A bexiga urinária é exposta constantemente a substâncias potencialmente prejudiciais presentes na urina, cuja exposição crônica pode levar a diversas patologias. Dentre estas patologias está a cistite hemorrágica que é uma condição inflamatória grave da bexiga associada ao uso de fármacos quimioterápicos, como a ciclofosfamida. É descrito que a exposição em longo prazo à ciclofosfamida aumenta o risco de desenvolvimento do câncer de bexiga, o qual é caracterizado como sendo a segunda neoplasia mais comum do trato urinário e o sétimo câncer mais prevalente entre homens no mundo. Alterações na sinalização purinérgica têm sido evidenciadas em diferentes patologias associadas à bexiga urinária. De fato, o sistema purinérgico tem emergido como um potencial alvo a ser estudado. Portanto, nesta tese buscou-se avaliar o envolvimento da sinalização purinérgica em um modelo in vivo de cistite hemorrágica e em um modelo in vitro de câncer de bexiga. No intuito de identificar estratégias preventivas e tratamentos eficazes para reduzir a morbidade e a mortalidade associadas à cistite hemorrágica, a espécie Uncaria tomentosa foi investigada, devido a sua ampla utilização em casos de inflamação crônica e doenças do trato urinário. A partir dos estudos conduzidos in vivo, demonstramos que o tratamento sistêmico com a fração purificada de glicosídeos do ácido quinóvico de U. tomentosa foi capaz de prevenir os eventos nociceptivos e inflamatórios associados à cistite hemorrágica. A diminuição da expressão dos receptores P2X7, provavelmente pela inibição da migração dos neutrófilos ao local da inflamação foi observada, evidenciando propriedades anti-inflamatórias promissoras para esta fração podendo, no futuro, se tornar um agente terapêutico potencial no tratamento desta patologia. Para o câncer de bexiga músculo invasivo, a cistectomia radical é considerada o tratamento padrão, porém está associada à morbidade significativa. Na tentativa de proporcionar uma melhor qualidade de vida aos pacientes, o interesse por abordagens terapêuticas que visam à preservação da bexiga urinária tem aumentado. Neste sentido, a radioterapia tem recebido destaque por ser uma modalidade de tratamento já utilizada. Desta forma, investigamos os efeitos da radioterapia sobre a sinalização purinérgica em linhagem celular de câncer de bexiga humano T24. Dentre os receptores expressos pelas células T24, o receptor P2X6 apresentou aumento expressivo após a radioterapia. A partir da análise de pacientes com câncer de bexiga (Kaplan-Meier), evidenciamos a relação existente entre a alta expressão deste receptor e o aumento da taxa de sobrevivência. Na sequência, o provável envolvimento da família das ectonucleotidases nos efeitos da radioterapia na linhagem celular T24 também foi avaliado. Observamos que a sinalização purinérgica, principalmente via hidrólise do ATP à adenosina pela ação combinada de ectoenzimas demonstrou papel importante no tratamento radioterápico in vitro. A indução transitória da expressão da enzima ecto- 5’NT/CD73 pela radioterapia também foi observada, sendo a adenosina gerada a responsável por contribuir na morte celular. O papel crucial da ecto-5’NT/CD73 na radiossensibilização das células foi confirmado pela inibição farmacológica e pelo uso do nocaute da enzima. Em conjunto, os resultados in vitro demonstraram que a vantagem da radioterapia parece ser alcançada naqueles pacientes que expressam o receptor P2X6 e a enzima ecto-5’NT/CD73 na área tumoral, podendo no futuro, ambos serem considerados possíveis marcadores para prever a eficácia da resposta à radioterapia para o tratamento do câncer de bexiga. Por fim, a realização do ensaio radiométrico frente à ecto-5’NT/CD73 evidenciou o potente efeito inibitório do ácido ursólico sobre esta enzima, cujo potencial também foi confirmado frente à linhagem celular T24. / The urinary bladder is constantly exposed to potentially harmful substances in the urine, whose chronic exposure can lead to various diseases. Among these pathologies the hemorrhagic cystitis is a severe inflammatory condition of the bladder associated with the use of chemotherapeutic drugs, such as cyclophosphamide. It has been reported that long-term exposure to cyclophosphamide increases the risk of developing bladder cancer, which is characterized as being the second most common cancer of the urinary tract and the seventh most common cancer among men in the world. Alterations in the purinergic signaling have been shown in diseases associated with urinary bladder. In fact, the purinergic signaling has emerged as a potential target to be studied. Therefore, this thesis sought to evaluate the involvement of purinergic signaling in an in vivo model of hemorrhagic cystitis and in an in vitro model of bladder cancer. In order to identify preventive strategies and effective treatments to reduce morbidity and mortality associated with hemorrhagic cystitis, the Uncaria tomentosa species was investigated due to its wide use in cases of chronic inflammation and urinary tract diseases. From studies conducted in vivo, we demonstrated that systemic treatment with the quinovic acid glycosides purified fraction from U. tomentosa was able to prevent nociceptive and inflammatory events associated with hemorrhagic cystitis. The decreased expression of the P2X7 receptor was observed, most likely by the reduction of neutrophils migration to the site of inflammation. Therefore, this investigation has shown promising antiinflammatory properties for this fraction, which may in the future become a potential therapeutic agent for the treatment of this pathology. For bladder muscle invasive cancer, although radical cystectomy has been considered the standard treatment is still associated with significant morbidity. In an attempt to provide a better quality of life for patients, interest in therapeutic approaches aimed the preservation of the urinary bladder have increased. In this regard, the radiotherapy has been highlighted by being a treatment modality already used. Thus, we investigated the effects of radiation on the purinergic signaling in T24 human bladder cancer cell line. Among the receptors expressed by T24 cells, the P2X6 receptor showed significant increase after radiotherapy. From the analysis of patients with bladder cancer (Kaplan-Meier), we noticed the relationship between high expression of this receptor and increased survival rate. Following, the involvement of ectonucleotidases after irradiation exposure in T24 cell line was also evaluated. The purinergic signaling, mainly through hydrolysis of ATP to adenosine by the combined action of ectoenzymes, demonstrated important role in radiotherapy in vitro. The transient induction of ecto-5’NT/CD73 expression by radiotherapy was also observed, being the adenosine generated a possible responsible in T24 cell death. The crucial role of ecto-5’NT/CD73 in the radiosensitization of the cells was confirmed by pharmacological inhibition and the use of the enzyme knockout. Taken together, the in vitro results demonstrate that the benefit of radiation therapy appears to be achieved in those patients that express the P2X6 receptor and the enzyme ecto-5’NT/CD73 in the tumor area, and in the future both may be considered potential markers for predicting the effectiveness response to radiotherapy for the treatment of bladder cancer. Finally, the radiometric ecto-5’NT/CD73 assay showed the potent inhibitory effect of ursolic acid on this enzyme, whose potential was also confirmed through the T24 cell line.

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel dos derivados da guanina na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados desta tese estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental (parte dois) e clínica (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas foi realizada e um novo sistema guanosinérgico foi proposto. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanosina é antinociceptiva em diversos modelos de dor. A administração sistêmica de guanosina causou um aumento significativo nos níveis de guanosina no líquido cefalorraquiano (LCR), demonstrando que este composto penetra ativamente no sistema nervoso central. Diversos testes comportamentais e neuroquímicos demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pela guanosina. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanosina foram investigados através de métodos neuroquímicos e farmacológicos. Guanosina foi escolhida porque tem demonstrado interagir com o sistema glutamatérgico - sabidamente envolvido na transmissão da dor - por estimular a recaptação de glutamato. Guanosina atenuou o comportamento doloroso induzido pela injeção intratecal de glutamato e seus agonistas (AMPA, cainato, trans-ACPD) e hiperalgesia induzida por altas doses de MK-801, um efeito provavelmente relacionado à diminuição das concentrações de glutamato e aspartato no LCR. Guanosina também foi testada em um método para avaliar a captação de glutamato em fatias de cérebro e medula. Nossos resultados demonstraram que a guanosina não alterou a captação basal de glutamato. Entretanto, a guanosina atenuou os efeitos da dor sobre a captação de glutamato. Baseado nestes dados, não é possível estabelecer uma relação causal entre os dados da captação e o comportamento doloroso. Entretanto, podemos argumentar que os efeitos da guanosina sobre a captação de glutamato foram provavelmente produzidos pela modulação do estímulo doloroso e não correspondem a um mecanismo de ação responsável por estas alterações. Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeitos antinociceptivos em camundongos. Este efeito está provavelmente relacionado ao acúmulo de adenosina e guanosina no meio extracelular. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. A terceira parte desta tese demonstra trabalhos sobre o sistema purinérgico em humanos. Estes estudos investigaram a correlação entre a concentração de purinas no LCR e dor aguda ou crônica em humanos. Os resultados demonstram que adenosina, guanosina e inosina correlacionaram-se significativamente com a dor em humanos. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanosina é proposto: a modulação da dor. Guanosina e outras purinas são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema glutamatérgico. / The main aims of this work were the investigation of the role of guanine-based purines on nociception and the understanding of the mechanism of action leading to extracellular effects of these compounds. The results obtained are presented in three distinct parts based on their nature, namely, literature review (part one), experimental (part two) and clinical (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular roles for the purinergic system was performed and a guanine-based purinergic system was proposed. In the second part, experimental procedures in animals demonstrated that guanosine is antinociceptive in several acute or chronic pain models in rodents. Systemic administration of guanosine significantly increased cerebrospinal fluid (CSF) guanosine levels, showing that this compound actively penetrates in the central nervous system. Several behavioral tasks and neurochemical approaches demonstrated that guanosine presents minimal toxic effects. After that, the mechanisms of action underlying the antinociceptive effects of guanosine were investigated, by using pharmacological and neurochemical means. Guanosine was chosen because it has been shown to interact with the glutamatergic system - which is known to be involved in the mechanisms of pain transmission - by promoting astrocytic glutamate reuptake. Guanosine attenuated nociceptive behavior induced by intrathecal administration of glutamate and its receptor agonists (AMPA, kainate, trans-ACPD) and hyperalgesia induced by high-dose MK-801, an effect that seems to be related with the reduction of glutamate and aspartate accumulation in the CSF. Guanosine was tested in a model of glutamate uptake by brain and spinal cord slices from rats and mice. Our results demonstrated that guanosine did not alter basal glutamate uptake at both brain and spinal cord. However, guanosine attenuated effects on glutamate uptake induced by pain behavior in animals. It is not possible to establish whether the changes in the spinal cord glutamate uptake were responsible for nociceptive behavior or it caused the changes. However, we may argue that the changes in the glutamate uptake induced guanosine were probably produced by modulation of nociceptive stimuli rather than an underlying mechanism of action. In the second part of this work, we demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used to treat hyperuricemia, also produced consistent antinociception in mice. This effect was probably related to the accumulation of extracellular adenosine and guanosine. It was therefore concluded that, although is early to propose the use of purines in a clinical setting, allopurinol could be an excellent alternative to test this hypothesis since shows the advantage of be already approved for commercial use, presenting well tolerability and very low cost. The third part of this work presents some results derived from the human models of pain. These studies investigated the correlation between the CSF concentration of purines and acute or chronic pain in humans. Our results show that adenosine, guanosine and inosine were significantly correlated with pain in humans. Altogether these results further demonstrate the role of purines in pain mechanisms and provide a new role for guanosine: pain modulation. Guanosine and other purines presents as a new target for future drug development and might be useful for treat pain related to overstimulation of the glutamatergic system.

A poluição ambiental causada por resíduos de metais tóxicos é muito relevante pelo seu amplo uso em processos industriais e agrícolas, sendo que muitos efluentes chegam ao ambiente aquático sem qualquer tratamento. A contaminação da água com estes poluentes tornaram-se iminentes e, consequentemente efeitos adversos são inevitáveis em humanos, plantas e animais, onde um dos táxons mais atingidos são os peixes. O peixe zebra (Danio rerio) é uma espécie muito utilizada como modelo experimental em diversas áreas, como neurociências e toxicologia. Evidências demonstram que nucleotídeos e nucleosídeos da adenina exercem efeitos sinalizadores no espaço extracelular por meio da ativação de receptores específicos. A inativação do sinal mediado pelo ATP extracelular é realizada por uma família de enzimas denominadas ectonucleotidases, na qual se destacam as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5'-nucleotidase. Após hidrólise pelas ectonucleotidases, o ATP produz o nucleosídeo adenosina. A adenosina pode ser desaminada pela enzima adenosina desaminase (ADA), gerando inosina. Evidências demonstram que o ATP é coliberado com a acetilcolina em terminais colinérgicos. A acetilcolina é uma molécula transmissora que age nos receptores muscarínicos e nicotínicos e seu catabolismo é promovido pela enzima acetilcolinesterase (AChE). Nosso laboratório já demonstrou a presença de diferentes membros da família das NTPDases e da família da ADA, além de uma ecto-5'-nucleotidase em cérebro de peixe zebra. A presença da enzima AChE também já foi descrita nesta espécie. No capítulo I foi testado o efeito in vitro do zinco e cádmio na atividade da AChE e das ectonucleotidases em cérebro de peixe zebra. Ambos os metais não alteraram a atividade da AChE. A hidrólise de ATP teve um aumento na presença de 1 µM de zinco (17 %) e a hidrólise de AMP teve um aumento dose dependente nas concentrações 0,5 e 1 µM de zinco (188 % e 199 %). Após a exposição a 0,5 e 1 µM de cádmio, a atividade ATPásica foi aumentada significativamente (53 % e 48 %). O cádmio na faixa de 0,25 a 1 µM inibiu a hidrólise de ADP de forma dose-dependente (13,4 - 69 %). A atividade da ecto-5'-nucleotidase foi inibida (38 %) apenas na presença de 1 µM de cádmio. No capítulo II foi investigado o efeito da exposição ao alumínio na atividade da AChE cerebral e em parâmetros comportamentais em peixe zebra. A exposição in vivo a 50 µg/L de AlCl3 durante 96 h a pH 5,8 aumentou significativamente (36 %) a hidrólise de acetiltiocolina em cérebro de peixe zebra. Não foram observadas mudanças na atividade da AChE quando os peixes foram expostos a mesma concentração de AlCl3 em pH 6,8. RT-PCR semi-quantitativo não demonstrou alterações significativas nos níveis de expressão do RNAm do gene da ache em cérebro de peixe zebra. Concentrações in vitro de AlCl3 variando de 50 a 250 µM aumentaram a atividade da AChE (28 a 33 %). Além disso, animais expostos ao AlCl3 em pH 5,8 apresentaram uma diminuição na atividade locomotora, avaliada pelo número de cruzamentos (25 %), distância viajada (14,1 %) e velocidade máxima (24 %). No capítulo III, foi verificado o efeito de metais tóxicos na atividade e expressão da ADA em frações solúveis e de membrana em cérebro de peixe zebra. Dos metais testados, apenas o mercúrio foi capaz de inibir a desaminação da adenosina em ambas as frações in vitro. A inibição foi observada de 5 a 250 µM de HgCl2 (84,6 - 92,6 %) na fração solúvel enquanto nas frações de membrana a inibição variou de 50 a 250 µM (20,9 - 26 %). A exposição in vivo do peixe zebra a 20 µg/L de HgCl2 foi avaliada após exposição aguda (24 h) e subcrônica (96 h). A atividade da ADA na fração solúvel foi inibida após a exposição aguda (24,5%) e subcrônica (40,8%) enquanto que a atividade da ADA na fração de membrana foi inibida somente após a exposição subcrônica (21,9 %). Em contraste, não foram observadas mudanças na expressão dos genes da ADA após os tratamentos. Nossos resultados apresentados demonstraram que as enzimas envolvidas na degradação de nucleotídeos e nucleosídeos (NTPDase, 5'-nucleotidase e ADA) e a acetilcolinesterase são afetadas por metais tóxicos em cérebro de peixe zebra. Além de serem possíveis alvos da neurotoxicidade dos metais, a alteração destas atividades enzimáticas pode ser utilizada como bioindicador da presença ambiental destes poluentes. / The environmental pollution caused by toxic metals is relevant due to its widespread use in industrial and agricultural process, and many effluents enter in the aquatic environment without treatment. The contamination of water by toxic metals has become imminent and, consequently, adverse effects are inevitable in humans, plants, and animals, which fish are one of the most affected taxons. Zebrafish (Danio rerio) is a specie consolidated as a model system in many research areas, including neuroscience and toxicology. Evidence has show that nucleotides and nucleosides exert signaling effects at the extracellular space by the activation of specific receptors. The inactivation of extracellular ATP signaling is promoted by a family of enzymes named ectonucleotidases, whivh inlude NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5'-nucleotidase. After hydrolysis promoted by ectonucleotidases, ATP forms the nucleoside adenosine. The adenosine could be deaminated by the enzyme adenosine deaminase (ADA). Evidence demonstrates that ATP is coreleased with acetylcholine in cholinergic terminals. Acetylcholine is a transmitter molecule that acts on muscarinic and nicotinic receptors and its catabolism is promoted by acetylcholinesterase (AChE) activity. Our laboratory has already characterized NTPDases, ecto-5'-nucleotidase and ADA activity in zebrafish brain. The AChE activity has been reported in this specie. In chapter I we tested the in vitro effect of zinc and cadmium on AChE and ectonucleotidase (NTPDase and ecto-5-nucleotidase) activities in zebrafish brain. Both zinc and cadmium treatments did not alter significantly the zebrafish brain AChE activity. ATP hydrolysis presented a significant increase at 1 mM zinc (17 %) and the AMPase activity had a dose-dependent increase at 0.5 and 1µM zinc exposure (188 % and 199 %). After cadmium treatment, ATPase activity was significantly increased (53 % and 48 %) at 0.5 and 1 µM, respectively. Cadmium, in the range 0.25-1 µM, inhibited ADP hydrolysis in a dose-dependent manner (13.4-69 %). Ecto-5-nucleotidase activity was only inhibited (38 %) in the presence of 1 µM cadmium. In chapter II we have investigated the effect of aluminum exposure on brain AChE activity and behavior parameters in zebrafish. In vivo exposure of zebrafish to 50 µg/L AlCl3 during 96 h at pH 5.8 significantly increased (36 %) acetylthiocholine hydrolysis in zebrafish brain. There were no changes on AChE activity when fish were exposed to the same concentration of AlCl3 at pH 6.8. Semi-quantitative RT-PCR has not shown significant alterations on the expression levels of ache mRNA gene in zebrafish brain. In vitro concentrations of AlCl3 varying from 50 to 250 µM have increased AChE activity (28 to 33 %, respectively) Moreover, we observed that animals exposed to AlCl3 at pH 5.8 presented a significant decrease in locomotor activity, as evaluated by the number of line crossings (25 %), distance traveled (14.1 %) and maximum speed (24 %). In chapter III we have investigated the effects of toxic metals on soluble and membrane ADA activity and gene expression in zebrafish brain. Regarding the metals tested, only HgCl2 was able to inhibit the adenosine deamination in vitro in both fractions. The inhibition was observed from 5 to 250 µM HgCl2 (84.6 - 92.6 %) in soluble fraction while in membrane fractions the inhibition varied from 50 to 250 µM (20.9 - 26 %). The in vivo exposure of zebrafish to 20 µg/L of HgCl2 was evaluated after acute (24 h) and subchronic (96 h) treatments on ADA activity in soluble and membrane fractions. The ADA activity from soluble fraction was inhibited after both acute (24.5 %) and subchronic (40.8 %) exposures whereas the ADA activity from brain membranes was inhibited only after subchronic exposure (21.9 %). In contrast, semi-quantitative RT-PCR analysis showed that HgCl2 was not able to modulate the ADA gene expression. Our results have show that the enzymes involved in the degradation of nucleotides and nucleosides (NTPDase, 5'-nucleotidase and ADA) and AChE are modulated by toxic metals in zebrafish brain. Besides been a possible target in the neurotoxicity mediated by metals, the alteration of these enzyme activities can be used as bioindicator of the environmental presence of these pollutants.

A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica, predominantemente oportunista, causada por leveduras encapsuladas do gênero Cryptococcus. As infecções por Cryptococcus neoformans são comuns em nível mundial, e as formas graves são observadas nos pacientes imunocomprometidos. A principal fonte de infecção da criptococose são fezes de pássaros (principalmente pombos) contaminadas com o fungo, sendo a inalação de basidiósporos a principal via de infecção. O estabelecimento e a propagação da infecção são altamente dependentes da imunidade do hospedeiro, sendo o sistema imune celular o mecanismo primário de defesa do organismo contra C. neoformans. Nos últimos anos têm-se descrito outros elementos como ativadores e moduladores da resposta imune, destacando o sistema purinérgico e o sistema colinérgico. Desta maneira, este estudo buscou avaliar a influência da criptococose experimental sobre a atividade do sistema purinérgico e colinérgico, através de três objetivos: (1) avaliar a atividade da ecto-difosfoidrolases (E-NTPDase) e ecto-adenosina deaminase (E-ADA) em linfócitos e soro; (2) atividade da acetilcolinesterase (AChE) no cérebro e linfócitos, e butirilcolinesterase (BChE) no soro; e (3) avaliar os níveis de purinas no soro. Os resultados da avaliação do sistema purinérgico demonstraram que a hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP) e difosfato de adenosina (ADP) foram diminuídas, bem como a atividade da E-ADA também esteva diminuída. Em relação a dosagem das colinesterases, observou-se um aumento na atividade da AChE nos linfócitos e no cérebro, e diminuição da BChE. Na dosagem do nível de purinas no soro, verificou-se um aumento nos níveis de ATP e adenosina (ADO) no dia 20 pós-infecção (PI), aumento de ATP e diminuição da ADO, inosina e ácido úrico no dia 50 PI. A avaliação da atividade da E-NTPDase e E-ADA levou a conclusão de que seus comportamentos hidrolíticos seriam compensatórios enquanto a E-NTPDase teria uma ação pró-inflamatória a E-ADA teria uma ação anti-inflamatória, gerando mecanismo de proteção contra danos teciduais secundários, possivelmente gerados respostas exacerbadas à infecção por C. neoformans. Adicionalmente, os dados da atividade da AChE, em amostras correspondentes, comprovaram o estabelecimento de uma resposta pró-inflamatória, corroborando com a hipótese da necessidade de um mecanismo de modulação. Por fim, observou-se um aumento nos níveis extracelulares de ATP caracterizando uma resposta pró-inflamatória. Desta forma, foi possível observar que existe uma participação direta dos sistemas purinérgico e colinérgico na imunomodulação da criptococose experimental, contribuindo para a instalação de uma resposta imune celular adequada para combater a proliferação da levedura, e um mecanismo de redução de danos teciduais associados à resposta imune exacerbada. / Cryptococcosis is a systemic fungal infection predominantly opportunistic, caused by encapsulated yeast from Cryptococcus genus. Cryptococcus neoformans infections are common worldwide, and the severe forms are observed in immunocompromised patients. The main source of cryptococcosis infection are bird droppings (especially pigeons) contaminated with the fungus, and the inhalation of basidiospore is the main route of infection. The establishment and spread of infection are highly dependent of the host immunity, and the cellular immune system is the primary mechanism for defense against C. neoformans. In recent years it has been described other elements as activators and modulators of the immune response, highlighting the purinergic and the cholinergic system. Thus, this study aimed to evaluate the influence of experimental cryptococcosis on the activity of purinergic and cholinergic systems through three objectives: (1) to evaluate the activity of the ecto-diphosphohydrolases (E-NTPDase) and ecto-adenosine deaminase (E-ADA ) in lymphocytes and serum; (2) the activity of acetylcholinesterase (AchE) in the brain and lymphocytes, and butyrylcholinesterase (BChE) in serum; and (3) evaluate the serum levels of purines. The results of the evaluation in the purinergic system demonstrated that the hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP) and adenosine diphosphate (ADP) was decreased as well as the E-ADA activity. For the dosage of the cholinesterase, there was an increase in AChE activity in lymphocytes and in the brain, and a decreased in BChE. The measurement of serum purine level demonstrate an increase in the levels of ATP and adenosine) on day 20 post-infection (PI), an increased in ATP and decreased in ADO, inosine and uric acid on day 50 PI. The assessment of the E-NTPDase and E-ADA activity led the conclusion that their hydrolytic behavior would be compensatory while the E-NTPDase would have a pro-inflammatory action, E-ADA would have an anti-inflammatory action, generating protective mechanism against secondary damage tissue, producing possibly exacerbated responses to C. neoformans infection. In addition, data of AChE activity in corresponding samples confirmed the establishment of a pro-inflammatory response, corroborating the hypothesis of the need for a modulation mechanism. Finally, there was an increase in extracellular levels of ATP featuring a pro-inflammatory response. In this way, it was observed a direct involvement of the purinergic and cholinergic systems in immunomodulation of experimental cryptococcosis, contributing to the installation of an immune cell response suitable to combat the proliferation of yeast, and a reduction mechanism of tissue damage associated with response immune exacerbated.

O ATP pode influenciar diversos processos fisiológicos através dos receptores P1 e P2, controlando as concentrações de ATP e adenosina extracelulares. O ATP pode modular a liberação e/ou ligação de outros neurotransmissores. No SNC, a adenosina e guanosina atuam como importantes neuromoduladores com efeitos inibitórios sobre a atividade neuronal. A inativação da sinalização do ATP é mediada pela ação das ecto-nucleotidases. Além dos seus papéis fisiológicos, as ações extracelulares das purinas podem ser relevantes para a patogênese e a atenuação de doenças cerebrais agudas e crônicas. Epilepsia é uma doença neurológica crônica caracterizada por crises recorrentes que são expressas na forma de convulsões acompanhadas pela modificação dos circuitos límbicos e freqüentemente apresenta características neurodegenerativas. A doença de Parkinson é caracterizada por uma neurodegeneração progressiva na substantia nigra pars compacta com subseqüente redução no conteúdo de dopamina estriatal. Encefalopatia diabética é uma reconhecida complicação do diabetes não tratado, resultando em um comprometimento cognitivo acompanhado de uma modificação da função hipocampal. Nesta tese, nós observamos: i) na epilepsia, nós demonstramos um aumento nas atividades das ecto-nucleotidases e das nucleotidases solúveis em fatias hipocampais e líquor após o modelo do abrasamento com PTZ, com distinta influência nos níveis dos nucleotídeos, nucleosídeos e oxipurinas e também nos níveis de RNAm das NTPDases de hipocampo. No modelo agudo, houve um aumento nos níveis de glicose e lactato extracelulares. Além disso, houve uma diminuição na captação de [14C]-2-deoxi-D-glicose e nos níveis de glicogênio hipocampais 10 minutos após a convulsão, retornando aos níveis normais 30 minutos após a convulsão; ii) na doença de Parkinson, nossos resultados reforçam a hipótese de que as mudanças no sistema adenosinérgico contribuem para a progressão da neurodegeneração na doença de Parkinson. Além disso, pela primeira vez, as mudanças no “sistema guanosinérgico” podem também ser mediadores na progressão desta doença; e iii) no diabetes, nosso estudo oferece evidências demonstrando que o sistema de sinalização do ATP está comprometido no hipocampo de ratos tratados com STZ, um modelo experimental de diabetes mellitus tipo 1. Estas modificações podem levar a alterações na modulação da neurotransmissão e gliotransmissão, podendo contribuir para um progressivo comprometimento cognitivo induzido pelo diabetes. / ATP may influence several physiological processes P1 and P2 receptors-mediated by controlling extracellular concentrations of ATP and adenosine. ATP may modulate the release and/or influence other neurotransmitters either by acting through its own receptors or by altering the neurotransmitter receptors. In the CNS, adenosine and guanosine act both as important neuromodulators with major inhibitory effects on neuronal activity. The inactivation of ATP signaling is mediated by the action of ecto-nucleotidases. Besides their physiological roles, purine-mediated extracellular actions may be relevant to the pathogenesis and/or alleviation of acute and chronic brain disorders. Epilepsy is a chronic neurologic disorder characterized by recurrent seizures that have a behavioral expression in the form of convulsions accompanied by a modification of limbic circuits and the frequent presence of neurodegenerative features. Parkinson’s disease is characterized by a progressive neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta with a subsequent reduction in the striatal dopamine content. Diabetic encephalopathy is a recognized complication of untreated diabetes resulting in a progressive cognitive impairment accompanied by modification of hippocampal function. In this thesis, we observed: i) in epilepsy, we demonstrated an enhancement of ecto- and soluble nucleotidase activities in hippocampal brain slices and CSF after PTZ-kindling model, with distinct influence on the levels of nucleotides, nucleosides and oxypurines and also hippocampal NTPDases mRNA levels. Animals that presented tonic-clonic seizure had CSF glucose and lactate levels increased. Moreover, the hippocampal [14C]-2-deoxy-D-glucose uptake and glycogen content decreases at 10 min after seizure and returned to control levels at 30 minutes; ii) in Parkinson’s disease, our results reinforce the hypothesis that changes in the adenosinergic system contribute to the progression of neurodegeneration in Parkinson’s disease and point to the possibility of using the ectonucleotidases as targets for therapy. In addition, this is the first time, in our knowledge, that changes in the “guanosinergic system” might also be considered as mediators of the progression of this disease; and iii) in diabetes, our study provides evidence showing that the ATP signaling system is compromised in the hippocampus of STZ-treated rats, an experimental model of type 1 diabetes mellitus. These modifications could lead to alterations in the modulation of neurotransmission and gliotransmission, which may contribute to the diabetes-induced progressive cognitive impairment.

Glioblastoma multiforme é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central em adultos e a sobrevida média é de apenas 12 a 15 meses após o diagnóstico. Por isso, é extremamente importante desenvolver tratamentos mais eficazes e específicos contra essa neoplasia. A presença do sistema imune, incluindo macrófagos associados ao tumor, promove a proliferação tumoral e está associada com um pior prognóstico em pacientes com essa doença maligna. A sinalização purinérgica e o receptor purinérgico P2X7, um canal iônico, têm sido implicados na progressão de diferentes tipos de tumores tanto in vitro como in vivo. A ciclooxigenase 2 (COX-2) desempenha um papel importante na regulação da proliferação celular, diferenciação e na tumorigênese. O ácido ursólico é um triterpeno pentacíclico encontrado em uma variedade de plantas e exibe diversas atividades biológicas e farmacológicas. O objetivo dessa tese é verificar a participação do sistema purinérgico, sistema imune e COX-2 no desenvolvimento e progressão do glioblastoma multiforme, e também investigar os efeitos citotóxicos do ácido ursólico. Primeiramente, verificamos que macrófagos expostos ao meio condicionado de glioma (GL-CM) foram modulados para um fenótipo do tipo M2 e houve um aumento da liberação de IL-10, IL-6 e MCP-1. Esses efeitos foram diminuídos na presença de antagonistas dos receptores P2X7 e A2A. Portanto, os resultados apresentados contribuem para o melhor entendimento da interação entre inflamação e câncer e demonstram que os receptores purinérgicos são importantes para a progressão do glioma. Após, analisamos o papel do receptor P2X7 na proliferação de células de glioma. Surpreendentemente, in vitro, não se observou nenhuma diferença no crescimento das células quando houve a transfecção com o P2X7. Entretanto, in vivo, essas células geraram tumores maiores quando comparado com o controle. Os nossos resultados demonstram que, como em outros tipos de cânceres, o P2X7 tem um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral. Uma vez verificado o importante papel do receptor P2X7 nos macrófagos associados ao tumor e nas células de glioma, investigamos se esse receptor poderia interagir com a enzima COX-2 em células de glioma. Porém, não houve diferença na expressão do P2X7 ou da COX-2 tanto in vitro como in vivo. E também não houve nenhum efeito adicional entre o antagonista de P2X7 e o inibidor seletivo de COX-2. Esse trabalho fornece evidências de que não há relação entre o P2X7 e COX-2 em células de glioma. Em conclusão, todos esses resultados reforçam a hipótese do envolvimento da sinalização purinérgica na progressão do glioblastoma multiforme e tornam o P2X7 como um interessante alvo terapêutico. Finalmente, também investigamos a possível atividade anticâncer do ácido ursólico contra as células de glioma. Essa molécula foi capaz de diminuir o número de células e induziu parada no ciclo celular. In vivo, o ácido ursólico reduziu ligeiramente o tamanho do tumor, mas não alterou as características malignas. Em conclusão, o ácido ursólico pode ser um potencial candidato como adjuvante para o tratamento do glioblastoma multiforme. Em conjunto, todos os resultados apresentados nessa tese indicam possíveis novas abordagens terapêuticas no tratamento e novos conhecimentos em relação a esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor of central nervous system in adults and the median survival is only 12 to 15 months after diagnosis. Therefore, it is extremely important to develop more effective and specific treatments. The presence of an inflammatory environment, including tumor-associated macrophages, promotes tumor proliferation and is associated with a poor prognosis in patients with this malignancy. Disruption of purinergic signaling has also been implicated in cancer progression. P2X7R is an ion channel receptor, whose participation in tumor progression has been demonstrated in in vitro and in vivo studies. Cyclooxygenase 2 (COX-2) plays an important role in regulating cell proliferation, differentiation, and tumorigenesis. Ursolic acid is a pentacyclic triterpenoid found in a variety of plants that exhibits several biological and pharmacological activities. The aim of this study is to verify the participation of the purinergic system, immune system and COX-2 in the glioblastoma multiforme development and progression, and also to investigate the anti-proliferative effects of ursolic acid. We first verified that macrophages exposed to glioma conditioned medium (GL-CM) were modulated to an M2-like phenotype and there was an increased IL-10, IL-6 and MCP-1 secretion and these effects were diminished by P2X7 and A2A receptors antagonists. Therefore, the results presented contribute to advancing in the field of cancer-related inflammation and point specific purinergic receptors as targets for glioma progression. After that, we analyzed the role of P2X7 receptor in glioma cell proliferation. Surprisingly, in vitro, no difference in cell growth was observed when the cells were transfected with P2X7R but in vivo these cells generated larger tumors when compared to the control. Our data demonstrate that, as in other type of cancers, P2X7R has an important role in sustaining the development of glioma. Once verified the important role of P2X7 receptor in tumorassociated macrophages and glioma cells, we verified whether this receptor could interact with the COX-2 enzyme in glioma cells. No differences in mRNA expression of P2X7R or COX-2 were verified both in vitro and in vivo experiments. And any additional effect with selective P2X7R antagonist and COX-2 inhibitor were observed in in vitro and in vivo experiments. This work provides evidence that there is no relationship between the P2X7R and COX-2 in glioma. In conclusion, all these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to P2X7R as an interesting target for glioma treatment. Finally, we also investigated the potential anticancer activity of ursolic acid against to glioma cells. Ursolic acid decreased the cell number and induced an arrest in the cell cycle in glioma cells. In vivo, ursolic acid slightly reduced the glioma tumor size but did not alter the malignant features. In conclusion, the ursolic acid may be a potential candidate as adjuvant for glioblastoma therapy. Taken together, the results presented herein indicate new adjuvant treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

A bexiga urinária é exposta constantemente a substâncias potencialmente prejudiciais presentes na urina, cuja exposição crônica pode levar a diversas patologias. Dentre estas patologias está a cistite hemorrágica que é uma condição inflamatória grave da bexiga associada ao uso de fármacos quimioterápicos, como a ciclofosfamida. É descrito que a exposição em longo prazo à ciclofosfamida aumenta o risco de desenvolvimento do câncer de bexiga, o qual é caracterizado como sendo a segunda neoplasia mais comum do trato urinário e o sétimo câncer mais prevalente entre homens no mundo. Alterações na sinalização purinérgica têm sido evidenciadas em diferentes patologias associadas à bexiga urinária. De fato, o sistema purinérgico tem emergido como um potencial alvo a ser estudado. Portanto, nesta tese buscou-se avaliar o envolvimento da sinalização purinérgica em um modelo in vivo de cistite hemorrágica e em um modelo in vitro de câncer de bexiga. No intuito de identificar estratégias preventivas e tratamentos eficazes para reduzir a morbidade e a mortalidade associadas à cistite hemorrágica, a espécie Uncaria tomentosa foi investigada, devido a sua ampla utilização em casos de inflamação crônica e doenças do trato urinário. A partir dos estudos conduzidos in vivo, demonstramos que o tratamento sistêmico com a fração purificada de glicosídeos do ácido quinóvico de U. tomentosa foi capaz de prevenir os eventos nociceptivos e inflamatórios associados à cistite hemorrágica. A diminuição da expressão dos receptores P2X7, provavelmente pela inibição da migração dos neutrófilos ao local da inflamação foi observada, evidenciando propriedades anti-inflamatórias promissoras para esta fração podendo, no futuro, se tornar um agente terapêutico potencial no tratamento desta patologia. Para o câncer de bexiga músculo invasivo, a cistectomia radical é considerada o tratamento padrão, porém está associada à morbidade significativa. Na tentativa de proporcionar uma melhor qualidade de vida aos pacientes, o interesse por abordagens terapêuticas que visam à preservação da bexiga urinária tem aumentado. Neste sentido, a radioterapia tem recebido destaque por ser uma modalidade de tratamento já utilizada. Desta forma, investigamos os efeitos da radioterapia sobre a sinalização purinérgica em linhagem celular de câncer de bexiga humano T24. Dentre os receptores expressos pelas células T24, o receptor P2X6 apresentou aumento expressivo após a radioterapia. A partir da análise de pacientes com câncer de bexiga (Kaplan-Meier), evidenciamos a relação existente entre a alta expressão deste receptor e o aumento da taxa de sobrevivência. Na sequência, o provável envolvimento da família das ectonucleotidases nos efeitos da radioterapia na linhagem celular T24 também foi avaliado. Observamos que a sinalização purinérgica, principalmente via hidrólise do ATP à adenosina pela ação combinada de ectoenzimas demonstrou papel importante no tratamento radioterápico in vitro. A indução transitória da expressão da enzima ecto- 5’NT/CD73 pela radioterapia também foi observada, sendo a adenosina gerada a responsável por contribuir na morte celular. O papel crucial da ecto-5’NT/CD73 na radiossensibilização das células foi confirmado pela inibição farmacológica e pelo uso do nocaute da enzima. Em conjunto, os resultados in vitro demonstraram que a vantagem da radioterapia parece ser alcançada naqueles pacientes que expressam o receptor P2X6 e a enzima ecto-5’NT/CD73 na área tumoral, podendo no futuro, ambos serem considerados possíveis marcadores para prever a eficácia da resposta à radioterapia para o tratamento do câncer de bexiga. Por fim, a realização do ensaio radiométrico frente à ecto-5’NT/CD73 evidenciou o potente efeito inibitório do ácido ursólico sobre esta enzima, cujo potencial também foi confirmado frente à linhagem celular T24. / The urinary bladder is constantly exposed to potentially harmful substances in the urine, whose chronic exposure can lead to various diseases. Among these pathologies the hemorrhagic cystitis is a severe inflammatory condition of the bladder associated with the use of chemotherapeutic drugs, such as cyclophosphamide. It has been reported that long-term exposure to cyclophosphamide increases the risk of developing bladder cancer, which is characterized as being the second most common cancer of the urinary tract and the seventh most common cancer among men in the world. Alterations in the purinergic signaling have been shown in diseases associated with urinary bladder. In fact, the purinergic signaling has emerged as a potential target to be studied. Therefore, this thesis sought to evaluate the involvement of purinergic signaling in an in vivo model of hemorrhagic cystitis and in an in vitro model of bladder cancer. In order to identify preventive strategies and effective treatments to reduce morbidity and mortality associated with hemorrhagic cystitis, the Uncaria tomentosa species was investigated due to its wide use in cases of chronic inflammation and urinary tract diseases. From studies conducted in vivo, we demonstrated that systemic treatment with the quinovic acid glycosides purified fraction from U. tomentosa was able to prevent nociceptive and inflammatory events associated with hemorrhagic cystitis. The decreased expression of the P2X7 receptor was observed, most likely by the reduction of neutrophils migration to the site of inflammation. Therefore, this investigation has shown promising antiinflammatory properties for this fraction, which may in the future become a potential therapeutic agent for the treatment of this pathology. For bladder muscle invasive cancer, although radical cystectomy has been considered the standard treatment is still associated with significant morbidity. In an attempt to provide a better quality of life for patients, interest in therapeutic approaches aimed the preservation of the urinary bladder have increased. In this regard, the radiotherapy has been highlighted by being a treatment modality already used. Thus, we investigated the effects of radiation on the purinergic signaling in T24 human bladder cancer cell line. Among the receptors expressed by T24 cells, the P2X6 receptor showed significant increase after radiotherapy. From the analysis of patients with bladder cancer (Kaplan-Meier), we noticed the relationship between high expression of this receptor and increased survival rate. Following, the involvement of ectonucleotidases after irradiation exposure in T24 cell line was also evaluated. The purinergic signaling, mainly through hydrolysis of ATP to adenosine by the combined action of ectoenzymes, demonstrated important role in radiotherapy in vitro. The transient induction of ecto-5’NT/CD73 expression by radiotherapy was also observed, being the adenosine generated a possible responsible in T24 cell death. The crucial role of ecto-5’NT/CD73 in the radiosensitization of the cells was confirmed by pharmacological inhibition and the use of the enzyme knockout. Taken together, the in vitro results demonstrate that the benefit of radiation therapy appears to be achieved in those patients that express the P2X6 receptor and the enzyme ecto-5’NT/CD73 in the tumor area, and in the future both may be considered potential markers for predicting the effectiveness response to radiotherapy for the treatment of bladder cancer. Finally, the radiometric ecto-5’NT/CD73 assay showed the potent inhibitory effect of ursolic acid on this enzyme, whose potential was also confirmed through the T24 cell line.

Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado que parasita o trato urogenital humano causando a tricomonose, doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo. Durante a infecção a aquisição de nutrientes, como nucleotídeos púricos, pirimidínicos e ferro é essencial à sobrevivência do parasito. T. vaginalis não sintetiza de novo purinas e pirimidinas, dependendo de vias de salvação para aquisição destas moléculas. O ferro desempenha um papel crucial na patogenicidade da tricomonose, influenciando a expressão de múltiplos genes envolvidos na virulência. Nucleotídeos extracelulares, especialmente o ATP, são liberados em situações de estresse, anoxia ou injúria, atuando como sinalizadores pró-inflamatórios ao sistema imune. As enzimas NTPDase e ecto-5'-nucleotidase degradam ATP à adenosina, esta com ação anti-inflamatória. A enzima adenosina deaminase (ADA) degrada adenosina à inosina. A presença desta cadeia enzimática em T. vaginalis sugere a modulação das concentrações nucleotídeos/nucleosídeos durante a inflamação. A atividade da ADA foi caracterizada em T. vaginalis, porém há poucos relatos sobre a participação desta enzima na sobrevivência do parasito, bem como, a localização celular e o efeito de nutrientes essenciais na atividade enzimática e na expressão gênica. O estudo da localização da ADA em T. vaginalis foi realizado, indicando a presença da enzima na membrana celular e no citoplasma do trofozoíto. Avaliando-se o perfil da ADA de diferentes isolados de T. vaginalis em uma condição de limitação de soro bovino, o qual representa a fonte de adenosina aos trofozoítos, não se observou diferenças significativas na deaminação da adenosina à inosina. Na avaliação do efeito de diferentes fontes de ferro ou a privação deste cátion na atividade e na expressão gênica da ADA foi possível verificar uma diminuição da atividade e um aumento na expressão gênica após a privação do ferro, reforçando a hipótese que este elemento pode modular a atividade das enzimas envolvidas na sinalização purinérgica. Os resultados obtidos nesta dissertação permitem a avaliação de importantes aspectos da ADA, contribuindo para o melhor entendimento do sistema purinérgico em T. vaginalis e seu papel no estabelecimento e manutenção da infecção e consequente sobrevivência do parasito. / Trichomonas vaginalis is a flagellate protozoan that parasitizes the urogenital human tract causing trichomonosis, the non-viral sexually transmitted disease (STD) most common in the world. During infection the acquisition of nutrients such as purine and pyrimidine nucleotides, and iron is essential to the parasite survival. T. vaginalis lacks de novo purines and pyrimidines synthesis depending on the salvation pathway for the acquisition of these molecules. Iron plays a crucial role in trichomonosis pathogenesis, influencing the expression of multiple genes involved in virulence. Extracellular nucleotides, especially ATP, are released during stress, injury or anoxia, acting as a pro-inflammatory signaling to the immune system. The enzymes NTPDase and ecto-5'-nucleotidase degrade ATP to adenosine with anti-inflammatory action. The adenosine deaminase (ADA) enzyme degrades adenosine to inosine. The presence of this enzymatic chain in T. vaginalis suggests the modulation of nucleotides/nucleosides concentrations during inflammation. The ADA activity was characterized in T. vaginalis, but there are few reports on the participation of this enzyme in the parasite survival, as well as the cellular localization and the effect of essential nutrients on enzyme activity and gene expression. The study of ADA localization in T. vaginalis was performed, indicating the presence of the enzyme on trophozoite cell membrane and cytoplasm. Evaluating the ADA profile in different T. vaginalis isolates in bovine serum limitation condition, which is the source of adenosine for the trophozoites, no significant differences were observed in the deamination of adenosine to inosine. Regarding the effect of different iron sources or iron deprivation in activity and gene expression of ADA, it was observed a decrease in activity and an increase in gene expression after iron deprivation, reinforcing the hypothesis that this element can modulate the activity of enzymes involved in the purinergic signaling. The results obtained in this study allow the assessment of important aspects of ADA, contributing to a better understanding of the purinergic system in T. vaginalis and its role in the establishment and maintenance of infection and consequent survival of the parasite.

Trypanosoma evansi is a protozoan parasite which infects a wide variety of mammalian hosts leading to the development of trypanosomiasis. Several papers have investigated the enzymatic changes in lymphocytes, important cells involved in immune responses, which are important for understanding the pathological mechanism of trypanosomiasis in animals. Among them we highlight the ectoATPases, enzymes that hydrolyze extracellular nucleotides and nucleosides of adenine. The curcumin (cur) has been associated with several beneficial effects associated with its use in animals experimentally infected with T. evansi, since this compound exhibits its properties among inflammatory and anti-parasitic effects. This study aimed to evaluate the activity of enzymes of the purinergic system in lymphocytes of rats supplemented or not with curcumin 30 days before infection with Trypanosoma evansi. Thirty-two adult male Wistar rats were divided into four groups. The uninfected control group (C) received saline intraperitoneally (IP), the infected control group (CI) received by the same route 0.2 ml of blood with 1x106 parasites and treatment with corn oil. The group pre-infection 20 (PreI20) received 20mg/kg curcumin and pre-infection group 60 (PreI60) received 60mg/kg of curcumin for 30 days prior to inoculation with T. evansi. After inoculation, the 03 treated groups continued to receive daily curcumin within 15 days before euthanasia. The NTPDase activity for both the hydrolysis of ATP to ADP increased significantly in the infected control group compared to the control group (P <0.05). The ADA activity decreased significantly in the infected control group compared to the control (P <.05). The use of curcumin at doses of 20 and 60 mg / kg for 30 days prior to infection with T.evansi reduced significantly NTPDase activity and increased significantly ADA activity in the treated groups (P <0.05). The results of this study support the evidence that the use of curcumin prior infection with T. evansi induces immunomodulatory effects, since they maintain the NTPDase activity reduced in lymphocytes, and maintains high ADA activity, favoring the response against the parasite. Thus, it is suggested that curcumin can be used as a food supplement for animals in areas where trypanosomosis is endemic. / O Trypanosoma evansi é um protozoário o qual infecta uma grande diversidade de hospedeiros mamíferos levando ao desenvolvimento da tripanossomíase. Diversos trabalhos têm investigado as alterações enzimáticas em linfócitos, importantes células envolvidas com respostas imunológicas, as quais são importantes para a compreensão do mecanismo patológico da tripanossomíase em animais. Dentre elas se destacam as NTPDases, enzimas que hidrolisam nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares de adenina. A curcumina (Cur) tem sido relacionada com diversos efeitos benéficos associados ao seu uso em animais experimentalmente infectados com o T. evansi, uma vez que este composto apresenta dentre suas propriedades efeitos antiinflamatórios e antiparasitários. Este estudo teve por objetivo avaliar a atividade das enzimas do sistema purinérgico nos linfócitos de ratos, suplementados ou não com curcumina 30 dias antes da infecção por Trypanosoma evansi. Trinta e dois ratos Wistar adultos foram distribuídos em grupos controle não infectado (C), recebeu solução fisiológica via intraperitoneal (IP), o grupo controle infectado (CI) recebeu pela mesma via 0,2ml de sangue com 1x106 parasitas e tratamento com óleo de milho. O grupo pré-infecção 20 (PreI20) recebeu 20mg/kg de curcumina e o grupo pré-infecção 60 (PreI60) recebeu 60mg/kg de curcumina por 30 dias prévios à inoculação com T. evansi.. Após a inoculação, os 3 grupos tratados continuaram a receber a curcumina diariamente no período de 15 dias até a eutanásia. A atividade da NTPDase tanto para a hidrólise do ATP quanto do ADP aumentou significativamente no grupo CI quando comparado ao grupo controle (P<0,05). A atividade da ADA diminuiu significativamente no grupo CI em relação ao controle (P<0,05). A utilização da Curcumina nas doses de 20 e 60mg/Kg por 30 dias prévios a infecção com o T. evansi reduziu significativamente a atividade da NTPDase e aumentou significativamente a atividade da ADA nos grupos tratados (P<0,05). Os resultados deste trabalho reforçam a evidencia que o uso da curcumina previamente a infecção por T. evansi induz efeitos imunomodulatórios, pois mantêm a atividade da NTPDase nos linfócitos reduzida, e mantém alta a atividade da ADA, favorecendo a resposta contra o parasita. Desta forma, sugere-se que a curcumina possa ser utilizada como suplemento alimentar para animais em áreas onde a tripanosomose é endêmica.

O ATP pode influenciar diversos processos fisiológicos através dos receptores P1 e P2, controlando as concentrações de ATP e adenosina extracelulares. O ATP pode modular a liberação e/ou ligação de outros neurotransmissores. No SNC, a adenosina e guanosina atuam como importantes neuromoduladores com efeitos inibitórios sobre a atividade neuronal. A inativação da sinalização do ATP é mediada pela ação das ecto-nucleotidases. Além dos seus papéis fisiológicos, as ações extracelulares das purinas podem ser relevantes para a patogênese e a atenuação de doenças cerebrais agudas e crônicas. Epilepsia é uma doença neurológica crônica caracterizada por crises recorrentes que são expressas na forma de convulsões acompanhadas pela modificação dos circuitos límbicos e freqüentemente apresenta características neurodegenerativas. A doença de Parkinson é caracterizada por uma neurodegeneração progressiva na substantia nigra pars compacta com subseqüente redução no conteúdo de dopamina estriatal. Encefalopatia diabética é uma reconhecida complicação do diabetes não tratado, resultando em um comprometimento cognitivo acompanhado de uma modificação da função hipocampal. Nesta tese, nós observamos: i) na epilepsia, nós demonstramos um aumento nas atividades das ecto-nucleotidases e das nucleotidases solúveis em fatias hipocampais e líquor após o modelo do abrasamento com PTZ, com distinta influência nos níveis dos nucleotídeos, nucleosídeos e oxipurinas e também nos níveis de RNAm das NTPDases de hipocampo. No modelo agudo, houve um aumento nos níveis de glicose e lactato extracelulares. Além disso, houve uma diminuição na captação de [14C]-2-deoxi-D-glicose e nos níveis de glicogênio hipocampais 10 minutos após a convulsão, retornando aos níveis normais 30 minutos após a convulsão; ii) na doença de Parkinson, nossos resultados reforçam a hipótese de que as mudanças no sistema adenosinérgico contribuem para a progressão da neurodegeneração na doença de Parkinson. Além disso, pela primeira vez, as mudanças no “sistema guanosinérgico” podem também ser mediadores na progressão desta doença; e iii) no diabetes, nosso estudo oferece evidências demonstrando que o sistema de sinalização do ATP está comprometido no hipocampo de ratos tratados com STZ, um modelo experimental de diabetes mellitus tipo 1. Estas modificações podem levar a alterações na modulação da neurotransmissão e gliotransmissão, podendo contribuir para um progressivo comprometimento cognitivo induzido pelo diabetes. / ATP may influence several physiological processes P1 and P2 receptors-mediated by controlling extracellular concentrations of ATP and adenosine. ATP may modulate the release and/or influence other neurotransmitters either by acting through its own receptors or by altering the neurotransmitter receptors. In the CNS, adenosine and guanosine act both as important neuromodulators with major inhibitory effects on neuronal activity. The inactivation of ATP signaling is mediated by the action of ecto-nucleotidases. Besides their physiological roles, purine-mediated extracellular actions may be relevant to the pathogenesis and/or alleviation of acute and chronic brain disorders. Epilepsy is a chronic neurologic disorder characterized by recurrent seizures that have a behavioral expression in the form of convulsions accompanied by a modification of limbic circuits and the frequent presence of neurodegenerative features. Parkinson’s disease is characterized by a progressive neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta with a subsequent reduction in the striatal dopamine content. Diabetic encephalopathy is a recognized complication of untreated diabetes resulting in a progressive cognitive impairment accompanied by modification of hippocampal function. In this thesis, we observed: i) in epilepsy, we demonstrated an enhancement of ecto- and soluble nucleotidase activities in hippocampal brain slices and CSF after PTZ-kindling model, with distinct influence on the levels of nucleotides, nucleosides and oxypurines and also hippocampal NTPDases mRNA levels. Animals that presented tonic-clonic seizure had CSF glucose and lactate levels increased. Moreover, the hippocampal [14C]-2-deoxy-D-glucose uptake and glycogen content decreases at 10 min after seizure and returned to control levels at 30 minutes; ii) in Parkinson’s disease, our results reinforce the hypothesis that changes in the adenosinergic system contribute to the progression of neurodegeneration in Parkinson’s disease and point to the possibility of using the ectonucleotidases as targets for therapy. In addition, this is the first time, in our knowledge, that changes in the “guanosinergic system” might also be considered as mediators of the progression of this disease; and iii) in diabetes, our study provides evidence showing that the ATP signaling system is compromised in the hippocampus of STZ-treated rats, an experimental model of type 1 diabetes mellitus. These modifications could lead to alterations in the modulation of neurotransmission and gliotransmission, which may contribute to the diabetes-induced progressive cognitive impairment.