysis of Sj 16 Nucleotide and Amino Acid Sequence --- p.78 / Chapter 3.3.1 --- Blastn Search Analysis --- p.80 / Chapter 3.3.2 --- Blastx Search Analysis --- p.82 / Chapter 3.3.3 --- Structural Analysis --- p.84 / Chapter 3.4 --- Subcloning of Sjl6 cDNA into pET30a+ and pSecTag2B Expression Vector --- p.88 / Chapter 3.5 --- Expression of the rSj 16 --- p.92 / Chapter 3.5.1 --- Animal Cell Expression --- p.92 / Chapter 3.5.1.1 --- Analysis of mRNA Transcript by RT-PCR --- p.93 / Chapter 3.5.1.2 --- Western Blot of Condition Medium --- p.95 / Chapter 3.5.2 --- Bacterial Cell Expression --- p.97 / Chapter 3.5.2.1 --- Optimization of rSjl6 Expression --- p.97 / Chapter 3.5.2.2 --- Estimation of rSjl6 Concentration --- p.98 / Chapter 3.5.2.3 --- Solubility of rSj16 --- p.99 / Chapter 3.5.2.4 --- Western Blot Analysis of rSjl6 --- p.100 / Chapter 3.6 --- Purification of Recombinant Protein --- p.101 / Chapter 3.6.1 --- Purification of rSj16 --- p.101 / Chapter 3.6.2 --- Purification of rSjCa8 --- p.104 / Chapter 3.7 --- Anti-inflammatory Activity of rSj 16 --- p.107 / Chapter 3.7.1 --- Analysis of PECs in Thioglycollate Induced Inflammation --- p.107 / Chapter 3.7.2 --- Hemacolor Staining of PECs --- p.110 / Chapter 3.7.3 --- FACS Analysis of PECs --- p.110 / Chapter 3.7.4 --- RT-PCR of RNA Isolated from PECs --- p.115 / Chapter 3.8 --- Immunogenicity and Antigenicity of rSjl6 --- p.117 / Chapter 3.8.1 --- Immunogenicity of rSj 16 --- p.117 / Chapter 3.8.2 --- Antigenicity of rSj16 --- p.117 / Chapter 3.9 --- Inhibitory Effect of rSj 16 on rMuIFN-a4 Induced Up-regulation of MHC(I) Expression --- p.120 / Chapter 3.9.1 --- Time Course of rMuIFN-α4 Induced Up-regulation of MHC(I) Expression --- p.120 / Chapter 3.9.2 --- Inhibitory Effect of rSjl6 on rMuIFN-α4 Induced MHC (I) Up-regulation --- p.120 / Chapter 3.9.3 --- "Anti-proliferation Effect of rMuIFN-a4, rSj 16 and rSjCa 8" --- p.124 / Chapter 3.9.4 --- Effect of Signal Transduction Inhibitors on rMuIFN-a4 Induced MHC (I) Up-regulation --- p.126 / Chapter Chapter Four : --- Discussion and Conclusion --- p.129 / Chapter 4.1 --- Discussion --- p.129 / Chapter 4.1.1 --- Overview --- p.129 / Chapter 4.1.2 --- Molecular and Structural Analysis of rSj 16 --- p.130 / Chapter 4.1.3 --- Relationship between Sml6 and Sjl6 --- p.131 / Chapter 4.1.4 --- Anti-inflammatory Activity of rSj 16 --- p.132 / Chapter 4.1.5 --- Immunogenicity and Antigenicity of rSjl6 --- p.137 / Chapter 4.1.6 --- Inhibitory Effect of rSjl6 on rMuIFN-a4 Induced Up-regulation of MHC (I) Expression --- p.138 / Chapter 4.1.7 --- Relation between Sj 16 and the Innate Immune System --- p.139 / Chapter 4.1.8 --- Further Study and Significance --- p.140 / Chapter 4.2 --- Conclusion --- p.141 / References --- p.142

A esquistossomose é uma das mais relevantes doenças induzidas por helmintos, acometendo cerca de 207 milhões de pessoas em todo o mundo. O Praziquantel e o Oxamniquine são os fármacos empregados no tratamento, mas além de não impedirem re-infecções, não atuam nos estágios imaturos do verme. Portanto, o desenvolvimento de uma estratégia de vacinação eficaz representa um componente essencial para o controle e erradicação desta doença. Neste sentido, tivemos como objetivo estudar a resposta imunológica induzida pela imunização com a vacina DNA-Sm14 em associação com a DNA-Hsp65 utilizando protocolos de imunização prime-boost, sendo eles heterólogo ou homólogo. A utilização das vacinas em prime-boost heterólogo não alterou a produção de IgG2a, mas diminuiu a produção de IFN- e IL-10 dos animais quando comparados aos que receberam apenas DNA-Sm14. Após infecção, a estratégia prime-boost heterólogo não foi eficaz em reduzir a carga parasitária dos animais, enquanto a vacinação com DNA-Sm14 reduziu parcialmente o número de vermes. Na vacinação prime-boost homóloga utilizando as duas vacinas, observamos que a modificação da estratégia também não alterou a produção de IgG2a, mas reduziu a produção de IFN- pelas células recuperadas do espaço bronco-alveolar, quando comparada com os animais que receberam DNA-Sm14. Após infecção, a imunização com DNA-Sm14/DNA-Hsp65 não alterou a carga parasitária dos animais, mas sistemicamente reduziu o número de eosinófilos. Quando avaliado o perfil de células de memória dos animais vacinados, verificamos aumento do número de células T CD8+ e menor número de células T CD4+ no baço dos animais imunizados com as duas vacinas simultaneamente. Em suma, a utilização das vacinas DNA-Sm14 e DNA-Hsp65 nas estratégias prime-boost heterólogo ou homólogo não foi capaz de gerar proteção contra infecção experimental por S. mansoni, e sugerimos que em parte, a diminuição de IFN-, IL-10, aumento da razão IgG1/IgG2a e a estimulação de células T CD8+ ao invés de CD4+, podem ter contribuído para baixa eficácia dos protocolos vacinais testados. / Schistosomiasis is one of the most important diseases due to helminthes, affecting approximately 207 million people worldwide. The treatment is based on Praziquantel and Oxamniquine drugs, however these drugs do not avoid reinfections and are inefficient against worm immature stages. Therefore, the development of an efficient vaccination strategy is an essential component in the control of this disease. The aim of this work was to study the immune response induced by immunization with DNA-Sm14 vaccine in combination with DNA-Hsp65 using prime-boost protocols, which were heterologous or homologous. The heterologous prime-boost vaccination did not modify IgG2a production, but decreased IFN- and IL-10 production compared to animals that received only DNA-Sm14. After infection, this prime-boost strategy was not effective in reducing the worm burden of animals, while vaccination with DNA-Sm14 induced partial reduction. Using both vaccines in the homologous prime-boost model, we found that the modification of the strategy did not alter IgG2a production, although reduced IFN- production by cells recovered from the broncho-alveolar space compared to DNA-Sm14 immunized mice. After infection, immunization with DNA-Sm14/DNA-Hsp65 didnt modify the animals parasitic burden, however systemically, reduced eosinophils number. When the profile of memory cells in vaccinated animals was evaluated, we verified increased numbers of CD8+ T cells and lower numbers of CD4+ T cells in the spleen of animals immunized with both vaccines simultaneously. In conclusion, the vaccines DNA-Sm14 and DNA-Hsp65 in both strategies, prime-boost heterologous or homologous, were not able to generate protection against experimental infection with S. mansoni, and we propose that, partly, the decrease of IFN-, IL-10 levels, increase of IgG1/IgG2a ratio and the stimulation of CD8+ T cells rather than CD4+, may have contributed to the low efficacy of the vaccination protocols tested.

As doenças parasitárias são uma das maiores causas de morte em países em desenvolvimento, e recebem pouca ou nenhuma atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de terapias. A esquistossomose mansoni também conhecida como barriga d´água ou doença do caramujo é uma doença parasitária crônica que afeta aproximadamente 207 milhões de pessoas no mundo sendo aproximadamente 6 milhões somente no Brasil. Os medicamentos disponíveis no mercado causam graves efeitos colaterais. Além disso, há relatos de cepas de S. mansoni resistentes à esses medicamentos, justificando assim a busca por novos fármacos. O Schistosoma mansoni não possui a via de novo para a biosíntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação para o suprimento dessa. Assim, este trabalho teve como objetivo determinar as constantes catalíticas e a estrutura tridimensional da MTAP (EC 2.4.2.28), enzima esta que participam da via de salvação de purinas, e é desta forma essencial para a reprodução do parasita. Esta enzima foi expressa de forma heteróloga, purificada e cristalizada. A proteína foi submetida à ensaios cinéticos em sistema acoplado, onde foram determinadas as constantes catalíticas. A proteína foi também cristalizada em condições que continham 100 mM de Bis-tris ou MES com pH variando entre 6,1 a 6,5 e PEG3350, cuja concentração variou ente 14-18%. Os cristais foram submetidos à difração de raios-X no LNLS e no DLS. Foram obtidos, quatro conjuntos de dados, que foram processados, refinados e analisados. Obteve-se estrutura apoenzima em complexo com fosfato, em complexo com adenina e sulfato, em complexo com tubercidina e sulfato e em complexo com adenina e glicerol em um grupo espacial diferente dos demais. Através da estrutura secundária, foi possível analisar o sítio ativo, além de obter informações preliminares do mecanismo catalítico da enzima alvo. Este trabalho colabora para a futura elucidação completa da via de salvação de purinas em S. mansoni, e fornece informações básicas para que a busca por novos fármacos tenha novos ramos a serem explorados. / The parasitic illness are the leading cause of deaths in developing countries, and receives little or no attention from drug companies to develop therapies. Schistosomiasis mansoni also known as water belly or snail´s disease is a chronic parasitic illness that affects approximately 207 million people worldwide with approximately 6 million in Brazil. Schistosomiasis is treated by the use of drugs that are not-in fact effective for the eradication of the disease, and although their efficiency cause serious side effects. In addition, there are reports of S. mansoni´s resistant strains to these drugs, thus justifying the search for new drugs. The Schistosoma mansoni parasite does not possess the de novo pathway for purine bases biosynthesis and depends entirely on salvage pathways for its purine requirement. Thus this study aimed to determine the catalytic constants and three-dimensional structure of MTAP (EC 2.4.2.28), an enzyme that is involved in purine salvation pathway, and is thus essential to the reproduction of the parasite. The MTAP was heterologously expressed, purified and crystallized. The protein was submitted to kinetic assays in coupled system, to determine the catalytic constants. The protein was crystallized in 100mM Bis-tris or MES pH 6.1-6.5 and 14-18% PEG 3350. The crystals were submitted to diffraction of rays-X in the LNLS and DLS. Data sets were obtained, processed, refined and analyzed. Structures were obtained in apoenzyme form complexed with fosfate, complexed with adenine and sulfate, complexed with tubercidin and sulfate, and with adenine and glycerol in a space group different of the others. Through the secondary structure, it was possible to analyze the active site and obtained preliminary information of the catalytic mechanism of the target enzyme. This study contributes to the complete elucidation of the purine salvation pathway in S. mansoni, and provides basic information for the research of the new drugs.

As proteínas ligadoras de ácidos graxos (Fatty Acid Binding Proteins, FABPs) de parasitos têm um papel importante no processo de infecção por estes organismos. Por este motivo, estas proteínas são antígenos candidatos para vacina contra a infecção por Schistosoma mansoni e Fasciola hepatica. No presente trabalho foram caracterizadas FABPs de F. hepatica e comparadas com a proteína Sm14 de S. mansoni, a FABP de parasito melhor caracterizada, mediante análise de sequências e estruturas modeladas. Também foram clonadas, expressas e purificadas as FABPs tipo 1 e tipo 3 de F. hepatica. Os resultados do presente estudo indicam que a FABP tipo 3 de F. hepatica é relacionada estrutural, imunológica e funcionalmente com a Sm14, um candidato vacinal amplamente estudado. Devido à importância da Sm14 como alvo para o desenvolvimento de vacina para a esquistossomose, as características apresentadas pela FhFABP3 de F. hepatica apontam esta proteína como um candidato importante também para o desenvolvimento de uma vacina contra a fasciolose / Parasites fatty acid binding proteins (FABPs) have an important role in infection process by these organisms. For this reason, these proteins are candidates as vaccine antigens against Schistosoma mansoni and Fasciola hepatica infection. In the present study, FABPs from F. hepatica were characterized and compared with Sm14 protein from S. mansoni, the best characterized parasite FABP, by sequence analysis and modeled structure. Type 1 and type 3 FABPs from F. hepatica were also cloned, expressed and purified. The results of this study indicated that type 3 FABP from F. hepatica is structural, immunological and functionally related with Sm14, a vaccine candidate widely studied. Due to the importance of Sm14 as a target for vaccine development for schistosomiasis, the characteristics presented by the FhFABP3 from F. hepatica suggest this protein as a candidate also important for the development of a vaccine against fasciolosis

A esquistossomose representa um grande problema de saúde pública em regiões tropicais, negligenciado pelas empresas farmacêuticas. Três genes foram selecionados a partir do transcriptoma do S. mansoni para serem caracterizados molecularmente e testados como vacinas. O gene da Carboxipeptidase apresentou altos níveis de transcrição no estágio de cercária e uma variável expressão protéica nos estágios intra-hospedeiros. A proteína recombinante renaturada apresentou baixa atividade. O gene da Esfingomielinase apresentou alto nível transcricional em ovos, sendo expresso em todos os estágios exceto em esquistossômulos de 7 dias e fêmeas. O gene da Fosfatase Alcalina apresentou elevada transcrição em cercária, mas a expressão da proteína se eleva somente no estágio de esquistossômulo. A imunização de camundongos com cada uma das três proteínas recombinantes expressas em E. coli não levou à redução da carga parasitária após desafio. Estes resultados demonstram que diversas características de um antígeno são necessárias para que este seja um bom candidato vacinal. / Schistosomiasis is a major public health problem in tropical areas and neglected by most of the pharmaceutical companies. Three genes were selected from S. mansoni transcriptome to be molecularly characterized and tested as vaccines. The Carboxypeptidase gene showed high transcription levels in cercariae stage and a variable protein expression in intra-host stages. The refolded recombinant protein showed limited activity. The Sphingomyelinase gene showed the highest level of transcriptional activity in the egg stage and the protein is expressed in all stages but 7-day old schistosomula and females. The Alkaline Phosphatase gene showed a high transcriptional activity in cercariae stage with most of the mRNA being translated into protein as soon as it penetrates its definitive host. Immunization of mice with each of the three proteins did not show reduction in worm burden recovery after challenge. These results demonstrate that several characteristics of an antigen are important for it to be considered a good vaccine candidate.

A doença granulomatosa inflamatória envolve interações coordenadas entre linfócitos, monócitos/macrófagos, células epitelióides, eosinófilos, neutrófilos e fibroblastos. A comunicação intercelular mediada por junções gap, constituídas por conexinas, é responsável pela homeostase tecidual. A Cx43 está presente em células linfóides, células mielóides, fibroblastos e outras. Assim, para compreendermos o possível envolvimento das conexinas no granuloma, nós analisamos o efeito da deleção heterozigótica de uma Gja1 (gene Cx43) na formação e desenvolvimento dos granulomas hepáticos, induzidos por ovos de Schistosoma mansoni. Para tanto, camundongos heterozigotos (Cx43+/-) e selvagens (Cx43+/+) foram infectados com cercárias de Schistosoma mansoni e avaliados nos tempos: 6, 8 e 12 semanas após a infecção. As células dos granulomas apresentaram expressão de conexina 43, notadamente após 12 semanas de infecção. As lesões dos camundongos Cx43+/- apresentaram índice de proliferação reduzido e aumento na deposição de colágeno em fases tardias da doença. Apesar desses achados, não se encontrou redução no tamanho e celularidade das lesões em comparação aos camundongos selvagens. Também não obtivemos diferenças em relação ao hemograma ou população de linfócitos esplênicos CD4, CD8 e CD19. As células peritoneais dos animais de ambos genótipos apresentaram produção de NO e H<SUB2O<SUB2 similares. Contudo, os neutrófilos e monócitos sanguíneos dos animais Cx43+/-, estimulados por PMA, apresentaram aumento significante do burst oxidativo. Concluindo, nossos resultados indicam que a deleção de um alelo do gene da Cx43 modifica claramente a evolução da doença granulomatosa, mostrando um papel desta conexina no desenvolvimento do granuloma. / Inflammatory granulomatous disease involves coordinated interactions among lymphocytes, monocytes/macrophages, epithelioid cells, eosinophils, neutrophils and fibroblasts. Intercellular communication mediated by gap junctions constituted of connexins, is responsible for tissue homeostasis. Cx43 is present in lymphoid cells, myelogenous cells, fibroblasts and others. In order to understand the possible involvement of connexins in granuloma, we analyzed the effect of the heterologous deletion of a Gja1 (Cx43 gene) on the formation and development of hepatic granulomas induced by Schistosoma mansoni eggs. Heterozigous (Cx43+/-) and wild-type (Cx43+/+) mice were infected with S. mansoni cercarie and evaluated after 6, 8 and 12 weeks. Granuloma cells express Cx43, with considerable reduction in Cx43+/- mice. Moreover, granuloma cells from Cx43v+/- mice displayed reduced proliferation and increased collagen deposition at late phases of the disease. Despite these findings, no reduction of size or cellularity of the lesions was found in comparison to wild-type mice. We didn?t find differences in relation to blood count and splenic lymphocyte population CD4, CD8 and CD19. Peritoneal cells from animals of both genotypes presented similar production of NO and H2O2. However, blood neutrophils and monocytes from Cx43+/- mice, stimulated by PMA, displayed significantly increased oxidative burst. In conclusion, our results indicate that the deletion of one allele of the Cx43 gene clearly modifies the evolution of a granulomatous disease, supporting a role for this connexin on granuloma development.

Este trabalho mostrou a purificação de uma apirase em extratos de tegumento de vermes adultos de S. mansoni com razão de hidrólise de ADP/ATP aproximadamente 2. Análise da amostra por MALDI-TOF evidenciou a presença de helicase e carboxilesterase, sendo que a atividade de hidrólise de ADP ainda não foi descrita para estas proteínas. Através de \"Western blot\" mostrou-se que a proteína purificada não tem epítopos reconhecíveis por anticorpo anti-apirase de batata, e que a imunoreatividade cruzada com apirase da família CD39 está presente na fração insolúvel que não foi utilizada no processo de purificação. Esta tese caracteriza também a utilização de \"primers\" consenso degenerados na construção de bibliotecas de cDNA com PCR de baixa estringência. A introdução do \"touch-down\" PCR aumentou o número médio de sequências não redundantes por biblioteca de 20 para 40. O \"touch-down\" associado ao uso de primers híbridos consenso-degenerados (40 pb) elevou a média de sequências não redundantes para 300. Este número significa uma diminuição de cerca de 10 vezes na quantidade de trabalho de clonagem e sequenciamento necessário para se gerar o mesmo montante de dados (Fietto et al., 2000, addendum patent application Nº196,716). A diminuição da concentração de sal na reação e abaixamento da velocidade de rampa entre os passos de anelamento e extensão gerou os melhores perfis de amplificação de cDNA. Bibliotecas feitas com primers híbridos mais curtos (25 pb) mostraram-se mais redundantes, refletindo uma maior especificidade por certas sequências alvo. Com estes primers, usando-se RNAm de tegumento, clonamos um fragmento parcial de cDNA altamente homólogo à CD39 de camundongo. Esta sequência serviu como base para o isolamento de grande parte do gene de Schistosoma (2,9 Kb) através de RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends). / This work shows purification of an apyrase from the tegument membrane of S. mansoni adult worms that exhibited an ADP/ATP hydrolysis ratio near 2. MALDI-TOF analyses showed that helicase and carboxylesterase were present in the sample, however in the literature there is no ADPase activity described for either enzyme. Western blot analyses showed that the purified apyrase ha no epitopes common to members of the CD39 apyrase family. On the other hand, a CD39-like apyrase remained in the insoluble fraction that was not used in the purification procedures. This work studied the construction of cDNA libraries with Hybrid Consensus-degenerate Oligonucleotide Primers (40bp) and low stringency RT-PCR. Introduction of touch-down PCR in the standard ORESTES technique improved the number of non-redundant sequences per library twofold. Association of touch-down with hybrid consensus-degenerated oligonucleotide primers increased this number to 300 sequences per library. The modifications resulted in a 10-fold decrease in the amount of work required for libraries construction and high-throughput sequencing (Fietto et al., 2000; addendum to patent application #196,716 - Ludwig Institute for Cancer Research). The best amplification profiles were obtained in RT-PCR reactions with low salt and a slow temperature ramp. Libraries made with shorter hybrid primers (25bp) showed more redundant sequences, reflecting a higher specificity for few templates. These shorter primers were used in combination with tegument mRNA to clone a gene fragment homologous to CD39 of mouse. This sequence was used in RACE-PCR reactions (rapid amplification of cDNA ends) to clone a 2.9 Kb cDNA corresponding to most of the predicted coding sequence of the Schistosoma gene.

O BCG é um bacilo atenuado de Mycobacterium bovis atualmente investigado na expressão de antígenos heterólogos. Genes oriundos de vírus, bactérias e parasitas são clonados em vetores de expressão micobacterianos e a partir deles, são geradas cepas de BCG recombinante, rBCG. Duas cepas micobacterianas, BCG e M. smegmatis, demonstraram a expressão do antígeno SmStoLP-2 e animais imunizados com este BCG não demonstra diferença na proteção contra a infecção por cercárias, apesar da resposta imune diferenciada. A otimização do códon de SmTSP-2 e SmVAL-5 permitiu sua expressão em M. smegmatis recombinante, mas não em BCG. M. smegmatis transformado com uma biblioteca de plasmídeos contendo o promotor L5p mutagenizado à montante de egfp demonstra acentuada diferença na fluorescência. 3 destes plasmídeos definidos como \'\'forte\'\' e \'\'fraco\'\', com base em sua capacidade de produzir GFP foram utilizados para expressar em BCG o antígeno Sm29 em maior e menor nível. / BCG is an attenuated bacillus derived from Mycobacterium bovis currently being investigated to express foreign antigens. Genes from viruses, bacteria and parasites are cloned to mycobacterial vectors and with them, recombinant BCG strains are created. Recombinant BCG and M. smegmatis strains where capable to express SmStoLP-2 and mice immunized with these rBCGs do not show better protection against infection with cercariae, although the distinct immune response observed. The use of codon optimization made possible the expression of SmTSP-2 and SmVAL-5 in M. smegmatis but not BCG. M. smegmatis transformed with a library of plasmids containing the L5p upstream egfp gene show a wide range in fluorescence. 3 of these plasmids strong and weak defined as their ability to produce GFP were used to express in BCG the antigen Sm29 at different levels by each promoter.