Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-11T13:42:17Z No. of bitstreams: 2 TESE Adriana da Silva Andrade Pereira.pdf: 6828087 bytes, checksum: 9d66e9700be0a70e927b955ee06cb850 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-11T13:42:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Adriana da Silva Andrade Pereira.pdf: 6828087 bytes, checksum: 9d66e9700be0a70e927b955ee06cb850 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-17 / CNPq; CAPES / Schistosoma mansoni, é um dos mais importantes parasitas que infectam seres humanos. No nordeste do Brasil, a esquistossomose é historicamente endêmica e considerada como um problema de saúde pública. No estado de Pernambuco, particularmente no litoral e zona da Mata, predomina a cepa São Lourenço da Mata (SLM). Estudos ultraestruturais desta cepa até então ainda não foram realizados, embora análises morfométricas e morfológicas de outras cepas existentes no Brasil já tenham sido publicadas na literatura. Os vermes são bem adaptados ao hospedeiro, tendo a sua longevidade vista como uma conseqüência do eficaz escape do sistema imune. Na circulação sanguínea os vermes devem obter lipídios a partir do hospedeiro, já que eles não sintetizam tais compostos, sendo as lipoproteínas plasmáticas a possível fonte de tais lipídios, além de poderem atuar mascarando o reconhecimento do verme pelo sistema imune. Neste trabalho, microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi utilizada para a análise morfológica e morfométrica de cercárias e vermes adultos de S. mansoni cepa SLM, bem como para estudar a interação da lipoproteína de baixa densidade (LDL) com o tegumento do parasito. Também foram usadas diferentes técnicas para a localização e identificação das proteínas envolvidas no processo de absorção e/ou transporte de lipoproteínas no verme adulto de S. mansoni. As cercárias foram obtidas de caramujos Biomphalaria glabrata e os vermes adultos de camundongos machos Mus musculus e Swiss, ambos infectados pela cepa SLM de S. mansoni. Os resultados da SEM mostraram que os corpos da cercárias são cobertos por espinhos, com uma ventosa ventral, uma ventosa oral com receptores sensoriais, e um par de glândulas de penetração na cabeça. Seu comprimento total variou de 174 a 290μm. O comprimento dos vermes adultos machos foi de 4mm e das fêmeas 5mm. O comprimento da região anterior do macho foi de 470μm e 271μm para o sexo feminino. Todos os parâmetros foram realizados em dez amostras. Os valores encontrados na morfometria da cepa SLM foram menores que em outras cepas de S. mansoni já descritas. Através da microscopia eletrônica de transmissão (TEM), os experimentos de imunomarcação mostraram partículas de ouro localizadas dentro do tegumento, na região muscular e espículas dos machos e em torno das células vitelínicas das fêmeas. A utilização de técnicas tais como imunoblotting e “liquid chromatography–mass spectrometry” (LC-MS) proporcionaram a identificação no S. mansoni de duas formas diferentes da chaperona Hsp 70, proteínas envolvidas na interação com a apo-B e o seu transporte para o retículo endoplasmático, sendo responsável também pela ruptura das interações clatrina-clatrina na endocitose humana. Com a descoberta destas proteínas, novos estudos serão necessários para esclarecer o papel funcional das mesmas no S. mansoni.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:48:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1276_1.pdf: 1492422 bytes, checksum: a909298503f5ea7da3bf64aee390832f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A esquistossomose mansônica é uma doença endêmica em várias partes das América e da África, causada pelo Schistosoma mansoni. Segundo dados da Organização Mundial de Saúde existem entre 200 e 300 milhões de pessoas infectadas no mundo e aproximadamente 1 bilhão sob risco. O verme adulto do Schistosoma mansoni adquiriu uma habilidade peculiar para escapar do ataque do sistema imune do hospedeiro. Muitos mecanismos têm sido propostos para explicar a sobrevivência do parasita, um deles é a aquisição de lipoproteínas plasmáticas. O que chama a atenção para as lipoproteínas nestes mecanismos é o fato de os esquistossômulos não sintetizarem nem colesterol, nem ácidos graxos de cadeia longa, entretanto, estes compostos estão presentes nas suas estruturas. Provavelmente, eles adquirem do hospedeiro através da interação do tegumento do verme com as lipoproteínas no sangue do animal infectado. Neste trabalho, microscopia eletrônica de varredura, eletroforese 2-D e immunoblotting foram utilizadas como ferramentas para estudar a interação da lipoproteína de baixa densidade (LDL) com o tegumento do Schistosoma mansoni e identificar a proteína ligante de LDL. Depois de 50 dias de infecção (100 cercárias, cepa São Lourenço da Mata - SLM), camundongos albinos (Mus musculus) foram sacrificados e os vermes adultos retirados, os quais foram separados para incubação com LDL para a microscopia eletrônica de varredura e preparação do extrato para identificação da proteína ligante de LDL. Os vermes foram lavados e incubados em meio de cultura RPMI 1640 + 10% (v/v) de soro deficiente de lipoproteína (LPDS), contendo 40 μg de LDL/mL durante 30, 60, 120 min. Vermes controles foram processados da mesma forma sem LDL. O extrato de proteínas foi obtido e 200 μg de proteínas foram aplicadas em fitas gradiente de pH imobilizado (IPG strip), 7 cm, pH=3-10, seguidos de focalização isoelétrica no sistema Multiphor II (GE Healthcare) e SDS-PAGE. Proteínas foram transferidas para membranas de PDVF, e bloqueadas com caseína 3%. Subsequentemente, incubações foram feitas com soro humano, anticorpo policlonal anti-LDL (chicken) e conjugado peroxidase anti-chicken (IgG). A membrana foi revelada com substrato TMB e duas bandas foram identificadas apresentando pesos moleculares e pontos isoelétricos (pI) de 55.5 kDa e pI 5.12 e de 28.5 kDa e pI 7.17, respectivamente. Os resultados da microscopia eletrônica de varredura demonstraram uma maior interação de partículas de LDL com a região dorsal mediana do parasita, em relação à outras regiões do tegumento. Agregados lipoprotéicos foram observados nas incubações de 30 e 60 min, sendo verificado uma diminuição na incubação de 120 min. O tamanho das partículas de LDL diminuiu com o tempo de incubação, esses resultados sugerem que a redução do tamanho das partículas pode ser devido ao uso dos lipídeos das lipoproteínas pelo verme. Concluímos que a identificação da proteína ligante poderá ajudar novos projetos terapêuticos, levando a um bloqueio da interação LDL/parasita e consequentemente a morte dos vermes

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-28T13:48:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação para biblioteca- Versão digital.pdf: 3924060 bytes, checksum: 99b5d3f2c655eb2094f3e4cf887ae8c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T13:48:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação para biblioteca- Versão digital.pdf: 3924060 bytes, checksum: 99b5d3f2c655eb2094f3e4cf887ae8c9 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / CNPq / Descendentes adultos de mães esquistossomóticas demonstraram alteração da imunidade para antígenos homológos e heterólogos, devido á gestação ou amamentação nestas mães. A gestação em descendentes, sob infecção pós-natal concomitantemente imunizados com OA(ovalbumina)+adjuvante, demonstrou maior número de granulomas e alta deposição de colágeno enquanto que a amamentação diminuiu o tamanho. Para o antígeno heterólogo, ambas a gestação e a amamentação levaram à imunossupressão anti-OA. Contudo, sabe-se pouco sobre os efeitos da sensibilização materna com antígenos parasitários do verme do S. mansoni (SWAP). Aqui, as mães foram sensibilizadas com SWAP e foi avaliada a imunidade em descendentes nascidos e/ou amamentados. Para isto, descendentes adultos foram divididos em: animais nascidos de mães sensibilizadas e amamentados em mães não-sensibilizadas (MI), animais nascidos em mães não-sensibilizadas e amamentados em mães sensibilizadas (AI) ou nascidos e/amamentados (MIAI) em mães sensibilizadas e mães não-sensibilizadas (Controle). Estes descendentes foram infectados (80 cercárias de S. mansoni) e uma parte foi imunizada com OA+adjuvante. Realizou-se a dupla marcação para linfócitos T e coestimulatórias (CD4 e CD28, CD154 ou CTLA-4) e macrófagos (CD14 e CD40) em esplenócitos, sob estimulação com OA ou mitógeno (ConA). Foi realizada a dosagem das citocinas (IL-4, IL-10, IL-5 e IFN-γ), e anticorpos IgG1 e IgG2a anti-SWAP e antiOA, bem como a histomorfometria do granuloma hepático. Em relação ao Controle, os grupos AI e MIAI, sob infecção pós-natal apresentaram menor grau de fibrose e não houve diferença no grupo MI. Houve maior produção de IL-10 nos grupos MIAI, AI e MI, com diminuição de IL-5 e maior frequência de células CD14+CD40+ no primeiro e menor produção de IFN- e maior frequência de células CD4+CD28+ no segundo. No grupo MI, houve maior frequência basal de células CD4+CD28+ e CD14+CD40+, porém estiveram diminuídas em resposta ao mitógeno. Houve maior produção de isótipo IgG2a anti-SWAP em todos os grupos experimentais e de IgG1 anti-SWAP apenas no grupo AI.Para a imunidade anti-OA, no grupo MIAI, houve maior frequência de células CD14+/CD40, menor produção de IL-5 sem diferença na produção de anticorpos anti-OA. Amamentação induziu maior frequência de células CD4+/CD28, CD4+/CTLA-4, CD14+/CD40, maiores níveis de IL-4 e menos IFN-γ basal e em resposta à OA e maior produção de IgG1 anti-OA. A gestação induziu maior frequência basal de células CD14+/CD40+ e menor frequência em resposta à OA e ConA, maiores níveis de IL-4, em resposta à OA, sem diferença para IFN-γ. Em resposta ao mitógeno, menos células CD4+CD28+, alta frequência de células CD40/CD154, e altos níveis de IL-10. Assim, a amamentação, e não a gestação, em mães sensibilizadas com SWAP, seguida de infecção pós-natal ameniza a inflamação granulomatosa. Para o antígeno heterólogo, ambos gestação e amamentação desviam a resposta para Th2, porém a amamentação melhora os status de ativação de linfócitos e macrófagos, acompanhada de melhor resposta de anticorpos anti-OA. / Descendants adult schistosome mothers had alterations of immunity to homologous and heterologous antigens due to pregnancy or breastfeeding these mothers. The pregnancy in offspring in postnatal infection concomitantly immunized with OA (ovalbumin) + adjuvant, demonstrated great number of granulomas and high deposition of collagen, while suckled decreased size. For the heterologous antigen, both pregnancy and breastfeeding led to anti-OA immunosuppression. However, little is known about the effects of maternal sensitization with worm parasite antigens of S. mansoni (SWAP). Here, mothers were sensitized with SWAP and immunity was evaluated in born and / or breastfed offspring. For this, adult descendants were divided into animals born sensitized mothers and breastfed in non-sensitized mothers (BIM), animals born in nonsensitized and breastfeeding mothers sensitized mothers (SIM) or born and / breastfed (BSIM) in mothers sensitized mothers and non-sensitized (CONTROL). These offspring were infected (80 cercariae of S. mansoni) and a part was immunized with adjuvant + OA. Was performed for double labeling T lymphocytes and co-stimulatory (CD4 and CD28 or CTLA-4 CD154) and macrophages (CD14 and CD40) in splenocytes, OA or upon stimulation with mitogen (ConA). the dosage of cytokines was performed (IL-4, IL-10, IL-5 and IFN-γ) and IgG1 and IgG2a anti-SWAP and anti-OA and histomorphometry of hepatic granuloma. In relation to control, SIM and BSIM groups under postnatal infection had lower degree of fibrosis and no difference in BIM group. There was a greater IL-10 production in BSIM groups, SIM and BIM, with decreased IL-5 and increased frequency of CD14+ CD40+ in the first and lowest IFN-γ and increased frequency of CD4+ CD28+ in the second. In the BIM group had higher baseline frequency of CD4+CD28+ and CD14+CD40+ cells, but were reduced in response to mitogen. There was a higher production of isotype IgG2a anti-SWAP in all experimental groups and anti-IgG1 SWAP only in the SIM group. For the anti-OA immunity in BSIM group had a greater frequency of CD14+/ CD40 cells, decreased production of IL-5 with no difference in the production of anti-OA antibodies. Breastfeeding induced higher frequency of CD4+/CD28+ CD4+/CTLA-4+, CD14+/ CD40+ increased IL-4 levels under basal and IFN-γ and in response to OA and increased production of anti-OA IgG1. Pregnancy induced basal frequency of CD14+/ CD40+ and lower frequency in response to OA and Con-A, increased IL-4 levels in response to OA was no difference for IFN-γ. In response to mitogen less CD4+ CD28+ cells, CD40 high-frequency cells CD154, and high IL-10 levels. Thus, breastfeeding, and not pregnancy in mothers sensitized with SWAP, followed by postnatal alleviates granulomatous inflammation infection. For the heterologous antigen, both pregnancy and breastfeeding divert the response towards Th2, but breastfeeding enhances activation status of lymphocytes and macrophages, together with better anti-OA antibody response.

Orientador: Silmara Marques Allegretti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T03:19:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Frezza_TarsilaFerraz_M.pdf: 1047879 bytes, checksum: 74e06a87b1d60512f1a9f3f80aeb6639 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Para o tratamento da esquistossomose mansônica no Brasil, a Oxamniquina (OXA) e o Praziquantel (PRZ) são os fármacos escolhidos. O primeiro tem sua produção reduzida por causa dos efeitos colaterais, carcinogênicos e mutagênicos que apresenta. O segundo tem amplo espectro de atuação e baixa toxicidade, quando comparado ao OXA, mas tem a desvantagem de ser eliminado rapidamente pelo organismo. Além disso, tem ação dependente da idade do parasito e seu uso extensivo culmina na resistência do Schistosoma mansoni ao fármaco. Assim, o estudo de novas alternativas que tornem o PRZ mais disponível no organismo, com taxa de liberação mais adequada, é necessário. Uma dessas alternativas é sua incorporação ao lipossoma (LPZ). O presente trabalho teve por objetivo analisar o efeito do PRZ incorporado a LPZ (PRZ+LPZ) pela sua ação na sobrevida dos vermes adultos de S. mansoni, linhagem BH, e alteração na postura dos ovos além da sua ação na formação de granulomas no fígado. Foram testadas cinco doses de PRZ livre e PRZ+LPZ (40; 47; 60; 250 e 300 mg/kg) em camundongos Swiss, administradas por meio da tubagem esofágica, em dose única. Os lipossomas de fosfatidilcolina foram preparados pelo método da sonicação. Os camundongos foram divididos em dois grandes grupos (um deles foi tratado após 30 dias de infecção e o outro após 45 dias) sendo que em cada grupo, dez animais receberam uma determinada dose de PRZ a ser testada, para os outros dez a mesma dose, dessa vez com o PRZ+LPZ e para os dez restantes, Tampão Tris HCl pH 7,5. Após 15 dias da administração do tratamento, os animais foram sacrificados e necrospsiados. O tratamento feito com PRZ+LPZ na dose de 300 mg/kg, administrado no 45º dia de infecção, mostrou-se mais eficaz para a maioria dos parâmetros analisados (maior quantidade de vermes fora do sistema porta-hepático ¿ indicando uma resposta do verme à ação do fármaco - maior redução no número de vermes e de ovos nas fezes e maior redução dos ovos viáveis no intestino ¿ principalmente dos imaturos). Provavelmente, este tratamento alterou a oviposição do verme. Os órgãos dos camundongos tratados com PRZ+LPZ na dose 300 mg/kg, administrado no 30º dia de infecção, apresentaram poucas lesões. Além disso, não apresentaram granulomas nos fígados observados histologicamente, o que pode ser explicado pela baixa oviposição que ocorre nesse período, com o fato deste tratamento talvez ter a capacidade de minimizar a formação dos granulomas. O tratamento feito com PRZ+LPZ foi superior provavelmente porque aumentou a disponibilidade do fármaco no organismo assim como a sua solubilidade em meios aquosos. Além disso, o fármaco, quando incorporado, provavelmente foi absorvido com mais facilidade pelo verme, fazendo com que os danos provocados pelo PRZ no parasito, fossem mais profundos / Abstract: For the treatment of schistosomiasis mansoni in Brazil, the drugs of choice are Oxamniquina (OXA) and the Praziquantel (PRZ). OXA has its production reduced by its collateral, carcinogenic and mutagenic effects that it presents. PRZ has wide action spectrum and low toxicity, when compared to OXA. However, it has the disadvantage of being eliminated very fast by the organism. Besides, it has its action depending on the age of the parasite and its extensive use leads to a resistance of the Schistosoma mansoni to the drug. It¿s necessary the research of new alternatives to make PRZ more available in the organism, with more adequate liberation rate. One of these alternatives is its incorporation to the liposome (LPZ). The current work had as a target to analyze the effect of the PRZ incorporated to LPZ (PRZ+LPZ) by its action in the survival of adult worms of Schistosoma mansoni, BH strain, and alteration in the laying of eggs beyond its action in the formation of granulomas in the liver. Five doses were tested of PRZ e PRZ+LPZ (40; 47; 60; 250 and 300 mg/kg) in Swiss mice, administered by the intragastric route in only one dose. The liposomes of phosphatidilcoline were prepared by the method of sonication. The mice were divided in two big groups (one of them was treated after 30 days of infection and the other group treated after 45 days) and in each group ten animals received a determined dose of PRZ to be tested, to the other ten the same dose, this time with PRZ+LPZ and to the last ten, Busser Tris HCl pH 7,5. After 15 days of the administration of the treatment, the animals were sacrificed and necropsies. The treatment done with PRZ+LPZ in the dose of 300 mg/kg, administered of the 45th day of the infection, showed itself superior to the majority of the analyzed parameters (higher quantity of worms outside the porta-hepatic system ¿which indicates a response of the worm to the action of the drug -, big reduction in the number of worms and eggs in the fezzes and big reduction of the viable eggs in the intestines ¿ mainly of immature eggs). Probably this treatment altered the oviposition of the worm. The organs of mice treated with PRZ+LPZ in dose of 300 mg/kg, administered in the 30est day of infection, presented fewer injuries. Besides, they don¿t show granulomas in the livers observed histological, which can be explained by the low oviposition that occurs in this period, with the fact that this treatment perhaps having the capacity of minimize the formation of granulomas. The treatment done with PRZ+LPZ was superior probably because the availability increased of the drug in the organism as well its solubility in water environment. Besides, the drug, when incorporated, probably was more easily absorbed by the worm, making the harm provoqued by PRZ deeper / Mestrado / Mestre em Parasitologia

Orientador: Luiz Augusto Magalhães / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T01:23:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoes_LucianaFranceschi_M.pdf: 1041430 bytes, checksum: 4b6e70c20a3f055898484e201cbe2d31 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A esquistossomose é uma doença parasitária grave e de larga distribuição geográfica, que acomete cerca de 200 milhões de pessoas no mundo e ao menos 600 milhões vivem em área de risco. No Brasil a doença é conhecida por xistosa ou barriga d'água e é causada pelo Schistosoma mansoni, verme que se abriga na veia porta e nas veias do plexo mesentérico do hospedeiro. Estima-se seis milhões de infectados no país e cerca de vinte milhões de pessoas vivendo em áreas de risco de infecção. Atualmente o tratamento da esquistossomose é baseado no uso de dois medicamentos: a oxamniquina e o praziquantel, sendo que apenas o último apresenta atividade sobre todas as espécies de Schistosoma que parasitam o homem. A busca de novos medicamentos para o tratamento dessa parasitose é relevante devido ao aparecimento de linhagens do verme tolerantes e resistentes aos fármacos disponíveis. O uso de plantas medicinais vem sendo apontado como alternativa no tratamento de parasitoses e aplicações em outras doenças. Por apresentarem fácil aceitabilidade, boa disponibilidade e baixo custo, extratos de plantas vêm sendo estudados e utilizados em experimentos para tratamento de várias moléstias. Neste trabalho avaliou-se o efeito e a ação esquistossomicida do extrato de Piper tuberculatum sobre o Schistosoma mansoni da linhagem BH. P. tuberculatum, também conhecida como pimenta d'árda é uma espécie representante da família Piperaceae, que vem sendo bastante estudada e apresenta propriedades antitumorais, hipotensora, fungicida e inseticida, entre outras. A avaliação do efeito do extrato da planta sobre o S. mansoni foi realizada em testes in vitro e in vivo. Para a diluição do extrato foi utilizado meio de cultura contendo 2% de Dimetilsulfóxido (DMSO) como diluente. O DMSO possui algumas propriedades terapêuticas, entre elas a de antiinflamatório. No teste in vitro, foram testadas as seguintes concentrações do extrato: 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 e 2000µg/ml. No teste in vivo, feito em Mus musculus infectados, o experimento foi realizado com a dosagem de 252 mg/ml diluído em salina com 2% de DMSO. Montou-se um grupo de animais que recebeu apenas salina com 2% de DMSO e um grupo controle que não recebeu tratamento algum. O extrato de P. tuberculatum mostrou-se bastante eficiente no teste in vitro, matando todos os vermes em até 72 horas, sendo que nas concentrações mais elevadas (1000 e 2000µg/ml) os vermes morreram em apenas 2 horas. Observou-se ainda que a mortalidade foi maior nos machos do que nas fêmeas. Nos experimentos in vivo, não se observou diferença significativa no número de ovos contados nas fezes antes e depois do tratamento, assim como não se observou diferença no número de granulomas hepáticos nos três grupos testados. Houve diminuição do tamanho dos granulomas hepáticos nos grupos cujos tratamentos continham DMSO, em comparação com o grupo não tratado. No tratamento com P. tuberculatum houve diminuição do número de ovos de 1º e 2º estágios em programas, o que sugere diminuição na postura de ovos por parte dos vermes. / Abstract: Schistosomiasis is a serious parasitic disease of wide geographical distribution. It affects about 200 million people worldwide and at least 600 million live in areas at risk. In Brazil, the disease is known as "xistosa" or "barriga d'água" and is caused by Schistosoma mansoni, a worm that inhabits the portal vein and mesenteric plexus. An estimated six million people are infected in Brazil and around twenty million live in areas at risk of infection. Currently, schistosomiasis treatment is based on the use of two drugs: oxamniquine and praziquantel, the latter is the only that shows activity on all species of Schistosoma that parasite mankind. The search for new drugs to treat this parasite is relevant due to the appearance of tolerant and resistant worm strains. The use of medicinal plants has been identified as an alternative in the treatment of this parasite and in other diseases. By demonstrating easy acceptance, good availability and lows costs, plant extracts have been studied and used in experiments for treatment of various diseases. This present work evaluated the antischistosomal effect and action of the Piper tuberculatum extract on the Schistosoma mansoni BH strain. P. tuberculatum, also known as "pimenta d'árda, belongs to the Piperaceae family and is studied by its anti-tumoral and hypotensive properties, fungicide and insecticide, among others. The evaluation of the effect of the plant extracts on S. mansoni was made in vitro and in vivo. Extracts dilutions were performed with culture medium containing 2% Dimethyl sulfoxide (DMSO) as diluent. The DMSO has certain therapeutic properties, including anti-inflammatory effects. In vitro, plant extracts were tested in the following concentrations: 25, 50, 100 250, 500, 750, 1000 and 2000µg/ml. In vivo tests were performed in infected Mus musculus conducted with 252 mg/ml diluted in saline with 2% DMSO. Two control groups were performed, receiving only saline with 2% DMSO or no treatment whatsoever. P. tuberculatum extracts proved to be very efficient in in vitro tests, killing all worms within 72 hours, with the highest concentrations (1000 and 2000µg/ml), worms were killed in just 2 hours. It was observed that the mortality was higher in males than in females. In vivo experiments did not demonstrate significant differences in the number of eggs counted in the faeces before and after the treatment, and there was no difference in the number of liver granulomas between the three treatments. A decrease in liver granuloma sizes in groups treated with DMSO, compared with the untreated group, was demonstrated. In the treatment with P. tuberculatum, there was a decrease in the number of eggs of 1st and 2nd stages in oograms, suggesting a decrease in oviposition by part of the worms. / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Parasitologia

A Adenina Fosforibosiltransferase (APRT E.C. 2.4.2.7) pertence à família de enzimas Fosforibosil Transferases (PRTase) do Tipo I , que catalisa a conversão reversível de Adenina e 5-fosfo-α-D-ribose-1-difosfato (PRPP) em difosfato e adenosina monofosfato, um importante precursor energético da célula. A APRT integra a via de salvação de purinas, única forma de suprir o balanço de purinas em Schistosoma mansoni. Este trabalho apresenta o isolamento, clonagem, expressão heteróloga e purificação da APRT de S. mansoni a fim de caracterizá-la quanto seus parâmetros físico-químicos. Não se obtendo cristais de proteína, foram elaborados modelos tridimensionais por homologia para estudos de dinâmica molecular e avaliação conformacional via tCONCOORD. A estrutura de APRT humana foi usada como controle nas simulações. Os dados computacionais e de biologia molecular foram comparados entre si para validação mútua e, verificou-se que a análise cuidadosa de dados computacionais é capaz de fornecer informações críticas sobre a APRT, auxiliando e guiando os estudos experimentais. Ainda, as simulações de dinâmica molecular foram capazes de evidenciar a abertura de loops do sítio ativo, explicitar a importância da análise de rotâmeros em modelos, permitindo, então, rearranjar da forma correta resíduos erroneamente modelados. Por fim, um estudo envolvendo mecanismo catalítico sugere a participação de uma molécula de água abstraindo o próton ligado ao N9 da adenina e, para efeito de comparação, um mecanismo alternativo independente desta participação também foi descrito. Ambas as observações expandem a corrente visão sobre o mecanismo catalítico de APRTs. / The Adenine Phoshoribosyltransferase (APRT E.C.2.4.2.7) belongs to the Phosphoribosyltransferase enzyme family (PRTase) of type I which catalyzes the reversible conversion of adenine and 5-phospho-α-D-ribose-1-diphosphate (PRPP) in diphosphate and adenosine monophosphate, an important source of this compound for the cell. APRT is involved in the purine salvage pathway, the only way that Schistosoma mansoni has to supply its purine demands. This work shows the isolation, cloning, heterologous expression and the purification of APRT from S. mansoni in order to establish its physical chemical and kinetics parameters. Since crystallographic structure was not obtained, we built homology models to perform molecular dynamics experiments and conformational evaluation via tCONCOORD. The human APRT structure was used as control in the simulation experiments. The computational and molecular biology data were compared for consistency and the detailed analysis of the former allowed us to improve experimental manipulation of APRT. The molecular dynamics experiments showed the opening of the loops of the catalytic binding site and the key function of rotamers. Finally, we were able to suggest that a water molecule may catch the proton of adenine N9. Both observations improve the current view of APRT catalytic mechanism.

La schistosomiase est la seconde endémie parasitaire mondiale après le paludisme puisqu’en 2016, environ 200 millions de personnes ont été traitées pour cette parasitose. Plusieurs espèces de schistosomes peuvent être la cause de cette maladie dont Schistosoma mansoni, responsable de la schistosomiase intestinale. Son cycle de vie est complexe et comprend deux hôtes : un hôte définitif vertébré, l’Humain et un hôte intermédiaire qui est un mollusque d’eau douce. Actuellement, un seul médicament, le praziquantel, est utilisé contre toutes les espèces de schistosomes, mais son utilisation de façon massive et répétée à favoriser l’émergence de souches parasitaire tolérantes et/ou résistantes. La nécessité de trouver de nouveaux médicaments et de nouveaux traitements est donc devenue impérative.Les lysines désacétylases ou KDAC(s) constituent des cibles thérapeutiques intéressantes, notamment parce que ce sont des enzymes impliquées dans des processus cellulaires essentiels tels que la régulation de l'expression des gènes et du cycle cellulaire, ou encore la différenciation cellulaire. À ce jour, des inhibiteurs de KDAC(s) sont déjà approuvés dans le traitement du cancer et d’autres sont en essais cliniques.Chez S. mansoni, trois KDAC(s) de classe I ont été identifiées: HDAC 1, 3 et 8. D'autre part, l'utilisation d'inhibiteurs de KDAC(s) a démontré qu'il était possible d'induire l'apoptose et la mort des parasites en culture. Des études réalisées sur la protéine HDAC8 humaine et SmHDAC8 ont montré qu'il existait des différences significatives au niveau de la poche catalytique entre ces deux protéines. Ces données soulignent l’intérêt de développer des inhibiteurs sélectifs de SmHDAC8. Il est devenu, néanmoins essentiel de déterminer le rôle de SmHDAC8 dans la biologie du parasite et notamment ses partenaires protéiques. De ce fait, la première partie de ce travail de thèse s’est focalisé sur la mise en évidence de l’interactome de l’enzyme parasitaire SmHDAC8. Par l’utilisation du système en double hybride chez la levure et de la co-immunoprécipitation couplée à la spectrométrie de masse, nous avons identifié plusieurs partenaires de SmHDAC8 qui sont impliqués dans des processus essentiels à la cellule tel que la régulation de la transcription et de la traduction, le cycle cellulaire, le métabolisme, la réparation de l’ADN, la protéolyse ou encore le transport des protéines. Parmi ces interactants, nous avons également retrouvé la GTPase SmRho1 suggérant que l’enzyme SmHDAC8 serait impliqué dans la modulation de l’organisation du cytosquelette.Dans une seconde partie, nous nous sommes donc intéresser à l’interaction entre SmHDAC8 et la SmRho1. Nous avons initialement démontré que cette interaction était bien présente chez le parasite et notamment chez les vers adultes et les schistosomules. L’acétylation de SmRho1 sur la lysine K136 a également été mise en évidence par spectrométrie de masse et nous avons aussi pu observer un effet de l’inhibition de SmHDAC8 sur l’organisation du cytosquelette d’actine chez le parasite.Deux isoformes de SmRho1 (SmRho1.1 et SmRho1.2) ont été identifiées et caractérisées. La technique du double hybride chez la levure et la co-immunoprécipitation en ovocytes de xénope, a permis de démontrer que seule SmRho1.1 pouvait interagir avec SmHDAC8. Enfin, la caractérisation des motifs d'interaction entre SmHDAC8 et SmRho1.1, par co-immunoprécipitation en ovocytes de xénope, suggère que le domaine C-terminal de SmRho1 serait impliqué dans cette interaction. Ces données sont en faveur d’un rôle potentiel de SmHDAC8 dans la modulation du cytosquelette d’actine via son interaction spécifique avec la GTPase SmRho1.1. / Schistosoma mansoni is the major parasitic platyhelminth species causing intestinal schistosomiasis, for which around 200 million people are in need of treatment. The schistosome life cycle is complex and includes two hosts: a definitive mammalian host, mainly humans in the case of S. mansoni, and an intermediate snail host. Currently one drug, praziquantel, is the treatment of choice against all species of schistosomes, but tolerant/resistant strains have been isolated in endemic areas following its extensive use in mass treatment programs, as well as in laboratory studies. The need to find new drugs and new treatments is therefore imperative.Lysine deacetylases (KDACs) form a family of enzymes that are conserved in metazoans. They are attractive therapeutic targets in a variety of pathologies, particularly cancer, because they are involved in the regulation of gene transcription and several KDAC inhibitors have already been approved as drugs. Our previous studies identified and characterized three class I KDACS in Schistosoma mansoni: HDAC 1, 3 and 8. Invalidation of the transcription of SmHDAC8 by RNAi led to the impaired survival of the worms after the infection of mice, showing that it is a valid therapeutic target.The analysis of the 3D structure of SmHDAC8 by X-ray crystallography showed that the catalytic domain structure diverges significantly from that of human HDAC8 and this was exploited to identify selective inhibitors that induce apoptosis and death of the worms and are thus lead compounds for the development of novel anti-schistosomal drugs.The precise biological roles of mammalian or schistosomal HDAC8 are unknown and in order to determine why SmHDAC8 knockdown or inhibition causes apoptosis and death it is essential to study the cellular signaling pathways involving SmHDAC8. In the first part of the work described in this thesis, protein partners of SmHDAC8 were characterized by screening a yeast two-hybrid cDNA library and co-immunoprecipitation/mass spectrometry (MS) analysis. SmHDAC8 partners are involved in different processes, included transcriptional and translational regulation, cell cycle, metabolism, DNA repair, proteolysis or protein transport. Among the partners thus identified the schistosome orthologue of the human RhoAGTPase, suggesting that SmHDAC8 may be involved in the modulation of the organization of the cytoskeleton.The second part of the work focused on the interaction between SmHDAC8 and SmRho1. In adult worms and schistosomula S. mansoni, SmHDAC8 interacts with SmRho1 GTPase which is acetylated on lysine K136. Treatment with an SmHDAC8 inhibitor caused massive disruption of the worm and schistosomula actin cytoskeleton. We have also identified two closely related isoforms of SmRho1 (SmRho1.1 and SmRho1.2). By using two heterologous expression systems (the yeast two hybrid assay and Xenopus oocytes), we have demonstrated a specific interaction between SmHDAC8 and SmRho1.1 involving its C-terminal moiety. Our results show that SmHDAC8 is potentially involved in cytoskeleton organization via its interaction with the SmRho1.1 isoform.

La plupart des études sur l’hybride naturel entre Schistosoma haematobium (S.) et S. guineensis sont réalisées sur les vers adultes et contrairement aux études expérimentales sur l’hybridation, on ne retrouve pas de vers adultes hybrides après analyse de leur ADN. Avec cette étude, nous souhaitons mettre en évidence la présence d’hybride naturel entre ces deux espèces au Gabon à partir du premier élément suspect : l’œuf. Nous avons suivi l’œuf de son observation morphologique, à sa coloration par la technique de Ziehl-Neelsen jusqu’à l’amplification par PCR de son ADN et on a pu montrer qu’un œuf de morphologie suspecte observé dans les urines est capable d’amplifier à la fois une région spécifique de S. haematobium et de S. guineensis. / Most studies on the natural hybrid between Schistosoma haematobium (S.) and S.guineensis are performed on adult worms and contrary to experimental studies of hybridization, we do not find an adult hybrid worm after analysis of their DNA. With this study, we wish to highlight the presence of a natural hybrid between these two species in Gabon from the first suspect element: the egg. We followed the egg from its morphological observation to its staining using Ziehl-Neelsen technique until PCR amplification of its DNA and it has been shown that a suspected egg morphology seen in the urine is able to amplify both a specific region of S. haematobium and S. guineensis.

Dendritic cells (DCs) play an essential role in bridging the innate and adaptive immune system, activating T cell responses against invading pathogens. It has been shown definitively that DCs fulfil the vital role of activating Th2 responses in the liver and spleen during infection with the parasitic helminth Schistosoma mansoni. However, DCs are an incredibly heterogeneous cell type, with diverse subsets displaying different phenotypes and functions in specific tissues in the body. Moreover, relatively little is known about how DCs become activated and stimulate T cells in response to Th2-associated parasitic helminths. This thesis addresses how distinct DC subsets function in response to schistosomes, both in vitro and in vivo. The primary DC differentiation factor, Flt3-L, generates DC subsets in vitro that are analogous to the subsets resident in the lymphoid organs in the steady-state: CD24+ conventional DCs (cDCs, CD8α+ equivalents), CD11b+ cDCs and plasmacytoid DCs (pDCs). These different DC subsets displayed distinct responses to the strongly Th2- polarising soluble egg antigens (SEA) from S. mansoni. pDCs are unlikely to play a role in priming the Th2 response against SEA, although pDCs upregulated surface expression of MHC II and co-stimulatory molecules, these markers were expressed only at very low-levels, and pDCs failed to migrate to the draining lymph node (dLN) following adoptive transfer. In contrast, cDCs migrated efficiently to the T cell zone of the dLN. CD11b+ and CD24+ cDCs also significantly upregulated expression of the surface markers associated with T cell priming in response to SEA, however, this was a muted surface phenotype when compared to the classical activation elicited by a bacterial stimulus. The DC subsets produced very little cytokine in response to SEA stimulation, with the exception of Type I Interferons (IFN-I), which were uniquely secreted by CD24+ cDCs. The Toll-like receptor (TLR) adaptor proteins, TRIF and MyD88, were revealed to have contrasting roles in the control of SEA-specific IFN-I production. TRIF was essential for this response, whilst MyD88 acted as a negative regulator. TLRs are not the only receptors involved in this response however, as the C-type lectin CD205 was also required for optimal IFN-I production by SEA-stimulated cells. IFN-I proved critical to the ability of Flt3L-generated cDCs (FL-cDCs) to polarise responses following adoptive transfer, as IFN-I receptor-deficient (Ifnar1-/-) cells failed to prime an SEA-specific Th2 response in the dLN. Ifnar1-/- cells were almost completely unresponsive to SEA stimulation, failing to upregulate co-stimulatory molecules on their surface or to produce IFN-I. However Ifnar1-/- FL-cDCs displayed no deficiency in their ability to initiate T cell proliferation or IL-4-dependent Th2 polarisation in vitro. As T cell priming was abrogated in vivo only, this suggests that optimal cDC migration may be abrogated in the absence of the IFN-I receptor, although this is yet to be demonstrated definitively. The importance of IFN-I responsiveness for optimal Th2 induction during helminth infection was also assessed. Th2 responses were normal in the liver of S. mansoni Ifnar1-/- mice; however, IL-4 and IL-13 levels in the mesenteric LN (MLN) were drastically reduced. It was found that Th2 induction in the MLN was also ablated in mice infected with the gastrointestinal helminth Heligomosoides polygyrus. This suggests that there is a selective dependency on IFN-I for the activation of Th2 responses in lymphoid organs. The small intestine and the MLN provided an ideal site for further investigation of the development of the schistosome-specific immune response in peipheral tissues versus the draining lymph nodes, as this site is directly affected by parasite egg traffic during S. mansoni infection. The intestine is a unique immune environment – with a propensity towards regulation and tolerance, and a large population of innate effectors. Intestinal DCs depend on Flt3-L for their generation; however, the importance of DCs resident in the intestinal lamina propria (LP) for the initiation of Th2 inflammation in response to helminths is not yet known. Characterisation of LP DCs indicated that the activation of these cells is modulated during acute S. mansoni infection, whilst a novel model of schistosome egg deposition in the intestinal tissue illustrated that CD11c+ cells are essential for induction of the egg-specific Th2 response in both the LP and MLN following egg challenge. These data demonstrate the importance of IFN-I signalling for the development of helminth-specific immune responses, highlighting for the first time a role for this pluripotent innate effector in Th2 induction. Development of an egg challenge model in the intestine also provides an ideal setting with which to further explore the importance of IFN-I for Th2 polarisation in peripheral tissues and lymphoid organs.

Graduation date: 2001