A homogeneização das doses de sêmen suíno e a ressuspensão dos espermatozoides durante o armazenamento têm sido considerados como procedimentos benéficos para a qualidade espermática. Contudo, os fundamentos acerca dessa recomendação não estão completamente elucidados. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da homogeneização nos parâmetros espermáticos e status oxidativo das doses de sêmen suíno durante o armazenamento. Vinte e um ejaculados suínos normospérmicos foram diluídos em split sample nos diluentes Androstar® Plus (AND) e Beltsville Thawing Solution (BTS) e as doses de sêmen foram submetidas aos protocolos sem homogeneização (NoHom) ou com homogeneização manual duas vezes ao dia (2xHom) durante o armazenamento a 17ºC por 168 h. Os parâmetros espermáticos foram avaliados de acordo com motilidade espermática, cinética espermática e integridade de membrana com as sondas fluorescentes SYBR-14/PI através do sistema CASA, integridade de acrossoma sob microscopia óptica com contraste de fase, teste de termorresistência a 38ºC por 30 min e 120 min, e pH das doses de sêmen. O status oxidativo foi determinado pela peroxidação lipídica, oxidação proteica, teor de grupos sulfidrila, espécies reativas intracelulares, potencial antioxidante total e atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD). As doses inseminantes submetidas a NoHom ou 2xHom foram semelhantes (P>0,05) na maioria dos parâmetros espermáticos e oxidativos avaliados, para ambos os diluentes. A NoHom foi superior (P<0,05) à 2xHom quanto à motilidade e cinética espermáticas após o teste de termorresistência por 30 min, à manutenção do pH e à preservação da atividade da SOD. Além disso, melhores resultados nos parâmetros espermáticos e status oxidativo foram evidenciados no diluente AND em comparação ao BTS, exceto na motilidade total e progressiva, que diferiu apenas no final do período de armazenamento, e para espécies reativas intracelulares. Considerando que a homogeneização manual duas vezes ao dia não aprimorou a qualidade espermática e o status oxidativo, este procedimento não é necessário para o armazenamento de doses de sêmen normospérmicas por 168 h, tanto para o diluente Androstar® Plus quanto para o BTS. / Homogenization of diluted boar semen and resuspension of spermatozoa during storage have always been regarded as beneficial for semen quality. Nevertheless, the fundamental basis for its recommendation remains unclear. The aim of this study was to verify the effect of homogenization on spermatic parameters and oxidative status of boar semen doses during storage. One normospermic ejaculate from each of 21 boars was diluted in a split sample design with Androstar® Plus (AND) and Beltsville Thawing Solution (BTS) and semen doses were submitted to no-homogenization (NoHom) or twice-a-day manual homogenization (2xHom) during storage at 17°C for 168 h. Spermatic parameters were assessed upon motility, kinematics and membrane integrity with SYBR-14/PI with CASA system, acrosome integrity under phase-contrast microscopy, thermoresistance test at 38ºC for 30 min and 120 min, and pH. Oxidative status was determined by lipid peroxidation, protein oxidation, sulfhydryl content, intracellular reactive species, total radical-trapping antioxidant potential, and superoxide dismutase (SOD) activity. NoHom and 2xHom of liquid-stored semen doses were similar (P>0.05) in most of the spermatic and oxidative parameters for both AND and BTS extenders. NoHom was superior (P<0.05) to 2xHom regarding sperm motility and kinematics after thermoresistance test for 30 min, pH maintenance, and SOD activity preservation. Additionally, better results were evident for spermatic parameters and oxidative status in AND compared to BTS, except for total and progressive motility, which differed only at the end of the storage period, and intracellular reactive species. Taking into account that no beneficial effects for sperm motility traits and oxidative status were observed following twice-a-day homogenization, its use is not necessary for storage of semen doses for 168 h in both short- and long-term tested extenders.

Os materiais de origem animal utilizados na produção in vitro (PIV) de bovinos podem apresentar-se contaminados pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) quando provenientes de animais infectados. Tendo isso em vista é importante realizar estudos aplicados para minimizar a transmissão de patógenos via biotécnicas de reprodução. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a capacidade dos métodos de processamento seminal, Swim up, gradiente de Percoll e a combinação Swim up/Percoll em reduzir ou eliminar o BVDV de amostras de sêmen experimentalmente infectadas (Experimento 1), e também, avaliar o efeito do BVDV durante a maturação in vitro (MIV) de complexos cumuli-oophorus bovinos (CCOs), assim como, no seu posterior desenvolvimento embrionário. Foi avaliada também a produção de antígenos nas células do cumulus (CC) em cultivo em comparação com as células MDBK (Experimento2). No Experimento 1 foram obtidas as seguintes faixas de títulos virais após processamento, 100.87 – 102.3 TCID/50/mL no Percoll, 101.87 – 103.3 TCID/50/mL no Swim up e no grupo combinado Swim up/Percoll não foi possível detectar vírus nas amostras. E a PIV produziu taxas de blastulação semelhantes nos grupos de diferentes processamentos seminais avaliados. Os dados mostraram que a combinação Swim up/Percoll reduziu/eliminou significativamente o número de partículas virais nas amostras de sêmen, sem causar danos aos espermatozóides, e também, possibilitou a PIV. No Experimento 2 nossos dados mostraram que os grupos controle (C) e infectado (V) apresentaram padrões diferentes de expansão das CC. A taxa de MIV do grupo C foi significativamente maior do que no grupo V, assim como as taxas de blastulação. Títulos virais mais altos foram obtidos nas CC em comparação com as células MDBK. Os resultados mostraram que a presença do BVDV na MIV infecta as CC, afeta o padrão de expansão das CC e reduz as taxas de maturação e blastulação. Dessa forma conclui-se que os dados obtidos nesse trabalho são extremamente importantes para auxiliar no desenvolvimento de protocolos de lavagem de sêmen a fim de eliminar os microorganismos presentes e possibilitar a produção de embriões livres de patógenos. / The materials of animal origin used in cattle to produce in vitro embryos (IVP) have been shown to contain BVDV when originate from infected animals. Considering that it is important to perform applicable studies to minimize transmission of pathogens via these assisted reproductive techniques. The aim of the study were evaluate the capacity of sperm separation procedures Percoll gradient, Swim-up, and a combination of Swim-up/Percoll, to reduce/eliminate BVDV from experimentally infected semen samples (Experiment 1), and to evaluate BVDV experimentally infection during in vitro maturation (IVM) of bovine cumuli oophorus complexes (COCs) and also BVDV effect on the COCs posterior embryo development. It was also evaluated the production of BVDV antigens through cumulus cells (CC) culture in comparison to MDBK cell culture (Experiment 2). At experiment 1 the virus titration presented a titer range among 100.87 - 102.3 TCID50/mL in Percoll; 101.87 - 103.3 TCID50/mL in Swim up; and undetected for all samples in the Swim up/Percoll. And the PIV produced similar blastocyst rates among the groups. The data showed that the combination of Swim up/Percoll promoted a significant reduction/elimination in the number of viral particles in the semen, without promotion of damage in spermatozoa cells and allow IVP with similar blastocyst rates among the different groups. From experiment 2 our data showed that control (C) and infected (V) groups presented different CC expansion patterns. The IVM rate for C group was higher than V group. Embryo development rate to blastocyst stage was significantly higher in C group than in V group. The highest virus titers were obtained in CC in comparison with MDBK cells. Our findings showed that BVDV presence during IVM infected CC and this affects their expansion pattern, which may be related to the observed reduced nuclear maturation and blastocyst development rates. Therefore it is possible to conclude that our data are extremely important as a help to develop semen washing protocols to eliminate microorganisms and allow the embryo production free of pathogens.

Os materiais de origem animal utilizados na produção in vitro (PIV) de bovinos podem apresentar-se contaminados pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) quando provenientes de animais infectados. Tendo isso em vista é importante realizar estudos aplicados para minimizar a transmissão de patógenos via biotécnicas de reprodução. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a capacidade dos métodos de processamento seminal, Swim up, gradiente de Percoll e a combinação Swim up/Percoll em reduzir ou eliminar o BVDV de amostras de sêmen experimentalmente infectadas (Experimento 1), e também, avaliar o efeito do BVDV durante a maturação in vitro (MIV) de complexos cumuli-oophorus bovinos (CCOs), assim como, no seu posterior desenvolvimento embrionário. Foi avaliada também a produção de antígenos nas células do cumulus (CC) em cultivo em comparação com as células MDBK (Experimento2). No Experimento 1 foram obtidas as seguintes faixas de títulos virais após processamento, 100.87 – 102.3 TCID/50/mL no Percoll, 101.87 – 103.3 TCID/50/mL no Swim up e no grupo combinado Swim up/Percoll não foi possível detectar vírus nas amostras. E a PIV produziu taxas de blastulação semelhantes nos grupos de diferentes processamentos seminais avaliados. Os dados mostraram que a combinação Swim up/Percoll reduziu/eliminou significativamente o número de partículas virais nas amostras de sêmen, sem causar danos aos espermatozóides, e também, possibilitou a PIV. No Experimento 2 nossos dados mostraram que os grupos controle (C) e infectado (V) apresentaram padrões diferentes de expansão das CC. A taxa de MIV do grupo C foi significativamente maior do que no grupo V, assim como as taxas de blastulação. Títulos virais mais altos foram obtidos nas CC em comparação com as células MDBK. Os resultados mostraram que a presença do BVDV na MIV infecta as CC, afeta o padrão de expansão das CC e reduz as taxas de maturação e blastulação. Dessa forma conclui-se que os dados obtidos nesse trabalho são extremamente importantes para auxiliar no desenvolvimento de protocolos de lavagem de sêmen a fim de eliminar os microorganismos presentes e possibilitar a produção de embriões livres de patógenos. / The materials of animal origin used in cattle to produce in vitro embryos (IVP) have been shown to contain BVDV when originate from infected animals. Considering that it is important to perform applicable studies to minimize transmission of pathogens via these assisted reproductive techniques. The aim of the study were evaluate the capacity of sperm separation procedures Percoll gradient, Swim-up, and a combination of Swim-up/Percoll, to reduce/eliminate BVDV from experimentally infected semen samples (Experiment 1), and to evaluate BVDV experimentally infection during in vitro maturation (IVM) of bovine cumuli oophorus complexes (COCs) and also BVDV effect on the COCs posterior embryo development. It was also evaluated the production of BVDV antigens through cumulus cells (CC) culture in comparison to MDBK cell culture (Experiment 2). At experiment 1 the virus titration presented a titer range among 100.87 - 102.3 TCID50/mL in Percoll; 101.87 - 103.3 TCID50/mL in Swim up; and undetected for all samples in the Swim up/Percoll. And the PIV produced similar blastocyst rates among the groups. The data showed that the combination of Swim up/Percoll promoted a significant reduction/elimination in the number of viral particles in the semen, without promotion of damage in spermatozoa cells and allow IVP with similar blastocyst rates among the different groups. From experiment 2 our data showed that control (C) and infected (V) groups presented different CC expansion patterns. The IVM rate for C group was higher than V group. Embryo development rate to blastocyst stage was significantly higher in C group than in V group. The highest virus titers were obtained in CC in comparison with MDBK cells. Our findings showed that BVDV presence during IVM infected CC and this affects their expansion pattern, which may be related to the observed reduced nuclear maturation and blastocyst development rates. Therefore it is possible to conclude that our data are extremely important as a help to develop semen washing protocols to eliminate microorganisms and allow the embryo production free of pathogens.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-08-01T13:36:14Z No. of bitstreams: 1 Amanda Baricatti Finazzi.pdf: 587738 bytes, checksum: 3544755ab40549d4e228afdfc83d9c20 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-01T13:36:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amanda Baricatti Finazzi.pdf: 587738 bytes, checksum: 3544755ab40549d4e228afdfc83d9c20 (MD5) Previous issue date: 2016-06-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This study aimed to evaluate the effect of a colloid in single layer centrifugation (AndroColl®-E; Minitub, Germany) associated to three freezing extenders: extender 1 (Botucrio®; Biotech, Botucatu,, Brazil), extender 2 (EquiPlus Freeze®; Minitub, Germany + 3% glycerol) and extender 3 (EquiPlus Freeze®; Minitub, Germany + 3% DMSO) on equine semen quality. We used three ejaculates from five stallion (n=15), collected by artificial vagina. After collection, the semen was diluted with extender to from skimmed milk (EquiPlus®, Minitub, Germany) and divided into 2 groups: group E (centrifuged without colloid) and group A (centrifuged with colloid). No grupo E, o sêmen foi centrifugado à 676g por 15 minutos, no grupo A, o sêmen foi centrifugado à 314g por 20 minutos. Após a centrifugação, os grupos receberam os diferentes diluentes: diluente 1, diluente 2 e diluente 3. The kinetics was evaluated by CASA and the integrity of plasma and acrossomal membrane by association of fluorescent probes and subjected to flow cytometry. With respect to the CASA parameters, it can be seen that the A1 group, with the colloid centrifuged, had superior result in LIN and WOB variables, compared to the E1 group. The variables, RAP, VCL, VAP, ALH and BCF, had lower results when centrifuged with colloid, A1 group than in the group E1. With respect to the integrity of plasma and acrosomal membrane, it can be seen that A1 and A3 groups were centrifuged with colloid, they had superior result to E1 and E3 groups, which were centrifuged without the colloid. The use of colloid improved integrity of plasma and acrosomal membranes probably avoided the process of sperm hyperactivation and provided lower production of ROS. Greater in vivo studies are needed to prove this technique. / Objetivou-se avaliar o efeito da centrifugação em coloide de camada única (AndroColl®-E; Minitub, Alemanha) e três diluentes de congelamento: diluente 1 (Botucrio®; Biotech, Botucatu, Brasil), diluente 2 (EquiPlus Freeze®; Minitub, Alemanha + 3% glicerol) e diluente 3 (EquiPlus Freeze®; Minitub, Alemanha + 3% DMSO), sobre a qualidade do sêmen equino. Utilizou-se 3 ejaculados de 5 garanhões (n=15). Após a colheita, o sêmen foi diluído com meio à base de leite desnatado (EquiPlus®, Minitub, Alemanha) e dividido em 2 grupos: grupo E (centrifugado sem coloide) e grupo A (centrifugado com coloide). No grupo E, o sêmen foi centrifugado à 676g por 15 minutos, no grupo A, o sêmen foi centrifugado à 314g por 20 minutos. Após a centrifugação, os grupos receberam os diferentes diluentes: diluente 1, diluente 2 e diluente 3. Logo após foram levadas ao congelamento em máquina programável portátil e armazenadas em botijões criogênicos. A cinética foi avaliada pelo CASA e a integridade das membranas plasmática e acrossomal, por associação de sondas fluorescentes submetidas ao Citômetro de Fluxo. Com relação aos parâmetros do CASA, pode-se observar que o grupo A1, centrifugado com o coloide, teve resultado superior nas variáveis LIN e WOB, comparadas com o grupo E1. Já as variáveis, RAP, VCL, VAP, ALH e BCF, tiveram resultados inferiores quando centrifugadas com o colóide, grupo A1 em relação ao grupo E1. Com relação à integridade de membrana plasmática e acrossomal, pode-se observar que os grupos A1 e A3, que foram centrifugados com o coloide, tiveram resultado superior aos grupos E1 e E3, que foram centrifugados sem o coloide. O uso do coloide melhorou integridade das membranas plasmática e acrossomal, provavelmente evitou o processo da hiperativação espermática e proporcionou menor produção de ROS. Maiores estudos in vivo serão necessários para comprovação desta técnica.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tatiana Moreria da Silva DISSERTACAO DE MESTRADO.pdf: 4157039 bytes, checksum: 141730648f501822185cd3dc86bb7823 (MD5) Previous issue date: 2012-07-06 / Research shows that oral supplementation with antioxidants can reduce the damage caused by reactive oxygen species and increase the fertilizing capacity of sperm due to improvement in semen parameters. Semen analysis was assessed according to the criteria of the World Health Organization (1999), subfertile men who received folic acid at a dose of 5 mg/day or placebo, comparing results before and after treatment. A total of 49 patients aged 23-56 years (mean 35.3 years) and diagnosis of subfertility were randomized into two groups. The treated group (n= 23) receiving folic acid and the control group (n= 26) received placebo, each for 3 months. Before the intervention, the mean sperm concentration (x106/mL) in the treated group was 25.91 and 26.08 after treatment. In the control group was: 20.85 pre-treatment and 20.04 after treatment (p= 0.92). Means of progressive motile sperm obtained from the treated and placebo groups before treatment were, respectively: 46.48% and 49.23%. After the intervention, the mean values found were 48.26% in the treated group and 49.65% in the control group (p= 0.99). The mean normal sperm morphology was 23.26% in the treated group pre-intervention, and later was 23.91%. The control group had an average of 22.3% and 24.23%, respectively (p= 0.83). Mean vitality found in the treated group was 66.73% before the treatment and 69.56% after the treatment with folic acid. In the control group was 65.77% after pre-treatment and 65.38% was not significant (p= 0.95). Numerous studies have evaluated the use of antioxidants for improving sperm quality and thus fertility. These substances are used individually or in combination, and differ in the type, the target population, dosage and duration of therapy. This study showed that folic acid at a concentration of 5 mg / day did not improve sperm parameters in subfertile men compared to the control group. / Acredita-se que a suplementação oral com antioxidantes possa reduzir os danos causados por espécies reativas de oxigênio e aumentar a capacidade de fertilização dos espermatozoides devido à melhora dos parâmetros seminais. Avaliou-se o espermograma, segundo os critérios da Organização Mundial de Saúde (1999), de homens subférteis que receberam ácido fólico na dosagem de 5 mg/dia ou placebo, comparando os resultados pré e pós tratamento. Um total de 49 pacientes com idade entre 23 a 56 anos (média 35,3 anos) e diagnóstico de subfertilidade foi randomizado em dois grupos. O grupo tratado (n= 23) recebeu ácido fólico e o grupo controle (n= 26) recebeu placebo, ambos durante 3 meses. Antes da intervenção, a concentração média de espermatozóides (x106/mL) no grupo tratado foi 25,91 e após o tratamento 26,08. No grupo controle foi: 20,85 pré-tratamento e 20,04 pós-tratamento (p=0,92). Quanto à motilidade, as médias de espermatozóides móveis progressivos obtidas nos grupos tratado e placebo, antes da terapêutica foram, respectivamente: 46,48% e 49,23%. Após a intervenção, as médias encontradas foram 48,26% no grupo tratado e 49,65% no grupo controle (p=0,99). A média de morfologia normal dos espermatozóides foi 23,26% no grupo tratado pré-intervenção, e posteriormente foi de 23,91%. O grupo controle apresentou média de 22,3% e 24,23%, respectivamente (p= 0,83). A média de vitalidade encontrada no grupo tratado foi de 66,73% antes do tratamento e 69,56% após o tratamento com ácido fólico. Já no grupo controle foi de 65,77% pré-tratamento e após foi de 65,38% não sendo significante (p= 0,95). Inúmeras pesquisas têm avaliado o uso de antioxidantes para melhorar a qualidade do esperma e assim, a fertilidade. Essas substâncias foram utilizadas individualmente ou em combinação, e se diferem quanto ao tipo, à população-alvo, dose e duração da terapia. Esse estudo mostrou que o ácido fólico na concentração de 5 mg/dia não melhorou os parâmetros espermáticos de homens subférteis em comparação ao grupo controle.

A produção animal atualmente conta com diferentes biotecnologias para aumentar sua produtividade, incluindo técnicas aplicadas na reprodução. A inseminação artificial, por exemplo, vem sendo aplicada há muitos anos e de maneira extensiva. Esta tem como objetivo o aproveitamento de apenas um ejaculado em diversas prenhezes viabilizando a realização de testes de progênies e um grande aproveitamento de touros melhoradores. Atualmente essa técnica pode contar com um material ainda mais específico, o sêmen sexado que possui maior porcentagem (acima de 87%) de espermatozóides portadores de cromossomo X ou Y resultando numa progênie com o sexo predeterminado. A pré-seleção do sexo vem sendo estudada desde final dos anos 70, uma das linhas de pesquisa resultaram no desenvolvimento de um equipamento, o citômetro de fluxo, em que a célula espermática tem seu conteúdo de DNA estimado e, na seqüência é orientado para separação. Atualmente essa técnica é utilizada para produção de sêmen sexado comercialmente, anteriormente à comercialização do produto, a confirmação da taxa de separação dos cromossomos X e Y é realizada pelo próprio equipamento, o que acrescenta um custo operacional e pode introduzir um viés na confirmação da taxa de sexagem. Sendo assim o objetivo desse trabalho foi elaborar um protocolo de confirmação da taxa de sexagem mediante PCR em tempo real, utilizando sonda TaqMan® em regiões dos genes X-específico (PLP) e Y-específico (SRY). Foram analisadas duas sub-espécies de bovinos (Bos primigenius taurus e Bos primigenius indicus), sendo 21 doses de sêmen sexado X, 21 doses de sêmen sexado Y e 42 doses de sêmen não sexado (controle). A extração do DNA foi desenvolvida com a utilização de di-etiltreitol (DTT) e isotiocianato de guanidina. As amostras foram, em seguida, submetidas à técnica de PCR em tempo real aplicando sondas específicas. Foi possível amplificar os fragmentos específicos dos cromossomos X e Y separadamente e em conjunto e estimar a proporção relativa entre ambos. Todavia a repetibilidade do teste e sua acurácia não permitem recomendá-lo da maneira que se encontra para a aplicação na prática. / There are different biotechnologies to apply to increase the animal production nowadays, reproduction techniques are including. The artificial insemination (AI), for example, is a technique very used during many years ago and it is used at extensive production. The aim of this technique is to increase the numbers of pregnancies with just one ejaculation what will propose easier testing of offspring and better use of genetic selected bulls. At present the AI can associate a more specific material, the sexed semen, that contains a higher percentage (more than 87%) of X- or Y- bearing spermatozoa. Its application will result in a offspring with the desired sex. The sorting sex process has been studied since the 1970\'s, since then, some researchers have determined the cytometric sexing flow, a \"promising technique\" that allows the separation of the X-bearing chromosome sperm from the Y-bearing chromosome sperm based on the estimation of the DNA content in each measured cell. The cytometric flow is the unique commercial technique applied for mammalian species in many countries. Before the commercialization the bovine sexed semen has its percentage of the desired sex confirmed by using the same technique that sorted at the beginning of the process. This point can improve the cost and benefits the sorting technique. This way, the objective of this study was to determine a protocol of sex proportion confirmation by real time PCR using TaqMan® probe at X-specific gene (PLP) and Y-specific gene (SRY). Two subspecies of cattle semen were analyzed (Bos primigenius taurus and Bos primigenius indicus). Twenty-one sexed semen for female, other twenty-one sexed semen for male and forty-two non sexed semen were used in this research. The DNA extraction used DTT and guanidine isothiocyanate, and then the obtained samples were used to the real time PCR applying specific probes. This study allows the amplification in different reactions of specific products of X-chromosome bearing and Y-chromosome bearing. Putting the results together, it was possible to determine the relative proportion between the products. But the repeatability and accuracy of the test don\'t permit use this technique in this way of practice.

A pré-seleção do sexo tem grande impacto na produtividade da bovinocultura de corte e leite. A única técnica comercialmente viável para a pré-seleção do sexo, até agora, é a sexagem espermática utilizando citometria de fluxo. Atualmente palhetas de sêmen com espermatozóides sexados vêm sendo utilizadas regularmente em programas de inseminação artificial. Entretanto, ainda existem limitações referentes à taxa de gestação em condições de campo, explicadas em parte pela perda da integridade celular dos espermatozóides. O intuito deste experimento foi avaliar os efeitos da sexagem e o tempo de espera do ejaculado para a sexagem as 0, 3 e 6 hs sobre os parâmetros de motilidade pelo sistema computadorizado da motilidade espermática (CASA), funcionalidade da membrana plasmática pelo teste de resistência osmótica (HOST), morfologia dos espermatozóides pela técnica de contraste de interferência diferencial (DIC) e entre as subespécies taurinas (Bos taurus taurus) e zebuínas (Bos taurus indicus). Espermatozóides sexados apresentaram a maioria dos parâmetros de motilidade superiores aos submetidos à técnica convencional, indicando que existe uma seleção por parte do citômetro de fluxo. O tempo em que o espermatozóide bovino espera (até seis horas) para ser submetido ao processo de sexagem pela técnica de citometria de fluxo alterou a linearidade (LIN). A funcionalidade da membrana plasmática foi afetada quando o espermatozóide bovino passa pelo processo de sexagem.. A sexagem induz o aumento de defeitos menores, provavelmente por alterações da membrana plasmática da cauda dos espermatozóides. Os zebuínos são mais sensíveis às alterações da membrana plasmática da cauda em relação aos taurinos. Finalmente existem fortes indícios que espermatozóides bovinos que passam pela técnica de citometria de fluxo entrem em estado de hiperativação. / Sex selecting has a huge impact in dairy and beef production. The only way commercially viable to obtain sex selecting nowadays, is a flow citometry sex sorted sperm technique. Currently sex sorted sperm have been used regularly in Artificial Insemination programs. Meanwhile, there are limitations about non return rate in farm conditions, superficially explained as cellular loss integrity. The objective of this experiment was assessing sex sorted sperm effects and time to wait 0, 3 and 6 hours before sorting in motility parameters by computer assisted sperm analysis (CASA), plasmatic membrane functionality by hiposmotic swelling test (HOST), sperm morphology by differential interference contrast microcopy (DIC) and between taurine subspecies (Bos taurus taurus) zebuine subspecies (Bos taurus indicus). Sex sorted sperm showed best results in the most motility parameters compared with conventional sperm, suggesting a flow citometer selection. The time to wait of the sperm (untis 6 hours) to keep sorting, altered a linearity (LIN). Plasmatic membrane functionality was affected when sperm runs through flow citometer.. Sex sorted induces increase of minor defects in sperm, probably by tail membrane plasmatic alterations. Zebuin sperm are more sensitive for tail plasmatic membrane alterations compared with taurine sperm. Finally, there is strong indication that bovine sperm that runs through flow citometer sign in hiperactivation state.

Diversos estudos indicam que touros europeus (Bos taurus) apresentam uma maior susceptibilidade ao estresse térmico com um consequentemente aumento do estresse oxidativo. Este, por sua vez, leva a uma diminuição na qualidade espermática. O espermatozoide possui, fisiologicamente, uma grande quantidade de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) em sua membrana. As ligações duplas entre carbonos desses PUFAs confere a membrana plasmática uma maior fluidez, necessária aos processos fisiológicos do espermatozoide como motilidade e fertilização. No entanto essas ligações são mais facilmente oxidadas e, portanto, mais susceptíveis a peroxidação lipídica. Sendo assim, a suplementação com PUFAs promoveria uma melhoria na qualidade espermática, porém, tornaria o espermatozoide ainda mais susceptível à peroxidação lipídica. A vitamina E é um antioxidante chave na prevenção do estresse oxidativo através da interceptação do radical hidroxila, protegendo os PUFAs da membrana espermática contra a peroxidação lipídica. Portanto, uma alternativa para melhorar a qualidade espermática de touros europeus submetidos ao estresse térmico, seria a suplementação com PUFAs associada a um tratamento com vitamina E para prevenir um possível efeito deletério oxidativo desses ácidos graxos. Estudos sugerem uma importante relação entre os testes convencionais de avaliação de sêmen e fertilidade. No entanto, a limitação destes testes também tem sido reconhecida, principalmente em casos de infertilidade idiopática. Estudos demonstram que os testes funcionais de avaliação do sêmen, podem ser uma alternativa importante para a avaliação da capacidade fecundante de uma determinada amostra seminal. A interação entre espermatozóide e zona pelúcida ocorre através da ligação de receptores acrossomais às proteínas ZP3 e ZP2 do oócito. A membrana perivitelínica de ovos de galinha possui uma homologia com essas proteínas, permitindo sua ligação com espermatozóides de diversas espécies. Sendo assim, o teste de ligação espermática a essa membrana parece ser bastante eficiente para avaliar a capacidade fecundante do sêmen. No presente estudo, 16 touros Bos taurus foram submetidos à insulação testicular durante 4 dias e submetidos a um arranjo fatorial 2x2, sendo os fatores: dieta rica em PUFAs (Megalac&reg;, 4 Kg ao dia) e tratamento com Vitamina E (Monovin E&reg;, 3000 UI a cada 13 dias) durante 60 dias. As amostras seminais criopreservadas/descongeladas foram submetidas à avaliação da análise computadorizada da motilidade (CASA; Hamilton Thorne, Ivos 12.3, USA), integridade de membrana (Eosina Nigrosina), integridade acrossomal (Fast Green Rosa Bengala), atividade mitocondrial (33 diaminobenzidina), susceptibilidade ao estresse oxidativo (Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico - TBARS), integridade de DNA (SCSA) e o teste de ligação de espermatozóides à membrana vitelínica de ovos de galinha, que foi previamente padronizado. O tratamento com vitamina E apresentou efeitos benéficos para algumas características espermáticas, sendo o contrário observado pelo tratamento com PUFAS, quando ambos foram analisados isoladamente. No entanto, a associação entre estes tratamentos não foi eficiente para melhorar a qualidade espermática assim como a capacidade fecundante avaliada através do teste de ligação espermática em membrana perivitelínica de ovos de galinha. / Several studies suggest a high susceptibility of European bulls (Bos taurus) to the heat stress, which will lead to an increase on oxidative stress and consequent impairment on sperm viability. Sperm membranes are rich in poly-unsaturated fatty acids (PUFAs). The carbon-carbon double bounds (insaturations) that characterize these PUFAs confer the necessary fluidity to the sperm membrane, essential to motility and fecundation capacity. However, these insaturations are more unstable and, therefore, more susceptible to the lipid peroxidation (i.e., attack of reactive oxygen species to the lipids). Hence, PUFA supplementation would improve certain sperm characteristics but increase the already high susceptibility to the oxidative stress. Vitamin E is a key antioxidante on oxidative stress prevention by intercepting hydroxyl radical and protecting sperm membrane PUFAS against lipid peroxidation. Therefore, an alternative to improve sperm quality in heat stressed european bulls would be a PUFA supplementation associated to a Vitamin E therapy in order to avoid a possible deleterious oxidative effects of these fatty acids. Estudies suggest an important relationship between conventional tests for sperm evaluation and fertility. However, limitations have been also verified, especially in cases of idiopathic infertility. Thus, tests to evaluate sperm functionality may be an interesting alternative to assess fecundation capacity of semen samples. The binding of sperm to the zona pellucida occurs initially by the interaction between acrosomal receptors and oocyte proteins ZP3 and ZP2. The perivitelline membrane of chicken eggs present homologies to zona pellucida proteins, which allows sperm from several species to bind to this membrane. Thus, the sperm binding test to the perivitelline membrane may be an efficient method to asses the fecundation capacity in semen of bulls. In the present study, 16 Bos taurus bulls were submitted to testicular insulation for 4 day. Animals were then submitted to a 2x2 factorial design, with the factor represented by a PUFA oral supplementation (Megalac&reg;, 4 Kg for day) and the treatment with Vitamin E (Monovin E&reg;, 3000 UI, each 13 days) for 60 days. Samples were cryopreserved/thawed and analyzed for motility variables by the computer assisted sperm analysis (CASA; Hamilton Thorne, Ivos 12.3, USA), membrane integrity (Eosin / Nigrosin), acrosome integrity (Fast Green / Bengal Rose), mitochondrial activity (33 diaminobenzidine), susceptibility to the oxidative stress (tiobarbituric acid reactive substances - TBARS), DNA integrity (SCSA) and the sperm binding test to the chicken egg perivitelline membrane, which was previously validated. Results demonstrated a beneficial effect of Vitamin E on some sperm characteristics, with the inverse effect observed for PUFA when both treatments were considered individually. However, the association between both treatments were not efficient to improve sperm quality as well as the fecundation capacity as evaluated by the sperm binding test to the chicken perivitelline membrane.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:13:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Giovano Neumann.pdf: 1483055 bytes, checksum: 73310de09daeb1b45d1ac1eda6a64ce0 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This dissertation is based on the development of two separate scientific papers. (1) First article it is a scientometric analysis: In 2007 was released in the scientific means by Wilson-Leedy and Ingermann, the first article using the CASA free software in sperm mobility analysis for fish, for this study, from of scientometric techniques, the contribution has been assessed and the impact that the article caused the scientific community. It also evaluated the frequency in the number of publications using andrologic analysis in fish, from 2007 to 2014 in four magazines that publish articles related to this topic. Were evaluated under articles made soundness analysis in fish using any existing CASA system, the variables used and ways to interpret the results to determine the sperm viability and correlate the sperm motion parameters with the potential fertilization. For scientometry CASA launching the contribution in free software took place in the google scholar search to get all the work that had quoted the article. For scientometry of items with fish using CASA, was conducted using the search index of ScienceDirect. And to assess the variables and the interpretations made by the authors, harvest characteristics of the materials and methods and results in the articles. It was found 123 quotes Wilson-Leedy article and Ingermann these, 94 are articles, of which 66 were performed with fish, and 35 of these conducted their research using CASA in free software, and there was an increase of 85% in citing publications the author reference. In the search for articles that use in fish soundness analysis, an increase of 59.4% from 2007 to 2014. Of the publications articles using any home system for the assessment of sperm motility in fish, 75.76% of the two work assesses or more times the spermatic movement, 51.52% use at least four of the characteristics generated by CASA, about ¼ of the work validated the CASA results with fertilization and hatching of eggs and used statistical models to group correlated variables CASA and explanations them, less than 10% of articles explores statistical modeling in sperm kinetics and to explain the characteristics generated by CASA on sperm fertility. The article by Wilson-Leedy and Ingermann contributed to the advancement of research with fish sperm, and sperm was used in the evaluation of other animals and other cells also concluded that little is known of the relationship of some sperm variables generated by CASA with fertility sperm in fish. And the researchers do not use in full the resources of the CASA system. (2) According to an article this is an experiment of artificial reproduction: The objective of this study was to evaluate the interactive effects of the relationship or independent mobile sperm: oocyte and sperm speed on artificial reproduction procedures with the use of semen catfish (Rhamdia quelen) cryopreserved. Through the Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) were evaluated in six replicates motility and sperm velocity of cryopreserved semen from eight seconds of its activation and to each according to the end of the spermatic movement. For the fertilization test an experimental design was used in a factorial (6x3x3) consists of six mobile sperm relations: oocyte (70,000, 90,000, 110,000, 130,000, 150,000 and 170,000), three sperm speeds (60, 40 and 20&#956;m.s-1) and three experimental replicates or blocks (pools of oocytes from three groups of female). Activation curves of sperm (kinetic) have been prepared with the help of non-linear statistical model. The effects were evaluated on the fertilization, hatching and normal larvae. In evaluating the variables, the response surface analysis showed no interaction effect (p>0.05) between the relationship moving sperm: oocyte and sperm speed, on the fertilization rates, hatching and normal larvae. Only linear effect was found (p<0.05) of sperm speed under the fertilization rates and hatching eggs. According to the results, it is concluded that there is no difference between the use of 70,000 up to 170,000 mobile sperm for each oocyte on the reproductive success in terms of fertilization rate, hatching and larval normality of catfish (Rhamdia quelen) and that the value of the sperm velocity is decisive on the reproductive success of sperm catfish (Rhamdia quelen) decreasing the fertilization and hatching rates as decreases sperm speed. / Esta dissertação baseia-se na elaboração de dois artigos científicos distintos. (1) Primeiro artigo trata-se de uma análise cientométrica: Em 2007 foi lançado no meio cientifico por Wilson-Leedy e Ingermann, o primeiro artigo utilizando o CASA em software livre em análise de mobilidade espermática para peixes, para este estudo, a partir de técnicas cientométricas, foi avaliado a contribuição e o impacto que o artigo provocou na comunidade cientifica. Também foi avaliada a frequência no número de publicações utilizando analises andrológicas em peixes, desde 2007 à 2014 em quatro revistas que publicam artigos referentes a este tema. Foram avaliados sob artigos que realizaram analise andrológica em peixes utilizando algum sistema CASA existente, as variáveis utilizadas e as formas de interpretação dos resultados para determinar a viabilidade espermática e correlacionar os parâmetros de movimento espermático com o potencial de fertilização. Para a cientometria da contribuição do lançamento do CASA em software livre foi realizada busca no google acadêmico para levantar todos os trabalhos que haviam citado o artigo. Para a cientometria dos artigos com peixes utilizando o CASA, foi realizado busca utilizando o indexador da ScienceDirect. E para avaliar as variáveis e as interpretações realizadas pelos autores, colhemos suas características dos materiais e métodos e resultados nos artigos. Encontrou-se 123 citações do artigo de Wilson-Leedy e Ingermann destes, 94 são artigos, dos quais 66 foram realizados com peixes e, 35 destes realizaram suas pesquisas utilizando o CASA em software livre, e ocorreu um aumento de 85% nas publicações citando o autor referência. Na busca de artigos que utilizam analise andrológica em peixes, ocorreu um aumento de 59,4% das publicações de 2007 à 2014. Dos artigos que utilizam qualquer sistema CASA para a avaliação da mobilidade espermática em peixes, 75,76% dos trabalhos avalia dois ou mais tempos do movimento espermático, 51,52% utiliza pelo menos quatro das características geradas pelo CASA, aproximadamente ¼ dos trabalhos validou os resultados do CASA com fertilização ou eclosão dos ovos e usou modelos estatísticos para agrupar as variáveis correlacionadas do CASA e explica-las, menos de 10% dos artigos explora modelagem estatística na cinética espermática e para explicar as características gerados pelo CASA sobre a fertilidade espermática. O artigo de Wilson-Leedy e Ingermann contribuiu para o avanço das pesquisas com espermatozoides de peixes, e foi utilizado na avaliação espermática de outros animais e outras células, também concluímos que pouco se sabe da relação de algumas variáveis espermáticas geradas pelo CASA com a fertilidade espermática em peixes. E que os pesquisadores não utilizam em sua totalidade os recursos do sistema CASA. (2) Segundo artigo trata-se de um experimento de reprodução artificial: O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos interativos ou independentes da relação espermatozoides móveis:ovócito e da velocidade espermática em procedimentos de reprodução artificial com o uso do sêmen do jundiá (Rhamdia quelen) criopreservado. Através do Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) foram avaliadas em seis réplicas a motilidade e a velocidade espermática do sêmen criopreservado a partir de oito segundos da sua ativação e a cada um segundo até o termino do movimento espermático. Para o ensaio de fertilização foi aplicado um delineamento experimental em esquema fatorial (6 x 3) composto de seis relações espermatozoides móveis:ovócito (70.000, 90.000, 110.000, 130.000, 150.000 e 170.000), três velocidades espermáticas (60, 40 e 20µm.s-1) e três réplicas ou blocos experimentais (pools de ovócitos provenientes de três grupos de fêmeas). As curvas de ativação dos espermatozoides (cinéticas) foram elaboradas com auxílio de modelo estatístico não linear. Os efeitos foram avaliados sobre as taxas de fertilização, eclosão e larvas normais. Na avaliação das variáveis, a análise de superfície de resposta não mostrou efeito interativo (p>0,05) entre a relação espermatozoides móveis:ovócito e as velocidades espermáticas, sobre as taxas de fertilização, de eclosão e de larvas normais. Somente foi encontrado efeito linear (p<0,05) da velocidade espermática sob as taxas de fertilização e de eclosão dos ovos. De acordo com os resultados, conclui-se que não há diferença alguma entre uso de 70.000 até 170.000 espermatozoides móveis para cada ovócito sobre o sucesso reprodutivo em termos de taxa de fertilização, eclosão dos ovos e normalidade larval do jundiá (Rhamdia quelen) e, que o valor da velocidade espermática é determinante sobre o sucesso reprodutivo dos espermatozoides de jundiá (Rhamdia quelen) diminuindo as taxas de fertilização e eclosão conforme diminui a velocidade espermática.

A criopreservação de sêmen humano tem sido amplamente utilizada como método de preservação da fertilidade. A fim de reduzir os danos causados pelo processo de congelamento, diversos estudos utilizaram substâncias antioxidantes e estimulantes, porém, sua eficácia, bem como seu papel no controle funcional dos espermatozoides, não está bem estabelecida na literatura. Assim, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito da suplementação de melatonina e cafeína nas características estruturais e funcionais de espermatozoides pré-criopreservação e pós-descongelamento. Para isso, este estudo prospectivo utilizou 30 amostras seminais de pacientes entre 19 e 45 anos de idade da rotina do Laboratório Androscience entre maio de 2013 e maio de 2017. Todas as amostras foram classificadas como normozoospérmicas, segundo análise seminal inicial de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS). Em seguida, as amostras foram criopreservadas com Human Tubal Fluid modificado sem suplemento ou com 2mM de melatonina. Após o descongelamento, as amostras foram analisadas ou suplementadas com 2 mM de cafeína, incubadas por 15 minutos. Ao final dos experimentos, obtivemos 4 grupos: Amostras pós-descongelamento sem suplementação (CONT), amostras suplementadas com cafeína (CAF), melatonina (MEL) e cafeína + melatonina (CM). Parâmetros seminais de contagem, motilidade e cinética, analisados pelos critérios da OMS e pelo software SCA®, a atividade mitocondrial, pela coloração por diaminobenzidina, avaliação da taxa de fragmentação de DNA, pelo método SCSA® e a dosagem dos níveis de radicais livres de oxigênio (ROS), pelo método de luminescência, foram realizados pré-criopreservação e pós-descongelamento com ou sem suplementação. Os dados foram analisados pelo teste T de Student pareado e pela análise de variâncias de uma via com medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Holm-Sidak, e adotado um alfa de 5%. Observamos redução significativa concentração espermática (p < 0,001), motilidade total (p < 0,001) e progressiva (p < 0,001), parâmetros cinéticos (p < 0,009) e atividade mitocondrial (p < 0,001) e aumento das taxas de fragmentação de DNA (p=0,046) e ROS (p=0,052) nas amostras CONT quando comparadas com as amostras a fresco. Quando suplementadas com cafeína e melatonina, observamos aumento da motilidade progressiva nos grupos CAF (p=0,005) e CM (p=0,048) e aumento da atividade mitocondrial no grupo CM (p < 0,05). Podemos concluir que a associação da suplementação com cafeína e melatonina nas amostras pré-criopreservação e pós-descongelamento demonstrou ser uma ferramenta importante para ser aplicada em amostras criopreservadas para atuarem como substâncias estimuladoras de motilidade espermática / Human semen cryopreservation has been widely used as a method of preserving fertility. In order to reduce the damages caused by the freezing process, several studies used antioxidant and stimulant substances, however, their efficiency as well as their role in the functional control of spermatozoa have not been well established in literature. Thus, the goal of this study was to investigate the effect of melatonin and caffeine supplementation on the structural and functional characteristics of pre-cryopreservation and post-thaw spermatozoa. For this, this prospective study used 30 seminal samples from patients aged from 19 to 45 years in the routine of the Androscience Laboratory between May 2013 and May 2017. All samples were classified as normozoospermic, according to the initial seminal analysis following criteria of the World Health Organization (WHO). Then, the samples were cryopreserved with modified Human Tubal Fluid without supplement or with 2 mM of melatonin. After thawing, the samples were analyzed or supplemented with 2 mM of caffeine, and incubated for 15 minutes. At the end of the experiments, we obtained 4 groups: Post-thaw samples without supplementation (CONT), samples supplemented with caffeine (CAF), melatonin (MEL) and caffeine + melatonin (CM). Seminal parameters for count, motility and kinetics, analyzed by WHO criteria and by the SCA® software, mitochondrial activity, by diaminobenzidine staining, evaluation of DNA fragmentation rate, by the SCSA® method, and dosage of radical oxygen species (ROS) levels, by the luminescence method, pre-cryopreservation and post-thaw were carried out with or without supplementation. The data were analyzed by the paired Student\'s t-test and by one-way analysis of variance with repeated measurements, followed by the Holm-Sidak post-test, adopting an alpha of 5%. We observed a significant reduction in sperm concentration (p < 0.001), total (p < 0.001) and progressive (p < 0.001) motility, kinetic parameters (p < 0.009) and mitochondrial activity (p < 0.001), and increased rates of DNA fragmentation (p=0.046) and ROS (p=0.052) production in the CONT samples when compared with fresh sample. When supplemented with caffeine and melatonin, we observed an increase in progressive motility in the CAF (p=0.005) and CM (p=0.048) groups, and an increase in mitochondrial activity in CM group (p < 0.05). We can conclude that that the combination of caffeine and melatonin supplementation in pre-cryopreservation and post-thaw samples proved to be an important tool to be applied in cryopreserved samples to act as substances that stimulate sperm motility