Jornadas Académicas de Salud 2021 / Las Jornadas Académicas en Salud 2021 tienen como propósito promover la actualización de los profesionales de la salud de diversas especialidades, enfatizando la atención interprofesional centrada en el paciente.

Objetivo general Determinar los mecanismos por los cuales los microorganismos intestinales interaccionan con las células del hospedador en especial en lo que respecta a aquellos eventos relacionados con su transporte dentro de células del sistema inmune y al antagonismo de los efectos de patógenos intestinales por microorganismos probióticos. Objetivos específicos 1. Determinar qué tipo de interacciones se establecen entre B. cereus y células fagocíticas. Determinación del destino intracelular y la supervivencia de este microorganismo. 2. Establecer la capacidad de otros microorganismos de interferir en la interacción de B. cereus con células epiteliales y células dendríticas. Estudio de la respuesta generada sobre estas células. 3. Desarrollo de un modelo murino de infección con B. cereus.

El cáncer de mama es la neoplasia más frecuente en la población femenina mundial y una de las principales causas de muerte por cáncer. Algunos de los tratamientos convencionales para tratarlo (como la quimioterapia) generan efectos secundarios muy tóxicos, dado que suelen afectar a todas las células en división activa (sanas y tumorales). Por ello, son necesarios tratamientos específicos, con terapias dirigidas a las características moleculares del tumor y su microambiente. Una aproximación a ello podría ser la búsqueda de compuestos naturales con capacidad inmunopotenciadora y toxicidad selectiva sobre células tumorales. Recientemente, se han descubierto actividades inmunomoduladoras y antitumorales en diversos hongos. Entre ellos, los β-glucanos de Fracción D de Grifola frondosa (Maitake) son capaces de generar respuestas inmunes innatas y adaptativas, ejerciendo efectos antitumorales. Los beneficios terapéuticos reportados del tratamiento de la tumorigénesis mamaria con Fracción D de Maitake requieren profundizar aspectos farmacológicos y toxicológicos de sus moléculas bioactivas, para garantizar inocuidad y eficacia en la administración a un paciente. Por ello, los ensayos planteados en este trabajo tuvieron como finalidad elucidar aspectos toxicológicos, farmacodinámicos y farmacocinéticos de los ß-glucanos de Fracción D. De este modo, esperamos realizar un aporte significativo al conocimiento farmacológico de estos compuestos bioactivos promoviendo una estrategia inmunoterapéutica y antitumoral novedosa, destinada a la prevención de la carcinogénesis mamaria por medio de la administración de compuestos naturales. A través de nuestro trabajo aquí presentado, hemos demostrado en cultivos in vitro que Fracción D induce muerte apoptótica de células tumorales mamarias tanto murinas LM3 (hormono independientes) como humanas MCF-7 (hormono dependientes), mientras que no afecta la viabilidad de células mamarias normales MCF-10F. Hallamos que los ß-glucanos del extracto actúan a través de receptores Dectina-1 para inducir apoptosis tumoral, y además son capaces de modificar el perfil de expresión de una amplia variedad genes con diversidad de funciones, entre ellos genes específicos de apoptosis asociados a la supresión del fenotipo tumoral mamario, y genes asociados a procesos celulares cuya desregulación se vincula al desarrollo y progresión tumoral. Nuestros estudios farmacocinéticos in vivo de administración oral e intravenosa en modelos murinos demostraron que Fracción D presenta más de un pico de concentración plasmática máxima. Posee alto volumen de distribución, y es captado principalmente a nivel gastrointestinal. Pese a su estructura voluminosa y alto peso molecular, es capaza de llegar a cerebro. Demostramos que Fracción D previene el desarrollo de tumores mamarios en ratones hembra BALB/c, reduce la angiogénesis tumoral e incrementa la sobrevida total. Una dosis de 5 mg/kg/día administrada por 15 días es capaz de bloquear en más del 40% el proceso tumorigénico, mientras que, si el período de prevención se extiende a 50 días, la prevención tumoral ¡es del 100%! Su toxicidad aguda y subaguda es escasa, incluso a dosis 400 veces superior a la terapéutica, situándose la DL50 por encima de los 2000 mg/kg. En modelos murinos de inmunosupresión, hemos demostrado la capacidad de Fracción D de Maitake de restaurar poblaciones linfocitarias específicas en ganglios linfáticos, entre ellos granulocitos polimorfonucleares y LT/NK, además de inducir procesos de maduración celular. Comparado con quimioterapia, Fracción D de Maitake aumenta la sobrevida total de los animales y reduce la malignidad de los tumores mamarios. Estos sorprendentes hallazgos nos permiten suponer que el componente bioactivo de Maitake podría llegar a emplearse como agente preventivo de tumorigénesis mamaria en una población de riesgo, induciendo supresión tumoral, bloqueando la invasividad y la metástasis, esto es, las principales causas de muerte por cáncer mamario. / Breast cancer is the most frequent neoplasia in the world and one of the main causes of death among cancer women. Some of the conventional treatments for cancer are chemotherapy or radiotherapy, knowing that both generate very toxic side effects, since they usually affect all cells in active division (healthy or tumoral cells). Therefore, specific treatments are necessary, with therapies aimed at the molecular characteristics of the tumor and its microenvironment. An approach to this could be the search for natural compounds with immuno-potentiating capacity and selective toxicity on tumor cells. Recently, immunomodulatory and antitumor activities have been discovered in various fungi. Among them, β-glucans of Fraction D of Grifola frondosa (Maitake) are capable of generating innate and adaptive immune responses, exerting antitumor effects. The reported therapeutic benefits of treatment of breast tumorigenesis with D Fraction of Maitake require to deepen pharmacological and toxicological aspects of its bioactive molecules, in order to guarantee innocuousness and efficacy in the administration to a patient. Therefore, the trials proposed in this work aimed to elucidate toxicological, pharmacodynamic and pharmacokinetic aspects of ß-glucans from D Fraction. In this way, we hope to make a significant contribution to the pharmacological knowledge of these bioactive compounds by promoting an immunotherapeutic and antitumor strategy novel agent, aimed at the prevention of mammary carcinogenesis through the administration of natural compounds. Through our work presented here, we have demonstrated in in vitro cultures that D Fraction induces apoptotic death of mammary tumor cells both murine LM3 (independent hormone) and human MCF-7 (hormone dependent), while not affecting the viability of normal MCF-10F mammary cells. We found that the ß-glucans in the extract act through Dectin-1 receptors to induce tumor apoptosis, and are also capable of modifying the expression profile of a wide variety of genes with diverse functions, including apoptosis-specific genes associated with the suppression of the mammary tumor phenotype, and genes associated to cellular processes whose deregulation is linked to the development and tumor progression. Our in vivo pharmacokinetic studies on oral and intravenous administration in murine models showed that D Fraction presents more than one higher peak in the plasma concentration. It has a higher volume of tissue distribution and is captured mainly at the gastrointestinal level. Despite its voluminous structure and high molecular weight, it is able to reach the brain.

Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias Biológicas con mención en Biología Molecular, Celular y Neurociencias. / Lysosomal physiology has been shown to be important for the correct functioning of immune cells, including their migratory and their phagocytic properties. In this work, we aimed to explore the migratory process of immune cells and understand the connection between cytoskeletal dynamics and lysosomal degradative capacity. Specifically, we characterized the role of the calcium permeable channel Trpml in the process of cell migration, as well as that of the immune response and its connection with lysosomal physiology, using as model of study the Drosophila melanogaster macrophages, called hemocytes. Hemocytes are the cellular component of the immune response in Drosophila, performing key functions during development, as well as in immune defense in response to bacterial or parasitic infection. These cells are highly migratory in vivo and, importantly, present a substantial degree of functional and structural conservation with mammalian innate immune cells. Conveniently, the Drosophila genome contains only one gene coding for the Trpml channel, and its mutant phenotype resembles that of Mucolipidosis type IV patients, which bear a loss of function mutation in MCOLN1, the human homolog of the Drosophila trpml gene. Results presented in this thesis demonstrate that Trpml plays a fundamental role in phagolysosomal degradation and in vivo hemocyte migration, and that it participates in these processes through partially independent mechanisms. The most likely scenario is that Trpml is important for the degradative process by favoring phagolysosomal fusion and further phagocytic degradation. This is supported by the fact that calcium ions are needed for the fusion of phagosomal and lysosomal membranes. On the other hand, for the migratory process, localized Trpml activation from the lysosomes in the rear of polarized hemocytes, would promote the local activation of non-muscle myosin-II, which is necessary event to trigger cell body translocation during movement. / La fisiología lisosomal ha mostrado ser importante para el correcto funcionamiento de células inmunes, abarcando tanto sus propiedades migratorias como fagocíticas. En este trabajo, se quiso ahondar en el proceso migratorio de células del sistema inmune para comprender el nexo existente entre la dinámica del citoesqueleto y la capacidad degradativa de los lisosomas. En particular, se caracterizó el rol del canal lisosomal permeable a calcio, Trpml, en el proceso de migración celular, al igual que la respuesta inmune y su vínculo con la fisiología lisosomal, usando como modelo de estudio, los macrófagos de Drosophila melanogaster denominados hemocitos. Los hemocitos, son el componente celular de la respuesta inmune de Drosophila, cumpliendo funciones claves durante el desarrollo, así como durante la defensa ante infección por microorganismos o parásitos. Estas células son altamente migratorias in vivo, e importantemente, presentan un sustancial grado de conservación funcional y estructural con las células del sistema inmune innato de mamíferos. Convenientemente, Drosophila posee sólo un gen que codifica para el canal Trpml, cuyo fenotipo mutante semeja al de pacientes con Mucolipidosis tipo IV, quienes presentan pérdida de función del gen homólogo que codifica Trpml en humanos, MCOLN1. Los resultados presentados en esta tesis demuestran que Trpml cumple un rol fundamental en la degradación fagolisosomal, y la migración de hemocitos in vivo, y que estaría participando en estos dos procesos mediante mecanismos parcialmente independientes. A partir de los resultados obtenidos podemos proponer que Trpml es fundamental para el procesamiento degradativo, mediante el favorecimiento de la fusión fagolisosomal, y consecuente degradación fagocítica. Esto posiblemente se sustenta en la necesidad de iones Ca2+ para la fusión de las membranas del fagosoma con el lisosoma. Por su parte, en el proceso migratorio, la activación localizada de Trpml desde los lisosomas en la región posterior de células polarizadas, promovería la activación de Miosina-II no muscular en esta región, evento necesario para la translocación del cuerpo celular. / Conicyt 21140289, Proyectos Redes 140004, Fondecyt 1140522, Anillo ACT 1401 y Fondap 15090007.

El alcohol es un compuesto neurotóxico y su abuso puede causar daño cerebral y neurodegeneración. Sin embargo, los procesos neuropatológicos que producen estos efectos no se conocen con exactitud. Nuestro grupo demostró por primera vez que el etanol induce gliosis, neuroinflamación, daño cerebral y neurodegeneración mediante la activación del sistema inmune innato en cerebro a través de los receptores TLR4 de las células gliales. Además, evidencias recientes apuntan a que el alcohol altera los procesos de degradación de proteínas en patologías como la hepatopatía alcohólica, pero se desconoce si estos procesos proteolíticos también participan en el daño cerebral inducido por el consumo de alcohol. Mediante esta tesis, pretendemos evaluar la relación de los dos principales complejos proteolíticos, el sistema ubicuitina-proteasoma y la vía de la autofagia, con el daño producido por el alcohol en el cerebro, así como la implicación de los receptores TLR4 en este proceso. Para ello, usaremos ratones WT y TLR4-/- tratados crónicamente con etanol en agua durante 5 meses y los compararemos con los respectivos controles mediante técnicas como el western blot, PCR cuantitativa, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica o citometría. Del mismo modo, trabajaremos también con cultivos primarios de células gliales para evaluar el efecto del alcohol en dosis agudas in vitro. Nuestra hipótesis de partida es que al activar la señalización por TLR4, el etanol causa inflamación en el cerebro, estrés oxidativo y acumulación de proteínas por disfunción de los sistemas proteolíticos. Esta acumulación de agregados proteicos podría a su vez estimular la activación de los receptores TLR4, amplificando los efectos del etanol en la producción de daño cerebral y neurodegeneración. / Pla Rodríguez, A. (2014). IMPORTANCIA DE LOS MECANISMOS DE DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS EN LA NEURODEGENERACIÓN CAUSADA POR EL ABUSO DE ALCOHOL: PAPEL DE LOS RECEPTORES TLR4 [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/36532 / TESIS

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular / Las Gap Junctions (GJs) son clústers de canales intercelulares localizados en la membrana plasmática que permiten la comunicación directa entre células adyacentes. Cada canal GJ está compuesto por 2 hemicanales hexaméricos conocidos como conexones, los cuales a su vez están compuestos por seis proteínas de transmembrana llamadas conexinas (Cxs), siendo Cx43 la más representada en el sistema inmune. Se ha vinculado la variación de los niveles normales de expresión de las Cxs con la patogénesis de distintas enfermedades, incluyendo sordera congénita, arritmias cardiacas y cáncer. Dentro de esta última nuestro laboratorio ha desarrollado proyectos de investigación que permitan determinar el papel de las GJs en la respuesta inmune antitumoral. Por ejemplo, publicaciones previas de nuestro laboratorio han demostrado que Cx43 participa en la transferencia directa de antígenos tumorales entre células dendríticas (DCs). Así mismo, Cx43 polariza hacia la sinapsis entre DC y linfocitos T (LT) CD4+, formando canales funcionales que permiten una comunicación bidireccional requerida para la activación de LT mediada por APC. Además, se ha encontrado que Cx43 juega un rol en la activación de células natural killer (NK) por parte de DCs y en la regulación de la citotoxicidad de las células NK contra células tumorales. Así mismo, resultados no publicados indican que Cx43 polariza hacia el sitio de contacto entre LT CD8+ citotóxicos (CTLs) y células de melanoma, sugiriendo que Cx43 participaría en la citotoxicidad de CTLs en contra de éstas. Estos antecedentes sugieren que las GJs podría participar en el transporte de moléculas o señales que se encuentren involucradas en el proceso de activación de LT CD8+ mediada por DCs, tema que aún no ha sido estudiado por las investigaciones actuales. En estudios 2 anteriores nuestro laboratorio ha trabajado con modelos celulares humanos, sin embargo, dado que la obtención de LT vírgenes específicos contra el tumor a partir de donantes sanos es improbable y engorroso, en este trabajo decidimos utilizar el modelo murino específico para melanoma pMEL-1 y validar y optimizar su utilización para estudios de la participación de las GJs en la activación de LT CD8+ por parte de DCs. Nuestros resultados indican que el modelo pMEL-1 no representa alteraciones en la expresión de Cx43 respecto a su contraparte silvestre (wild type (WT)), y que es un modelo muy sensible, encontrando expresión del marcador de activación CD69 incluso desde 1 hora post co-cultivo. Además, se determinó que existe transferencia de calceína entre moDC y LT CD8+ pMEL-1 en un contexto estrictamente antígeno específico. Sin embargo, no pudimos dilucidar si las GJs participan del proceso de activación ya que el método de inhibición utilizado, el cual es un péptido mimético de Cx43, presentó problemas técnicos de funcionamiento, fenómeno que fue comprobado en modelos donde anteriormente se había determinado la comunicación mediada por GJs. Proponemos en el futuro utilizar otros métodos de inhibición, como el uso de siRNA contra Cx43, para determinar si estos canales juegan un rol en este proceso. / Gap Junctions are clusters of intercellular channels located in the plasma membrane that allow direct communication between adjacent cells. Each GJ channel is composed of 2 hexameric hemichannels known as connexions, which are composed by six transmembrane proteins called conexins (Cxs), being Cx43 the most represented one in the inmmune system. Variation in normal expression levels on Cxs have been linked to the development of different diseases, including congenital deafness, cardiac arrhythmias and cancer, being the last the one where our laboratory has developed investigation lines that allow to determine the role of GJs in the antitumoral response. In example, previous publications of our group have demonstrated that Cx43 participates in the direct transfer of tumoral antigens between dendritic cells (DCs) and that polarizes to the synapsis between DCs and CD4+ T lymphocytes, forming functional channels that allow bidirectional communication required for the DCs mediated activation of LT. Besides this, we have found that Cx43 plays a role in the activation of natural killer (NK) cells mediated by DCs, and in the regulation of the cytotoxicity of NK cells against tumor cells. Likewise, unpublished data indicate that Cx43 polarizes to the contact site between cytotoxic CD8+ T cells (CTLs) and melanoma cells, suggesting that Cx43 participates in the cytotoxicity of these cells. These backgrounds suggest that GJs may participate in the transport of molecules or signals that may be involved in the process of DC mediated activation of CD8+ T cells, subject that hasn’t been studied by the actual investigations. In previous studies our group has worked with human cellular models, however, given that obtaining naïve T cells from healthy donors is unlikely and difficult, in this work we decided to use the melanoma specific murine model pMEL-1 and valid and optimize it’s use for studies of the participation of GJs in the DCs 4 activation of T cells. Our results indicate that the pMEL-1 model doesn’t have alterations in the Cx43 expression levels compared with the wild type background and that it is a very sensible model, in which we can evaluate the activation of T cells even an hour after co-culture. Besides, it was determined the existence of calcein transfer between moDCs and CD8+ pMEL-1 T cells in a strictly antigen specific context. However, we could not elucidate if the GJs participate or not in the CD8+ T cell activation process, as our inhibition method, which is a Cx43 mimetic peptide, presented technical problems, phenomenon that was proven in models where GJ mediated communication has previously been determinate. We propose in the future to use a different inhibition method, as the use of anti-Cx43 siRNA, in order to determine if these channels play a role in this process.

Los resultados del trasplante renal a largo plazo están limitados por la pérdida a largo plazo del injerto y la muerte con injerto funcionante. Los inmunosupresores tienen gran importancia por su efecto sobre el injerto (control de la respuesta inmunológica y nefrotoxicidad) y sobre los factores de riesgo cardiovascular y el desarrollo de neoplasias. Los nuevos inmunosupresores apuntan a un mejor perfil en este sentido para reducir estos dos tipos de complicaciones y prolongar la supervivencia del injerto y del paciente, siendo los fármacos del grupo mTOR los más prometedores en este sentido. La presente tesis doctoral analiza los efectos de este grupo de fármacos inmunosupresores (Sirolimus y Everolimus) en pacientes trasplantados renales.Se analizan los efectos del uso de inhibidores de mTOR en pacientes trasplantados renales sobre el daño crónico del injerto en biopsias de protocolo, sobre la aparición de proteinuria como complicación de su uso en pacientes estables y sobre la formación de células T reguladoras circulantes en sangre periférica. / Long-term results of kidney transplantation are limited by the chronic graft failure and the death of the patient with a functioning kidney. Immunosuppressive drugs have an important role due to its effects on the graft (control of immune response and nephrotoxicity) and on vascular risk factors and the development of neoplasms. New immunosuppressive drugs, specially mTOR inhibitors have a better profile and are able to reduce both types of complications, increasing graft and patient survival. The present doctoral thesis analyzes the effects of this group of immunosuppressive drugs (Sirolimus and Everolimus) in renal transplant recipients.The effects of mTOR inhibitors over chronic graft damage in protocol kidney biopsies, on the appearance of proteinuria as a complication of its use in stable patients and on the formation of circulating regulatory T-cells in renal transplant patients are analyzed

Aquesta tesi (mitjançant cinc estudis) va ser destinada a investigar factors que tenen un efecte potencial sobre la salut materna durant la gestació i el postpart temprà, tenint en compte la melatonina com una possible millora de la salut i el rendiment de les vaques. En el primer estudi, els factors que afecten els leucòcits perifèrics de la mare, com un indicador d'estat immune, entre els dies 90-210 de gestació van ser, la interacció entre l'edat de la vaca i Neospora caninum, l'estació, la gestació gemelar, la producció de llet i el temps de mostreig. Seguint el sistema immune matern més enllà en la seva fase més crítica, el segon i el tercer estudis resumeixen els diferents factors que afecten el sistema immunològic de la mare des del dia 220 de gestació fins a 30 dies postpart. El toro d'IA, les glicoproteïnes associades a la gestació (PAG), la interacció N. caninum-C. burnetii, l'estació, l'edat, la gestació gemelar i el temps de mostreig afectaven significativament els leucòcits materns. L'objectiu del quart estudi va ser avaluar la dosi adequada de la melatonina, per provar els seus possibles efectes en la millora de la salut de la mare durant el peripart i la dosi de 332 mg / kg era la més adequada. Finalment, els possibles efectes de la melatonina en millorar la salut materna durant el peripart van ser avaluats en el cinquè estudi. Les vaques tractades amb melatonina tenien menys probabilitat de ser repetidores i de perdre la gestació, i, per tant, tenien menys dies oberts. / Esta tesis (mediante cinco estudios) fue destinada a investigar factores que tienen un efecto potencial sobre la salud materna durante la gestación y el posparto temprano, teniendo en cuenta la melatonina como una posible mejora de la salud y el rendimiento de las vacas. En el primer estudio, los factores que afectan a los leucocitos periféricos de la madre, como un indicador de estado inmune, entre los días 90-210 de gestaion fueron, la interacción entre la edad de la vaca y Neospora caninum, la estación, la gestación gemelar, la producción de leche y el tiempo de muestreo. Siguiendo el sistema inmune materno más allá en su fase más crítica, el segundo y el tercer estudios resumen los diferentes factores que afectan al sistema inmunológico de la madre desde el día 220 de gestación hasta 30 días posparto. El toro de IA, las glicoproteínas asociadas a la gestación (PAG), la interacción N. caninum-C. burnetii, la estación, la edad, la gestación gemelar y el tiempo de muestreo afectaban significativamente los leucocitos maternos. El objetivo del cuarto estudio fue evaluar la dosis adecuada de la melatonina, para probar sus posibles efectos en la mejora de la salud de la madre durante el periparto y la dosis de 332 mg/kg era la más adecuada. Por último, los posibles efectos de la melatonina en mejorar la salud materna durante el periparto fueron evaluados en el quinto estudio. Las vacas tratadas con melatonina tenian menos probabilidad de ser repetidoras y de perder la gestación, y, por lo tanto, tenian menos días abiertos. / This thesis (by means of five studies) aimed at investigating factors that have potential effect on the maternal health during gestation and the early postpartum, plus considering melatonin for improving cows’ health and performance. In the first study, factors affecting maternal peripheral leukocytes, as an indicator to immune status, between Days 90-210 of gestaion were, the interaction between cows’ age and Neospora caninum-seropositivity, season, twin-pregnancy, milk production and time. Following the maternal immune system further in its most critical phase, the second and third studies summarize different factors affecting maternal immune system from gestation Day 220 till 30 days postpartum. Artificial inseminating bull, plasma pregnancy associated glycoproteins (PAGs), N. caninum-C. burnetii interaction, season, age, twin-pregnancy and time were found to significantly affect maternal peripheral leukocytes during that stage. The aim of the forth study was to evaluate proper melatonin dose as subcutaneous implants, for testing its possible effects in enhancing maternal health during the peripartum. Melatonin dose of 332 μg/kg was the most adequate. Finally, possible melatonin effects on enhancing maternal health during the peripartum were evaluated in the fifth study. Melatonin treated cows were found to have less likelihood of repeat breeding syndrome and pregnancy loss, and, therefore, less days open.