Os polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres bacterianos. Na sua biossíntese, a PHA sintase incorpora monômeros 3HA à cadeia polimérica. O objetivo deste trabalho foi estudar o potencial da PHA sintase de 2 isolados do gênero Burkholderia sp. na produção de copolímeros. Construiram-se linhagens recombinantes que abrigavam os genes da PHA sintase classe I, em mutantes de Pseudomonas sp. e Burkholderia sacchari, que não acumulam PHA. Foram realizados ensaios de acúmulo de PHA usando glicose como fonte de carbono, apresentando a produção de unidades de 3HB, 3HO e 3HD nas linhagens recombinantes de Pseudomonas sp. As linhagens recombinantes de B. sacchari incorporaram como único constituinte P(3HB). Ensaios de acúmulo de PHA foram realizados nas linhagens recombinantes de B. sacchari, usando como co-substratos diferentes ácidos graxos, sendo detectada a incorporação de unidades de 3HV e 3HHx além do 3HB, quando foram fornecidos acido hexanóico e valérico. Estes resultados indicam que as PHA sintases classe I são capazes de incorporar diferentes unidades monoméricas. / The polyhydroxyalkanoates (PHA) are bacterial polyester. In their biosynthesis, the PHA synthase incorporates monomers 3HA to the polymer chain. The objective of this work was to study the potential of PHA synthase of 2 isolates of the genus Burkholderia sp. in the production of copolymers. Were constructed recombinant strains that housed the genes of PHA synthase class I mutants of Pseudomonas sp. and Burkholderia sacchari, which do not accumulate PHA. PHA accumulation assays were performed using glucose as carbon source, showing the production of units of 3HB, 3HO and 3HD in recombinant strains of Pseudomonas sp. The recombinant strains of B. sacchari incorporated as single constituent P(3HB). PHA accumulation assays were performed on the recombinant strains of B. sacchari, Using as co-substrates different fatty acids, being detected the incorporation of units of 3HV and 3HHx beyond the 3HB, when were supplied hexanoic acid and valerico. These results indicate that the PHA synthases class I are able to incorporate different monomer units.

Duas enzimas têm-se destacado como possíveis marcadores biológicos periféricos na esquizofrenia: a fosfolipase A2 (PLA2) e a glicogênio sintase quinase-3 beta (GSK-3B). Essas moléculas exercem importante influência na arquitetura e plasticidade celulares, na regulação de vias metabólicas comuns (metabolismo de fosfolípides e via Wnt), em fatores de transcrição, na regulação de genes e na sobrevivência celular. Tais aspectos tornam pertinentes as investigações a respeito da possível participação dessas enzimas na fisiopatologia da esquizofrenia. Foi verificada a atividade de subtipos de PLA2 (método radioenzimático: iPLA2, cPLA2 e sPLA2) e os níveis de GSK-3B total (GSK-3Bt) e fosforilada [p(Ser9)-GSK-3B] (ELISA) em plaquetas de pacientes com esquizofrenia inicialmente livres de tratamento medicamentoso com média de 5 anos de doença (D+5a) (n=10), aos quais foi prescrita a olanzapina. Foi avaliado também um grupo de pacientes livres de tratamento medicamentoso com menos de 6 meses de sintomas psicóticos (D-6m) (n=6) aos quais foi posteriormente prescrito o haloperidol. Esses pacientes foram comparados com um grupo controle (n = 20) e avaliados longitudinalmente após o tratamento descrito por 8 semanas. Um grupo de 40 pacientes com esquizofrenia (tempo médio da doença: 17 anos) com pelo menos 6 meses de tratamento com antipsicótico (clozapina, olanzapina ou haloperidol) foi ainda avaliado. Os sintomas clínicos foram avaliados por meio da Escala de Avaliação das Síndromes Positiva e Negativa (PANSS). Quando comparado com o grupo controle, os pacientes D+5a apresentaram aumento da atividade de iPLA2 (p<0,01) e os pacientes D-6m apresentaram aumento da atividade de sPLA2 (p<0,05). Na avaliação longitudinal, somente a olanzapina diminuiu a atividade de iPLA2, cPLA2 e sPLA2 (p<0,01). Quando comparada a atividade dos subtipos de PLA2 entre os pacientes medicados a pelo menos 6 meses e o grupo controle, não foram observadas diferenças significativas. Quando comparado com o grupo controle, os pacientes D+5a apresentaram diminuição dos níveis de GSK-3Bt e p(Ser9)-GSK-3B (p<0,05). Na avaliação longitudinal, foi observado que somente a olanzapina aumentou os níveis de GSK-3Bt e p(Ser9)-GSK-3B (p < 0,01). Quando comparados os níveis de GSK-3Bt e p(Ser9)-GSK-3B entre os pacientes medicados a pelo menos 6 meses e o grupo controle não foram observadas diferenças significativas. Para os pacientes medicados a pelo menos 6 meses foram observadas correlações entre a sub-escala negativa da PANSS e os níveis de p(Ser9)-GSK-3B (r=,53, p<0,001). Sugere-se que a medicação module PLA2 e GSK-3B, independente do antipsicótico utilizado. Esses resultados apontam para uma futura aplicação dessas enzimas na verificação de adesão ao tratamento e estabilização do quadro clínico / The enzymes phospholipases A2 (PLA2) and glycogen synthase kinase-3 beta (GSK-3B) are thought to play a role in schizophrenia by influencing cellular architecture and plasticity, common signaling pathways (phospholipids metabolism and Wnt pathway), gene transcription, regulation factors and apoptosis. These aspects motivated the investigation of both these enzymes in schizophrenia. The activities of PLA2 subtypes (iPLA2, cPLA2 and sPLA2 by radio enzymatic method) and the levels of total GSK-3B and phosphorylated GSK-3B [p(Ser9)-GSK-3B] (by immune enzyme assay) were performed in platelets of drug free patients with schizophrenia for average 5 years of disease (D+5y) (n=10), who was lately prescribed with olanzapine and in drug naïve patients with less than 6 months of psychotic symptoms (D-6m) who was lately prescribed with haloperidol. These patients were compared to a control group (n=20) and were longitudinally evaluated after 8 weeks of monotherapy treatment with the prescribed antipsychotic. These enzymes were also investigated in a group of 40 patients with schizophrenia (mean duration of disease: 17 years) who were at least 6 months treated with antipsychotic (clozapine; olanzapine or haloperidol). Psychopathology was assessed with the Positive and Negative Syndrome Scale (PANSS). Patients D+5y presented higher iPLA2 activity than control group (p < 0.01) and patients D-6m presented higher sPLA2 activity than control group (p < 0.05). On longitudinal evaluation, only olanzapine decreased iPLA2, cPLA2 and sPLA2 activities (p < 0.01). In the long-term medicated patients group compared to the control group, no differences regarding PLA2 subtype activity were found. Patients D+5y presented lower GSK-3Bt and p(Ser9)-GSK-3B levels than control group (p<0.05). On longitudinal evaluation, only olanzapine increased GSK-3Bt and p(Ser9)-GSK-3B levels (p < 0.01). In the long-term medicated patients group compared to the control group, no differences regarding GSK-3B levels were found. For long-term medicated patients, it was observed correlation between p(Ser9)-GSK-3B and the PANSS negative syndrome subscale score (r = .53, p < 0.001). It was suggested that antipsychotic treatment modulated PLA2 and GSK-3B, in spite of the drug used. The results pointed to a future use of these enzymes to verify drug treatment compliance and clinical stabilization

Introdução: O Diabetes Mellitus é doença que apresenta elevada incidência e prevalência na população em diversas partes do mundo. Estudos experimentais sugerem que o estresse oxidativo esteja envolvido na patogênese e na progressão dela. Objetivo: Investigar os efeitos da utilização exógena do antioxidante orgoteína (SOD Cu/Zn) sobre o estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição nuclear kappa B (NFκB) e expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) hepática no modelo experimental de diabetes mellitus (DM). Métodos e Resultados: Foram utilizados 28 ratos machos Wistar, divididos em quatro grupos: controle (CO), controle tratados com orgoteína (CO+ORG), diabéticos (DM) e diabéticos tratados com orgoteína (DM+ORG). A dose utilizada da ORG (orgoteína ®) foi de 13 mg/Kg de peso corporal durante os sete últimos dias de experimento através de injeção subcutânea. O DM foi induzido por injeção de estreptozotocina (i.p.,70 mg/kg) e, após sessenta dias, foi avaliada a lipoperoxidação hepática através das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS- nmoles/mg de proteína), a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT-pmoles/mg de proteína), superóxido dismutase (SOD-U/mg de proteína) e glutationa peroxidase (GPx- nmoles/mg de proteína). Também foi realizada a medida de nitritos e nitratos (mM de NO2 e NO3). As expressões da p65 do NFκB e da iNOS foram avaliadas pela técnica de Western blot e quantificadas por densitometria em relação à percentagem do controle. Resultados: Houve aumento na lipoperoxidação hepática no grupo DM e redução significativa no grupo DM+ORG (0,36±0,15 vs 0,18±0,04; p<0,01). A atividade da enzima CAT apresentou aumento no grupo DM e redução significativa no grupo DM+ORG (p<0,001), enquanto a atividade da SOD e da GPx apresentaram redução no DM e aumento no grupo DM+ORG, respectivamente (p<0,001 e p<0,05). A medida de nitritos e nitratos apresentou redução no DM e aumento no grupo DM+ORG (1,47±0,61 vs 2,29±0,20; p<0,05) enquanto a expressão da iNOS foi 32% maior no grupo DM em relação ao grupo CO e 53% maior no grupo DM+ORG, quando comparado com o grupo DM (p<0,01). A p65 foi 37% mais expressa no DM (p<0,05) e sem diferença estatística, quando comparado o grupo DM com o grupo DM+ORG. Conclusão: O tratamento com orgoteína reduziu o estresse oxidativo hepático em animais diabéticos, mesmo não alterando o fator de transcrição nuclear NFкB. A orgoteína também aumentou a bioatividade do NO, provavelmente, devido ao aumento da atividade, dismutando o radical superóxido, e devido ao aumento da expressão da iNOS. / Aim: To investigate the effects of exogenous antioxidant orgoteína on oxidative stress, activation of nuclear transcription factor kappa B (NFκB), and hepatic expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the experimental model of diabetes mellitus (DM). Methods: 28 male Wistar rats divided in four groups were used: control (CO), controls treated with orgoteína (CO+ORG), diabetics (DM), and diabetics treated with orgoteína (DM+ORG). Orgoteína (orgotein®, 13 mg/Kg body weight was administered subcutaneously for the last 7 days of the trial. DM was induced by a single streptozotocin injection (i.p.,70 mg/kg), and 60 days later, we evaluated liver lipoperoxidation through thiobarbituric acid reactive substances (TBARS- nmoles/mg of protein) and activity of antioxidant enzymes catalase (CAT-pmoles/mg of preotein), superoxide dismutase (SODU/ mg of protein) and glutathione peroxidase (GPx- nmoles/mg of protein). Nitrites e nitrates (mM NO2 and NO3) were also measured, and p65 of NFκB and iNOS expressions were evaluated by Western blot and quantified by densitometry as compared to control percentage. Results: Liver peroxidation was increased in the DM group and significantly decreased in the DM+ORG group (0.36±0.15 vs 0.18±0.04; p<0.01). CAT activity was increased in the DM group and significantly decreased in the DM+ORG group (p<0.001), whereas SOD and GPx activity were decreased in the DM group and increased in the DM+ORG group, respectively (p<0.001 and p<0.05). Nitrite and nitrate measures were reduced in the DM and increased in the DM+ORG group (1.47±0.61 vs 2.29±0.20; p<0.05), while iNOS expression in the DM group was 32% greater than in the CO and 53% greater in the DM+ORG group than in the DM group (p<0.01). P65 expression was 37% higher in the DM (p<0.05), and there was no significant difference between the DM and DM+ORG groups. Conclusion: Orgoteína treatment reduced liver oxidative stress in diabetic animals, even though it did not change NFкB. Orgoteína also increased NO bioactivity, probably by the increased dismutation of the superoxide radical and by increase in iNOS expression.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos causado principalmente pela deficiência na atividade da enzima cistationina-β-sintase (CBS), resultando em acúmulo de homocisteína (Hcy) e metionina nos fluidos biológicos. As manifestações clínicas incluem retardo mental, ectopia lentis, episódios tromboembólicos e osteoporose. Estudos realizados em modelos animais demonstram um possível papel do estresse oxidativo na fisiopatologia da homocistinúria. Mais recentemente, foram demonstradas alterações em alguns parâmetros de estresse oxidativo em pacientes homocistinúricos. Nesse trabalho, essas investigações foram ampliadas, no intuito de melhor entender os mecanismos fisiopatológicos e a terapêutica da homocistinúria por deficiência de CBS. Dessa forma, o objetivo principal desse trabalho foi avaliar os perfis lipídico, inflamatório e oxidativo, bem como a atividade das enzimas paraoxonase (PON1) e butirilcolinesterase (BuChE) em pacientes homocistinúricos tratados (dieta hipoproteica suplementada com vitamina B6, ácido fólico, betaína e vitamina B12) e não tratados, em comparação com indivíduos saudáveis, e adicionalmente avaliar a indução in vitro de mutagenicidade causada pela Hcy, através do teste de micronúcleos em leucócitos, e ainda avaliar o efeito in vitro do antioxidante N-acetil-L-cisteína na redução do dano ao DNA causado pelas altas concentrações de Hcy. No que se refere ao perfil sérico, foi verificada uma redução nos níveis de colesterol HDL, apolipoproteína A, bem como na atividade da enzima (PON1) em pacientes homocistinúricos tratados e não tratados. A atividade da enzima BuChE e os níveis de interleucina 6 (IL-6) estavam aumentados apenas nos pacientes não tratados. Correlações significativas positivas foram encontradas nos dois grupos de pacientes estudados entre a atividade da PON1 e o conteúdo de sulfidrilas; entre a atividade da PON1 e os níveis de vitamina B12; entre os níveis de HDL e apolipoproteína A1; entre os níveis de apolipoproteína A1 e vitamina B12; e entre os níveis de IL-6 e os níveis de carbonilas. Correlação significativa negativa foi encontrada entre os níveis de ácido fólico e de homocisteína total (tHcy). Em um segundo momento foram avaliados parâmetros de estresse oxidativo e níveis de nitritos na urina dos pacientes. Foram demonstrados níveis aumentados de 15-F2t-isoprostanos, di-tirosina e nitritos na urina de pacientes homocistinúricos tratados. Os níveis de 15-F2t-isoprostanos apresentaram uma correlação significativa positiva com os níveis de tHcy e os níveis de di-tirosina apresentaram correlação significativa negativa com os níveis de sulfidrilas. A atividade da enzima catalase encontrou-se aumentada no sangue de pacientes homocistinúricos tratados. Finalmente, demonstrou-se em estudo in vitro que a Hcy causa um aumento no dano cromossômico, avaliado pelo método de micronúcleos. Além disso, foi observado um efeito in vitro do antioxidante N-acetil-L-cisteína na redução do dano ao DNA causado pelas altas concentrações de Hcy. Avaliados em conjunto, nossos resultados indicam que o estresse oxidativo, acompanhado por alterações nos níveis urinários de nitritos, e por alterações nos perfis inflamatório e lipídico são fatores que possivelmente contribuam para o dano vascular encontrado na homocistinúria. Esses eventos parecem estar interconectados, e parecem ser decorrentes dos altos níveis de tHcy encontrados no sangue dos pacientes. Novas abordagens terapêuticas, além das atualmente utilizadas que incluem ácido fólico e vitamina B12, como o uso de antioxidantes, poderiam ser alternativas para atingir melhores resultados no tratamento de pacientes homocistinúricos. / Homocystinuria is an inborn error of metabolism of amino acids primarily caused by deficiency in the activity of cystathionine-β-synthase (CBS), resulting in accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine in biological fluids. Clinical manifestations include mental retardation, ectopia lentis, thromboembolic events and osteoporosis. Studies in animal models show a possible role of oxidative stress in the pathophysiology of homocystinuria. More recently, changes in some parameters of oxidative stress have been demonstrated in homocistinuric patients. In this work, we expanded these investigations, in order to understand the mechanisms that lead to the development of clinical manifestations of disease and the therapeutic for homocystinuria due CBS deficiency. Thus, the main objective of this study was to evaluate the lipid, inflammatory and oxidative profiles as well as the activity of paraoxonase (PON1) and butyrylcholinesterase (BuChE) in treated homocistinuric patients (hypoproteic diet supplemented with vitamin B6, folic acid, betaine and vitamin B12) and untreated patients compared with healthy individuals, and to evaluate the in vitro induction of mutagenicity caused by Hcy, through the micronucleus test in leukocytes, and further, to evaluate the in vitro effect of N-acetyl-L-cysteine in reducing DNA damage caused by high concentrations of Hcy. With regard to the serum profile, was observed a reduction in HDL cholesterol, apolipoprotein A, and in enzyme activity (PON1) in both group of CBS-deficient patients. The activity of butyrylcholinesterase and levels of interleukin 6 (IL-6) were increased only in untreated patients. Positive significant correlations were found in both patients groups between PON1 activity and the content of sulfhydryl; between PON1 activity and vitamin B12 levels; between the levels of HDL and apolipoprotein A1; between the levels of apolipoprotein A1 and B12; and between IL-6 levels and levels of carbonyls. Negative significant correlation was found between folic acid levels and total homocysteine (tHcy). In a second moment were evaluated parameters of oxidative stress and the nitrite levels in the urine of patients. Increased levels of 15-F2t-isoprostanes, di-tyrosine and nitrite were demonstrated in the urine of treated homocistinuric patients. The 15-F2t-isoprostanes levels showed a significant positive correlation with tHcy levels; and di-tyrosine levels showed a significant negative correlation with the sulfhydryl levels. The catalase activity was found increased in the blood of treated homocistinuric patients. Finally, it was shown the in vitro effect of Hcy on increase of chromosomal damage assessed by micronuclei method. Furthermore, it was observed the in vitro effect of N-acetyl-L-cysteine antioxidant in reducing DNA damage caused by high concentrations of Hcy. Evaluated together, our results indicate that oxidative stress accompanied by changes in urinary nitrite levels and changes in inflammatory and lipid profiles are factors possibly contributing to vascular damage found in homocystinuria. These events appear to be interconnected, and appear to be due to the high tHcy levels found in the blood of patients. New therapeutic approaches in addition to the currently used which include folic acid and vitamin B12, as the use of antioxidants, could be alternatives to achieve best results in the treatment of homocistinuric patients. Furthermore, an early diagnosis and, consequently, an early treatment, could avoid that the patients remain for a long time subjected to exposure of high concentrations of tHcy.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T03:11:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 295312.pdf: 1743921 bytes, checksum: 5721b330602424fbe65211dfbf890383 (MD5) / Vários estudos demonstraram que produção excessiva de NO, relacionada com o aumento da expressão da NOS-2, contribui para as alterações hemodinâmicas observadas durante a sepse. No entanto, alguns trabalhos mostram que a inibição desta enzima não reverte a hipotensão, a hiporeatividade a agentes vasoconstritores e não influencia na sobrevivência de animais sépticos. Portanto, resolvemos investigar o papel do NO proveniente da isoforma neuronal da óxido nítrico sintase (NOS-1) sobre a reatividade a agentes vasoconstritores, e sua influência na progressão da sepse bem como o efeito de agonistas opióides sobre parâmetros comumente avaliados nesta doença. Nossos resultados demonstram que animais sépticos são sensíveis a analgesia com drogas opióides em modelo de dor por estímulo térmico e, além disso, os analgésicos opióides reduziram a hipotensão e hiporeatividade vascular induzidas pela sepse. Estes compostos quando administrados em doses baixas não interferiram na sobrevivência de animais sépticos, enquanto que doses maiores aumentam a mortalidade. A inibição da NOS-1 melhorou a reatividade vascular a agonistas e -adrenérgicos, tanto na fase inicial quanto na fase tardia da sepse. Tanto a NOS-1 quanto a guanilato ciclase solúvel tem sua expressão aumentada nas camadas de músculo liso vascular da aorta e do leito vascular mesentérico, e nos momentos mais tardios, ambas as enzimas interagem fisicamente no leito vascular mesentérico. Parte do mecanismo de reversão da hiporeatividade a agonistas -adrenérgicos, após inibição da NOS-1, se deve a redução na formação de GMPc. No entanto, a reversão da hiporeatividade vascular a agentes -adrenérgicos durante a sepse pelo 7-NI parece ser independente do aumento nos níveis de cAMP. As alterações promovidas pelo NO proveniente da NOS-1 no início da sepse estão relacionadas com a instalação da hipotensão, disfunção vascular, alterações na glicemia e nos níveis de leucócitos sanguíneos. A redução do conteúdo enzimático da NOS-1, reduz ou abole as alterações patológicas induzidas pela sepse. Nosso trabalho demonstra que o NO proveniente da NOS-1 participa ativamente na disfunção vascular promovida pela sepse. / Several studies have shown that overproduction of NO, associated with the increased expression of NOS-2, contributes to the hemodynamic changes observed in sepsis. However, inhibition of NOS-2 does not reverse hypotension, hyporesponsiveness to vasoconstrictor and does not influence the survival of septic animals. Therefore, we decided to investigate the role of NO derived from the neuronal isoform of nitric oxide synthase (NOS-1) on the reactivity to vasopressor agents and the progression of sepsis as well as the effect of opioid agonists on parameters commonly evaluated in this pathology. Our results demonstrate that septic animals are sensitive to analgesia with opioids in the pain model of thermal stimulation. In addition, opioids reduced the hypotension and vascular hyporesponsiveness induced by sepsis. When administered in low doses these drugs did not affect the survival of septic animals, whereas higher doses increased the mortality. The inhibition of NOS-1 improved the vascular reactivity to and -adrenergic agonists, both in early and late phase of sepsis. The expression of NOS-1 and soluble guanylate cyclase was increased in vascular smooth muscle layers of aorta and mesenteric vascular bed and both enzymes interact physically in the mesenteric vascular bed in late phase of sepsis. At least part of the mechanism of the recovery in the responsiveness to adrenergic agonists, after inhibition of NOS-1, is due to the reduced formation of cGMP. The changes promoted by NOS-1-derived NO in early sepsis are associated with the onset of hypotension, vascular dysfunction and changes in blood glucose levels and blood leukocytes. The reduction in the NOS-1 enzyme content reduces or abolishes the pathological changes induced by sepsis. Our work demonstrates that NOS-1-derived NO plays a role in promoting vascular dysfunction in sepsis.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-04-26T13:22:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 386408 bytes, checksum: 1d07ce98be2c52bdc785ddfdff577fa1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-26T13:22:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 386408 bytes, checksum: 1d07ce98be2c52bdc785ddfdff577fa1 (MD5) Previous issue date: 2000-08-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A ocorrência de plantas daninhas resistentes a herbicidas é um fato novo no Brasil. A caracterização da resistência é importante para embasar previsões e eleger métodos de manejo e controle. Desse modo, foram realizados na Universidade Federal de Viçosa, de março de 1997 a julho de 1999, quatro experimentos, objetivando de identificar biótipos resistentes e caracterizar a resistência. O primeiro experimento objetivou identificar e estudar os mecanismos envolvidos na resistência, cujos resultados indicaram resistência cruzada aos herbicidas inibidores da enzima ALS. Estudos com ALS, extraída de plantas resistentes de leiteiro, indicaram I50 superior a 3.000 μM para o imazapyr e 2.000 μM para o imazethapyr, contrastando com valores de I50 de 2 μM para aquele e 0,7 μM para este em plantas sensíveis. No segundo experimento, investigou-se a resposta dos biótipos resistentes a herbicidas com diferentes mecanismos de ação. Constatou-se que os herbicidas inibidores da ALS controlaram com eficiência o biótipo sensível, à exceção do flumetsulan; já sobre o biótipo resistente, somente o herbicida imazapyr, na maior dose, apresentou controle. Os herbicidas com mecanismos de ação distintos daqueles dos inibidores da ALS apresentaram-se altamente eficientes no controle dos biótipos resistentes e sensíveis quando aplicados de forma isolada ou em mistura. O terceiro experimento objetivou descrever uma técnica de cruzamento controlado em Euphorbia heterophylla L. Os resultados evidenciaram que as polinizações e emasculações realizadas no estádio 1 produzem grande número de ciátios com uma ou duas sementes e raramente com três. As realizadas no estádio 2, ou acima deste, garantiram o sucesso dos cruzamentos com boa produção de sementes. No quarto experimento, estudaram-se a herança, o número de genes que conferem a resistência e o grau de resistência dos biótipos homozigotos e heterozigotos resistentes. As plantas F1 mostraram-se totalmente resistentes ao herbicida, indicando que a resistência é nuclear e dominante. As plantas F2 apresentaram alta probabilidade para segregação 3:1, evidenciando que a resistência é codificada por um gene dominante. Pela aplicação de doses crescentes de imazethapyr sobre as plantas F1, calculou-se que os biótipos homozigotos resistentes e os heterozigotos apresentaram o mesmo grau de resistência para doses de até 1.600 g ha-1 desse herbicida. Os resultados permitiram concluir que a insensibilidade da enzima ALS aos herbicidas que a inibem é o principal mecanismo responsável pela resistência das plantas de Euphorbia heterophylla L. a tais produtos. Os biótipos resistentes são controlados com eficiência com herbicidas com mecanismos de ação distintos daqueles dos inibidores da ALS. A resistência é codificada por um gene dominante nuclear com dominância completa. / The occurrence of herbicide-resistant weeds is a new fact in Brazil. The characterization of the resistance is important to provide a base for previsions and select methods of management and control. Therefore, four experiments were carried out at the Universidade Federal de Viçosa, from March,1997, to July, 1999, to identify resistant biotypes and to study the mechanisms involved in resistance. The first experiment, aimed to identify and study the mechanisms involved in the resistance, had the results indicating cross resistance to ALS inhibitory herbicides. Studies with ALS, extracted from resistant plants, showed l50 superior to 3000 μM for imazapyr and 2000 μM for imazethapyr, which contrasted with l50 values of 2 μM for the former and 0.7 μM for the latter in susceptible plants. The second experiment analyzed the response of the resistant biotypes to herbicides with different modes of action. It was verified that the ALS inhibitory herbicides had efficient control over the susceptible biotypes, apart from flumetsulan; as for the resistant biotype, only the herbicide imazapyr at its highest dose, showed control. The herbicides with modes of action distinct from those ALS inhibitors were shown highly efficient on controlling susceptible and resistant biotypes when applied separately or in mixture. The third experiment aimed to describe a technique of controlled crossings in Euphorbia heterophylla L. The results showed evidence that pollination and emasculation performed at stage 1 produce a great number of ciatios with one or two seeds and rarely with three. Those performed at stage 2, or above this stage, assured the success of the crossings with a good production of seeds. In the fourth experiment, the inheritance, the number of genes that confer resistance and the degree of resistance in resistant homozygote and heterozygote biotypes, were studied. The F1 plants were shown totally resistant to the herbicide, indicating that the resistance is nuclear and dominant. The F2 plants presented a high probability for 3:1 segregation, making evident that the resistance is codified by a dominant gene. It was calculated that the biotypes resistant homozygote and heterozygote showed the -1 same degree of resistance for doses up to 1600 g ha , by means of the application of increasing doses of imazethapyr on F1 plants. The results obtained permit the conclusion that the insensitivity of the ALS enzyme to the herbicides is the primary mechanism responsible for the resistance of Euphorbia heterophylla L. to such products. The resistant biotypes are efficiently controlled by herbicides with mechanism of action distinct from those of the ALS inhibitors. The resistance is codified by a nuclear dominant gene with complete dominance.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-06T17:21:16Z No. of bitstreams: 1 Cleiton Silva Santos O papel...2014.pdf: 3463624 bytes, checksum: e0ea46a25188ac23e355981d84456b5f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-06T17:44:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Cleiton Silva Santos O papel...2014.pdf: 3463624 bytes, checksum: e0ea46a25188ac23e355981d84456b5f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T17:44:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cleiton Silva Santos O papel...2014.pdf: 3463624 bytes, checksum: e0ea46a25188ac23e355981d84456b5f (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A patogênese da leptospirose é pouco compreendida e os estudos com enfoque na resposta inflamatória sistêmica ou local são escassos, em especial no que se refere ao papel do óxido nítrico (NO) e da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS). Dados de ensaios em culturas de células renais sugerem um papel importante da liberação de mediadores inflamatórios, tais como NO, na resposta às leptospiras e consequente nefrite intersticial. A transposição destes achados para o modelo in vivo foi pouco explorada. Por outro lado, estudos em humanos sugerem que a liberação sistêmica de NO correlaciona-se com a gravidade da doença renal e, portanto, pode ser um potencial alvo para terapia adjuvante à antibioticoterapia. O presente trabalho estudou a correlação da iNOS com distúrbios hidroeletrolíticos na patogênese da leptospirose. No modelo experimental de hamsters, avaliamos a associação da inibição dos efeitos do NO, através da terapia combinada de antibioticoterapia padrão e azul de metileno, com distúrbios eletrolíticos, alterações histopatológicas em hamsters e sobrevida. Nenhum benefício da terapia adjuvante com azul de metileno foi demonstrado. No modelo de camundongos transgênicos, investigamos o efeito da ausência do gene da iNOS na nefrite intersticial e na quantidade de bactérias observadas nos tecidos. A ausência do gene iNOS esteve associado a menor frequência de nefrite intersticial grave. Maiores estudos são necessários para investigar a função da inibição da produção de NO na patogenia da doença e da nefrite associada a leptospirose. / The pathogenesis of leptospirosis is poorly understood, and there are few studies fusing on the systemic or local inflammatory responses, especially referring to the role of nitric oxide (NO) and the enzyme inducible nitric oxide synthase (iNOS). Data from in vitro studies suggest an important role of inflammatory mediators, such as NO, in the response to leptospires in the development of interstitial nephritis. The transposition of these findings to an in vivo model was little explored. However, studies in humans suggest that systemic liberation of NO is correlated with severity of renal disease and therefore can be potential target to adjuvant therapy along with antibiotic therapy. The present work evaluated the correlation of iNOS with the pathogenesis of leptospirosis. In the experimental hamster model, we evaluated the effect of inhibiting downstream effects of NO on electrolytic disorders, histopathological changes and survival. No benefit of methylene blue treatment could be observed when compared to antibiotic (ampicillin) therapy only. In the mouse transgenic model, we investigated the effect of the absence of the Inos gene in interstitial nephritis and in the bacterial burden in target tissues. The absence of a functional iNOS gene was associated with lower frequency of severe interstitial nephritis.

A homocistinúria é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos causado principalmente pela deficiência na atividade da enzima cistationina-β-sintase (CBS), resultando em acúmulo de homocisteína (Hcy) e metionina nos fluidos biológicos. As manifestações clínicas incluem retardo mental, ectopia lentis, episódios tromboembólicos e osteoporose. Estudos realizados em modelos animais demonstram um possível papel do estresse oxidativo na fisiopatologia da homocistinúria. Mais recentemente, foram demonstradas alterações em alguns parâmetros de estresse oxidativo em pacientes homocistinúricos. Nesse trabalho, essas investigações foram ampliadas, no intuito de melhor entender os mecanismos fisiopatológicos e a terapêutica da homocistinúria por deficiência de CBS. Dessa forma, o objetivo principal desse trabalho foi avaliar os perfis lipídico, inflamatório e oxidativo, bem como a atividade das enzimas paraoxonase (PON1) e butirilcolinesterase (BuChE) em pacientes homocistinúricos tratados (dieta hipoproteica suplementada com vitamina B6, ácido fólico, betaína e vitamina B12) e não tratados, em comparação com indivíduos saudáveis, e adicionalmente avaliar a indução in vitro de mutagenicidade causada pela Hcy, através do teste de micronúcleos em leucócitos, e ainda avaliar o efeito in vitro do antioxidante N-acetil-L-cisteína na redução do dano ao DNA causado pelas altas concentrações de Hcy. No que se refere ao perfil sérico, foi verificada uma redução nos níveis de colesterol HDL, apolipoproteína A, bem como na atividade da enzima (PON1) em pacientes homocistinúricos tratados e não tratados. A atividade da enzima BuChE e os níveis de interleucina 6 (IL-6) estavam aumentados apenas nos pacientes não tratados. Correlações significativas positivas foram encontradas nos dois grupos de pacientes estudados entre a atividade da PON1 e o conteúdo de sulfidrilas; entre a atividade da PON1 e os níveis de vitamina B12; entre os níveis de HDL e apolipoproteína A1; entre os níveis de apolipoproteína A1 e vitamina B12; e entre os níveis de IL-6 e os níveis de carbonilas. Correlação significativa negativa foi encontrada entre os níveis de ácido fólico e de homocisteína total (tHcy). Em um segundo momento foram avaliados parâmetros de estresse oxidativo e níveis de nitritos na urina dos pacientes. Foram demonstrados níveis aumentados de 15-F2t-isoprostanos, di-tirosina e nitritos na urina de pacientes homocistinúricos tratados. Os níveis de 15-F2t-isoprostanos apresentaram uma correlação significativa positiva com os níveis de tHcy e os níveis de di-tirosina apresentaram correlação significativa negativa com os níveis de sulfidrilas. A atividade da enzima catalase encontrou-se aumentada no sangue de pacientes homocistinúricos tratados. Finalmente, demonstrou-se em estudo in vitro que a Hcy causa um aumento no dano cromossômico, avaliado pelo método de micronúcleos. Além disso, foi observado um efeito in vitro do antioxidante N-acetil-L-cisteína na redução do dano ao DNA causado pelas altas concentrações de Hcy. Avaliados em conjunto, nossos resultados indicam que o estresse oxidativo, acompanhado por alterações nos níveis urinários de nitritos, e por alterações nos perfis inflamatório e lipídico são fatores que possivelmente contribuam para o dano vascular encontrado na homocistinúria. Esses eventos parecem estar interconectados, e parecem ser decorrentes dos altos níveis de tHcy encontrados no sangue dos pacientes. Novas abordagens terapêuticas, além das atualmente utilizadas que incluem ácido fólico e vitamina B12, como o uso de antioxidantes, poderiam ser alternativas para atingir melhores resultados no tratamento de pacientes homocistinúricos. / Homocystinuria is an inborn error of metabolism of amino acids primarily caused by deficiency in the activity of cystathionine-β-synthase (CBS), resulting in accumulation of homocysteine (Hcy) and methionine in biological fluids. Clinical manifestations include mental retardation, ectopia lentis, thromboembolic events and osteoporosis. Studies in animal models show a possible role of oxidative stress in the pathophysiology of homocystinuria. More recently, changes in some parameters of oxidative stress have been demonstrated in homocistinuric patients. In this work, we expanded these investigations, in order to understand the mechanisms that lead to the development of clinical manifestations of disease and the therapeutic for homocystinuria due CBS deficiency. Thus, the main objective of this study was to evaluate the lipid, inflammatory and oxidative profiles as well as the activity of paraoxonase (PON1) and butyrylcholinesterase (BuChE) in treated homocistinuric patients (hypoproteic diet supplemented with vitamin B6, folic acid, betaine and vitamin B12) and untreated patients compared with healthy individuals, and to evaluate the in vitro induction of mutagenicity caused by Hcy, through the micronucleus test in leukocytes, and further, to evaluate the in vitro effect of N-acetyl-L-cysteine in reducing DNA damage caused by high concentrations of Hcy. With regard to the serum profile, was observed a reduction in HDL cholesterol, apolipoprotein A, and in enzyme activity (PON1) in both group of CBS-deficient patients. The activity of butyrylcholinesterase and levels of interleukin 6 (IL-6) were increased only in untreated patients. Positive significant correlations were found in both patients groups between PON1 activity and the content of sulfhydryl; between PON1 activity and vitamin B12 levels; between the levels of HDL and apolipoprotein A1; between the levels of apolipoprotein A1 and B12; and between IL-6 levels and levels of carbonyls. Negative significant correlation was found between folic acid levels and total homocysteine (tHcy). In a second moment were evaluated parameters of oxidative stress and the nitrite levels in the urine of patients. Increased levels of 15-F2t-isoprostanes, di-tyrosine and nitrite were demonstrated in the urine of treated homocistinuric patients. The 15-F2t-isoprostanes levels showed a significant positive correlation with tHcy levels; and di-tyrosine levels showed a significant negative correlation with the sulfhydryl levels. The catalase activity was found increased in the blood of treated homocistinuric patients. Finally, it was shown the in vitro effect of Hcy on increase of chromosomal damage assessed by micronuclei method. Furthermore, it was observed the in vitro effect of N-acetyl-L-cysteine antioxidant in reducing DNA damage caused by high concentrations of Hcy. Evaluated together, our results indicate that oxidative stress accompanied by changes in urinary nitrite levels and changes in inflammatory and lipid profiles are factors possibly contributing to vascular damage found in homocystinuria. These events appear to be interconnected, and appear to be due to the high tHcy levels found in the blood of patients. New therapeutic approaches in addition to the currently used which include folic acid and vitamin B12, as the use of antioxidants, could be alternatives to achieve best results in the treatment of homocistinuric patients. Furthermore, an early diagnosis and, consequently, an early treatment, could avoid that the patients remain for a long time subjected to exposure of high concentrations of tHcy.

Os astrócitos são células gliais do sistema nervoso central (SNC) que, entre diversas funções, tem um importante papel na manutenção do ambiente extracelular, removendo neurotransmissores e íons os quais podem ser tóxicos em altas concentrações. Estas células estão envolvidas em diversas doenças neurodegenerativas e representam um importante alvo de estudo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A técnica de cultura primária (CP) de astrócitos de ratos é amplamente utilizada como modelo para o estudo de características mecânicas e bioquímicas dessa célula em um sistema isolado. Alternativamente, astrócitos imortalizados por transfecção (AI) e a linhagem C6 de rato (C6) são usados como modelo astrocítico, uma vez que são células mais homogêneas, além de serem de fácil e rápida manipulação. No entanto, apesar de resultados divergentes serem encontrados na literatura, existe uma carência de estudos comparativos entre estes três modelos experimentais. A escolha de um modelo adequado para o estudo destas células nos permitiria estudar de forma mais precisa as funções extracelulares de proteínas como a S100B. Essa proteína pode ser liberada ou secretada principalmente por astrócitos no SNC e, apesar de possuir efeitos tróficos, exerce funções tóxicas, quando em altas concentrações no meio extracelular. Apesar disso, pouco se sabe sobre o processo de remoção da S100B extracelular. Em vista disso, o objetivo desta tese foi comparar e caracterizar funcionalmente a CP, AI e C6 no que diz respeito a diferenças morfológicas, marcadores proteicos e funções clássicas astrocíticas, bem como estudar a capacidade destas células de internalizar a proteína S100B, avaliando-se o mecanismo deste processo. Além disso, foi realizada a padronização de um ensaio colorimétrico utilizando a atividade glutamil-transferase da glutamina sintetase (GS), visto a carência deste ensaio em cultura de astrócitos e em diferentes estruturas cerebrais. Esta enzima é considerada um marcador astrocítico e sua disfunção pode comprometer o ciclo glutamina-glutamato, processo relacionado ao quadro de excitotoxicidade glutamatérgica, observado em doenças neurodegenerativas. O ensaio mostrou-se preciso, sensível, linear, específico e com alta aplicabilidade no SNC e nos modelos de cultura celular. Nossos resultados mostraram que as duas linhagens celulares (AI e C6) foram positivas para proteínas características de astrócitos, bem como funcionais no metabolismo glutamatérgico e energético. No entanto, estes parâmetros mostraram-se reduzidos em estado basal em comparação com a CP. Frente a estímulos específicos, os AI não se mostraram como um modelo reprodutível das funções astrocíticas clássicas, ao contrário da linhagem C6, a qual apresentou resposta similar aos astrócitos de CP. De forma geral a linhagem C6 representou um modelo válido para estudo das características astrocíticas estudadas, porém sempre com valores basais reduzidos quando comparados com a CP que, em nossa avaliação, representou um melhor modelo para o estudo da internalização da proteína S100B. Estas células foram capazes de endocitar a S100B extracelular por um mecanismo dependente de RAGE e dinamina. Uma vez internalizada, a S100B seguiu pela via endocítica, colocalizando com importantes marcadores, como Dextran e Lysotracker. As vesículas de S100B mostraram um aumento de direcionalidade ao longo do tempo de incubação, afetado pela variação de cálcio intracelular. Estes dados mostram a importância da escolha de um modelo in vitro adequado de cultura de astrócitos, bem como evidenciam o importante papel destas células na remoção de concentrações tóxicas da proteína S100B do meio extracelular, auxiliando na compreensão dos mecanismos de sinalização desta proteína. / Astrocytes are glial cells that participate in a variety of function of central nervous system (CNS) such as the maintenance of the extracellular environment, removing toxic concentration of ions and neurotransmitters. These cells are involved in several neurodegenerative diseases and are important targets for the development of therapeutic strategies. Astrocyte primary culture (PC) is a potent instrument to study these cells in an isolated system, allowing the elucidation of mechanistic features specific for this type of cell. An alternative to this model is the use of cell lines, such as immortalized astrocytes (IA) or C6 glioma cells (C6). These linages have the advantage to present more homogeneous features, are easily, faster and lower cost to manipulate. Despite these facilities, cell lines present highly proliferative features and some different characteristics in comparison to PC, which put into question the validity of them as an astrocytic model. The selection of a suitable model to the study of astrocytes would allow us to evaluate protein extracellular effects, such as S100B with greater reliability. This protein is released and secreted mainly by astrocytes in the CNS, exerting trophic and toxic effect in a RAGE dependent manner. S100B toxic effects are shown in high extracellular concentrations, although the clearance of this protein from the extracellular space is poorly understood. In view of this, the goal of this research was to show a comparative analysis of PC, IA and C6 regarding morphological features, protein profile and classical astrocytic functions. Furthermore, we evaluated the mechanism of S100B internalization, characterization of internalized vesicles and intracellular dynamics in astrocytes. In addition, the standardization of a colorimetric assay to measure the glutamyl-transferase activity of glutamine synthetase (GS) was performed, considering the lack of this study in culture of astrocytes and different brain structures. This enzyme is considered an astrocytic marker and any dysfunction may compromise the glutamine-glutamate cycle, which is observed in many neurodegenerative diseases. The assay was accurate, sensitive, linear, specific and with high applicability in the CNS. Our results showed that the two cell lines (IA and C6) were positive for characteristic proteins of astrocytes, although expressing less quantities then PC. Similarly, the glutamatergic and energetic metabolism and cellular communication by gap junction also showed to be reduced in lineages cells. IA did not reveal a reproducible model of classic astrocytic functions, in opposite to C6 cells that presented a similar response to PC when submitted to the same stimulus. Nevertheless, PC showed pronounced astrocytic characteristics, representing the best model for the study of S100B protein internalization. The results in this study revealed that cultured astrocytes efficiently remove fluorescently labeled extracellular S100B in a time-dependent manner by vesicle endocytosis. The internalization was RAGE and dynamine dependent. In time, vesicles capturing S100B exhibit directional mobility, meaning that vesicles get functionally attached to the cytoskeleton. Moreover, the mobility of vesicles capturing S100B was affected by changes in [Ca2+]. These data support to the understanding of the mechanism of extracellular signaling of S100B protein, as well as the role of astrocytes in this regulation.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:04:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338128.pdf: 2873785 bytes, checksum: 55675b858483a8a04254782459b2cae6 (MD5) Previous issue date: 2015 / O mecanismo pelo qual a disfunção vascular séptica é iniciada, e como baixas concentrações de óxido nítrico (NO) podem estar relacionadas às vias de sinalização dos receptores de glicocorticoides (GR), são pouco entendidas. Os objetivos desse trabalho foram avaliar como a produção inicial de NO, induzida por lipopolissacarídeo (LPS), pode interferir na ativação de células musculares lisas obtidas de aorta de ratos (A7r5) e na distribuição celular dos GR. Células A7r5 estimuladas com LPS e Interferon-? (IFN) apresentaram um rápido (em minutos) aumento na produção de NO e ânion superóxido, formando peroxinitrito, e posterior ativação do NF-kB, expressão da NOS-2 e acúmulo de nitrito no sobrenadante celular. A inibição da NO sintase (NOS) e NADPH oxidase (NOX), ou o sequestro do NO e do ânion superóxido, diminuíram todos estes eventos. O silenciamento das enzimas envolvidas demonstrou que apenas a ativação das isoformas NOS-1 e NOX-1 são importantes para a expressão da NOS-2 nas células A7r5. O pré-tratamento de ratos adrenalectomizados (ADX) com 7-nitroindazol (7-NI), antes do desafio com LPS reduziu os níveis plasmáticos de IL-6 e de NOx, diminuiu a translocação nuclear de GR e reduziu a mortalidade induzida por LPS em 65%. Observou-se que a translocação nuclear de GR mediada pelo pulso de NO e peroxinitrito depende da integridade do domínio de dimerização do GR, pois não foi observada translocação de GR em fibroblastos de camundongos deficientes na dimerização de GR (GRdim/dim), bem como o pré-tratamento com 7-NI não preveniu a mortalidade destes camundongos quando desafiados com LPS. Dessa forma, concluímos que a rápida formação de NO, ânion superóxido e peroxinitrito, derivados da atividade da NOS-1 e da NOX-1, respectivamente, atuam como agentes sinalizadores para a expressão da NOS-2 através da ativação de NF-kB, sendo importantes para o início da disfunção vascular séptica. Além disso, demonstramos de forma inédita que este pulso de espécies reativas participa de uma nova via de translocação nuclear de GR induzida por LPS/IFN, na ausência de corticoides. Esta nova via pode ser importante para ajudar a entender as causas da falha dos glicocorticoides em conter a inflamação em fases avançadas da sepse. Palavras-chave: células musculares lisas vasculares, óxido nítrico, óxido nítrico sintases, peroxinitrito, receptores de glicocorticoides, translocação nuclear.<br> / Abstract : The mechanism whereby the vascular dysfunction is initiated, and how low concentrations of nitric oxide (NO) are related to glucocorticoid receptors (GR) signaling pathways are poorly understood. The objectives of this study were to understand how an initial NO release induced by lipopolysaccharide (LPS) could interfere with the activation of smooth muscle cells from rat aorta (A7r5) and cellular distribution of GR. A7r5 cells stimulated with LPS and interferon-? (IFN) showed a rapid (within minutes) increase in NO and superoxide production, forming peroxynitrite with subsequent NF-kB activation, NOS-2 expression and nitrite accumulation in cell supernatant. The inhibition of NO synthase (NOS) and NADPH oxidase (NOX) or the scavenging of NO and superoxide anion, decreased all these events. The silencing of involved enzymes showed that only the activation of NOS-1 and NOX-1 isoforms are important for the expression of NOS-2 in A7r5 cells. Pretreatment of adrenalectomized (ADX) rats with 7-nitroindazole (7-NI) before LPS challenge, reduced the plasma levels of IL-6 and NOx, decreased nuclear translocation of GR and reduced mortality induced by LPS in 65%. It was observed that the nuclear translocation of GR mediated by the NO and peroxynitrite pulse depends on the integrity of the dimerization domain of the receptor, once GR translocation in fibroblasts obtained from GR dimerization deficient mice (GRdim/dim) was not observed. Also, pre-treatment with 7-NI did not prevent the death of these mice when they were challenged with LPS. Thus, we conclude that rapid formation of NO, superoxide and peroxynitrite derived from the activity of NOS-1 and NOX-1, respectively, act as signaling agents for the expression of NOS-2 through the activation of NF-kB, being important for the initiation of septic vascular dysfunction. Furthermore, we demonstrated for the first time that this pulse of reactive species participate in a new route of GR nuclear translocation induced by LPS/IFN, in the absence of steroids. This new pathway may be important to help understand the causes of glucocorticoids failure to contain inflammation in advanced stages of sepsis.